一种线粒体膜囊泡的制备方法

1.本发明涉及膜囊泡制备技术领域，更具体地说，它涉及一种线粒体膜囊泡的制备方法。


背景技术：

2.各种细胞来源的细胞膜已经成功地用于包覆纳米材料以实现纳米材料仿生功能化，但是由于细胞膜表面蛋白丰富，自身携带较多抗原导致其在体内具有较大的免疫原性，因此探索新的可替代的低免疫原性的生物膜用于纳米材料的包裹和药物递送是目前面临的问题。
3.目前，真核生物细胞器的胞内膜仍未被探索是否能用于纳米材料包覆，由于线粒体在细胞内主要参与能量代谢维持细胞正常生命活动中扮演重要作用，线粒体还能在从正常的细胞中转移到受损的细胞内，以满足受损细胞的能量需求，且与细胞膜相比，线粒体膜的表面蛋白种类单一，具有较低的免疫原性，因此，本发明首次提出一种线粒体膜囊泡的制备方法，以用于制备线粒体膜囊泡，为后期纳米材料的包裹和药物递送提供技术支撑。


技术实现要素：

4.本发明的目的是首次提出一种线粒体膜囊泡的制备方法，该方法不仅能够高效制备线粒体膜囊泡，还为探索新的可替代的低免疫原性生物膜用于纳米材料的包裹和药物递送提供技术支撑。
5.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种线粒体膜囊泡的制备方法，具体包括以下步骤：
6.s1：从小鼠胚胎成纤维细胞系3t3中提取线粒体；
7.s2：提取线粒体外膜；
8.s3：将线粒体外膜进行超声处理，然后在聚碳酸酯多孔膜中挤压多次后得到线粒体膜空囊泡；
9.s4：通过线粒体膜囊泡对cus进行包裹。
10.进一步的，所述s1的具体步骤为：
11.1)从细胞培养皿中移除培养基，用pbs洗涤细胞；
12.2)洗涤之后，移除pbs，再将细胞刮下，然后将刮下的细胞悬液转移到离心管中，用pbs反复冲洗并将所有细胞收集至离心管内；
13.3)对离心管内的细胞进行离心处理，沉淀细胞，弃去上清液；
14.4)将制备的线粒体提取液加入离心管并重悬细胞；
15.5)在冰浴条件下多次研磨细胞；
16.6)再通过多次离心操作收集管底线粒体。
17.进一步的，所述s2的具体步骤为：
18.1)在线粒体内加入超纯水然后进行震荡；
19.2)在线粒体样品中加入蔗糖溶液；
20.3)将2)中得到的混合物进行均质处理，接着通过离心收集上清液；
21.4)再进行离心，使得线粒体外膜沉淀在管底，然后将线粒体外膜进行保存；
22.5)计算线粒体外膜提取率。
23.综上所述，本发明具有以下有益效果：
24.1、采用该制备方法能够制备线粒体膜囊泡，且不影响线粒体膜蛋白组成；
25.2、该制备方法能够提高线粒体外膜的提取率，从而提高线粒体膜囊泡的制备效率。
26.3、该制备方法能提供一种细胞器膜包裹的光热纳米材料，提高纳米材料的生物相容性。
附图说明
27.图1是本发明实施例中提取的线粒体透射电镜图；
28.图2是本发明实施例中细胞膜和线粒体膜蛋白的凝胶电泳图；
29.图3是本发明实施例中线粒体膜经挤压后的囊泡透射电镜图；
30.图4是本发明实施例中cus纳米粒的透射电子显微镜图；
31.图5是本发明实施例中mm@cus的透射电镜图。
32.图6是本发明实施例中mm和mm@cus的蛋白凝胶电泳图。
具体实施方式
33.以下结合附图1-6对本发明作进一步详细说明。
34.实施例：一种线粒体膜囊泡的制备方法，具体包括以下步骤：
35.s1：从小鼠胚胎成纤维细胞系3t3中提取线粒体，如图1所示，提取的线粒体外膜结构完整，形态均一；
36.s2：提取成纤维细胞膜(cm)和成纤维细胞的线粒体外膜(mm)。提取的膜蛋白分别进行sds-page凝胶电泳。如图2所示，细胞膜蛋白组成明显比线粒体外膜的蛋白组成更加丰富，且线粒体外膜中40kda以下的小分子量蛋白的丰度较低，预示着线粒体膜比细胞膜的免疫原性更低；
37.s3：线粒体外膜1000ug/ml通过冰浴超声水浴锅进行超声处理5min，使其混合均匀；然后使用avanti微型挤压机在100nm聚碳酸酯多孔膜中挤压6次后得到线粒体膜空囊泡；电镜下观察线粒体膜囊泡的结构，如图3所示，透射电子显微镜下观察，制备的线粒体囊泡呈现典型的双分子层膜结构，且囊泡直径为100nm左右；
38.s4：通过线粒体膜囊泡对cus进行包裹；首先将线粒体外膜与cus按照质量比1：1的比例混合，线粒体外膜和cus均为500ug，4℃恒温振荡器(400rpm)中混匀后，冰浴超声5min后，并通过avanti微型挤压机在100nm聚碳酸酯多孔膜中挤压8次得到mm@cus(被包裹的cus)，接着在4℃，7000g离心30min，去除多余的未装在成功的cus。如图4所示，透射电子显微镜下观察cus纳米粒分散较好，尺寸分布均匀，粒径大小为11nm左右。如图5所示，透射电子显微镜下观察到mm@cus呈现典型的双分子层膜结构，且线粒体膜内侧颜色较深的部分为包裹的cus纳米粒。如图6所示，蛋白sds-page凝胶电泳图显示该方法制备的mm@cus和mm显
示出相同的蛋白组成条带，cus包裹进入mm并没有影响mm的蛋白组成。以上结果表明cus被成功的包裹进线粒体。
39.s1的具体步骤为：
40.1)从细胞培养皿中移除培养基，用pbs洗涤细胞一次；
41.2)洗涤之后，移除pbs，用细胞刮刀将细胞刮下，将刮下的细胞悬液转移到15ml离心管中，pbs反复冲洗并收集所有细胞至离心管。
42.3)在4℃条件下，将600g的细胞悬液进行10分钟离心，沉淀细胞，弃去上清液；
43.4)将制备的线粒体提取液加入离心管重悬细胞，每1
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107个细胞加入1ml线粒体提取液；其中线粒体提取液的制备方法为：10ml 0.1m tris-mpos和1ml egta/tris加入20ml 1m蔗糖中，加入蒸馏水定容至100ml，ph调至7.4；
44.5)在0℃冰浴条件下，用玻璃匀浆器研磨细胞70次；
45.6)进行一系列的离心步骤富集线粒体，离心过程均为4℃条件下进行，首先在1000g条件下离心5min，弃沉淀收集上清；再1000g离心5min，弃沉淀，收集上清；12000g离心10min，弃去上清液，收集管底线粒体。
46.s2的具体步骤为：
47.1)将纯化的线粒体内加入超纯水500ul，线粒体样品在4℃震荡20分钟；
48.2)，在线粒体样品中加入500ul的1.4m的蔗糖溶液，在4℃混匀5分钟；
49.3)将2)中得到的混合物在4℃条件下，800rpm的振荡器内均质30min，接着在4℃条件下12000g离心10min，然后收集上清液；
50.4)在4℃条件下，100000g离心30分钟，使得线粒体外膜沉淀在管底，用100ulpbs重悬沉淀，然后将线粒体外膜放入-80℃进行保存；
51.5)计算线粒体外膜提取率；从纯化的线粒体中提取的线粒体外膜提取率％＝线粒体膜蛋白浓度/线粒体蛋白浓度*100％＝193.09(ug/ml)/1120.7(ug/ml)*100％＝17.23％，该提取率为17.23％。
52.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。