一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法

1.本发明涉及猴头菇孢子粉加工技术领域，具体涉及一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法。


背景技术：

2.猴头菇又名猴头菌、花菜菌等，具有肉质洁白、柔软细嫩、清香可口，营养丰富的特点。猴头菇孢子粉是猴头菇生长成熟后释放的用于传播的种子，其和猴头菇一样含有猴头菇多糖类活性物质，研究显示猴头菇多糖具有增强免疫功能、清除自由基而起到抗衰老作用，对胃黏膜上皮的再生和修复起重要作用，能增强胃黏膜屏障机能等方面的功效，因此猴头菇多糖被广泛应用于医药、食品等领域。
3.目前，获取猴头菇多糖的方式是从猴头菇中进行提取，而猴头菇孢子粉中同样含有与猴头菇中存在的多糖活性组分，但猴头菇孢子粉未被很好地利用，造成了浪费。目前，已有一些针对猴头菇孢子粉中多糖进行提取的工艺。然而，本发明人发现，这些工艺注重的是如何将多糖从猴头菇孢子粉中提取出来，而忽略了从提取液中再次提取出多糖时的提取率，造成了多糖物质的损失。


技术实现要素：

4.针对上述的问题，本发明的目的是提供一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，其不仅能够更加高效、彻底地从猴头菇孢子粉中浸提处多糖物质，同时还提高了从浸提液中二次提取多糖物质的提取效果，降低了多糖物质的损失，提高了对猴头菇孢子粉的利用率。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案。
5.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
6.(1)将猴头菇孢子粉破壁处理后用热水超声浸提，完成后固液分离，分别收集液相、固体残渣，备用。
7.(2)将所述固体残渣用碱液再次进行超声浸提，完成后固液分离，收集液相，备用。
8.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向液相中加入乙醇和干冰颗粒后静置，使液相中多糖在中和条件下析出、沉淀，完成后分离的析出沉淀物，即得多糖粗提物。
9.(4)将所述多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液中，搅拌使多糖粗提物中的无机盐溶解到混合液中，完成后分离出沉淀物，去除其残留的混合液，即得多糖物质。
10.优选地，所述步骤(1)中，猴头菇孢子粉破壁方法包括酶法破壁、超低温气流破壁技术等中的任意一种。应当尽可能选择破壁率高的方法或者尽可能提高对猴头菇孢子粉破率，以充分提取其中的多糖物质。
11.优选地，所述步骤(1)中，浸提的温度为40～60℃，采用水浴加热的方式，浸提时间为40～70min，通过浸提使孢子粉中的水溶性多糖尽可能地溶解至热水中。
12.优选地，所述步骤(1)中，猴头菇孢子粉和水的比例为1g：40～80ml。
13.优选地，所述步骤(2)中，碱液包括氢氧化钠、氢氧化钾中的任意一种。通过碱液对
孢子粉残渣的再次提取，有助于提取出碱溶性多糖，提高多糖的提取率。
14.优选地，所述步骤(2)中，碱液的浓度为0.05～0.1mol/l，采用低浓度碱液有助于防止多糖降解。
15.优选地，所述步骤(2)中，所述固体残渣与碱液的比例为1g：30～55ml，浸提时间为30～60min。
16.优选地，所述步骤(3)中，乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍以上，如四至五倍等，以使其中的多糖能够更加充分地析出、沉淀。
17.优选地，所述步骤(3)中，干冰颗粒分批加入，直至将合并后液相的ph中和至6.5～7.0之间，优选地，每隔半小时加入一次干冰颗粒。通过加入干冰不仅起到了中和液相使碱溶性多糖充分析出沉淀，提高多糖的二次提取率，同时干冰颗粒作为低温形核剂可打破液相平衡，提高多糖提取率，加速多糖析出。
18.优选地，所述步骤(3)中，静置时间为4～6小时，使液相中多糖充分析出。
19.优选地，所述步骤(4)中，混合液中甘油的体积占比为20～35％，在步骤(3)的中和过程中会产生部分碳酸钠无机盐以及从猴头菇孢子粉中浸提出来的无机盐，其会影响多糖产物的纯度，影响多糖产物的稳定性，通过这种混合液可有效分离出所述无机盐。
20.优选地，所述步骤(4)中，多糖粗提物与混合液的比例为1g：30～40ml，或者也可以根据需要改变混合液的加入量，以将多糖粗提物中的无机盐去除至满足要求即可。
21.优选地，所述步骤(4)中，将分离出的沉淀物置于通风橱中通风干燥半小时以上，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
22.相较于现有技术，本发明包括以下方面的有益效果：
23.在从猴头菇孢子粉中提取多糖物质的过程中，要得到多糖组分，至少需要经历两个提取工序，第一个是先将猴头菇孢子粉中的多糖提取到溶剂中得到浸提液，第二个是从该浸提液中再次将多糖分离出来，目前的工艺注重上述第一个过程，包括提高猴头菇孢子粉的破壁率，采用新的浸提液、优化工艺参数等，但忽略了第二个提取过程，导致相当一部分多糖残留在浸提液中而造成了浪费，本发明人发现，这主要是目前的醇沉工艺的提取效果有限造成的，该工艺无法做到精细化提取。
24.为此，本发明采用了新的提取工艺，一方面是通过对水提后的残渣用碱液再次提取，可使其中碱溶性多糖也被提取出来，然后将水提和碱提得到的浸提液合并后提取其中多糖。但本发明发现，碱提液中的碱溶性多糖无法通过醇沉的方式析出，因为碱液不像水一样与乙醇互溶而迫使碱液中的多糖析出，这就导致这部分碱提出来的多糖最终还是残留在了浸提液中而无法得到利用。为此，本发明在醇沉的同时加入干冰颗粒有效克服了上述问题，一方面加入的干冰在液相中气化形成的二氧化碳溶于水后形成的酸液可中和液相中的碱液，从而使碱溶性多糖失去了溶解环境，迫使碱溶性多糖从液相中析出。另一方面，干冰颗粒进入液相成为低温形核剂可有效增加形核位点，增加多糖的形核动力，促进多糖的析出。同时，低温环境打破了液相中的化学平衡(尤其是分批加入干冰颗粒)，促使多糖以更快的速率析出。通过上述的措施有效提高了浸提液中多糖的提取率。
25.除此之外，本发明发现步骤(3)的中和过程中会产生部分碳酸钠无机盐以及从猴头菇孢子粉中浸提出来的无机盐，其会影响多糖产物的纯度，影响多糖产物的稳定性。为此，本发明采提出了采用乙醇和甘油的混合物对从浸提液中提取出来的多糖粗提物。首先，
利用乙醇使粘稠状的甘油转换成溶液状，以便于和多糖粗提物的均匀混合以及后续的固液分离。在此基础上，利用混合液中的甘油溶解粗提取物中的碳酸钠、氯化钠等无机盐，而粗提取物中的多糖则无法溶解在乙醇和甘油中，这样就使粗提取物中的多糖和无机盐得到分离，而且由于多糖以沉淀的形式存在，只需要进行固液分离即可获得纯化后的多糖，避免了再次从溶液中提取多糖而使工艺复杂化的问题。同时，由于乙醇和甘油都是易挥发的物质，纯化后的多糖中残留的乙醇和甘油可以在室温下方便地去除，不需高温加热等方式，避免了直接对多糖进行加热造成降解等的问题。
具体实施方式
26.需要说明的是，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同，除非另行定义。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。
27.此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
28.实施例1
29.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
30.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：50ml的比例将两者混合，然后水浴加热至45℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提60min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
31.(2)按照固体残渣与氢氧化钠溶液1g：40ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提45min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
32.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入浓度为95％的乙醇和干冰颗粒后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍，所述干冰颗粒每隔30min加入一次，直至将合并后液相的ph中和至7.0，静置时间为5小时，待液相中多糖在中和条件下析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
33.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为30％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：40ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
34.实施例2
35.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
36.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：80ml的比例将两者混合，然后水浴加热至60℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提45min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
37.(2)按照固体残渣与氢氧化钠溶液1g：50ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.05mol/l的氢氧化钠溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提60min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
38.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入浓度为95％的乙醇和干冰颗粒后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的五倍，所述干冰颗粒每隔30min加入一次，直至将合并后液相的ph中和至6.5，静置时间为4小时，待液相中多糖在中和条件下析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
39.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为20％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：40ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥30min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
40.实施例3
41.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
42.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：65ml的比例将两者混合，然后水浴加热至40℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提70min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
43.(2)按照固体残渣与氢氧化钾溶液1g：55ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.1mol/l的氢氧化钾溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提30min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
44.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入无水乙醇和干冰颗粒后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍，所述干冰颗粒每隔30min加入一次，直至将合并后液相的ph中和至7.0，静置时间为6小时，待液相中多糖在中和条件下析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
45.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为35％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：35ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
46.实施例4
47.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
48.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：40ml的比例将两者混合，然后水浴加热至55℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提40min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
49.(2)按照固体残渣与氢氧化钾溶液1g：30ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.1mol/l的氢氧化钾溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提50min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
50.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入无水乙醇和干冰颗粒后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的五倍，所述干冰颗粒依次序挤入，其加入量以将液相的ph中和至7.0为准，静置时间为5小时，待液相中多糖在中和条件下析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
51.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为25％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：30ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油
充分挥发，即得多糖物质。
52.实施例5
53.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
54.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：50ml的比例将两者混合，然后水浴加热至45℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提60min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
55.(2)按照固体残渣与氢氧化钠溶液1g：40ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提45min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
56.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入浓度为95％的乙醇后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍，静置时间为5小时，待液相中多糖析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
57.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为30％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：40ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
58.实施例6
59.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
60.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：50ml的比例将两者混合，然后水浴加热至45℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提60min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
61.(2)按照固体残渣与氢氧化钠溶液1g：40ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提45min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
62.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入浓度为95％的乙醇和干冰颗粒后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍，所述干冰颗粒每隔30min加入一次，直至将合并后液相的ph中和至7.0，静置时间为5小时，待液相中多糖在中和条件下析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
63.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇中，所述粗提取物与乙醇的比例为1g：40ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
64.实施例7
65.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
66.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：50ml的比例将两者混合，然后水浴加热至45℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提60min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
67.(2)按照固体残渣与氢氧化钠溶液1g：40ml的比例，将步骤(1)的固体残渣加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，再次进行超声(频率25khz，功率200w)浸提45min，完成后对提取液进行过滤，收集液相，备用。
68.(3)将步骤(1)和步骤(2)的液相合并，然后向合并液相中加入浓度为95％的乙醇和稀盐酸后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍，所述稀盐酸每隔30min加入一次，直至将合并后液相的ph中和至7.0，静置时间为5小时，待液相中多糖在中和条件下析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
69.(4)将步骤(3)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为30％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：40ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
70.实施例8
71.一种猴头菇孢子粉中多糖的提取方法，包括如下步骤：
72.(1)采用经过超低温气流破壁技术处理的猴头菇孢子粉，其破壁率达到97.4％，按照破壁孢子粉和水为1g：50ml的比例将两者混合，然后水浴加热至45℃，在超声条件(频率25khz，功率200w)下浸提60min，完成后对提取液进行过滤，分别收集液相、固体残渣，备用。
73.(2)向步骤(1)的液相中加入浓度为95％的乙醇后静置，其中，所述乙醇的添加量为合并后液相总体积的四倍，静置时间为5小时，待液相中多糖析出、沉淀后对液相进行过滤，分离出沉淀物，即得多糖粗提物。
74.(3)将步骤(2)的多糖粗提物加入乙醇和甘油形成的混合液(甘油的体积占比为30％)中，所述粗提取物与混合液的比例为1g：40ml，然后机械搅拌30min，完成后过滤分离出沉淀物，然后将该沉淀物置于通风橱中通风干燥40min，以使沉淀物中残留的乙醇和甘油充分挥发，即得多糖物质。
75.测试上述实施例1至实施例8的猴头菇孢子粉多糖得率和多糖物质的纯度，结果如表1所示。
76.表1
[0077][0078]
从上表的结果可以看出，实施例5的猴头菇孢子粉多糖得率较实施例1明显较低，这是由于从合并液相中二次再次多糖物质时没有加入干冰，导致部分碱溶性多糖未能被提取出来，同时，由于也没有了干冰起到的促进多糖析出的作用也导致部分多糖未能被提取出来。而实施例的产物纯度讲笑下降，另外对实施例1步骤(3)制备的多糖粗提物的纯度进行测试，结果显示其纯度为90.61％，再结合实施例6中仅采用乙醇对多糖粗提物再次提取得到的多糖物质的纯度可以看出，采用乙醇和甘油的混合液对多糖粗提物进行提纯能够显著提高多糖粗提物的纯度。在实施例7中，采用盐酸代替干冰颗粒，但由于盐酸不具有干冰的促进多糖析出的作用，导致多糖得率下降了17.5％以上。实施例8对猴头菇孢子粉只进行了水提，而没有进行碱提，导致部分碱溶性多糖未能被提取出来，因此多糖得率较低。可以
看出，相对于实施例5至实施例8，实施例1至实施例4不仅能够更加高效、彻底地从猴头菇孢子粉中浸提处多糖物质，同时还提高了从浸提液中二次提取多糖物质的提取效果，降低了多糖物质的损失，提高了对猴头菇孢子粉的利用率。
[0079]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。