提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物及方法与应用与流程

1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物及方法与应用。


背景技术：

2.皮肤是人体面积最大的器官，由真皮和表皮构成。真皮位于表皮的深面，在真皮网织层中的主要细胞是成纤维细胞(fibroblasts，fbs)，它能合成和分泌大量的胶原蛋白以及少量的弹性蛋白,随着年龄的增长，由于生理或病理因素，新陈代谢的平衡被破坏，皮肤fbs抗酶破坏力降低，数量不断减少，胶原纤维和弹性纤维的数量和质量也随之减少，真皮层结构发生改变，真皮层厚度慢慢变薄，弹性变差，逐渐衰老，皮肤干燥粗糙,皱纹增多、加深,皮肤松弛，弹性下降等。甚至在表情肌运动较多的部位因皮肤松弛产生了皱纹”。由此而知，成纤维细胞的减少是引起皱纹产生的重要原因。
3.有大量研究表明成纤维细胞分泌的：表皮生长因子(egf)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(afgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、角质细胞生长因子(kgf)、血管内皮生长因子(vegf)等多种因子对于抗衰老和促进肌肤修复、收敛毛孔、令肌肤柔嫩有弹性具有重要的作用。但是成纤维细胞分泌因子发挥作用的一个重要前提是需要维持有效的浓度，也就是说需要较高的分泌水平。
4.目前是利用脂肪来源的间充质干细胞进行诱导后用于修复皮肤，实现方式是用不同组合的诱导药物对细胞实施诱导。这种诱导方法是通过药物对细胞进行诱导后提高细胞分泌bfgf水平，但是通过诱导后提高分泌水平的因子种类比较单一，只提高了bfgf的分泌水平，并没有提升其他相关因子的分泌水平。虽然现在有使用脂肪来源的间充质干细胞修复疤痕和烧伤，但效果远远不如成纤维细胞的分泌因子用于修复的效果好。显然利用脂肪来源的间充质干细胞诱导后细胞因子分泌水平并不高，更不能达到长时间稳定地高水平分泌。另外由于采用低代次细胞，一般都会使用第3-4代的细胞，如果长期使用低代次或者原代细胞进行诱导，会造成可用于诱导使用的每单位原代细胞或低代次细胞数量非常有限。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物及方法与应用。
6.技术方案：一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物，由以下物质组成：
7.环磷酸腺苷5-100ng/ml；
8.维甲酸10-180ng/ml；
9.β-巯基乙醇100-3000μmol/l；
10.二甲基亚砜10-2000μmol/l；
11.余量为α-mem培养基。
12.进一步地，由以下物质组成：
13.环磷酸腺苷15ng/ml；
14.维甲酸20ng/ml；
15.β-巯基乙醇100μmol/l；
16.二甲基亚砜10μmol/l；
17.余量为α-mem培养基。
18.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的方法，包括以下步骤：
19.(1)将第7至8代成纤维细胞平铺在六孔板上，等每个孔的细胞生长密度达到80％以上，且细胞生长状态良好，细胞存活率》95％，显微镜下观察细胞形态符合成纤维细胞形态后进入步骤(2)；
20.(2)、向α-mem培养基中加入适量的环磷酸腺苷、维甲酸、β-巯基乙醇以及二甲基亚砜得到组合物，其中：
21.环磷酸腺苷的浓度为5-100ng/ml、维甲酸的浓度为10-180ng/ml、β-巯基乙醇的浓度为100-3000μmol/l、二甲基亚砜的浓度为10-2000μmol/l；
22.(3)、将步骤(2)得到的组合物轻柔吹打至混合均匀，将上清吸出，吸干净残液后用pbs缓冲液反复洗涤3次，洗好后将pbs缓冲液残余液吸干，吸干后贴着步骤(1)的六孔板的孔板壁缓慢加入组合物，操作完成后将六孔板放入培养箱内，在co2的浓度为5％，37℃下培养72小时即可。
23.进一步地，步骤(2)中环磷酸腺苷的浓度为15ng/ml。
24.进一步地，步骤(2)中维甲酸的浓度为20ng/ml。
25.进一步地，步骤(2)中β-巯基乙醇的浓度为100μmol/l。
26.进一步地，步骤(2)中二甲基亚砜的浓度为10μmol/l。
27.上述的方法制备的成纤维细胞在制备修复皮肤的药物中的应用。
28.有益效果：本发明公开的提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物及方法与应用具有以下有益效果：
29.(1)利用多因子诱导方式，不需要对基因进行修饰、且程序简易、成分相对简洁，使用普通的α-mem培养基即可，不仅增强了细胞的安全性、易获性、还有效提高了成纤维细胞多种因子分泌水平；
30.(2)经检测得出本发明显提升了成纤维细胞表皮生长因子(egf)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(afgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、角质形成细胞生长因子(kgf)、血管内皮生长因子(vegf)等因子得分泌水平，且因子分泌稳定、种类丰富、分泌时间长久；
31.(3)成纤维细胞因子更比脂肪间充质干细胞更有优势、更利于皮肤修复。加上本技术诱导使用得都是高代次细胞，一般选择7-8代细胞进行诱导，这样可以保证有更多的原代细胞可用于诱导使用，因此能够更高效的研究如何提高成纤维细胞分泌活性因子水平用于皮肤修复的诱导方法中，同时通诱导细胞分泌因子的方法也避免了基因修饰等问题带来的风险和不确定性。
附图说明
32.图1为对照实施例与实施例1的每106个的细胞分泌的bfgf量的对比示意图。
33.图2为对照实施例和实施例1的每106个的细胞分泌的vegf量的对比示意图。
34.图3为对照实施例和实施例1的每106个的细胞分泌的egf量的对比示意图。
35.图4为对照实施例和实施例1的每106个的细胞分泌的kgf量的对比示意图。
36.图5为对照实施例和实施例1的每106个的细胞分泌的afgf量的对比示意图。
37.图6为对照实施例和实施例2的每106个的细胞分泌的bfgf量的对比示意图。
38.图7为对照实施例和实施例2的每106个的细胞分泌的vegf量的对比示意图。
39.图8为对照实施例和实施例2的每106个的细胞分泌的egf量的对比示意图。
40.图9为对照实施例和实施例2的每106个的细胞分泌的kgf量的对比示意图。
41.图10为对照实施例和实施例3的每106个的细胞分泌的bfgf量的对比示意图。
42.图11为对照实施例和实施例3的每106个的细胞分泌的vegf量的对比示意图。
43.图12为对照实施例和实施例3的每106个的细胞分泌的egf量的对比示意图。
44.图13为对照实施例和实施例3的每106个的细胞分泌的kgf量的对比示意图。
45.图14为对照实施例和实施例3的每106个的细胞分泌的afgf量的对比示意图。
46.图15为本发明公开的提高成纤维细胞分泌活性因子水平的方法的流程图。
具体实施方式：
47.下面对本发明的具体实施方式详细说明。
48.实施例1
49.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物，由以下物质组成：
50.环磷酸腺苷15ng/ml；
51.维甲酸20ng/ml；
52.β-巯基乙醇100μmol/l；
53.二甲基亚砜10μmol/l；
54.余量为α-mem培养基。
55.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的方法，包括以下步骤：
56.(1)将第7代成纤维细胞平铺在六孔板上，等每个孔的细胞生长密度达到80％以上，且细胞生长状态良好，细胞存活率》95％，显微镜下观察细胞形态符合成纤维细胞形态后进入步骤(2)；
57.(2)、向α-mem培养基中加入适量的环磷酸腺苷、维甲酸、β-巯基乙醇以及二甲基亚砜得到组合物，其中：
58.环磷酸腺苷的浓度为15ng/ml、维甲酸的浓度为20ng/ml、β-巯基乙醇的浓度为100μmol/l、二甲基亚砜的浓度为10μmol/l；
59.(3)、将步骤(2)得到的组合物轻柔吹打至混合均匀，将上清吸出，吸干净残液后用pbs缓冲液反复洗涤3次，洗好后将pbs缓冲液残余液吸干，吸干后贴着步骤(1)的六孔板的孔板壁缓慢加入组合物，操作完成后将六孔板放入培养箱内，在co2的浓度为5％，37℃下培养72小时即可。收取细胞上清并进行细胞计数，后续进行bfgf、vegf、egf、kgf、afgf等因子的elisa检测。
60.在另一个实施例中，步骤(1)中采用第8代成纤维细胞。
61.上述的方法制备的成纤维细胞在制备修复皮肤的药物中的应用。
62.实施例2
63.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物，由以下物质组成：
64.环磷酸腺苷5ng/ml；
65.维甲酸10ng/ml；
66.β-巯基乙醇100μmol/l；
67.二甲基亚砜10μmol/l；
68.余量为α-mem培养基。
69.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的方法，包括以下步骤：
70.(1)将第7代成纤维细胞平铺在六孔板上，等每个孔的细胞生长密度达到80％以上，且细胞生长状态良好，细胞存活率》95％，显微镜下观察细胞形态符合成纤维细胞形态后进入步骤(2)；
71.(2)、向α-mem培养基中加入适量的环磷酸腺苷、维甲酸、β-巯基乙醇以及二甲基亚砜得到组合物，其中：
72.环磷酸腺苷的浓度为5ng/ml、维甲酸的浓度为10ng/ml、β-巯基乙醇的浓度为100μmol/l、二甲基亚砜的浓度为10μmol/l；
73.(3)、将步骤(2)得到的组合物轻柔吹打至混合均匀，将上清吸出，吸干净残液后用pbs缓冲液反复洗涤3次，洗好后将pbs缓冲液残余液吸干，吸干后贴着步骤(1)的六孔板的孔板壁缓慢加入组合物，操作完成后将六孔板放入培养箱内，在co2的浓度为5％，37℃下培养72小时即可。收取细胞上清并进行细胞计数，后续进行bfgf、vegf、egf、kgf、afgf等因子的elisa检测。
74.在另一个实施例中，步骤(1)中采用第8代成纤维细胞。
75.上述的方法制备的成纤维细胞在制备修复皮肤的药物中的应用。
76.实施例3
77.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的组合物，由以下物质组成：
78.环磷酸腺苷100ng/ml；
79.维甲酸180ng/ml；
80.β-巯基乙醇3000μmol/l；
81.二甲基亚砜000μmol/l；
82.余量为α-mem培养基。
83.一种提高成纤维细胞分泌活性因子水平的方法，包括以下步骤：
84.(1)将第7代成纤维细胞平铺在六孔板上，等每个孔的细胞生长密度达到80％以上，且细胞生长状态良好，细胞存活率》95％，显微镜下观察细胞形态符合成纤维细胞形态后进入步骤(2)；
85.(2)、向α-mem培养基中加入适量的环磷酸腺苷、维甲酸、β-巯基乙醇以及二甲基亚砜得到组合物，其中：
86.环磷酸腺苷的浓度为100ng/ml、维甲酸的浓度为180ng/ml、β-巯基乙醇的浓度为3000μmol/l、二甲基亚砜的浓度为2000μmol/l；
87.(3)、将步骤(2)得到的组合物轻柔吹打至混合均匀，将上清吸出，吸干净残液后用pbs缓冲液反复洗涤3次，洗好后将pbs缓冲液残余液吸干，吸干后贴着步骤(1)的六孔板的孔板壁缓慢加入组合物，操作完成后将六孔板放入培养箱内，在co2的浓度为5％，37℃下培
养72小时即可。收取细胞上清并进行细胞计数，后续进行bfgf、vegf、egf、kgf、afgf等因子的elisa检测。
88.在另一个实施例中，步骤(1)中采用第8代成纤维细胞。
89.上述的方法制备的成纤维细胞在制备修复皮肤的药物中的应用。
90.对照实施例：
91.对照试验(非实施例3)的具体操作步骤如下：
92.将第7代成纤维细胞平铺在六孔板上，等每个孔得细胞生长密度达到80％，且细胞生长状态良好，细胞得活率》95％,显微镜下观察细胞形态符合成纤维细胞形态后进入下一个步骤；
93.将α-mem培养基的上清吸出，吸干净残液后用pbs缓冲液反复洗涤3次，洗好后将pbs缓冲液残余液吸干，吸干后贴着六孔板的孔板壁缓慢加入α-mem培养基，操作完成后将孔板放入培养箱，在co2的浓度为5％，37℃下培养72小时后，收取细胞上清并进行细胞计数，后续进行bfgf、vegf、egf、kgf、afgf等因子的elisa检测。
94.图1-5为对照实施例与实施例1的每106个的细胞分泌的bfgf量、vegf量、egf量、kgf量、afgf量的对比示意图。图6-9为对照实施例和实施例2的每106个的细胞分泌的bfgf量、vegf量、egf量、kgf量的的对比示意图。图10-14为对照实施例和实施例3的每106个的细胞分泌的bfgf量、vegf量、egf量、kgf量、afgf量的对比示意图。从提1-14可知，本技术的技术方案有效提高了成纤维细胞多种因子分泌水平。
95.上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。