一株铁还原菌DH4菌株及其应用的制作方法

一株铁还原菌dh4菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物采油技术领域，具体涉及一株铁还原菌dh4菌株及其应用。


背景技术：

2.我国绝大部分油气储集层中均含有黏土矿物，黏土矿物对油气储集层有着不同程度的危害，对储集层的损害特征是遇淡水发生膨胀，堵塞孔喉，膨胀后的黏土胶结强度大大降低，遇到较高速的流体冲击后，很容易分散并随流体在孔道中移动，进一步对储层造成损害。在油气的开发生产过程中，黏土的膨胀分散运移是储层损害的最普遍问题，研究黏土矿物的稳定剂和抑制剂，对提高原油采收率具有重要的现实和理论意义。微生物提高原油采收率研究与应用在近年来得到快速发展，例如微生物驱油、微生物吞吐、微生物清防蜡等生物技术在石油开发中得到了广泛的应用，但是微生物直接作用于黏土矿物，抑制黏土膨胀，改善渗流环境和提高原油采收率的研究和报道较少。
3.fe(ⅲ)还原功能微生物通常是指具有异化还原fe(ⅲ)为fe(ii)的功能微生物，是一类可以利用有机物作为电子供体的特殊微生物群体，在氧化有机物的同时，以fe
3
作为唯一的电子受体使fe(ⅲ)还原为fe(ii)，并在还原和代谢过程中获得自身生生长所需能量。铁还原微生物的代谢产物可以改变矿物表面的物理化学环境，是导致矿物分解的主要动力。微生物分解矿物速率比单一化学分解作用要高出几个数量级，如kim等人2004年发表在science杂志的研究发现，一株异化铁还原菌shewanella oneidensis mr
‑
1能在两周的时间内将富铁蒙脱石中的三价铁还原，并促进蒙脱石向伊利石转化。2002年daniel等首次发现嗜热厌氧产甲烷菌也能够还原粘土矿物结构中的三价铁，导致粘土矿物发生相变作用。这些发现打破了长期以来人们对蒙脱石发生伊利石转化过程受温度压力和时间控制的认识，突破了粘土矿物之间转化作用时间尺度较大的局限。因此，利用油藏铁还原微生物，抑制粘土水化膨胀或者缩膨，改善原油流体渗流环境，对于油藏提高原油采收率具有重要意义。
4.在进行微生物采油过程中，不同的油藏对菌种也有一定的要求，目前报道的产铁还原菌很多，但分离自油藏的铁还原菌非常少，目前关于分离自油藏环境的flaviflexus salsibiostraticola功能特征及其在石油开采和抑制黏土膨胀中的应用还未见相关研究报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供了一株铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株，所述菌株分离自分离自油藏环境，已于2021年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，所述flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株的保藏编号为：cctcc no：m 2021401。
6.本发明的目的之二在于提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂中包含上述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株。
7.进一步地，所述微生物制剂为固态制剂或液态制剂。
8.本发明的目的之三在于提供了一种生物缩膨菌剂，所述生物缩膨菌剂中包含：营养培养基，以及上述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株或上述微生物制剂。
9.进一步地，所述生物缩膨菌剂中的营养培养基为lb培养基或包含：蔗糖10
‑
50g/l，乙酸钠10
‑
40g/l，乳酸钠3
‑
20g/l，mgso
4 0.1
‑
2g/l，kcl 2
‑
18g/l，mnso
4 5
‑
9g/l，cuso
4 5
‑
10g/l，znso
4 5
‑
12g/l，kh2po
4 1
‑
7g/l，蒙脱石2
‑
10g/l，ph 5.0
‑
9.0的培养基。
10.进一步地，将所述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株或所述微生物制剂接种于营养培养基中，于ph 5
‑
9.5，温度20
‑
60℃条件下发酵，得到所述生物缩膨菌剂。
11.本发明的目的之四在于提供了所述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在还原fe(iii)中的应用。
12.本发明的目的之五在于提供了所述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在抑制黏土膨胀中的应用，通过抑制黏土膨胀可保护储层。
13.本发明的目的之六在于提供了所述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在降低储层岩心水敏性和/或降低储层注入压力中的应用。
14.本发明的目的之七在于提供了所述铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在提高原油采收率中的应用。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从油藏环境中分离筛选得到了一株可高效还原fe(iii)的铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4，扫描电镜分析等表明所述flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株可有效分解腐蚀蒙脱石矿物，并有效抑制黏土膨胀；同时岩心实验表明，flaviflexus salsibiostraticola dh4生物制剂可改善岩心的水敏性，降低石油开发中的注水压力，可将所述flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株应用于原油采收中，提高原油的采收率。
附图说明
16.图1为本发明实施例1中dh4菌株接种入柠檬酸三铁培养基前后培养基的颜色变化；
17.图2为本发明实施例2中接种dh4菌株后，与空白对照组相比，蒙脱石中fe
2
浓度随时间的变化；
18.图3为本发明实施例2中dh4菌株作用前后蒙脱石样品的扫描电镜图，其中图3
‑
a为蒙脱石原始样品，图3
‑
b为菌株dh4作用7天后蒙脱石样品。
具体实施方式
19.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属
于本发明保护的范围。
20.实施例1铁还原菌的分离鉴定
21.1、铁还原菌的分离
22.本发明提供了一株分离自油藏环境的铁还原菌，其筛选方法为：按照常规的菌株筛选方法，取10ml从油田采集的水样，接入盛有100ml柠檬酸三铁培养基(0.5％柠檬酸三铁，w：v)的厌氧瓶中，35℃，静置厌氧培养1周，选取褪色明显的实验组，在厌氧操作站中，无氧条件下取100μl发酵液涂布于lb琼脂平板培养基，35℃厌氧培养48h；挑取不同形态单菌落，在lb琼脂平板培养基上划线纯化，35℃，培养48h。挑取单菌落经过富集培养接种入柠檬酸三铁培养基中，35℃，静置厌氧培养72h，选取褪色明显的实验组所对应的菌株。本实施例通过初步筛选，发现样品中有能够使培养基明显褪色的微生物(菌培养前后培养基颜色变化如图1所示)，说明筛选得到的微生物能够还原fe(iii)。
23.本实施例中，通过初步筛选能够以fe(iii)为唯一电子受体进行代谢活动的微生物，进一步经培养、驯化，分离得到1株能够还原fe(iii)的菌株，将其命名为dh4。通过分光光度法对样品中的fe(iii)和fe(ii)浓度进行测定，结果显示，dh4菌株在4天内对培养基中fe(iii)的还原效率可以达到68.3％。
24.2、分子生物学鉴定
25.按照常规菌种鉴定方法，提取菌株dh4的基因组dna，设计引物进行pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将pcr产物送至南京派森诺基因科技有限公司进行dna测序。dh4的pcr扩增产物测序结果提交ncbi用blast进行检索和同源性比较，确定菌株dh4为flaviflexus salsibiostraticola(与flaviflexus salsibiostraticola strain ebr4
‑1‑
2的相似度为99.86％)。所述dh4菌株的16s rrna序列与genbank数据库序列比对结果如表1所示。
26.表1 dh4的16s rrna序列与genbank数据库序列比对结果
[0027][0028]
本发明的菌株dh4可以采用如下保存方法：
[0029]
(1)短期保存：将上述菌株于斜面培养基上划线，于35℃培养48h后，置于4℃条件下短期保存。
[0030]
(2)长期保存：采用甘油冷冻保存法，即从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有1.5ml 30％灭菌甘油的甘油管中，
‑
70℃冷冻保存。
[0031]
或采用脱脂牛奶冷冻保存法，即从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有灭菌脱脂牛奶的甘油管中，
‑
70℃冷冻保存。
[0032]
本发明所筛选到的flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株已于2021年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：cctcc no：m 2021401。
[0033]
实施例2 dh4菌株对蒙脱石的分解
[0034]
1、菌种
[0035]
实施例1中筛选得到的flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株。
[0036]
2、培养基
[0037]
培养基的组成为：蔗糖10
‑
50g/l，乙酸钠10
‑
40g/l，乳酸钠3
‑
20g/l，mgso4 0.1
‑
2g/l，kcl 2
‑
18g/l，mnso4 5
‑
9g/l，cuso4 5
‑
10g/l，znso4 5
‑
12g/l，kh2po4 1
‑
7g/l，蒙脱石2
‑
10g/l，ph 5.0
‑
9.0。培养基配制完成后于0.1mpa下灭菌30min。
[0038]
3、发酵培养
[0039]
将斜面保藏菌株用接种环于平板划线活化，于35℃恒温培养20h，然后从平板上挑取三环(每接种环菌种包含3个以上特征明显的单菌落)菌种接入摇瓶(50ml三角瓶，装液量为30ml)，于35℃，180r/min培养8h，离心收集菌体，无菌水清洗3次后重悬，接入到蒙脱石培养基中，35℃下厌氧培养，
[0040]
4、微生物对黏土矿物中fe(iii)的还原
[0041]
fe(ⅱ)含量测试方法使用邻菲罗啉分光光度法，具体操作参照《hj/t 345
‑
2007铁的测定邻菲罗啉分光光度法》，接入所述flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株后，按照标准中方法测定样品中总fe的含量，培养后每隔一段时间取抽提液5ml，使用亚铁含量测定标准曲线计算fe(ⅱ)含量，计算样品中fe(iii)还原效率。接种所述flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株后，与空白对照组相比，蒙脱石中fe
2
浓度随时间的变化如图2所示。结果显示，所述flaviflexus salsibiostraticola dh4可实现蒙脱石中fe(iii)的高效还原，fe(iii)还原效率为45.3％。
[0042]
5、微生物作用前后黏土矿物的微观形貌观察
[0043]
利用扫描电镜观察所述flaviflexus salsibiostraticola dh4作用前后的粘土矿物结构、形貌及矿物学上的变化。
[0044]
样品制备方法如下：(1)取1ml对数期菌液于1.5ml ep管中，13400r/min，5min，4℃离心，弃上清；(2)用1ml ph 7.4的pbs洗涤，13400r/min，5min，4℃离心，弃上清，重复3次；(3)将沉淀放置于干净的载玻片上，以浓度为2％多聚甲醛
‑
2.5％的戊二醛为固定液对样品固定1h；(4)使用不同浓度的乙醇对样品进行脱水处理，使用乙醇浓度为25％、50％、75％、95％、100％，每种浓度各两次，每次脱水15
‑
20min；(5)脱水处理完毕后，放入真空冷冻干燥机中处理24h；(6)干燥好的样品在真空中喷金；(7)用扫描电镜观察，得到不同放大倍数下微生物作用前后蒙脱石的微观形貌。
[0045]
扫描电镜观察结果如图3所示，其中图3
‑
a为蒙脱石原始样品，图3
‑
b为菌株dh4作用7天后的蒙脱石样品。结果显示，蒙脱石的原始样品为较紧致的实心颗粒聚集在一起，而flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株作用7天后，蒙脱石样品呈松散的网状结构，即蒙脱石样品经flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株作用后出现明显的溶蚀现象。
[0046]
实施例3防膨率测定
[0047]
在实施例2的基础上，参考标准粘土稳定剂中的粘土防膨胀率的测定方法，对fe(iii)还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株作用前后蒙脱石矿物膨胀性能进行了测定。实验步骤具体为：首先称取0.1g烘干后的对照组蒙脱石样品装入2.0ml离心管中，记录下样品在离心管中膨胀前的体积v0；然后加入1.5ml的膨胀介质溶液(分别以蒸馏水和煤油作为膨胀介质溶液)充分摇匀；在常温下放置24h，放入离心机中，在转速为5000转/分的条件下离心15分钟，读出样品膨胀后的体积v1。重复上述步骤对实验组的蒙脱石样
品进行膨胀体积测定，其膨胀前后体积分别记为v2和v3。计算蒙脱石样品抑膨率的公式如下：
[0048][0049]
式(1)中：η为防膨率，％；v0为对照组干燥蒙脱石样品的体积，ml；v1为对照组蒙脱石在膨胀介质中的膨胀体积，ml；v2为微生物作用后干燥蒙脱石的体积，ml；v3为微生物作用后蒙脱石在膨胀介质中的膨胀体积，ml。
[0050]
实验结果表明，flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株具有较好的抑制粘土矿物水化膨胀的作用，其中在水体系中的抑制膨胀率为45.65％，在煤油体系中的抑制膨胀率为85.29％。即本发明所述flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株具有优异的抑制黏土膨胀，保护储层的作用。
[0051]
实施例4 dh4菌株降低储层水敏性评价方法
[0052]
依次使用地层水、双蒸水测试天然岩心的渗透率，计算水敏指数；然后注入铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4菌株，关闭进、出口，培养2周；接着继续使用双蒸水测试渗透率，再次计算水敏指数；从而评价所述异化铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4降低储层水敏性。
[0053]
渗透率计算公式如式(2)所示：
[0054][0055]
其中：k渗透率，md；q流量，ml/s；μ粘度，mpa
·
s；l岩心长度，cm；a岩心截面积，cm2；δp压差，mpa。
[0056]
水敏指数计算按式(3)进行：
[0057][0058]
其中：i
w
水敏指数，小数；k
地层水
使用地层水所测岩心渗透率，md；k
双蒸水
使用双蒸水所测岩心渗透率，md。
[0059]
具体实验步骤：
[0060]
1、岩心120℃烘烤12h，冷却至室温后称得干重；
[0061]
2、打开高温恒温箱，将温度设置为55℃；将岩心置入岩心夹持器，加环压至5mpa；抽真空2h；
[0062]
3、注入地层水，流速0.80ml/min，注入体积15pv，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差，结束时称取岩心湿重；
[0063]
4、注入双蒸水，流速0.80ml/min，注入体积15pv，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差；
[0064]
5、注入铁还原菌dh4细胞悬浮液，流速0.40ml/min，注入体积2pv，然后关闭进口、出口，55℃培养2周；
[0065]
6、接着注入双蒸水，流速0.80ml/min，注入体积15pv，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差。
[0066]
铁还原菌dh4降低储层水敏性评价岩心参数如表2，结果如表3所示。
[0067]
表2铁还原菌dh4降低储层水敏性评价岩心参数
[0068][0069]
表3铁还原菌dh4降低储层水敏性评价结果
[0070][0071]
结果显示，岩心ws1和ws2双蒸水驱替时水敏指数分别为0.908和0.883，评价为强水敏性；使用异化铁还原菌dh4菌株作用后，水敏指数分别变为0.469和0.498，评价为中等水敏性，即说明铁还原菌dh4能显著降低储层的水敏性。
[0072]
实施例5 dh4菌株降低储层注入压力
[0073]
首先使用地层水测试低渗透储层的渗透率，然后注入菌株dh4细胞悬液，培养2周；接着再用地层水测试该低渗透储层的渗透率，从而评价异化铁还原菌dh4对低渗透储层注入压力的影响。具体操作步骤如下：
[0074]
1、岩心烘烤、称重，然后置入岩心夹持器、加环压、抽真空；
[0075]
2、注入地层水，流速0.50ml/min，注入体积15pv，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差；
[0076]
3、注入菌株dh4细胞悬浮液，流速0.30ml/min，注入体积2pv，然后关闭进口、出口，55℃培养2周；
[0077]
4、接着注入地层水，流速0.50ml/min，注入体积15pv，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差。
[0078]
菌株dh4降低低渗透储层注入压力评价的岩心参数如表4所示，测定结果如表5所示。
[0079]
表4铁还原菌dh4降低储层注入压力评价岩心参数
[0080][0081]
表5铁还原菌dh4降低储层注入压力评价结果
[0082][0083]
结果显示，对于渗透率<10md的岩心md1，使用地层水驱替时压差为0.216mpa；使用
铁还原菌dh4作用后，压差降低至0.178mpa，注入压差降低了17.59％，表明铁还原菌dh4能显著降低低渗透储层的注入压力。
[0084]
综上所述，本发明分离筛选得到了一株铁还原菌flaviflexus salsibiostraticola dh4，其可有效分解腐蚀蒙脱石矿物，并有效抑制黏土膨胀；同时岩心实验表明，flaviflexus salsibiostraticola dh4可改善岩心的水敏性，降低石油开发中的注水压力，将其应用于原油采收中，可有效提高原油的采收率。
[0085]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。