一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法与流程

1.本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法。


背景技术：

2.干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。
3.当前的干细胞培养装置主要有两类，一是2d培养装置，通过减小液层高度来强化气体交换；另一个是3d培养，通过搅拌来强化气体交换。无论2d培养，还是3d培养，都是被动的气体扩散来完成气体交换。由于氧气在溶液中的溶解度差，被动扩散速度慢，氧气供应会影响到干细胞的快速生长。


技术实现要素：

4.针对上述不足，本发明提供一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，其实质是在培养液中加入血红蛋白，利用血红蛋白在高氧浓度时容易与氧结合，在低氧浓度时容易与氧分离并结合二氧化碳的功能，通过血红蛋白的循环可以将干细胞培养体系的气相环境中的氧气转运给干细胞，满足干细胞生长过程对氧气的需求，同时还可以带走干细胞产生的二氧化碳，有效增强了干细胞培养系统的气体交换，提高干细胞培养效果。
5.本发明解决干细胞培养中气体交换不足的技术问题的步骤如下：
6.s1按标准实验方法与要求进行干细胞培养，
7.s2建立干细胞培养系统中气体组成调控体系，
8.s3在干细胞培养液中加入血红蛋白，利用血红蛋白进行培养系统中气体与干细胞之间的转运，为干细胞及时提供氧气与排出二氧化碳。
9.通过在每毫升培养液中添加0至100毫克血红蛋白，可以有效实现干细胞与培养系统中气相部分的气体交换穿梭，有效保证干细胞生长过程中的氧气供给与二氧化碳排放；同时配合干细胞培养系统中气相部分的氧气比例与二氧化碳的比例调控，能够有效根据干细胞的生长需求供应氧气与排放二氧化碳。
10.有益效果：
11.本发明设计了一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，使干细胞能够在一种更接近人体中干细胞生长条件下进行培养，有利于提高干细胞的生长质量。
具体实施方式
12.下面结合实施例对本发明作进一步说明。
13.实施例1
14.本发明提供了一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，步骤包括以下内
容：
15.步骤1：按标准实验操作进行msc细胞的培养，取msc种子细胞水浴锅 (thermo 2867)37℃复苏，在生物安全柜(thermo 1379)中用5ml移液管吸取细胞悬液至50ml离心管(corning 430829)，离心(thermo st40) 1200r/min，10min；离心完成后弃上清，涡旋混匀，用10ml移液管加入干细胞培养基(corning 10-022-cvr)重悬，接种到t175瓶(nunc 159910)；将培养瓶放入37℃，5％co2培养箱(thermo 3111)中。
16.步骤2：利用气体组成监测传感器，控制co2培养箱(thermo 3111)中气体组成，按要求达到5％co2、95％空气的培养条件。
17.步骤3：在干细胞培养液中加入血红蛋白，使血红蛋白的终浓度为30毫克/ 毫升，利用血红蛋白完成t175培养瓶中气体与干细胞之间的转运，为干细胞生长提供最快速的气体调节能力。
18.利用倒置显微镜(徕卡dmi4000b)下观察细胞融合率达到80％以上，在生物安全柜(thermo 1379)中弃去培养液，用10ml移液管加入生理盐水清洗培养瓶，弃去生理盐水；用10ml移液管干细胞消化液(corning 25-053-c1)，倒置显微镜下观察细胞变圆时加入15ml抑制剂(corning 10-022-cvr)，混匀后离心收集干细胞，1200r/min，10min离心(thermo st40)收获干细胞制备成细胞悬液进行检测。
19.同时，以同样培养条件下不加血红蛋白的干细胞培养物做对照。
20.结果表明：加入血红蛋白后的干细胞培养瓶提前21小时进行收获， cd29/cd44/cd73/cd90/cd105的阳性率超过98％，(控制表达的特征抗原) cd34\cd45\cd14\cd31\cd19\hla阳性率＜2％，符合msc干细胞指标要求。
21.实施例2
22.本实施例增强干细胞气体交换的方法具体过程如下：
23.步骤1：按标准实验操作进行msc细胞培养，取msc种子细胞水浴锅(thermo 2867)37℃复苏，将复苏后的种子接种于无菌的微载体(高压蒸汽灭，115℃灭菌20分钟)上，利用wheaton公司微载体培养瓶进行msc的3d培养，将wheaton公司双侧臂培养瓶放置于磁力搅拌器上，于co2培养箱(thermo3111)中进行msc的3d培养。
24.步骤2：利用气体组成监测传感器，控制co2培养箱(thermo 3111)中气体组成，按要求达到5％co2、95％空气的培养条件。
25.步骤3：在干细胞培养液中加入血红蛋白，使血红蛋白的终浓度为100毫克 /毫升，利用血红蛋白完成wheaton公司双侧臂培养瓶中气体与培养干细胞之间的气体转运，为干细胞生长提供最快速的气体调节。
26.在生物安全柜(thermo 1379)中取样，利用荧光染液进行活/死细胞荧光染色，利用倒置荧光显微镜(徕卡dmi4000b)下观察微载体上的干细胞生长状况，当干细胞基本长满微载体时，在生物安全柜(thermo 1379)中弃去培养液，用生理盐水洗涤后，用干细胞消化液(corning 25-053-c1)，在20分钟内完成消化并进行干细胞离心收集，将收获干细胞制备成细胞悬液进行检测。
27.实验中，以同样培养条件下不加血红蛋白的干细胞培养物做对照。
28.结果表明：加入血红蛋白后的干细胞培养瓶提前8小时进行收获， cd29/cd44/cd73/cd90/cd105的阳性率超过99％，(控制表达的特征抗原) cd34\cd45\cd14\cd31\
cd19\hla阳性率＜2％，符合msc干细胞指标要求。
29.本发明的利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，其特征在于，该方法的步骤如下：s1按干细胞培养方法及要求进行干细胞培养；s2建立干细胞培养系统中气体组成调控体系；s3在干细胞培养液中加入血红蛋白，利用血红蛋白进行培养系统中气体与干细胞之间的转运，为干细胞及时提供氧气与排出二氧化碳。2.根据权利要求1所述的一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，其特征在于，步骤s1中的干细胞培养可以是2d培养系统，也可以是3d培养系统。3.根据权利要求1所述的一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，其特征在于，步骤s2中的气体组成调控体系是指可以调控干细胞培养系统中气相部分的氧气比例、二氧化碳的比例。4.根据权利要求1所述的一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，其特征在于，步骤s3中每毫升培养液中的血红蛋白加入量在0毫克至100毫克。5.根据权利要求1所述的一种利用血红蛋白增强干细胞气体交换的方法，其特征在于，可以利用血红蛋白增强悬浮培养的细胞的气体交换，也可以增强贴壁培养的细胞的气体交换。

技术总结
通过在培养液里添加血红蛋白，可以模拟人体血液功能，利用血红蛋白在培养液内部与干细胞培养系统中气液交界面之间往返穿梭，及时为干细胞提供氧气与排出二氧化碳。干细胞提供氧气与排出二氧化碳。


技术研发人员：华子昂 朱美瑛 赵凯龙 张建 万君兴
受保护的技术使用者：华子昂
技术研发日：2020.05.21
技术公布日：2021/11/26