一种定量检测循环肿瘤DNA的一体化芯片

一种定量检测循环肿瘤dna的一体化芯片
技术领域
1.本技术涉及微流控技术领域，尤其涉及一种定量检测循环肿瘤dna的一体化芯片。


背景技术：

2.循环肿瘤dna(circulating tumor dna，ctdna)是一种肿瘤细胞释放到血液循环系统的游离dna，其中包含了源于肿瘤的突变和基因变异信息，检测循环肿瘤dna，可以有效监控与评估相关疾病的发生、发展与愈后。目前主流的核酸检测方法需要分别在离心机、核酸提取仪、核酸扩增仪等多个仪器上分别操作，这些设备昂贵、需要专业人员操作，在资源匮乏的地区难以使用。


技术实现要素：

3.本技术提供了一种定量检测循环肿瘤dna的一体化芯片，其技术目的是将目前多步核酸检测步骤集成到同一微流控芯片上，使得循环肿瘤dna的检测设备小型化、免电化且操作简单。
4.本技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
5.一种定量检测循环肿瘤dna的一体化芯片，包括由自上而下设置的盖板层、滤膜层、pdms流道层、pdms薄膜层和玻璃层组成的过滤模块、dna提纯模块、混合模块、sda模块和控制模块；
6.所述过滤模块包括依次连接的样本入口、滤膜和滤后出口；所述样本入口设在所述盖板层，所述滤膜设在所述滤膜层，所述滤后出口设在所述pdms流道层；
7.所述dna提纯模块包括dna提纯入口、dna提纯入口流道、磁珠入口、磁珠入口流道一、磁珠入口流道二)、dna提纯池、dna出口流道一、dna出口流道二、废液出口流道和废液出口一；
8.所述混合模块包括依次连接的dna入口流道、核酸扩增试剂入口、核酸扩增试剂入口流道、混合流道和混合出口流道；
9.所述sda模块包括依次连接的sda入口流道、一分多并行入口流道、sda流道、多合一废液出口流道和废液出口二；
10.所述控制模块包括开关阀一、开关阀二和开关阀三；
11.所述滤后出口与所述dna提纯入口相连通；所述混合出口流道与所述sda入口流道相连通；
12.所述dna提纯模块、所述混合模块、所述sda模块和所述控制模块都设在所述pdms流道层上；
13.所述pdms薄膜层和所述玻璃层上都设有孔一、孔二和孔三，所述孔一用于安装所述开关阀一，所述孔二用于安装所述开关阀二，所述孔三用于安装所述开关阀三。
14.本技术的有益效果在于：通过使用sda结构制备液滴，sda结构包括储液池通道、限制通道和旁路通道，既可以作为捕获液滴的结构也能作为生成液滴的结构，相比于传统液
滴生成方式，可以手动生成液滴，通过对sda结构的排列与优化，在相同面积下可以得到制备更多液滴。
15.本技术在一体化芯片上实现了样本前处理、dna提纯和定量检测，避免在多台仪器上分步操作，具有小型化、免电化、操作简单等优点。
附图说明
16.图1为本技术的结构示意图；
17.图2为本技术的爆炸示意图；
18.图3为本技术的盖板层和滤膜层示意图；
19.图4为本技术的pdms流道层示意图；
20.图5为本技术的pdms薄膜层示意图；
21.图6为本技术的玻璃层示意图；
22.图7为本技术的开关阀的装配示意图；
23.图8为本技术的开关阀工作原理图；
24.图9为本技术的sda流道的结构示意图；
25.图10为本技术的sda流道生成液滴原理图；
26.图11为本技术的sda结构制备液滴的实验结果图；
27.图12为本技术的sda流道处的不同标准dna样本浓度液滴荧光结果图；
28.图中：1-盖板层；2-滤膜层；3-pdms流道层；4-pdms薄膜层；5-玻璃层；6-样本入口；7-滤膜；8-核酸扩增试剂入口；9-核酸扩增试剂入口流道；10-混合流道；11-混合出口流道；12-一分多并行入口流道；13-sda流道；14-多合一废液出口流道；15-废液出口二；16-dna提纯池；17-dna提纯入口流道；18-滤后出口；19-磁珠入口流道二；20-开关阀一；21-磁珠入口流道一；22-磁珠入口；23-dna提纯出口流道一；24-开关阀二；25-废液出口流道；26-废液出口一；27-dna出口流道二；28-开关阀三；29-dna入口流道；30-sda入口流道；31-dna提纯入口；32-侧面打孔螺栓；33-垫圈；34-螺母；35-第一sda单元；36-第二sda单元；37-第一sda流道；38-第二sda流道；39-旁路流道；40-限制流道；41-储液池流道；42-sda单元；43-孔一；44-孔二；45-孔三。
具体实施方式
29.下面将结合附图对本技术技术方案进行详细说明。
30.本实施例的定量检测循环肿瘤dna的一体化芯片，如图1和图2所示，从上到下依次包括盖板层1、滤膜层2、pdms流道层3、pdms薄膜层4和玻璃层5。各层按顺序堆叠实现多个功能模块，包括过滤模块、dna提纯模块、混合模块、sda模块及控制模块。
31.如图3、图4所示，过滤模块包括样本入口6、滤膜7及滤后出口18。
32.具体地，过滤模块为三层结构，样本入口6设置在盖板层1，滤膜(7)设置在滤膜层2，滤后出口18设置在pdms流道层3；所述滤膜7为不对称聚醚砜膜或聚碳酸酯膜或醋酸纤维膜；滤后出口18与dna提纯入口31相连通。
33.如图4所示，dna提纯模块包括dna提纯入口31、dna提纯入口流道17、磁珠入口22、磁珠入口流道一21、磁珠入口流道二19、dna提纯池16、dna出口流道一23、dna出口流道二
27、废液出口流道25及废液出口一26。
34.dna提纯模块位于pdms流道层3。dna提纯模块使用磁珠在不同条件下结合或不结合dna的原理。当滤后出口18的样本进入dna提纯池16，打开开关阀一20，在磁珠入口22加入含有磁珠的去离子水溶液，使用磁铁缓慢将磁珠从磁珠入口流道一21、磁珠入口流道二19移动到dna提纯池16；关闭开关阀一20，打开开关阀二24，从样本入口6加入洗涤液去除样本中的杂质，废液经dna出口流道一23及废液出口流道25从废液出口一26流出；关闭开关阀二24，打开开关阀三28，从样本入口6加入洗脱液洗脱磁珠吸附的dna，dna从dna出口流道二27流出。
35.作为具体实施例地，dna提纯池16含有1个椭圆凸扩，该椭圆凸扩用于容纳磁珠并防止磁珠堵塞。
36.如图4所示，混合模块包括dna入口流道29、核酸扩增试剂入口8、核酸扩增试剂入口流道9、混合流道10及混合出口流道11。
37.混合流道10为不对称菱形结构，该不对称菱形结构包括n个交错排列的上宽下窄单体菱形流道和上窄下宽单体菱形流道；其中，宽流道宽度为窄流道宽度的2～3倍，n为4～16。不对称菱形结构的排列规则为上宽下窄单体菱形流道与上窄下宽单体菱形流道的交错排列，混合均匀后，液体进入混合出口流道11。
38.如图4所示，sda模块采用sda结构制备液滴，sda模块包括sda入口流道30、一分多并行入口流道12、sda流道13、多合一废液出口流道14及废液出口二15。
39.所述sda流道13的结构包括至少两列互相连通的sda单元42，每个sda单元42包括连通的第一sda单元35和第二sda单元36，所述第一sda单元35包括第一sda流道37，所述第二sda单元36包括所述第一sda流道37或第二sda流道38。
40.所述第一sda流道37包括储液池流道41、旁路流道39和限制流道40，所述旁路流道39设在所述储液池流道41的左侧与所述储液池流道41连通，所述限制流道40设在所述储液池流道41的右侧与所述储液池流道41连通；所述旁路流道39经由所述储液池流道41的上方与所述限制流道40连通，如图10中(a)所示。
41.所述第二sda流道38为所述第一sda流道37以所述储液池流道41为轴旋转180
°
得到，如图9中(b)所示。
42.相邻的所述sda单元42通过所述旁路流道39连通。
43.所述sda单元结构为：所述第一sda单元35设在所述第二sda单元36的左侧，所述第一sda单元35和所述第二sda单元36中都包括一个所述第一sda流道37，相邻的所述第一sda流道37通过各自的所述旁路流道39连通，如图9中(a)所示；或
44.所述第一sda单元35设在所述第二sda单元36的左侧，所述第一sda单元35包括一个所述第一sda流道37，所述第二sda单元36中包括一个所述第二sda流道38，所述第一sda流道37的所述旁路流道39与所述第二sda流道38的所述旁路流道39连通，如图9中(b)所示；或
45.所述第一sda单元35设在所述第二sda单元36的下方，所述第一sda单元35包括两个连通的所述第一sda流道37，所述第二sda单元36包括两个连通的所述第二sda流道38，所述第一sda流道37的旁路流道39与所述第二sda流道38的旁路流道39连通，如图9中(c)所示；或
46.所述第一sda单元35设在所述第二sda单元36的下方，所述第一sda单元35包括一个所述第一sda流道37，所述第二sda单元36包括一个所述第二sda流道38，所述第一sda流道37的旁路流道39与所述第二sda流道38的旁路流道39连通，如图9中(d)所示。
47.则sda流道13的结构为任意一种sda单元结构或多种sda单元结构构成的阵列，如图9所示。
48.如图4所示，sda模块的sda入口流道30与混合出口流道11相连通。
49.具体地，一分多并行入口流道12采用多通道并行结构，通道数为128～512；sda流道13由多个sda单元组成，sda单元数为10000～100000，按油相水相油相的顺序通入将在sda结构中自动生成液滴；多余的废液通过多合一废液出口流道14及废液出口二15流出。
50.如图4所示，控制模块采用开关阀进行控制，包括开关阀一20、开关阀二24及开关阀三28。开关阀一20控制磁珠入口流道一21和磁珠入口流道二19之间的连通与关闭；开关阀二24控制dna出口流道一23和废液出口流道25之间的连通与关闭；开关阀三28控制dna出口流道二27和dna入口流道29之间的连通与关闭。
51.具体地，如图7所示，开关阀一20、开关阀二24及开关阀三28由侧面打孔螺栓32，垫圈33和螺母34组成。
52.如图8所示，旋转侧面打孔螺栓32可将其侧面孔导通流道或者堵塞流道，从而实现开关阀的作用。
53.如图5和图6所示，所述pdms薄膜层4和所述玻璃层5上都设有孔一43、孔二44和孔三45，所述孔一43用于安装所述开关阀一20，所述孔二44用于安装所述开关阀二24，所述孔三45用于安装所述开关阀三28。
54.图10展示了sda模块制备液滴的原理。如图10(a)，sda流道13初始没有液体；如图10(b)，在sda流道中通入油相，油相充满了流道；如图10(c)，在sda流道中通入水相，水相无法通过限制流道40，水相充满了除限制流道的其他部分；如图10(d)，再次通入油相，油相在sda流道中切割水相，在sda流道中形成了液滴。
55.图11中，(a)为使用图9中(b)所示的静态液滴阵列制备液滴的实验结果，(b)为使用图9中(d)所示的静态液滴阵列制备液滴的实验结果，生产液滴大小均匀。
56.图12中，(a)为sda流道处的无模板对照组；(b)为sda流道处的156copies/μl标准dna；(c)为sda流道处的312copies/μl标准dna；(d)为sda流道处的625copies/μl标准dna；(e)为sda流道处的1250copies/μl标准dna；(f)为sda流道处的2500copies/μl标准dna的液滴荧光结果，实验结果与掺入标准dna浓度趋势相同。
57.上述实施例中，盖板层1和滤膜层2均采用硅胶材质，pdms流道层3和pdms薄膜层4均采用pdms材质，玻璃层5采用玻璃材质。各层之间采用等离子键合机进行键合，形成如图1所示的紧密连接。
58.上述实施例中，具体检测流程如下：
59.使用注射器将全血样本加入样本入口6，经过过滤模块中滤膜7的过滤作用产生血浆；开启开关阀一20，使用注射器将磁珠加入到磁珠入口22,使用磁铁将磁珠从磁珠入口流道一21、磁珠入口流道二19移动到dna提纯池16，将磁铁移开静置几分钟，使磁珠吸附血浆中的dna；关闭开关阀一20，打开开关阀二24，将磁铁放置在dna提纯池16下，使用注射器将洗涤液加入样本入口6以洗涤血浆中的杂质，废液经dna出口流道一23及废液出口流道25从
废液出口一26流出，使用注射器在核酸扩增试剂入口8加入油相，直到sda流道被油填满；关闭开关阀二24，打开开关阀三28，使用注射器将洗脱液加入样本入口6以洗脱磁珠上的dna，dna从dna出口流道二27进入dna入口流道29；将核酸扩增试剂和荧光染料加入核酸扩增试剂入口8，使核酸扩增试剂通过核酸扩增试剂入口流道9与dna在混合流道10充分混合后进入sda流道13；关闭开关阀三28，使用注射器在核酸扩增试剂入口8加入油相，sda结构将生成大小均匀液滴；将芯片放入相应扩增条件下，完成扩增反应后在荧光显微镜下观察统计正负液滴的数量，根据泊松分布定量出循环肿瘤dna的数量。
60.以上为本技术示范性实施例，本技术的保护范围由权利要求书及其等效物限定。