与鸡热应激耐受力有关的分子标记、引物组合及其检测鉴定方法与流程

1.本发明涉及基因工程和遗传育种领域，具体涉及一种与鸡热应激耐受力有关的分子标记、引物组合及其检测鉴定方法。


背景技术：

2.2022年国家重点研发计划将农业生物环境适应性纳入申报指南，以响应国家保障人民粮食安全的举措。禽产品作为人民粮食的重要组成部分，保障其质量安全至关重要。而家禽养殖系统受多种的气候因素影响，但是由于当今公众的认知和丰富的科学信息摄入，与热应激相关的禽产品质量安全问题变得尤为突出。在现代集约化家禽养殖的环境下，热应激压力在家禽生产中受到特别的关注，它已成为影响家禽生产性能的最关键的环境因素之一，包括造成家禽免疫力下降、生长速度减慢、饲料转化率低、禽产品质量变差等不利影响，对家禽生产造成了巨大的经济损失，每年高达1.28-1.65亿美元。现代商业化家禽由于其快速的新陈代谢而易产生更多的热量，使得家禽对环境温度更为敏感。因此，迫切需要制定各种有效的缓解策略，减少相应的生产损失。一般生产中重点针对环境改善或通过营养策略来调整改善热应激时的不良影响，但这不能满足应激条件下家禽的特殊需要且缓解效果有限。因此，迫切需要开发有效遗传标记等有效策略，对家禽进行耐热能力的选育才是有效之计。
3.目前国内外关于鸡热应激耐受力的分子标记研究尚少，仅有少数研究报道了可作为鸡抗热应激的潜在遗传标记。在当今平衡育种理念下，提高鸡热应激的耐受力对于适应未来全球气候变化形势至关重要。因此，精准定位与鸡热应激耐受相关的数量性状snp位点和筛选可鉴定其个体耐受力的dna分子标记，不仅可以避免鸡遭受热应激时表型观测选择的繁琐，更可以提高选择的准确性和选择的遗传进展，对有效筛选鸡热应激耐受的个体和抗热应激鸡群体的选育意义重大。


技术实现要素：

4.为了有效筛选鸡热应激耐受的个体，本发明一方面提供了一种与鸡热应激耐受力有关的snp分子标记，所述的snp分子标记对应于ncbi上鸡的参考基因组(gallus gallus 5.0)第5号染色体第40827385位以及40829460位。
5.较佳地，所述的第5号染色体第40827385位脱氧核苷酸是a、或者是c、或者是a和c。
6.较佳地，所述的第5号染色体第40829460位脱氧核苷酸是c、或者是t、或者是c和t。
7.较佳地，所述的snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.5所示且第163为碱基是g或者是a。
8.较佳地，所述的snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.6所示且第40为碱基是g或者是a。
9.较佳地，所述的snp分子标记用于如下应用：
10.(1)辅助鉴定鸡的热应激耐受能力；
11.(2)选育热应激耐受力相对较高的鸡群体。
12.较佳地，所述热应激耐受力相对较高是指与对应于ncbi上鸡的参考基因组(gallus gallus 5.0)第5号染色体第40827385位脱氧核苷酸是a的纯合体或者是c和a的杂合体以及40829460位脱氧核苷酸是c的纯合体或者是c和t的杂合体的鸡相比，对应于ncbi上鸡的参考基因组(gallus gallus 5.0)第5号染色体第40827385位脱氧核苷酸是c的纯合体和第40829460位脱氧核苷酸是t的纯合体的鸡热应激耐受力更强。
13.较佳地，所述热应激耐受力相对较高是指与对应于seq id no.5第163位脱氧核苷酸是a的纯合体或者是c和a的杂合体以及seq id no.6第40位脱氧核苷酸是c的纯合体或者是c和t的杂合体的鸡相比，对应于seq id no.5第163位脱氧核苷酸是cc的纯合体以及seq id no.6第40位脱氧核苷酸是tt的纯合体的鸡热应激耐受力更强。
14.本发明第二方面提供了一种引物组合，所述引物组合分别由seq id no.1、seq id no.3所示核苷酸序列的上游引物和具有seq id no.2、seq id no.4所示核苷酸序列的下游引物组成。
15.本发明第三方面提供了一种检测鉴定耐受热应激的鸡的方法，包括以下步骤：
16.(1)提取一定样本数量的待检测鸡的基因组dna；
17.(2)检测所述的基因组dna中如权利要求1～5任一项所述的snp分子标记位点的基因型；
18.(3)基于snp位点的基因型对鸡高温耐受鸡进行选择，其中，选择如权利要求1所述的2个位点分别为cc和tt基因型的鸡，其他基因型的鸡淘汰。
19.较佳地，所述的步骤(1)中样本数量为100-1000只。
20.本发明提供了一种可检测鸡热应激耐受力的单核苷酸多态，并提供了检测该两个位点基因型的普通pcr引物，可快速检测待测个体的基因型。其中两个位点为cc和tt时可作为优势基因型对鸡的热应激耐受力进行选择，为鸡分子标记辅助选育热应激耐受群体提供了一种有效、简单易操作、费用低的分子遗传标记，为鸡的热应激耐受力改良提供了一种有效的分子遗传标记。
附图说明
21.图1a～1b为鸡基因组上与高温耐受相关的选择信号。
22.图2为受选择信号2个snp位点在4个品种中的突变频率。
23.图3为2个snp位点在各个群体中基因型分析。
24.图4为2个snp位点sanger测序图。
具体实施方式
25.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
26.实施例1
27.选择中国4个不同环境生长的地方品种鸡包括文昌鸡、东乡绿壳蛋鸡、藏鸡和林甸鸡各50只，翅静脉采集2ml血样于edta-na抗凝管中，利用酚-氯仿法进行基因组dna提取。通过dna质控后基于illumina hiseq pe150平台进行全基因组测序。过略掉接头序列(＞10nt
与适配器进行校准，允许≤10％的错配)，去除低质量的序列包括≥10％未被识别的核苷酸或者＞50％且碱基测序质量＜5的，去除建库过程中可能产生的pcr重复序列。使用bwa(burrows-wheeler aligner)(0.7.8版本)软件包将剩余的高质量的配对序列用命令mem-t 4-k32 m与鸡参考基因组gallus_gallus-5.0进行匹配分析；同时为了减少测序前pcr扩增产生的错配，通过samtools(0.1.19版本)软件包去除重复的序列。将获得的序列根据gallus_gallus-5.0基因组，使用annovar软件包进行snp和indel注释。
28.选择信号筛选：筛选思路即将高温地区生长的文昌鸡、非高温生长地区的绿壳蛋鸡和藏鸡分别与低温地区生长的林甸鸡比较筛选受选择信号，三组信号结合分析，从文昌鸡受选择信号中剔除绿壳蛋鸡、藏鸡两组阴性对照(非高温环境)受选择信号来获得高温受选择信号。筛选方法即通过基于群体分化、以哈温平衡为前提种群遗传学统计方法fst、基于核苷酸多样度的θπratio以及tajima’d相结合的方法定位受选择信号(见图1a～1b)，并分析和筛选受选择信号上与温度适应相关的snp位点(见图2)。用samtools软件包中基于贝叶斯方法在群体中进行snp分析，计算4个品种的每个个体的基因型(见图3)，生长在高温地区品种鸡的二个位点基因型cc、tt的频率高于生长在温带和寒冷地区品种的鸡；进一步统计样本中的等位基因频率(见图2和表1)，结果发现2个snps在文昌鸡上突变频率较低，从绿壳蛋鸡到林甸鸡的突变频率逐渐升高，可能由于家鸡的驯化最初起源于东南亚地区，本身对高温环境有很强的适应性，因此生长在高温地区的鸡这3个位点与家鸡的祖先更为接近，推测这几个snps在热应激环境适应中可能发挥一定的作用。
29.实施例2
30.为了进一步研究上述2个snp位点的等位基因突变频率模式是否与高温环境适应性相关，试验选取中国其他4个地方品种鸡包括闽清毛脚鸡(mqmc)、广西龙胜凤鸡(lsfc)、山东济宁百日鸡(jnc)和北京油鸡(bjyc)各100只，以及巴西地方鸡(brazilian)191只、加纳地方鸡(ghana)1439只和坦桑尼亚地方鸡(tanzania)1399只，翅静脉采集2ml血样于edta-na抗凝管中，利用酚-氯仿法进行基因组dna提取。通过dna质控后，对与高温耐受相关的2个snp位点的目的片段进行扩增，2段序列扩增的上下游引物分别为：
31.碱基位于5号染色体第40827385位的引物：
32.上游引物f：ccaagccagccagtgcagtac(seq id no.1)
33.下游引物r：accagaggacaagcaaacatcacg(seq id no.2)
34.碱基位于5号染色体第40829460位的引物：
35.上游引物f：tcattcagcattacccagtgcaa(seq id no.3)
36.下游引物r：ttctgcactcatggtttccca(seq id no.4)
37.pcr扩增：本实施例中试剂来源于北京天根生化科技有限公司，引物合成及测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。以实施例中获得的其他7个品种鸡基因组dna为模板，使用上述引物分别进行pcr扩增。扩增体系如下：
[0038][0039]
pcr反应程序如下：
[0040][0041]
扩增序列的测序与鉴定：
[0042]
上述所扩增的pcr产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行sanger双向测序。将所得的序列与鸡的参考基因组比对，获得对应的snp突变位点。pcr扩增产物如下所示：
[0043]
seq id no.5
[0044][0045]
seq id no.6
[0046][0047]
注意：序列首位加粗的碱基序列为上下游引物序列位置，序列中加粗并标有下划线显示的碱基是突变位点，括号内的为突变碱基且为等位基因突变。
[0048]
由图3可知，随着北京油鸡(bjyc)、济宁白耳鸡(jnc)、闽清毛脚鸡(mqmc)、龙胜凤鸡(lsfc)、巴西地方鸡(brazilian)、加纳地方鸡(ghana)和坦桑尼亚地方鸡(tanzania)7个地方品种鸡生长地温度的增加，2个位点基因型cc、tt的频率分别逐渐增加，说明不同品种地方鸡基因型频率与环境温度之间有很强的相关性。进一步分析发现，2个snp位点突变频率坦桑尼亚地方鸡《加纳地方鸡《龙胜凤鸡《巴西地方鸡《闽清毛脚鸡《济宁白耳鸡《北京油鸡(见表2，具体测序图见图4)，即随着鸡生长环境温度的增加，突变频率变低，进一步认为这2个位点与热应激耐受力紧密相关。
[0049]
表2 7个鸡品种2个snp位点突变频率
[0050][0051]
实施例3
[0052]
为了进一步探索上述2个snp位点的等位基因突变频率是否适用于鉴定热应激耐受力群体的筛选，试验选择35周龄蛋鸡品系a和蛋鸡品系b各180只，所有鸡饲喂基础日粮，自由采食。本试验进行循环热应激试验，温度设置为：20:00-00:00、00:00-06:00设置为28℃，06:00-10:00、16:00-20:00设置为32℃，10:00-16:00设置为35℃。试验期为2周。试验第14天，统计其生产性能，并采集血液提取dna后按照实施例2中的2对引物序列和pcr条件扩增后送公司进行sanger测序，检测实施例2中2个snp位点的基因型。
[0053]
结果如表3所示，b组鸡直肠温度、呼吸频率、产蛋率下降率和死亡率均低于a组，推测b组鸡比a组鸡对热应激更耐受；通过测序分析发现b组鸡在2个snp位点的cc、tt基因型频率比a组鸡的高，进一步说明这2个snp位点可以作为筛选热应激耐受力鸡群体的关键指标。
[0054]
表3热应激环境下2组鸡生产性能和3个snp位点突变频率
[0055][0056]
实施例4
[0057]
为了进一步探索上述2个snp位点的等位基因突变频率是否能筛选抗性鸡个体，试验在实施例3的基础上进一步分析蛋鸡品系b的180只鸡对直肠温度、呼吸频率、产蛋率进行分组，将同时满足直肠温度《42.10℃、呼吸频率《214次/min、产蛋率下降率《24.35％的个体定义为高抗热应激个体gk，其余的定义为抗热应激个体k。对2个snp位点的基因型进行分析。
[0058]
结果如表4所示，通过对k组和gk组的测序分析发现gk组的鸡只在2个snp位点的cc、tt基因型频率比k组的高，与gk组拥有相对较低的直肠温度、呼吸频率和产蛋率下降率相对应，说明gk群体的个体相比k群体的个体具有更好的抗热应激耐受能力，因此这2个snp位点可以作为关键指标来筛选热应激耐受力鸡个体。
[0059]
表3热应激环境下2个snp位点突变频率
[0060][0061]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。