一株蒙氏假单胞菌及其在盐碱环境下降解石油烃的应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株蒙氏假单胞菌及其在盐碱环境下降解石油烃的应用。


背景技术：

2.石油作为当代经济的一大工业命脉，在各大工业领域有着广泛的应用。但与此同时，石油开采、运输、生产和加工过程中的不当操作与泄露事故同时也造成了环境污染。石油烃是石油中的主要成分之一，其中正构烷烃经长期积累及地球化学作用下，对底栖生物造成影响；多环芳烃具有致癌性，威胁着人类的生命健康。
3.微生物修复作为低成本、低毒害的环境友好石油污染修复方法，近年来获得了国内外的广泛关注。但微生物的生长和修复性能往往受到ph、盐度等条件的限制。土壤微生物的最适ph值往往在7.0左右、盐度在0.2％左右，高盐度和过酸过碱环境都会抑制微生物的活性。玉门油田、长庆油田等油气开发地位于中国的西北地区。西北地区常年干旱少水，盐碱积累，土壤高ph、高盐度的特性成了石油烃污染微生物修复的主要阻力(本次实验所用长庆油田采样点土壤的ph为7.12-8.58；盐度为：1.4-2.1％)。截至2017年，长庆油田所在的陇东地区原油污染土壤面积已达1.02
×
104km2，造成了巨大的环境压力。 (王金成，等.石油烃污染对陇东黄土高原土壤生物学及非生物学特性的影响[j].水土保持通报，2017,37,(1):9-16.)因此，亟需一种高效方法针对性地解决该地区盐碱土壤的石油污染问题。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明筛选出了一株耐盐碱的蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)，并应用于盐碱环境下石油烃污染修复。
[0005]
本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006]
一株耐盐碱的蒙氏假单胞菌，该菌株为蒙氏假单胞菌属(pseudomonas monteilii)，命名为9-2，该菌于2021年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23666，其its序列如序列表seq no:1所示。
[0007]
本发明得到的蒙氏假单胞菌，是从鄂尔多斯盆地长庆油田油井平台附近的土壤中，经以长庆油田原油为唯一碳源的培养基驯化、分离得到的菌株。
[0008]
本发明得到的蒙氏假单胞菌生化理化特征如下：单菌呈杆状，革兰氏染色阴性，淀粉水解、乳糖发酵、甲基红、明胶液化、吲哚反应、甲基红试验为阴性，接触酶反应为阳性。菌落为白色，边缘不规则。
[0009]
本发明得到的蒙氏假单胞菌能在30℃、150r/min、ph值8.0、盐度3.0％、原油浓度 1％(v:v)的条件下，经14天的反应，可降解83.99％的石油烃。
[0010]
本发明得到的蒙氏假单胞菌具有耐盐碱的特性。该菌株可耐受ph5.0-10.0的酸碱度及0.5％-6.0％的盐度范围。
[0011]
本发明的优点和有益效果为：
[0012]
1.本发明中的蒙氏假单胞菌抗逆性、适耐性高。可耐受ph值为5.0-10.0，最高能耐受6％盐度的生长环境；
[0013]
2.本发明中的蒙氏假单胞菌可在高盐碱环境下降解83.99％的石油烃，不但具有很高的石油烃降解效率，而且具有很好的抗盐碱性。
附图说明
[0014]
图1为本发明蒙氏假单胞菌的菌落形态照片。
[0015]
图2为本发明蒙氏假单胞菌革兰氏染色后的显微照片。
[0016]
图3为本发明蒙氏假单胞菌在不同盐度下的48小时生长曲线。
[0017]
图4为本发明蒙氏假单胞菌在不同ph下的48小时生长曲线。
[0018]
图5为原油降解前后气相色谱图。(a)接种本发明蒙氏假单胞菌前原油色谱图，(b) 接种本发明蒙氏假单胞菌培养14天后提取的原油色谱图(nap-d为内标物氘代萘，pr为姥鲛烷，ph为植烷)。
[0019]
图6为降解前后不同碳数正构烷烃在饱和烃中的相对含量。
[0020]
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
[0021]
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0022]
实施例1：
[0023]
本实施例涉及蒙氏假单胞菌pseudomonas monteilii 9-2的分离鉴定。
[0024]
具体步骤如下：
[0025]
取长庆油田周边5-10cm深的含石油烃的表层土壤，称取5g加入到装有200ml无菌水的灭菌锥形瓶中，在30℃，130r/min下摇床震荡培养24小时。将震荡培养后的锥形瓶静置1小时，吸取5ml悬液接种于加入1％长庆油田原油的100ml无机盐培养基中，在温度为30℃，转速为180r/min下摇床培养10天。培养结束后吸取5ml培养液加入相同的1％原油无机盐培养基中，在相同条件下培养7天。以此类推，以7天为一个周期连续培养5次。将菌液用平板划线法接种到lb固体培养基中，使其在30℃的恒温培养箱中生长48小时。将平板上的纯化菌株接种至斜面保藏培养基中，于-18℃冰箱中保存。
[0026]
对该纯化菌株进行革兰氏染色、生化理化特性鉴定、形态鉴定和扫描鉴定观察。结果如下：该菌株为革兰氏阴性菌，乳糖发酵、吲哚、淀粉水解、明胶液化、m.r.、v.p. 试验结果为阴性，接触酶、硝酸盐还原试验结果为阳性，菌落呈乳白色，边缘不规则，单菌呈杆状。
[0027]
在纯化后的菌体中获取细菌的基因组dna，使用相应的引物进行聚合酶链式反应 (pcr)扩增。扩增产物由广东美格基因科技有限公司使用abi3730测序平台进行测序。将测序结果在ncbi上进行对比，根据blast结果用邻接法构建系统发育树。结果如下：本发明涉及的菌株9-2为蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)，其its序列如序列表中seq no:1所示，与已发表菌株(cp043396.1)相似度为100％。该菌于2021年10 月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.23666。
[0028]
实施例2：
[0029]
本实施例涉及蒙氏假单胞菌pseudomonas monteilii 9-2的抗逆性，具体步骤如下：
[0030]
用nacl将100ml富集培养基的盐度分别调至：0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、 5.0％、6.0％、7.0％及8.0％，每个梯度设置三个平行组。将菌株接种到100ml富集培养基中培养48小时后，用灭菌的pbs溶液配制菌浓度为od
600
＝0.5的纯菌液，以5％的接种量接种到培养基中，在30℃、150r/min下培养48小时，每四小时以灭菌的富集培养基作为对照组用紫外可见分光光度计测量其在波长600nm下的吸光度。结果如图3所示，蒙氏假单胞菌pseudomonas monteilii 9-2在盐度为0.5％时在对数生长期生长最快，在 0.5％-5.0％盐度下生长较适宜，在6.0％时生长相对减弱，因此，降解菌9-2可耐受6.0％以下的盐度，在7.0％盐度下生长迟缓。
[0031]
同样用naoh和hcl将富集培养基的ph值分别调至：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、 10.0及11.0，每个梯度设置三个平行组。将菌株接种到100ml富集培养基中培养48小时后，用灭菌的pbs溶液配制菌浓度为od
600
＝0.5的纯菌液，以5％的接种量接种分别接种到不同ph值的培养基中，在30℃、150r/min下培养48小时，以灭菌的富集培养基作为空白组，每四小时用紫外可见分光光度计测量其在波长600nm下的吸光度。结果如图4所示，蒙氏假单胞菌pseudomonas monteilii 9-2在在ph范围5.0-10.0内生长较适宜，在ph11时，菌株生长迟缓，在ph3.0及ph4.0时几乎停止生长。
[0032]
本实施例中涉及的培养基配方如下：
[0033]
微量元素溶液：feso40.054g，mnso42.3g，cuso40.032g，超纯水1000ml。
[0034]
无机盐培养基：kh2po42.42g，k2hpo47.3g，(nh4)2so42g，nacl 2g，mgso40.3g， cacl20.03g，微量元素溶液1ml，超纯水1000ml，用naoh和盐酸将ph调至7.0。于高压灭菌锅灭菌20分钟。
[0035]
富集培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl 5g，超纯水1000ml，用naoh和盐酸将ph调至7.4，于高压灭菌锅灭菌20分钟。
[0036]
斜面保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂粉15g，超纯水1000ml，用naoh和盐酸将ph调至7.4，于高压灭菌锅灭菌15分钟。
[0037]
实施例3：
[0038]
本实施例涉及蒙氏假单胞菌pseudomonas monteilii 9-2在盐碱环境下的原油降解特性，具体步骤如下：
[0039]
将新鲜菌株在100m l富集培养基中培养48小时后，用灭菌的pbs溶液配制菌浓度为od
600
＝0.5的纯菌液，以5％的接种量接种到以1％原油为唯一碳源的无机盐培养基中，调整溶液ph值为8.0，盐度为3.0％的高盐碱环境。每组设置3个平行样，在30℃、 180r/min的条件下培养14天。然后用20ml 60-90沸程的石油醚进行萃取，每个样品萃取三次并合并萃取液。以未接种菌剂的原油培养基中萃取的原油作为对照组。将萃取液离心三次取上清液，用na2so4吸收水分转移至容量瓶，再用石油醚定容至20ml。充分摇匀后用移液枪取出200μl样品，加入100μl 0.3mg/ml c
24d50
和500μl 0.05mg/ml氘代萘作为内标备用。使用安捷伦6890n(gc)/5973b(msd)气相色谱质谱联用仪对样品进行gc-ms分析。用气相色谱图积分峰面积算出石油烃各组分降解率。结果如图5 所示，经计算，pseudomonas monteilii 9-2可
在原油初始浓度为1％(v:v)的条件下在14 天内降解83.99％的石油烃。如表1所示，经过14d摇床培养，nc13到nc20的正构烷烃分别被降解了38.85％、69.88％、82.84％、90.38％、94.69％、98.13％、98.58％和98.45％。 nc21到nc33在降解后残油中的含量均小于检出限，该结果说明pseudomonas monteilii 9-2对短链及长链正构烷烃均有很好的降解效果，且对长链正构烷烃降解效果更佳。经 pseudomonas monteilii 9-2降解前后不同碳数正构烷烃在饱和烃中的相对含量如图6所示。
[0040]
表1
[0041][0042]
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。