杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因LhWOX4及其应用

杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因lhwox4及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因lhwox4及其应用。


背景技术：

2.鹅掌楸属(liriodendron)为木兰科(magnoliaceae)的古老孑遗植物，原有23个种，经历数次冰川后，于第四纪冰川大部分种已灭绝，现全世界仅存两种野生种，一种为分布于亚洲的鹅掌楸(liriodendron chinense(hemsl.)sargent.)，主要位于我国中部和南部山区，呈星散分布；另一种为分布于北美洲的北美鹅掌楸(liriodendron tulipifera linn.)，位于美国中西部到加拿大东南部。鹅掌楸和北美鹅掌楸均是优良的珍贵阔叶用材树种，树干圆满通直，木材结构细致，质轻软强度弱，易于干燥不变形，是建筑、家具、纸浆的工业的优质原材料。其花朵鲜艳、叶形奇特，是造林树种的优选树种之一。20世纪30年代我国开始少量引进北美鹅掌楸，90年代以后相对较系统的进行了资源引进，为后来开展杂交育种工作提供了可能。
3.在二十世纪六十年代，我国著名林木育种学家叶培忠教授将鹅掌楸和北美鹅掌楸杂交，培育出性状优于亲本的新品种杂交鹅掌楸(liriodendron
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sinoamericanum p.c.yieh ex c.b.shang&zhang r.wang)。杂交鹅掌楸相对于鹅掌楸和北美鹅掌楸，具有明显的生长优势，其生长量和适应能力显著优于其亲本树种。通过对杂交鹅掌楸引种栽培试验表明：杂交鹅掌楸表现出极强的杂种优势，其高、直径及单株立木材积均显著高于对照种。杂交鹅掌楸具有生长快，树干通直，树形美观叶形奇特，花大美丽，呈浅黄色金杯形，病虫害少，适应性强等特点，采用嫁接繁殖，成活率可达85％～90％，是优良的绿化造林树种。鹅掌揪为雌雄同株同花植物，由于在花瓣展开之前雌蕊已经成熟，而此时雄蕊尚未成熟，雌雄花期不遇，雌雄配子败育现象普遍存在，致使种子发芽率较低，严重影响了鹅掌楸的繁殖，已被列为国家二级重点珍稀濒危保护植物。目前，杂交鹅掌楸已成为我国南方地区重要的用材树种。
4.已有研究表明，一些转录因子(transcription factor，tf)在调节sam和ram的维持中起着至关重要的作用，例如tf编码基因的单一突变，如sam中的wuschel(wus)或shoot meristemless(stm)和ram中的short-root(shr)或scarecrow(scr)可导致顶端生长的终止。已有研究发现了形成层分生组织活动需要的几种转录因子，包括wus相关同源基因wuschel-related homeobox4(wox4)、wuschel-related homeobox 14(wox14)、aintegumenta(ant)、ethylene response factor 018(erf018)和ethylene response factor 109(erf109)，以及生长素反应因子(auxinresponsefactors，arf)。wox基因家族的成员几乎在植物的各个器官中都有表达，其主要表达部位为各器官分裂旺盛的细胞群中。该家族基因在植物关键发育时期如胚的形成、干细胞稳定性和器官的形成的过程中发挥重要调控作用。这些功能的发挥与他们能够促进细胞分裂或阻止未成熟细胞的提前分化密不可分。
5.分生组织是植物的干细胞组织，对植物的生长和发育至关重要。维管形成层是一种次生分生组织，起源于初生分生组织、茎顶端分生组织(sam)和根顶端分生组织(ram)，对于木材生物量的生产至关重要。该发育过程受到很多遗传和其他内源因子的调控，其中转录因子发挥着极其关键的调控作用。虽然有一些转录因子被证明可以调节形成层活性，但相应的功能缺失突变体的表型并不明显，这限制了我们对维管组织相关转录调控机制的理解，所以对于形成层活性的转录调控机制还有待深入研究。
6.wox4转录因子在植物的生长发育过程中具有重要的调节作用，主要参与茎、根、叶、顶端分生组织的发育，在胚胎发育和相应干旱胁迫方面也具有一定作用。在拟南芥中，通过组织切片和共聚焦成像，观察到atwox4在花序、叶、茎和根中的表达模式。在拟南芥中存在tdif/cle41/cle44-tdr/pxy-wox4这一调控网络维持形成层的活性。wox4通过介导配体-受体信号传导通路来调控形成层细胞活性。在wox4突变体中，形成层活性受到抑制。毛果杨中，ptrwox4基因是调控维管形成层发育的关键基因，同时参与调控顶端分生组织发育。在毛竹中，phewox4c在毛竹茎顶端组织(包括笋顶端组织和鞭顶端组织)中活跃表达，可能参与了茎顶端分生组织的发育。在根的发育过程中，wox4也起着重要的作用。蓝莓中，vcwox4b通过降低iaa/cks及iaa/aba值抑制不定根形成，使根系木质部区域变大，形成层层数增多。在核桃中，jrwox4过表达导致不定根变短、增粗，不定根数增加。


技术实现要素：

7.针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因lhwox4。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因lhwox4的新用途。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
9.杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因lhwox4基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.所述的杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因wox4基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.所述的杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因wox4基因在促使植物顶端分生组织分裂中的应用。
12.所述的应用，在植物中过表达杂交鹅掌楸lhwox4基因，促使转基因植物顶端分生组织分裂旺盛。
13.所述的应用，包括以下步骤：
14.1)构建杂交鹅掌楸lhwox4基因的载体；
15.2)将所构建的杂交鹅掌楸lhwox4基因的载体转化到植物细胞中；
16.3)培育转基因植物，促使植物顶端分生组织分裂旺盛。
17.步骤1)所述杂交鹅掌楸lhwox4基因的载体为lhwox4 pbi121。
18.步骤2)所述的转化是采用根癌农杆菌gv3101进行转化。
19.所述的杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因wox4基因在构建植物根系生长迟缓模型中的应用。
20.所述的杂交鹅掌楸分生组织生长关键基因wox4基因在延缓植物生长中的应用。
21.有益效果：与现有技术相比，本发明从杂交鹅掌楸中提取lhwox4基因，将其构建至过表达载体导入拟南芥中研究其功能，结果表明过表达杂交鹅掌楸lhwox4基因的拟南芥植株出现植物顶端分生组织分裂旺盛，根系生长迟缓等表型，可见该基因在鹅掌楸和其它植物生产、育种中将有广泛的用途。
附图说明：
22.图1是杂交鹅掌楸lhwox4基因全长pcr产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；图中，a、b：以cdna为模板pcr获得的lhwox4基因全长；m：2000bp marker；
23.图2是pbi121-lhwox4农杆菌单菌落pcr的1％琼脂糖凝胶电泳图；图中，a-f：转lhwox4基因农杆菌；g：ddh2o；m：2000bp marker；
24.图3是构建好的杂交鹅掌楸lhwox4过表达载体图；
25.图4是过表达lhwox4转基因拟南芥t1代阳性植株pcr检测结果图；图中，a-h：转lhwox4基因拟南芥植株dna；mock：转pbi121空载的拟南芥植株dna；ck-：野生型拟南芥植株dna；ck ：质粒dna；h2o：ddh2o；m：2000bp marker；
26.图5是过表达lhwox4转基因拟南芥t1代植株与wt和mock的对照表型图；
27.图6是过表达lhwox4转基因拟南芥t1代植株表型图。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
29.实施例1
30.以杂交鹅掌楸植株为材料，提取总rna，并反转录成cdna，设计相应引物进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，与pclone007载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒提取，通过热激法，将提取的质粒转入农杆菌菌株gv3101中，待拟南芥适龄后，通过农杆菌介导的方法转化拟南芥花序，得到转基因拟南芥，观察转基因阳性植株与野生型拟南芥在叶片、茎、花等表型上的差异并统计数据。
31.1、总rna的提取
32.以杂交鹅掌楸的茎尖为材料，按照fastpure plant total rna isolation kit试剂盒(vazyme)的操作步骤进行rna的提取，杂交鹅掌楸茎尖总rna的1％琼脂糖凝胶电泳结果条带完整清晰；用紫外分光光度法测定总rna的吸光值，结果显示rna完整性较好，纯度高，可用于反转录。
33.2、cdna的获得
34.以所提rna为模板，反转录获得cdna，所使用的是vazyme公司的iii 1st strand cdna synthesis kit( gdna wiper)。实验中rna使用量按照说明书最大量5μg，具体步骤按照试剂盒说明进行，主要包括：rna模板变性、基因组dna的去除、配制第一链cdna合成反应液、进行第一链cdna合成反应(37℃45min，85℃5sec，4℃∞)，产物可立即用于pcr反应，或在-20℃保存。
35.3、同源克隆获得目的基因
36.利用oligo7.0设计引物，进行pcr，从而获得目的基因，进行转化测序，最后进行比对分析。引物序列如下：
37.lhwox4-f：5
’‑
atgaaggtgcaccagctcactcgtggc-3’38.lhwox4-r：5
’‑
tcatctgccttccgggtgtaaagggaacag-3’39.1)pcr扩增体系：使用的是vazyme公司的max super-fidelity dna polymerase试剂，依据说明书配制pcr反应液，50ul反应体系：ddh2o 18ul，2
×
phantamaxbuffera 25ul，dntpmix(10mmeach)lul，上游引物(10μm)2ul，下游引物(10μm)2ul，cdna 1ul，phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase 1ul。
40.2)pcr反应条件：95℃3min；95℃15sec，61℃15sec，72℃30sec，35cycles；72℃5min；4℃∞。
41.将pcr产物在1％琼脂糖凝胶电泳进行检测(图1)，获得预期目的片段，使用tsingke公司的dna凝胶回收试剂盒，对目的片段进行回收纯化，步骤如下：
42.1)在吸附柱ec中，加入250ul buffer bl，12000g离心1min，活化硅胶膜。2)在365nm长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的dna条带切下，尽量切除不含dna的凝胶，得到凝胶体积越小越好，将含有目的dna条带的凝胶放入2ml离心管中。3)加入500ul的buffer gl。4)65℃空气浴6min，每2min上下颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化，溶液呈淡黄色(若胶块体积较大，适当添加buffer gl至溶液呈淡黄色)。5)将溶液转入吸附柱ec中，12000g离心1min，弃废液，将吸附柱ec放回空收集管。6)在吸附柱ec中加入700ul buffer w2，12000g离心1min，弃废液；重复一次。7)将吸附柱ec放回空收集管中，12000g离心2min。8)取出吸附柱ec，放入干净的1.5ml离心管中，20～25℃开盖静置2min，在吸附柱膜的中央部位加入40ul 65℃预热的eluent，20～25℃静置2min，12000g离心2min，可再洗脱一次提高产量。
43.将目的基因片段与克隆载体pclone007 blunt vector kit(tsingke tsv-007b)，进行连接反应。10ul反应体系为：pcr纯化产物2ul，pclone007bluntvector 1ul，10
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topomix lul，ddh2o 6ul。所有溶液直接加入管底后，用移液器吸打混匀，室温(22-30℃)反应5min即可完成反应。
44.将连接产物转入大肠杆菌菌株中trelief
tm 5α chemically competent cell(tsingke tsc01)。具体步骤为：(1)从-80℃超低温冰箱取出100u1感受态细胞，置于冰上融化，加入连接产物10ul，轻轻混匀，冰上静置5min；(2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min；(3)加入900ul不含抗生素的液体培养基，37℃摇床复苏1h；(4)取合适体积菌液直接涂布在含amp的lb固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。
45.挑取独立的菌落进行pcr验证，检测重组质粒，将得到的阳性克隆进行测序分析。结果分析，wox4基因编码区长度为726bp，包含完整的开放阅读框(orf)，序列如seq id no.1所示，所编码的蛋白序列如seq id no.2所示，包括242个氨基酸。
46.实施例2
47.1、基因功能分析
48.首先构建杂交鹅掌楸35s：lhwox4过表达载体，并将其转入农杆菌菌株，通过农杆菌介导的方法转化野生型拟南芥花序哥伦比亚col(columbia)，获得过表达lhwox4基因的阳性转基因植株，观察转基因阳性植株表型与野生型植株表型差异，研究分析杂交鹅掌楸lhwox4的功能。
49.2、载体的构建
50.本实施例所用大肠杆菌菌株为dh5α(tiangen cb101-02)；表达载体为pbi121。
51.具体过程如下：
52.1)通过pcr在lhwox4基因片段上下游分别添加xbai和saci双酶切位点，pcr体系及反应条件同基因全长扩增，所用引物分别是：
53.lhwox4 xbai-f：5
′‑
agagaacacgggggactctagaatgaaggtgcaccagc-3
′
；
54.lhwox4 saci-r：5
′‑
gatcggggaaattcgagctctcatctgccttccgggt-3
′
；
55.2)重组质粒经测序正确后用相应的内切酶进行双酶切反应。使用xbai和saci限制性内切酶进行双酶切，得到含有黏性末端的并覆盖整个orf的lhwox4基因片段。用同样的酶切反应处理空的pbi121表达载体。
56.20ul双酶切反应体系如下：回收产物1ug，10
×
mbuffer 2ul，xbai 1ul，saci 1ul，ddh2o up to20ul。
57.酶切：热失活法。pcr反应条件：37℃30min；65℃30min。
58.将双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，根据条带大小判断出lhwox4基因和pbi121表达载体已经被正确切开。
59.将目的基因片段，空表达载体pbi121的双酶切产物，使用dna凝胶回收试剂盒(tsingke ge0101)进行回收纯化，溶于40μl的ddh2o中。
60.3)检测所回收的酶切产物浓度和纯度，按连接体系加入各试剂。同源重组连接采用vazyme公司的ii one step cloning kit c112。ii重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol，最适插入片段使用量为0.06pmol(载体与插入片段摩尔比为1∶2)。
61.20ul连接反应体系为：5
×
ce ii buffer 4ul，pbi121 1ul，目的片段4ul，exnase ii 2ul，ddh2o 9ul。
62.pcr反应条件：37℃30min；4℃∞。
63.4)连接产物转化大肠杆菌dh5a感受态细胞(tiangen cb101-02)，挑取单菌落接种至lb液体培养基中，37℃震荡培养，使用全长引物进行菌液pcr，以筛选阳性克隆并测序，测序正确的用质粒小提试剂盒(tiangen dp103-03)提取质粒。构建表达载体如图3所示，包含启动子，目的基因，终止子的长度及位置。
64.3、农杆菌的转化gv3101
65.本实施例使用的农杆菌菌株为gv3101，采用液氮冻融法将构建好的lh wox4过表达载体转入农杆菌。具体过程为：1)冰浴融化农杆菌感受态细胞，每管加入1-10ul(100ng)回收纯化的重组质粒，轻轻吸打混匀，置于冰上，静置冰浴30min。2)液氮速冻1min，37℃热激1-5min，迅速置于冰上1-2min。3)加入700ul无抗生素的lb液体培养基，28℃，220rpm，慢速振荡培养2-4h。4)6000rpm离心1min，吸去部分上清。5)留取适量菌液，轻轻混匀，涂布于含有50mg/l卡那霉素的固体lb培养基上。6)28℃倒置培养30-48h，至长出单菌落。7)菌液pcr检测阳性克隆，4℃保存备用。
66.4、拟南芥转化
67.待种植的拟南芥生长至开花，维持其健康状态。将pcr检测过的阳性克隆，摇菌至od
600 0.6-0.8时，采用花序浸泡法将目的基因转入野生型拟南芥中。具体过程为：1)将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用含有5％蔗糖的1/2ms溶液悬浮；2)在浸泡前，加入浓度为0.05％的silwetl-77，晃出泡沫；3)将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15～
30sec，期间轻轻晃动；4)将浸泡过的拟南芥平放至托盘上，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；5)取下保鲜膜，正常条件下培养至种子成熟，成熟后停止浇水。
68.5、转基因植株表型观察
69.1)收获干燥的种子，将t1代种子用50mg/l卡纳霉素的1/2ms培养基进行筛选，发现阳性植株仍然正常生长，其它阴性无卡纳霉素抗性的植株已经死亡。
70.2)将筛选出的可能的转基因阳性植株移栽至营养土中，正常培养。选取转基因阳性植株叶片，提取dna作为模板进行pcr检测，确定其为阳性植株。
71.pcr检测引物如下：
72.35s seq-f：5
′‑
cttcgtcaacatggtggag-3
′
；
73.pbi121wox4-r：5
′‑
atctgttgctgtcctcttcc-3
′
；
74.检测结果如图4所示，显示阴性对照ddh2o和野生型无条带，转基因植株pcr目的条带与阳性对照质粒一致，确定为阳性植株。
75.3)过表达lhwox4基因的t1代转基因植株的表型观察。转野生型col背景下的转基因植株，与野生型col对照比较，出现植株生长缓慢，植物顶端分生组织分裂旺盛，根系生长迟缓。结果如图5，6所示。
76.4)过表达lhwox4基因的t1代转基因植株的表型统计。在生长20天时，分别取15棵野生型col(wt)植株、空载转基因植株(mock)、lhwox4过表达转基因植株(lhwox4)，计算其表面积并进行比较。测量的平均值如表1。
77.表1表面积结果
[0078] wtmocklhwox4面积平均值/mm239.8824.0212.27