植酸酶发酵生产方法与流程

1.本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及植酸酶发酵生产方法。


背景技术：

2.植酸酶(phytase， phy)，又称肌醇六磷酸水解酶（myo-inositol hexakishydrolase phosphate），是一种酸性正磷酸单酯磷酸水解酶，可以催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸。suzuki等于1907 年首先在植物中发现了植酸酶，之后各国科研人员对各种来源的植酸酶进行了广泛深入的调查研究。
3.由于其特殊的催化特性，植酸酶近些年来成为一种颇受欢迎的食品添加剂和饲料添加剂，尤其是作为单胃动物饲料添加剂，已得到世界范围的普遍认可和应用。
4.科研人员对于植酸酶的研究探索主要集中在微生物植酸酶领域。全球多个国家都已经开发出商用化的植酸酶产品，如芬兰aiko bio technology 公司开发了多个植酸酶多酶体系产品（多酶sp、sf、tp 等），具有多种酶解作用，促进畜禽对磷、纤维素和蛋白质的吸收利用；美国alltech 公司开发了“allzyme phy tase”植酸酶，具有优异的热稳定性和ph 稳定性；中国上海永兴农科生物工程公司开发了一款新型的商业化植酸酶产品，具有良好的热稳定性和耐低ph 的优异性能。
5.植酸酶应用广泛，但在工业化应用方面仍存在一些急需解决的问题。一方面天然植酸酶的产量过低，难以满足工业化大规模应用的供给需求，而且天然植酸酶的提取和生产成本居高不下，导致天然植酸酶不具有广泛应用的价格基础。其次，植酸酶虽然来源广泛，但是植物和动物来源的植酸酶产量低，不足以满足工业化生产应用的需求，并且植物和动物来源的植酸酶适用范围没有微生物来源的植酸酶广泛，目前植酸酶的生产主要来源还是依靠于微生物。因此如何提升微生物发酵制备植酸酶的效率是科研人员真正需要关注的。


技术实现要素：

6.本发明是为了克服现有技术中的微生物发酵制备植酸酶的效率较低的缺陷，提供了一种植酸酶发酵生产方法，以克服上述缺陷。
7.为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：本发明第一个目的在于，提供了膨润土在植酸酶生产中的应用。
8.本发明第一个目的在于，提供了植酸酶发酵生产方法，其包含以下步骤：在发酵过程中添加膨润土。
9.本技术的发明人在日常实验中意外发现，在发酵生产植酸酶的过程中添加膨润土对植酸酶产率有促进作用。
10.对此，发明人进行了一定的研究。首先，膨润土是一种微观结构为片层状的矿物粘土，单片膨润土的厚度为1纳米左右，同时其比表面积较大，具有优异的吸附性能。当将膨润土添加到生产植酸酶的过程中时，微生物能够吸附在片层膨润土的表面生长，从而能够提
高微生物的生长环境的稳定性，使得微生物的活动力有效提升，从而使得植酸酶的生产效率大大提升，使得培养基中产物的浓度有效提升，并且提高了单位容积发酵罐的生产能力。
11.作为优选，所述膨润土包括：钠基膨润土、钙基膨润土、锂基膨润土、酸性改性膨润土中的至少一种或多种的组合。
12.作为优选，膨润土的添加量为0.5g/l-5g/l。
13.本技术发明人发现，膨润土的添加量对于植酸酶的生产有明显的影响。发明人发现，当膨润土的添加量小于0.5 g/l时，其对于微生物的生长环境的稳定性提升效果有限，使得植酸酶的生产效率提升不明显。但是由于膨润土吸附性能好，如果用量太大，有效成分都被吸附在膨润土上，会降低活性，影响发酵，经过发明人试剂测试后发现当膨润土的添加量在0.5g/l-5g/l之间时植酸酶的生产效率提升最为明显。
14.作为优选，还包括以下步骤：（s.1）一级液体培养；（s.2）发酵罐发酵；（s.3）植酸的分离纯化。
15.作为优选，所述步骤（s.1）中的一级液体培养工艺如下：将单菌落接入种子培养基，32℃-40℃摇床培养30-45小时。
16.作为优选，所用的菌种为黑曲曲酶。
17.作为优选，所述步骤（s.2）中的发酵罐发酵工艺如下：以6-18%的接种量接种于发酵培养基，32℃-40℃培养60-84小时，进行液体深层发酵培养。
18.作为优选，膨润土随发酵培养基一起加入到发酵罐中。
19.作为优选，所述发酵培养基成分为：柠檬酸钾，1-4 g/l；硫酸钙，1-2 g/l；磷酸二氢钾35-50 g/l；硫酸铵3-7 g/l；硫酸钾12-18 g/l；硫酸镁9-15 g/l；葡萄糖4-8 g/l。
20.因此，本发明具有以下有益效果：（1）本发明在植酸酶发酵生产过程中添加膨润土，能够使得微生物能够吸附在片层膨润土表面生长，提高了微生物的活性，提升了植酸酶的生产效率。
21.（2）本发明提供的植酸酶发酵生产工艺，添加的膨润土改善微生物的培养环境，有利于提高培养基中产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
23.实施例1植酸酶发酵生产工艺包括：一级液体培养；发酵罐发酵；植酸的分离纯化；一级液体培养工序，将单菌落接入种子培养基，35℃摇床培养36小时，进行一级液体培养。所用的菌种为黑曲曲酶;发酵罐发酵工段，以8%的接种量接种于发酵培养基，35℃培养72小时，进行液体深
层发酵培养；发酵培养基成分为：柠檬酸钾，2.0 g/l；硫酸钙，1.2 g/l；磷酸二氢钾38.0 g/l；硫酸铵4.0 g/l；硫酸钾15.0 g/l；硫酸镁11.0 g/l；葡萄糖5.0 g/l；发酵培养基中添加2.0 g/l 钠基膨润土。
24.实施例2植酸酶发酵生产工艺包括：一级液体培养；发酵罐发酵；植酸的分离纯化；一级液体培养工序，将单菌落接入种子培养基，35℃摇床培养36小时，进行一级液体培养。所用的菌种为黑曲曲酶;发酵罐发酵工段，以10%的接种量接种于发酵培养基，35℃培养84小时，进行液体深层发酵培养；发酵培养基成分为：柠檬酸钾，2.5 g/l；硫酸钙，1.0 g/l；磷酸二氢钾40.0 g/l；硫酸铵3.5 g/l；硫酸钾13.0 g/l；硫酸镁12.0 g/l；葡萄糖6.0 g/l；发酵培养基中添加3.0 g/l 钙基膨润土。
25.实施例3植酸酶发酵生产工艺包括：一级液体培养；发酵罐发酵；植酸的分离纯化；一级液体培养工序，将单菌落接入种子培养基，33℃摇床培养36小时，进行一级液体培养。所用的菌种为黑曲曲酶;发酵罐发酵工段，以14%的接种量接种于发酵培养基，33℃培养65小时，进行液体深层发酵培养；发酵培养基成分为：柠檬酸钾，3.5 g/l；硫酸钙，1.5 g/l；磷酸二氢钾45.0 g/l；硫酸铵5.5 g/l；硫酸钾16.0 g/l；硫酸镁14.5 g/l；葡萄糖6.0 g/l；发酵培养基中添加0.5 g/l 锂基膨润土。
26.实施例4植酸酶发酵生产工艺包括：一级液体培养；发酵罐发酵；植酸的分离纯化；一级液体培养工序，将单菌落接入种子培养基，38℃摇床培养45小时，进行一级液体培养。所用的菌种为黑曲曲酶;发酵罐发酵工段，以18%的接种量接种于发酵培养基，38℃培养84小时，进行液体深层发酵培养；发酵培养基成分为：柠檬酸钾，1.5 g/l；硫酸钙，1.0 g/l；磷酸二氢钾35.0 g/l；硫酸铵6.5 g/l；硫酸钾17.0 g/l；硫酸镁10.5 g/l；葡萄糖8.0 g/l；发酵培养基中添加5.0 g/l 酸性改性膨润土。
27.对比例1：组成同实施例1，区别是：没有使用膨润土。
28.对比例2组成同实施例1，区别是：发酵培养基中添加0.2g/l 钠基膨润土。
29.对比例3组成同实施例1，区别是：发酵培养基中添加6g/l 钠基膨润土。
30.对比例4组成同实施例1，区别是：发酵培养基中添加10g/l 钠基膨润土。
31.对比例5组成同实施例1，区别是：将钠基膨润土替换为高岭土。
[0032] 实施结果：见下表植酸酶发酵结果产率提高酶活u/g存活性实施例11701097%实施例22103098%实施例31902097%实施例412�9098%对比例1/994096%对比例2501097%对比例39�8097%对比例46�9096%对比例51�7095%
[0033]
上表中酶活性定义如下：样品在植酸钠浓度为5.0 mmol/l，温度 37℃，ph 值5.50 的条件下，每分钟从植酸钠释放1μmol 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以u 表示。
[0034]
结果表明，本发明提供的添加膨润土的植酸酶发酵工艺相较于对比文件1中没有使用膨润土而言，能够提高植酸酶的活性、生物活性和产率。
[0035]
同时将实施例1~4与对比例2~4相比较，发明人发现，膨润土的添加量对于植酸酶的生产有明显的影响。其中当膨润土的添加量小于0.5 g/l时（对比例2），其对于微生物的生长环境的稳定性提升效果有限，使得植酸酶的生产效率提升不明显。此外，由于膨润土吸附性能好，如果用量太大（对比例3以及对比例4），有效成分都被吸附在膨润土上，会降低活性，影响发酵，经过发明人试剂测试后发现当膨润土的添加量在0.5g/l-5g/l之间时植酸酶的生产效率提升最为明显。
[0036]
将将实施例1与对比例5进行比较后，我们发现，将膨润土替换为性质较为接近的高岭土后，其并未获得较为接近的性能测试结果，表明膨润土具有的提升植酸酶的生产效率这一效果是本领域技术人员在先前是预料不到的。
[0037]
最后，以上公布的仅是本发明的具体实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。