一种多能干细胞诱导产生3D类脑体的方法及试剂盒

一种多能干细胞诱导产生3d类脑体的方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及干细胞生物学领域中，一种多能干细胞诱导产生3d类脑体的方法及试剂盒。


背景技术：

2.人多潜能干细胞(hpsc)包括人胚胎干细胞(hesc)和诱导性多潜能干细胞(hipsc)，理论上具有分化成为人类所有细胞类型的能力。基于hpsc的基因打靶技术和反向遗传学的方式向hpsc引入疾病特异的突变，将携带人类疾病遗传基因的hpsc分化为特定的细胞类型，在理论上可以在体外模拟人类疾病的发生，研究人类疾病发生的机理，并建立体外筛选平台寻找治疗性药物。干细胞技术的发展将为人类疾病的机制研究和再生医学治疗带来革命性的突破。
3.在hpsc分化中，2d组织培养系统的生理相关性受到环境刚度、分泌因子在细胞外空间的有限运动以及空间受限的细胞-细胞相互作用的限制。2d培养和体内环境之间的差异可能是在贴壁培养中生长的细胞中观察到的异常特征的原因，这些异常可能导致2d培养和3d组织中进行的药物筛选试验结果不同。而类脑体是体外维持的3d培养物(也可称为3d类脑体)，可直接从hpsc分化而来。由于细胞成分更为多样，缺乏与人工基质的细胞相互作用，以及在发育中的大脑中看到的复杂3d结构的无定向形成，类似神经组织的类脑体有可能创造更真实的细胞环境，用于模拟神经系统的细胞生物学。此外，类脑体可以在体外长时间培养，从而可以研究延长的人类皮质生成。并且，不同大脑区域的细胞类型和其他组织类器官也可以组合成组合体，以研究不同起源的细胞类型之间的相互作用。
4.多能干细胞在体外分化体系中通过以下程序分化形成3d类脑体：拟胚体、神经干细胞、皮层神经元、星形胶质细胞。虽然3d类脑体分化方案发展迅速，但是分化细胞类型较少，分化结果存在异质性，难以控制，同时花费时间也较长，甚至可能超过200天。
5.因此，需要提供一种简单且便利的方法来分化并获得3d类脑体。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题为如何通过简单且便利的方法诱导产生多种细胞类型的3d类脑体。
7.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备3d类脑体的方法，所述方法包括：
8.1)将多能干细胞在培养基i中进行培养，得到培养基i培养后的组织(即具有明显边缘的拟胚体(embryoid body，eb))；
9.所述培养基i由向dmem/f12培养基中添加knockout
tm
serum replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、y-27632、dorsomorphin和sb431542得到；其中，knockout
tm
serum replacement在所述培养基i中的体积百分含量为20％；非必需氨基酸在所述培养基i中的含量为1mm；2-巯基乙醇在所述培养基i中的含量为0.1mm；y-27632在所述培养基i中的含量
为20μm；dorsomorphin在所述培养基i中的含量为5μm，sb431542在所述培养基i中的含量为5μm；
10.2)将所述培养基i培养后的组织在培养基ii中进行培养，得到培养基ii培养后的组织(即边缘光滑的拟胚体(embryoid body，eb))；
11.所述培养基ii由向dmem/f12培养基中添加knockout
tm
serum replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、y-27632、dorsomorphin和sb431542得到；其中，knockout
tm
serum replacement在所述培养基ii中的体积百分含量为20％；非必需氨基酸在所述培养基ii中的含量为1mm；2-巯基乙醇在所述培养基ii中的含量为0.1mm；y-27632在所述培养基i中的含量为5μm；dorsomorphin在所述培养基ii中的含量为5μm；sb431542在所述培养基ii中的含量为5μm；
12.3)将所述培养基ii培养后的组织在培养基iii中进行培养，得到培养基iii培养后的组织(即未成熟类脑体)；
13.所述培养基iii由向neurobasal a培养基中添加glutamax添加剂、b27添加剂without vitamin a、表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2得到；其中，glutamax添加剂在所述培养基iii中的体积百分含量为1％，b27添加剂without vitamin a在所述培养基iii中的体积百分含量为2％，表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2在所述培养基iii中的含量均为20ng/ml；
14.4)将所述培养基iii培养后的组织在培养基iv中进行培养，得到培养基iv培养后的组织(即类脑体)；
15.所述培养基iv由向neurobasal a培养基中添加glutamax添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到；其中，glutamax添加剂在所述培养基iv中的体积百分含量为1％，脑源性神经营养因子在所述培养基iv中的含量为20ng/ml；神经营养因子3在所述培养基iv中的含量为20ng/ml；胶质细胞源性神经营养因子在所述培养基iv中的含量为20ng/ml；
16.5)将所述培养基iv培养后的组织在培养基v中进行培养，得到3d类脑体；
17.所述培养基v由向neurobasal a培养基中添加glutamax添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到；其中，glutamax添加剂在所述培养基v中的体积百分含量为1％，脑源性神经营养因子在所述培养基v中的含量为10ng/ml；神经营养因子3在所述培养基v中的含量为10ng/ml；胶质细胞源性神经营养因子在所述培养基v中的含量为10ng/ml。
18.其中，所述3d类脑体可为含有pax6阳性的神经祖细胞，sox1阳性及sox2阳性的放射状胶质样细胞，tuj1阳性的未成熟神经元细胞，tbr1阳性和ctip2阳性皮层神经元和/或ki67和ph3s10阳性的增殖细胞的类脑体。
19.上述方法步骤1)中，在所述培养基i培养前，还可包括对所述干细胞进行消化的步骤。
20.所述消化可采用蛋白水解酶和胶原酶进行。所述消化具体可利用accutase细胞消化液进行。
21.上述方法步骤1)-5)中培养均可在37℃，5％co2的条件下进行。
22.步骤1)-5)中培养均在37℃，5％co2培养箱的条件下进行。
23.步骤3)中培养可在摇床中进行。
24.上述方法中，步骤1)中培养的时间可为2天。
25.步骤2)中培养的时间可为4天。
26.步骤3)中培养的时间可为19天。
27.步骤4)中培养的时间可为18天。
28.步骤5)中培养的时间具体可根据组织生长情况确定，以成功获得3d类脑体为准。
29.上述方法中，步骤1)中培养前还可将细胞进行离心。
30.步骤1)-5)中培养均可在低吸附细胞培养板中进行。
31.步骤2)-3)中还可包括更换培养基的步骤。
32.上述方法中，所述多能干细胞可为诱导性多能干细胞(hipsc)、成体(adult)干细胞、体性(somatic)干细胞、癌症干细胞或具有分化能力的任何其他多能干细胞。
33.所述诱导性多能干细胞可为人诱导性多能干细胞。在本发明的一个实施例中，所述人诱导性多能干细胞为北京赛贝生物技术有限公司产品，货号为#ca4027106。
34.本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述培养基iii、所述培养基iv和所述培养基v。
35.上述试剂盒还可包括所述培养基i与所述培养基ii。
36.所述试剂盒在制备3d类脑体中的应用，也属于本发明的保护范围。
37.所述试剂盒在制备诱导产生3d类脑体产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
38.本发明中，dmem/f12培养基可为life technologies产品,货号为11330032。
39.neurobasal a培养基可为life technologies产品,货号为10888。
40.knockout
tm
serum replacement可为invitrogen产品,货号为10828-028。
41.非必需氨基酸可为gibco产品，货号为11140050。
42.y-27632可为selleck产品,货号为#s1049。
43.dorsomorphin可为sigmaaldrich产品,货号为p5499。
44.sb431542可为selleck产品，货号为s1067。
45.glutamax添加剂可为gibco-brl产品,货号为cat.no.35050。
46.b27添加剂without vitamin a可为gibco-brl产品,货号为cat.no.12587-010。
47.本发明的制备3d类脑体的方法可以成功将多能干细胞诱导分化为能产生大量具有特殊形态、表达特异性标志物的成熟3d类脑体，不需要共培养技术及基因重组技术，方法简单易操作，且分化过程中不需要基质胶的包裹，能够有效减少对类脑体的操作，有助于分化的均一性和对类脑体的保护，同时能定向分化为pax6阳性的神经祖细胞，sox2及sox1阳性的放射状胶质样细胞，tuj1阳性未成熟神经元，tbr1阳性和ctip2阳性皮层神经元等多神经细胞类型的类脑体，使得研究人类大脑皮层发育、发掘类脑发育过程关键节点及新的治疗靶点成为可能，也为构建具有特定疾病防治功能的类脑体提供了基础。
48.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
49.图1为人多能干细胞诱导产生3d类脑体的流程图。
50.图2为多能干细胞诱导产生3d类脑体第18天免疫荧光染色结果。
51.图3为多能干细胞诱导产生3d类脑体第30天免疫荧光染色结果。
52.图4为多能干细胞诱导产生3d类脑体第60天免疫荧光染色结果。
53.图5为利用培养基i
′
培养的结果。
具体实施方式
54.以下实施例中的试验，均设置三次重复实验。
55.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
56.下述实施例中，加湿培养箱的条件为：湿度95％，37℃，5％co 2
。
57.下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
58.1、下述实施例中所用的试剂：
59.(1)人多潜能干细胞培养基(pgm1培养基)(北京赛贝生物技术有限公司,#ca1007500)。
60.(2)b27添加剂without vitamin a(gibco-brl,cat.no.12587-010)。
61.(3)accutase细胞消化液(bd,#561527)。
62.(4)脑源性神经营养因子(bdnf)(peprotech,cat.no.450-02)。
63.(5)glutamax添加剂(gibco-brl,cat.no.35050)。
64.(6)表皮细胞生长因子(peprotech,af-100-15)。
65.(7)基质胶(matrigel,corning,#356234)。
66.(8)人成纤维细胞生长因子-2(human fgf-basic,peprotech,#af-100-18b)。
67.(9)neurobasal a培养基(life technologies,10888)。
68.(10)dorsomorphin(sigmaaldrich,p5499)。
69.(11)sb431542(selleck，s1067)。
70.(12)胶质细胞源性神经营养因子(peprotech，450-10)。
71.(13)神经营养因子3(peprotech,45003)。
72.(14)dmem/f12培养基(life technologies,11330)。
73.(15)y-27632(selleck,#s1049)。
74.(16)4％多聚甲醛溶液(北京润泽康生物科技有限公司,#b1057-100)。
75.(17)牛血清白蛋白(bsa,easybio,#be6254)。
76.(18)tritonx-100(sigma-aldrich,#hpa014518)。
77.(19)叠氮化钠(sigma-aldrich,#s2002)。
78.(20)兔抗ki67抗体(themofisher,#rm-9106-s)。
79.(21)鼠抗tuj1抗体(801202,#801202)。
80.(22)兔抗pax6抗体(biolegend,#901301)。
81.(23)兔抗ph3s10抗体(abcam,#ab41548)。
82.(24)兔抗tbr1抗体(abcam,ab31940)。
83.(25)大鼠抗ctip2抗体(abcam,#ab18465)。
84.(26)兔抗sox2抗体(cell signaling technology,3728s)。
85.(27)羊抗sox1抗体(rd system,af3369)。
86.(28)alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗(jackson,#711-545-152)。
87.(29)alexa fluor 488标记驴抗鼠igg(h l)二抗(jackson,#711-545-150)。
88.(30)alexa fluor 594标记驴抗兔igg(h l)二抗(jackson,#711-585-152)。
89.(31)alexa fluor 568标记驴抗羊igg(h l)二抗(invitrogen,a11057)。
90.(32)alexa fluor 568标记羊抗大鼠igg(h l)二抗(life,cat.no.a11077)。
91.(33)人trustainfcx
tm
封闭剂(biolegend,#422301)。
92.(34)人诱导性多能干细胞(北京赛贝生物技术有限公司,#ca4027106)。
93.(35)dpbs(杜氏磷酸盐缓冲液)(gibco,c14190500cp)。
94.(36)oct(sakura,4583)。
95.(37)knockout
tm
serum replacement(invitrogen，10828-028)。
96.(38)非必需氨基酸(gibco，11140050)。
97.2、下述实施例中所用的培养基：
98.培养基i：培养基i由向dmem/f12培养基中添加knockout
tm
serum replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、y-27632、dorsomorphin和sb431542得到；其中，knockout
tm
serum replacement在培养基i中的体积百分含量为20％；非必需氨基酸在培养基i中的含量为1mm；2-巯基乙醇在培养基i中的含量为0.1mm；y-27632在培养基i中的含量为20μm；dorsomorphin在培养基i中的含量为5μm；sb431542在培养基i中的含量为5μm。
99.培养基ii：培养基ii由向dmem/f12培养基中添加knockout
tm
serum replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、y-27632、dorsomorphin和sb431542得到；其中，knockout
tm
serum replacement在培养基ii中的体积百分含量为20％；非必需氨基酸在培养基ii中的含量为1mm；2-巯基乙醇在培养基ii中的含量为0.1mm；y-27632在培养基ii中的含量为5μm；dorsomorphin在培养基ii中的含量为5μm；sb431542在培养基ii中的含量为5μm。
100.培养基iii：培养基iii由向neurobasal a培养基中添加glutamax添加剂、b27添加剂without vitamin a、表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2得到；其中，glutamax添加剂在培养基iii中的体积百分含量为1％；b27添加剂without vitamin a在培养基iii中的体积百分含量为2％；表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2在培养基iii中的含量均为20ng/ml。
101.培养基iv：培养基iv由向neurobasal a培养基中添加glutamax添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到；其中，glutamax添加剂在培养基iv中的体积百分含量为1％；脑源性神经营养因子在培养基iv中的含量为20ng/ml；神经营养因子3在培养基iv中的含量为20ng/ml；胶质细胞源性神经营养因子在培养基iv中的含量为20ng/ml。
102.培养基v：培养基v由向neurobasal a培养基中添加glutamax添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到；其中，glutamax添加剂在培养基v中的体积百分含量为1％；脑源性神经营养因子在培养基v中的含量为10ng/ml；神经营养因子3在培养基v中的含量为10ng/ml；胶质细胞源性神经营养因子在培养基v中的含量
为10ng/ml。
103.封闭液：封闭液由向dpbs中添加bsa、triton x-100和叠氮化钠得到；其中，bsa在封闭液中的浓度为2g/100ml，triton x-100在封闭液中的体积百分含量为0.3％，叠氮化钠在封闭液中的浓度为0.3g/100ml。
104.实施例1、多能干细胞诱导产生3d类脑体的方法
105.一、人诱导性多能干细胞诱导至3d类脑体
106.流程图如图1所示，步骤如下：
107.1、将人诱导性多能干细胞培养在matrigel包被过的六孔板上，采用人多潜能干细胞维持培养基(pgm1培养基)，37℃，5％co2，湿度为95％的加湿培养箱中培养至细胞贴壁生长至50％-70％(培养4-5天)，期间每天更换一次培养基，每次2ml。
108.2、吸出培养基，dpbs清洗2遍以去除死细胞，每孔加入0.5mlaccutase细胞消化液，37℃，5％co2，湿度为95％的加湿培养箱静置3分钟，然后加入1mlpgm1培养基终止消化，200g离心5分钟收集细胞。
109.3、吸出上层液并用培养基i重悬，按9000细胞/孔，将细胞接种在低吸附96孔板中，立即300g，离心3分钟，37℃，5％co2，湿度为95％的加湿培养箱中培养2天。将利用培养基i开始培养当天记为培养第0天，共培养2天。
110.4、吸出上层液并缓慢加入培养基ii，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养4天得到400-500μm拟胚体，每天更换培养基ii，150μl/孔。利用培养基ii开始培养当天为培养第2天，共培养4天。
111.5、采用200μl低吸附宽孔移液枪头吸出拟胚体，转移至低吸附24孔板中，弃培养基后添加培养基iii，在37℃，5％co2的加湿培养箱的摇床中培养18天，每两天更换培养基iii，400μl/孔。利用培养基iii开始培养当天为培养第6天，共培养19天。
112.6、吸出上层液后添加培养基iv，置于37℃，5％co2的加湿培养箱中培养18天，每两天更换培养基iv，500μl/孔。利用培养基iv开始培养当天为培养第25天，共培养18天。
113.7、吸出上层液后添加培养基v，置于37℃，5％co2的加湿培养箱中培养，每隔4天换液，500μl/孔，利用培养基v开始培养当天为培养第43天，培养结束即获得3d类脑体。
114.二、多能干细胞诱导产生3d类脑体第18及30天免疫荧光染色
115.取步骤一中培养第18或30天的类脑体，弃培养基，加入4％多聚甲醛溶液固定4-6小时，弃4％多聚甲醛溶液，加入30g/100ml蔗糖水溶液脱水2天后，使用oct将类脑体冷冻包埋后，采用冰冻切片机(莱卡，cm950)将类脑体切片20-40μm。
116.对切片后的类脑体进行免疫荧光染色：用500μl dpbs漂洗三次，每次5分钟，吸弃上清。加入500μl封闭液，室温封闭1小时。吸弃封闭液，加入200μl新的封闭液，按1：1000加入羊抗sox1抗体、兔抗sox2抗体、兔抗ki67抗体、兔抗ph3s10抗体、鼠抗tuj1抗体和兔抗pax6抗体中的一种，4℃孵育12小时。吸弃上清，用500μl dpbs漂洗三次，每次5分钟。吸弃上清，加入200μl新的封闭液，按1：2000加入dapi，1：500加入抗体对应的二抗，上述一抗分别对应如下二抗：alexa fluor 568标记驴抗羊igg(h l)二抗，alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗，alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗，alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗，alexa fluor 488驴抗鼠igg(h l)二抗二抗，alexa fluor 594标记驴抗兔igg(h l)二抗，37℃避光孵育1.5小时后，吸弃上清，用500μldpbs避光漂洗三次，每次5分
钟。免疫荧光染色后的类脑体，用抗淬灭封片剂(即人trustainfcx
tm
封闭剂)封片后，利用荧光显微镜观察染色情况。
117.步骤一中第5步培养第18天的类脑体(记为d18类脑)免疫荧光染色结果如图2所示：d18类脑具有sox1阳性和sox2阳性的放射状胶质样细胞，pax6阳性的神经祖细胞及tuj1阳性的未成熟神经元细胞，说明此时的类脑体具备神经干/祖细胞及神经元的存在。
118.步骤一中第6步培养第30天的类脑体(记为d30类脑)免疫荧光染色结果如图3所示：d30类脑具有ki67和ph3s10阳性的增殖细胞，pax6阳性的神经祖细胞及tuj1阳性的未成熟神经元细胞，说明此时的类脑体具备神经干/祖细胞及神经元多种细胞类型。
119.三、多能干细胞诱导产生3d类脑体第60天免疫荧光染色
120.取步骤一中第7步培养第60天的类脑体，弃培养基，加入4％多聚甲醛溶液固定4-6小时，弃4％多聚甲醛溶液，加入30％蔗糖溶液脱水2天后，使用oct将类脑体冷冻包埋后，采用冰冻切片机(莱卡，cm950)将类脑体切片20-40μm。
121.对切片后的类脑体进行免疫荧光染色：用500μl dpbs漂洗三次，每次5分钟，吸弃上清。加入500μl封闭液，室温封闭1小时。吸弃封闭液，加入200μl新的封闭液，按1：1000加入兔抗ki67抗体、兔抗ph3s10抗体、鼠抗tuj1抗体、兔抗pax6抗体、兔抗tbr1抗体和大鼠抗ctip2抗体中的一种，4℃孵育12小时。吸弃上清，用500μl dpbs漂洗三次，每次5分钟。吸弃上清，加入200μl新的封闭液，按1：2000加入dapi，1：500加入抗体对应的二抗，上述一抗分别对应如下二抗：alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗、alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗、alexa fluor 488驴抗鼠igg(h l)二抗、alexa fluor 594标记驴抗兔igg(h l)二抗、alexa fluor 488标记驴抗兔igg(h l)二抗、alexa fluor 568标记羊抗大鼠igg(h l)二抗，37℃避光孵育1.5小时后，吸弃上清，用500μl dpbs避光漂洗三次，每次5分钟。免疫荧光染色后的类脑体，用抗淬灭封片剂(即人trustainfcx
tm
封闭剂)封片后，利用荧光显微镜观察染色情况。
122.步骤一中第7步培养第60天的类脑体(记为d60类脑)免疫荧光染色结果如图4所示：d60类脑具有ki67和ph3s10阳性的增殖细胞，pax6阳性的神经祖细胞及tuj1阳性的未成熟神经元细胞，tbr1阳性及ctip2阳性的皮层深层神经元(即大脑皮层5-6层的神经元)，说明此时的类脑体具备神经干/祖细胞及皮层神经元多种细胞类型。
123.对比例1、
124.按照实施例1的方法，将培养基i替换为培养基i
′
，其他步骤均不变，进行培养，结果显示，利用该方法无法形成拟胚体。
125.培养基i
′
和培养基i的区别在于，培养基i
′
中dorsomorphin和sb431542的含量均为10μm，其他成分与浓度均与培养基i相同。
126.结果(图5)显示，利用培养基i
′
不能成功获得拟胚体。
127.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。