一株乳酸乳球菌乳酸亚种A32菌株及其衍生产品和应用

一株乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株及其衍生产品和应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株乳酸乳球菌乳酸亚种 (lactococcus lactis subsp.lactis)a32菌株及其衍生产品和应用。


背景技术：

2.nisin又称乳酸链球菌素、尼辛，是rogers等人于1928年首次提出乳酸链球菌产生的、能够抑制其它乳酸菌的生长的代谢产物。1933年，witehead 等人发现两种野生乳链球菌都能产生一种能够抑制乳酸菌的生长并阻止酸的产生的物质，并证明该物质具有蛋白质特性，猜测其可能是一种多肽。自 1944年开始，mattick一直在进行此物质的研究，随后，他发现不同链球菌菌株在产nisin的产量方面明显不同，并筛选出了一株能够产生高产nisin 的菌种，并制备纯化这种多肽物质，由于是n群中的乳酸菌所产生的抑菌物质，故命名为n-inhibitor substance，即n群抑菌物质，简称为nisin，也称乳酸链球菌素。
3.1928年，美国农业部乳品工业局研究实验室报道了乳链球菌对保加利亚乳杆菌的抑制作用；1953年，nisaplin上市，开创了nisin商业应用的先河；1969年，粮农组织(fao)、世界卫生组织(who)和食品添加剂联合专家委员会(jecfa)先后批准nisin作为防腐剂应用于食品工业。此后， nisin在乳制品、罐头食品、饮料、及肉制品等品类食品加工、运输和贮存环节的防腐中发挥了重要作用，可减少粮食变质导致的浪费并延长食品运输距离，作为食品防腐剂在世界一百多个国家和地区得到广泛应用。
4.随着社会经济发展，人民对高品质生活和健康饮食的追求愈发强烈，传统防腐剂引发越来越多的安全和健康担忧，乳酸链球菌素等生物防腐剂受到越来越多的重视和关注。作为国际公认的安全无毒的天然防腐剂，nisin高效合成一直是领域内热点之一；此外由于其良好的生物安全性，关于其应用价值的研究早已超出食品防腐领域。
5.正是由于食品行业、医疗行业等对nisin的需求持续增长，但目前缺乏具有高产nisin性能的优异菌株的报道。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株及其衍生产品和应用，不仅具有较理想的遗传稳定性，而且还具有较高的生产 nisin的能力。
7.本发明提供了一株乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株，所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株的保藏编号为gdmcc no：62395。
8.本发明提供了一种生产nisin的菌剂，活性成分包括所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株。
9.本发明提供了所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株或所述菌剂在生产 nisin中的应用。
10.优选的，所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株对所述nisin的抗性为 15000iu/ml。
11.优选的，所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株生产的nisin的效价为 5066.58iu/ml
以上。
12.本发明提供了一种基于所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株生产nisin的方法，包括以下步骤：
13.将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株的菌液接种至发酵培养基中发酵培养，收集发酵液分离nisin。
14.优选的，所述发酵培养基为cm1液体培养基。
15.优选的，所述菌液的接种量为8％～15％。
16.优选的，所述发酵培养的温度为28～32℃；
17.优选的于，所述发酵培养的时间为20～40h。
18.本发明提供的乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株，保藏编号为gdmcc no： 62395。l.lactisa32菌株是在原始菌株l.lactis lxl的基础上经过复合诱变获得。试验证明，l.lactis a32菌株具有高产nisin的能力，nisin效价为5066.58 iu/ml以上，与原始菌株l.lactis lxl的nisin效价相比，提高了3～4倍；同时乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株的生长曲线较原始菌株l.lactis lxl稍有延迟，在12h到达平稳期，最大生物量一致。
附图说明
19.图1为nisin效价标准曲线；
20.图2为a32与lxl的生长曲线(左图)和nisin效价(右图)结果；
21.图3为比较基因组学分析a32与lxl菌株的结果。
22.生物材料保藏存活信息
23.乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)a32菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，单位简称gdmcc，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏时间2022年04月18 日，保藏编号为gdmcc no：62395，菌株编号为a32菌株。
具体实施方式
24.本发明提供了一株乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株，所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株的保藏编号为gdmcc no：62395。
25.在本发明中，将l.lactis lxl作为原始菌株经过常压室温等离子体(artp) 和紫外复合诱变得到两株高产菌株a32、a225，产量较原始菌株提高了2 倍以上。通过遗传稳定性实验，a225菌株遗传不稳定，培养过程中出现了明显回复突变的突变株；而a32菌株未见明显回复突变，生产nisin的能力十分稳定，将菌株a32进行生物保藏，用于后续生产。
26.在本发明中，将乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株和原始菌株lxl进行基因组比对分析，相比于l.lactis lxl菌株，a32菌株中107个基因发生了突变，包括39个单碱基突变、34个插入突变和34个缺失突变。根据注释的结果一些发生突变的基因具有明确的功能，一些突变基因与能量代谢有关，如rexb、ftsh、gntp、yfmr等；一些突变基因与离子转运相关，如yfmr、rbcr、zitr、 adca、copb等；一些突变基因与dna复制转录和翻译有关，如dnag、rpsi、 rex、arlr等；一些突变基因与氨基酸转运和代谢有关，如patm、tcyc、tcyj、 cyss、brnq等，但是大多数突变基因的功能未知。
27.在本发明中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株的扩大培养方法，优选包括以下步骤：
28.将保存的乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株经过划线培养和种子培养，得到种子液；
29.将所述种子液接种至cm1液体培养基中，培养12～14h，收获乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株。
30.在本发明中，所述划线培养和种子培养的培养基优选为gm17培养基。所述划线培养和种子培养的温度优选为28～32℃，更优选为30℃。所述划线培养和种子培养的时间优选为10～12h。所述种子培养优选为振荡培养。所述振荡培养的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm。
31.本发明提供了一种生产nisin的菌剂，活性成分包括所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株。
32.在本发明中，所述菌剂优选还包括辅料。本发明对所述辅料的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌剂的辅料种类即可。本发明对所述菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌剂的制备方法即可。
33.本发明提供了所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株或所述菌剂在生产 nisin中的应用。
34.在本发明中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株对nisin的抗性优选为 15000iu/ml。所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株生产的nisin的效价优选为 5066.58iu/ml以上。
35.本发明提供了一种基于所述乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株生产nisin的方法，包括以下步骤：
36.将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株的菌液接种至发酵培养基中发酵培养，收集发酵液分离nisin。
37.在本发明中，所述发酵培养基优选为cm1液体培养基。在本发明实施例中，所述cm1液体培养基优选包括以下含量组分：蔗糖10g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、kh2po
4 10g/l、nacl 2g/l、mgso
4 0.2g/l，ph 6.8。
38.在本发明中，所述菌液的接种量优选为8％～15％，更优选为10％～12％。所述发酵培养的温度优选为28～32℃更优选为30℃。所述发酵培养的时间优选为20～40h，更优选为28～35h，最优选为30h。
39.在本发明中，发酵液中最大菌体生物量与原始菌株lxl一致，而测定上述获得的发酵液的nisin效价，结果表明，随着发酵时间的延长，nisin效价逐渐升高，在28h左右达到最高，之后随着发酵时间的延长，逐渐降低，且远远高于原始菌株lxl的nisin效价。这表明a32在生长期累积的nisin方面较原始菌株lxl有明显的优势。
40.下面结合实施例对本发明提供的一株乳酸乳球菌乳酸亚种a32菌株及其衍生产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
41.实施例1
42.诱变筛选试验
43.以l.lactis lxl作为出发菌株，分别经常压室温等离子体(artp)和紫外复合诱变，筛选得到两株菌株，将其命名为l.lactis a32和l.lactis a225。将a32、 a225菌株以及l.lactis lxl分别经过种子培养后接种至cm1液体培养基(蔗糖10g/l、蛋白胨10g/l、酵母
膏10g/l、kh2po410g/l、nacl2g/l、mgso40.2g/l，ph6.8，121℃灭菌20min)中在30℃下培养48h，得到发酵液测定nisin效价。
44.测定发酵液中nisin效价的方法，称取nisin标准品500mg，溶解于100ml，浓度为0.02mol/l的稀hcl溶液中，配制成浓度为5000iu/ml的nisin母液；再将nisin母液分别稀释成50、100、200、400、800、1000、2000、3000、4000iu/ml；将系列稀释液各200μl加入小孔中，37℃培养18h，此时，加入样品的小孔周围会出现明显的抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈直径；以抑菌圈直径为横坐标，以nisin效价的lg值为纵坐标，绘制nisin效价标准曲线(见图1)。
45.结果见表1。
46.表1两株突变株和原始菌株的产nisin效价
47.菌株nisin效价(iu/ml)原始菌株lxl1603.06a235066.58a2255385.14
48.由上述结果可知，两株突变株较原始菌株在nisin效价方面已经有显著提高了，提高了2～3倍。
49.将诱变筛选得到的高产菌株在固体gm17平板上划线，30℃，培养24h，作为f1代；从f1代平板挑取一环在另一固体gm17平板上划线，30℃，培养24h，作为f2代，一直到f20代。每隔3代，在平板上挑取菌落活化后，进行发酵培养，30℃，200rpm培养后，离心取上清测定nisin效价。
50.表2遗传稳定试验结果
[0051][0052]
通过遗传稳定性实验结果可知，a225菌株遗传不稳定，出现了明显回复突变的突变株；而a32菌株未见明显回复突变，生产nisin的能力稳定的a32菌株，置于-80℃冰箱中保存。
[0053]
实施例2
[0054]
a32菌株的抑菌圈试验
[0055]
(1)划线培养：从-80℃超低温冰箱取出保存菌株l.lactisa32菌株菌种的甘油管。在超净工作台中，用酒精灯火焰适当灼烧接种环，冷却后沾取甘油管中的菌液，在gm17固体平板上进行三区划线，置于30℃恒温培养箱倒置培养24h；
[0056]
(2)种子培养：从划线的gm17固体平板上挑取单菌落接种至gm17液体培养基(250ml三角瓶，装液量50ml)中，置于30℃恒温摇床200rpm培养12h，作为种子液；
[0057]
(3)发酵培养：将培养好的种子液，按10％(v/v)接种量接至盛有50mlcm1液体培养基的250ml三角瓶中，放入30℃恒温摇床中，200rpm，培养24h，得到菌株a32发酵液。
[0058]
按照上述方法培养原始菌株l.lactis lxl发酵液。分别从菌株a32发酵液和原始菌株l.lactis lxl发酵液取上清液做抑菌圈实验得出其效价。
[0059]
抑菌圈实验具体方法如下：首先在平板中倒入一层琼脂培养基，待冷却凝固，作为第一层培养基，并等距离放入牛津杯；然后向冷却至50℃左右的检测菌培养基s1中加入0.2％(v/v)活化好的检测菌(原始菌株l.lactis lxl或 a32菌株)，倒在第一层培养基上，作为第二层培养基，待冷却凝固，将牛津杯取出，就形成了均匀的小孔；将200μl待测样品加入小孔中，37℃培养至小孔周围出现明显的抑菌圈，测量抑菌圈直径。
[0060]
结果见表2’。
[0061]
表2’原始菌株l.lactis lxl和a32菌株抑菌圈试验
[0062][0063]
实施例3
[0064]
原始菌株l.lactis lxl和a32菌株对nisin的抗性研究
[0065]
首先设计nisin浓度梯度，然后按照浓度梯度称取一定量的nisin，溶于无菌的0.02mol/l稀盐酸中，摇匀后，加入60℃左右的固体gm17培养基中，摇匀，倒平板，待凝固，作为高浓度nisin梯度平板。将活化好的lxl或a32菌液均匀涂布于高浓度nisin梯度平板上，放置于30℃恒温培养箱中，倒置培养，观察平板上菌落的生长情况。
[0066]
结果见表3。
[0067]
表3原始菌株l.lactis lxl和a32菌株的nisin的抗性结果
[0068][0069]
a32菌株相对于原始菌株a32对nisin的抗性有明显提高，这也保证了 a32菌株具有较高的nisin产量。
[0070]
实施例4
[0071]
诱变菌株l.lactis a32与出发菌株lxl发酵对比试验
[0072]
按照实施例2的方法，将l.lactis a32与原始菌株lxl活化好后分别接种于cm1中进行48h发酵培养。每隔3h取一次样，于紫外分光光度计600nm 处测定吸光度，用od
600
表示；并利用抑菌圈实验测定发酵液中nisin效价。
[0073]
结果如图2所示。
[0074]
从图2左图可以看出，a32较原始菌株lxl的生长曲线有延迟，原始菌株lxl在9h之后达到平稳期，而a32在12h到达平稳期，其od
600
的峰值为大致相同。从上述结果可知，a32在生长期累积的nisin较lxl多(见图2 右图)。
[0075]
实施例4
[0076]
l.lactis a32和lxl比较基因组分析
[0077]
对高产nisin突变株l.lactis a32和原始株l.lactis lxl进行了全基因组比较，具体委托广州基迪奥生物科技有限公司公司完成。
[0078]
测序结果如图3所示。与l.lactis lxl基因组相比，a32基因组中有107 个基因发生了突变(e值《0.0001)，包括39个单碱基突变、34个插入突变和34个缺失突变，如表3所示。突变的基因与ncbi数据库中的参考基因组序列比对，进行cog功能注释，一些有碱基突变的基因具有明确的功能(如表4)，一些突变基因与能量代谢有关，如rexb、ftsh、gntp、yfmr等；一些突变基因与离子转运相关，如yfmr、rbcr、zitr、adca、copb等；一些突变基因与dna复制转录和翻译有关，如dnag、rpsi、rex、arlr等；一些突变基因与氨基酸转运和代谢有关，如patm、tcyc、tcyj、cyss、brnq等，但是大多数突变基因的功能未知。
[0079]
表4部分突变基因列表
[0080]
[0081][0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。