一种免洗脱、低蛋白吸附纸基核酸提取材料及制备方法和应用

1.本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种免洗脱、低蛋白吸附纸基核酸提取材料及制备方法和应用。


背景技术：

2.纸基材料作为一种成本低廉、降解性好、易于修饰改性且可用毛细作用力驱动等优点的多孔材料已被用于快速核酸提取领域。相对于传统核酸提取技术 (例如：离心柱法、磁珠法、酚氯仿抽提法)存在的成本昂贵、不便携、操作复杂、耗时等缺陷，纸基核酸提取技术具有成本低廉、便于携带、操作简单、快速等优点，已被用于从全血、细胞、唾液、细菌等生物样本中提取核酸，但是，提取效率低的缺点限制了其进一步的临床应用。
3.目前，研究者已采用不同方法改进纸基材料提取效率低的问题。例如：用壳聚糖、聚多巴胺、聚乙烯亚胺对滤纸、硅基膜、fusion 5进行后改性提升核酸的提取性能。但是，此类方法需要借助额外的试剂、设备、在多步清洗的条件下使核酸吸附量提高和杂蛋白吸附量降低，最终实现核酸的高效提取，导致纸基材料成本昂贵、制备复杂和制备耗时的缺陷，难以满足快速核酸提取简单、快速和高效的要求。因此，研究一种免洗脱低蛋白吸附的纸基核酸提取材料具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决上述现有技术的问题，本发明提供一种免洗脱、低蛋白吸附纸基核酸提取材料及制备方法和应用，该材料可实现核酸简单、快速和高效的提取要求。
5.本发明通过以下技术方案实现：
6.一种免洗脱、低蛋白吸附纸基核酸提取材料的制备方法，包括：
7.将壳聚糖溶液和第一份棉浆搅拌混合，得到混合物1；
8.将聚乙二醇溶液和第二份棉浆搅拌混合，得到混合物2；
9.将混合物1、混合物2和第三份棉浆搅拌混合，抄造成纸，得到免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料。
10.优选的：按照第一份棉浆、第二份棉浆和第三份棉浆的总量的绝干质量百分比计，第一份棉浆的绝干、第二份棉浆的绝干和第三份棉浆的绝干的比例为 (20％-80％)：(70％-40％)：(1％-10％)。
11.优选的：所述第一份棉浆、第二份棉浆和第三份棉浆的打浆度均为40-80 打浆度。
12.优选的：所述壳聚糖溶液为壳聚糖的水溶液，聚乙二醇溶液为聚乙二醇的水溶液。
13.优选的：所述搅拌混合的时间为4-12h。
14.优选的：壳聚糖分子量为2000-50000mw。
15.优选的：聚乙二醇分子量为400-4000mw。
16.采用所述的制备方法得到的免洗脱、低蛋白吸附纸基核酸提取材料。
17.所述的免洗脱、低蛋白吸附纸基核酸提取材料在提取生物样本内核酸中的应用。
18.优选的：将裂解后的生物样本混合液滴加到所述纸基核酸提取材料上，所述纸基核酸提取材料吸附核酸；之后，将吸附有核酸的纸基核酸提取材料作为模板进行pcr扩增，然后用凝胶电泳对pcr扩增后纸基核酸提取材料进行核酸检测。
19.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
20.本发明中考虑到同时加入壳聚糖和聚乙二醇对于纤维改性存在竞争关系，无法确定纤维是否被两种试剂均改性。因此，采用壳聚糖和聚乙二醇对纤维进行分别改性，分别在纤维表面引入了氨基基团和羟基基团，氨基基团在酸性条件下吸附核酸，而聚乙二醇会在纤维表面形成水化层，阻止蛋白吸附，从而提高核酸特异性吸附和降低杂蛋白非特异性吸附；同时，考虑到化学试剂改性后，纤维之间依靠羟基结合的作用有可能减弱，导致力学性能差，因此，加入部分原纤维与壳聚糖改性纤维和聚乙二醇改性纤维混合，抄造成纸，用于生物样本中核酸提取，此操作通过氨基基团将核酸直接吸附在纸基材料中，通过聚乙二醇形成的水化层将杂蛋白拒之门外，且吸附有核酸的纸片可直接作为模板进行后续的pcr或rt-pcr扩增，因此，在提取过程中无需清洗和洗脱可实现核酸的高效率提取(低蛋白吸附)。该纸基核酸提取材料成本低廉、便于携带、操作简单，可实现批量生产，应用广泛，可用于不同纸基核酸检测平台进行不同生物样本的核酸提取，快速且高效。
21.进一步的，本发明限定了第一份棉浆、第二份棉浆和第三份棉浆比例范围，聚乙二醇改性纤维占比过大或过少超出范围后，抗蛋白吸附性能增强或减少，会影响核酸的吸附效率，纸基材料核酸提取性能会降低。壳聚糖改性纤维占比过少超出范围后，纸基材料提取核酸的效率会降低；反之，壳聚糖改性纤维占比过多超出范围后，纸基核酸提取材料吸附杂蛋白的能力会提升，也会影响纸基材料的核酸提取效率。
22.本发明所得免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料核酸提取效率高，且成本低廉、便于携带，可以用于核酸的高效检测。
附图说明
23.图1为本发明制备的纯纤维素纸(a：cf纸)，壳聚糖改性纤维制备的纸基材料(b：cos/cf纸)，聚乙二醇改性纤维制备的纸基材料(c:peg/cf纸)，免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料(d：cos/cf-peg/cf-cf纸)电镜图以及进行亲水性测试结果图e。
24.图2为本发明制备的cf纸、cos/cf纸、peg/cf纸、cos/cf-peg/cf-cf 纸的在裂解前后抗蛋白吸附性能对照结果图。
25.图3为本发明制备的纯纤维素纸(1-cf纸)，壳聚糖改性纤维制备的纸基材料(2-cos/cf纸)，聚乙二醇改性纤维制备的纸基材料(3-peg/cf纸)，免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料(4-cos/cf-peg/cf-cf纸)的纯dna的核酸提取性能比较结果图。
26.图4为本发明实施例1-3免洗脱低蛋白吸附纸基材料用于提取唾液样本的 dna，凝胶电泳检测结果图。
27.图5为本发明制备的cf纸、cos/cf纸、peg/cf纸和实施例2制备的改性后cos/cf-peg/cf-cf纸核酸提取效率对比结果。
具体实施方式
28.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。
29.本发明提供一种操作简单、快速的免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料。通过选择合适长度的纤维以及用量，并添加改性试剂，通过控制改性试剂的用量可以改善纸基材料吸附核酸的性能。
30.一种用于核酸提取的免洗脱低蛋白吸附纸基材料的制备方法，包括以下步骤：
31.步骤1的具体过程为：采用槽式打浆机制备40-80打浆度下的绝干为 3.17-6.34g的棉浆。
32.步骤2的具体过程为：称取1-4g壳聚糖溶解在200ml去离子水中，配置成 0.5-2mg/ml的壳聚糖溶液。壳聚糖分子量为2000-50000mw。
33.步骤3的具体过程为：称取1-5g聚乙二醇溶解在100ml去离子水中，配置成1-5mg/ml的聚乙二醇溶液。聚乙二醇分子量为400-4000mw。
34.步骤4的具体过程为：取步骤1中20％-80％的棉浆加入到壳聚糖溶液中，搅拌4-12h均匀分散，得到混合物1。
35.步骤5的具体过程为：取步骤1中70％-40％的棉浆加入到聚乙二醇溶液中，搅拌4-12h均匀分散，得到混合物2。
36.步骤6的具体过程为：将混合物1、混合物2与步骤1中1-10％的棉浆混合，搅拌时间是4-12h，采用湿法成型，热压干燥抄造成纸，100-105℃温度烘干10-15min。此时，纸基材料定量为150g/m2。
37.步骤7的具体过程为：首先，将步骤6制备的纸基材料打孔为直径是 3-4.5mm的纸盘，裁剪1-2cm宽的吸水纸，用含直径为2-3mm的孔的封口膜将纸盘和吸水纸固定住，纸盘在吸水纸的上层，封口膜的孔和纸盘对齐；其次，将30-150μl样品加入到30-200μl的naoh溶液(500mm)进行裂解；最后，在ph《5.5条件下将裂解液加入到纸盘上，取出纸盘作为模板直接用于下一步扩增检测，用凝胶电泳进行检测，若在200-300bp之间出现目的条带，说明可以进行核酸提取，出现的条带亮度更强，说明提取到的核酸纯度更高，杂蛋白吸附少；若没有出现目的条带，说明没有提取到核酸或者提取到的核酸太少，不能被检测到。
38.步骤8的具体过程为将制备好的纸，裁成1cm
×
1cm的纸片，将gibco胎牛血清溶于pbs溶液中，配成蛋白浓度为1mg/ml的模拟溶液备用。将样本和裂解液混合均匀后，加入浓盐酸使ph《5.5，配制成终体积440μl的溶液，然后，将纸片放入孵育2h，离心除去纸上的多余液体后，使用紫外分光光度计测量裂解前和裂解后的吸光值；通过紫外在波长280nm处测定吸光值，根据标准曲线代入吸光值计算得到吸附后残余液体的蛋白浓度。用移液器测量残余液体的体积。最后，根据公式计算：纸基材料的蛋白吸附量＝初始蛋白总量-残余蛋白总量。
39.实施例1
40.一种免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料的制备方法，包括以下步骤：
41.步骤1，采用槽式打浆机制备40打浆度下的棉浆。
42.步骤2，称取2g壳聚糖(2000mw)溶解在200ml去离子水中，配置成1mg/ml 的壳聚糖溶液。
43.步骤3，称取3g聚乙二醇(400mw)溶解在100ml去离子水中，配置成 3mg/ml的聚乙二醇溶液。
44.步骤4，称取绝干为4.755g的棉浆，将20％的棉浆均匀分散在壳聚糖溶液中，搅拌12h，分散成均匀的悬浮液。
45.步骤5，称取绝干为4.755g的棉浆，将70％棉浆均匀分散在聚乙二醇溶液中，搅拌12h，分散成均匀的悬浮液。
46.步骤6，将步骤4、步骤5与占绝干4.775g棉浆10％的棉纤维混合，搅拌时间是12h，采用湿法成型，热压干燥抄造成纸，105℃温度烘干15min。此时，纸基材料定量为150g/m2。
47.步骤7，步骤6制备的纸基材料打孔成直径为4.5mm的纸盘。裁剪2cm宽的吸水纸，用含直径为3mm的孔的封口膜将纸盘和吸水纸固定住，纸盘在吸水纸的上层，封口膜的孔和纸盘对齐。将30、90、150μl的唾液样本分别添加到 38.4、115.2、192μl的naoh溶液(500mm)溶液中混合均匀提取dna。将 ph《5.5的裂解混合液滴加至纸盘上，取出纸盘作为模板直接用于下一步扩增检测。
48.实施例2
49.一种免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料的制备方法，包括以下步骤：
50.步骤1，采用槽式打浆机制备40打浆度下的棉浆。
51.步骤2，称取2g壳聚糖(2000mw)溶解在200ml去离子水中，配置成1mg/ml 的壳聚糖溶液。
52.步骤3，称取3g聚乙二醇溶解(400mw)在100ml去离子水中，配置成 3mg/ml的聚乙二醇溶液。
53.步骤4，称取绝干为4.755g的棉浆，将50％的棉浆均匀分散在壳聚糖溶液中，搅拌12h，分散成均匀的悬浮液。
54.步骤5，称取绝干为4.755g的棉浆，将40％棉浆均匀分散在聚乙二醇溶液中，搅拌12h，分散成均匀的悬浮液。
55.步骤6，将步骤4、步骤5与占绝干4.775g棉浆10％的棉纤维混合，搅拌时间是12h，采用湿法成型，热压干燥抄造成纸，105℃温度烘干15min。此时，纸基材料定量为150g/m2。
56.步骤7，步骤6制备的纸基材料打孔成直径为4.5mm的纸盘。裁剪2cm宽的吸水纸，用含直径为3mm的孔的封口膜将纸盘和吸水纸固定住，纸盘在吸水纸的上层，封口膜的孔和纸盘对齐。将30、90、150μl的唾液样本分别添加到 38.4、115.2、192μl的naoh溶液(500mm)溶液中混合均匀提取dna。将 ph《5.5的裂解混合液滴加至纸盘上，取出纸盘作为模板直接用于下一步扩增检测。
57.实施例3
58.一种免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料的制备方法，包括以下步骤：
59.步骤1，采用槽式打浆机制备40打浆度下的棉浆。
60.步骤2，称取2g壳聚糖(2000mw)溶解在200ml去离子水中，配置成1mg/ml 的壳聚糖溶液。
61.步骤3，称取3g聚乙二醇(400mw)溶解在100ml去离子水中，配置成 3mg/ml的聚乙二醇溶液。
62.步骤4，称取绝干为4.755g的棉浆，将80％的棉浆均匀分散在壳聚糖溶液中，搅拌
12h，分散成均匀的悬浮液。
63.步骤5，称取绝干为4.755g的棉浆，将10％棉浆均匀分散在聚乙二醇溶液中，搅拌12h，分散成均匀的悬浮液。
64.步骤6，将步骤4、步骤5与占绝干4.775g棉浆10％的棉纤维混合，搅拌时间是12h，采用湿法成型，热压干燥抄造成纸，105℃温度烘干15min。此时，纸基材料定量为150g/m2。
65.步骤7，步骤6制备的纸基材料打孔成直径为4.5mm的纸盘。裁剪2cm宽的吸水纸，用含直径为3mm的孔的封口膜将纸盘和吸水纸固定住，纸盘在吸水纸的上层，封口膜的孔和纸盘对齐。将30、90、150μl的唾液样本分别添加到 38.4、115.2、192μl的naoh溶液(500mm)溶液中混合均匀提取dna。将 ph《5.5的裂解混合液滴加至纸盘上，取出纸盘作为模板直接用于下一步扩增检测。
66.为考察抄造成纸的材料对核酸提取性能的影响，本发明观察了纯纤维素纸 (a：cf纸)、纯壳聚糖改性纤维纸(b：cos/cf纸)、聚乙二醇改性纤维纸 (c：peg/cf纸)和实施例2复合纸基核酸提取材料(d：cos/cf-peg/cf-cf 纸)的物理化学特性(图1)和抗蛋白吸附性能(图2)和核酸提取性能(图3)。
67.图1结果显示：在使用不同改性纤维复合制备的纸基材料表面均呈多孔结构，观察图1右上角的接触角测试发现：cos/cf纸、peg/cf纸、 cos/cf-peg/cf-cf纸的亲水性有所改善，红外图1e表明cos的氨基基团和 peg的羟基基团被成功复合在纤维上。图2结果显示：加入peg改性纤维后，相较于cf纸、cos/cf纸，cos/cf-peg/cf-cf纸的抗蛋白吸附性能有所善，因此，采用cos/cf-peg/cf-cf纸进行实际样本提取。图3结果显示：通过对比不同纸的纯dna吸附性能，发现cos/cf-peg/cf-cf纸的扩增条带较亮，提取效果较好。
68.本发明cf纸、cos/cf纸、peg/cf纸、实施例2中cos/cf-peg/cf-cf 纸提取纯dna的效率结果如图5所示，cf纸核酸提取效率为23.82％，cos/cf 核酸提取效率为40.65％，peg/cf纸核酸提取效率为28.5％， cos/cf-peg/cf-cf纸核酸提取效率为42.27％。相较于未改性的cf纸及 cos/cf纸、peg/cf纸，复合改性后的cos/cf-peg/cf-cf纸核酸提取效率增大。
69.本发明考虑到壳聚糖改性纤维、聚乙二醇改性纤维和原纤维混合抄纸，其混合比例不同会影响核酸提取性能。因此，在实施例中选用了三个不同质量比例，分别观察了在聚乙二醇改性纤维占比多于壳聚糖改性纤维(实施例1)，以及占比相近时(实施例2)和壳聚糖改性纤维占比多于聚乙二醇改性纤维(实施例3)制备的纸基材料，提取实际样本，观察了核酸提取性能变化(图4)。图4结果显示：实施例1中步骤5、4、6中棉浆比例为7：2：1的90μl唾液样本(1-7：2：1)和150μl唾液样本(4-7：2：1)在200-300bp之间出现目的条带，说明纸基材料可以从90、150μl的唾液样本中提取到dna并且通过核酸电泳能够被检测到。实施例2中步骤5、4、6中棉浆比例为5：4：1的90μl 唾液样本(2-5：4：1)和150μl唾液样本(5-5：4：1)在200-300bp之间出现目的条带，说明纸基材料可以从90、150μl的唾液样本中提取到dna并且通过核酸电泳能够被检测到，提取效果好于实施例1。实施例3中步骤5、4、6 中棉浆比例为8：1：1的纸基材料提取90μl唾液样本(1-8：1：1)和150μl 唾液样本(4-8：1：1)在200-300bp之间出现目的条带，说明结果显示：纸基材料可以从90、150μl的唾液样本中提取到dna并且通过核酸电泳能够被检测到，提取效果好于实施例1，提取效果仅次于实施例2。此结果说明在壳聚糖改性纤维占比较小时，聚乙二醇改性比例较大时核酸提取效果较差，而在实施例2中的不同改性纤维比例为5:4:1时，核酸提取效果较好。
70.综上所述，本发明通过引入壳聚糖改性纤维改变纸基材料表面官能团增强其核酸吸附性能，同时实现在免清洗及洗脱的条件下提取核酸的目的；通过引入聚乙二醇改性纤维在纸基材料表面形成水化层增强了纸基材料的抗蛋白吸附性能。最终，制备成功一种免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料可实现核酸的高效提取(提取效率为43.95％)。本发明解决了已有纸基核酸提取材料中存在的需要大型仪器的协助、复杂的操作和较长的时间才能实现核酸的高效提取的问题，制备了一种操作简单、快速的免洗脱低蛋白吸附纸基核酸提取材料。