OsTPR075的突变体在水稻抽穗期调控过程中的应用

ostpr075的突变体在水稻抽穗期调控过程中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及ostpr075的突变体在水稻抽穗期调控过程中的应用。


背景技术：

2.水稻是世界上重要的粮食作物，为全世界近一半的人口提供食物来源，在农业生产和科学研究过程中都具有举足轻重的地位。水稻的抽穗期(开花)是水稻从营养生长转换到生殖生长的重要标志，是决定水稻繁衍的重要农艺性状，也是人工选择的主要目标性状之一。水稻抽穗期的调控是一个极其复杂的生命过程，由基因等内在的遗传因素和光温等外界的环境因素共同决定。水稻抽穗期决定了水稻品种在不同地域的适应能力和产量。然而抽穗期的调控十分复杂，现有的研究成果并不能完全阐释抽穗期变异的全部机制。因此，对开花基因的分子调控机制的研究对农业生产仍具有重要的理论指导意义。
3.抽穗期通常是指水稻从播种到穗子从剑叶中伸出所需要的生长天数。抽穗期的早与迟会影响水稻光合作用产物的积累，然后影响水稻灌浆时期籽粒的充实进程，最终影响水稻的产量和稻米品质(王洪波等，2020)。经过漫长的进化，植物进化出多种途径诱导开花，主要途径包括光周期途径、温周期途径、自主途径、春化途径、赤霉素途径和年龄途径(bl
ü
mel等，2015；fornara等，2010；srikanth和schmid，2011；teotia和tang，2015；he和amasino，2005；cho等，2017)。研究表明，在不同的环境条件下，植物体内的这些途径综合反应并转化成相应的信号，经过一系列复杂的基因互作网络调控的信号转导，最后将成花信号传递给成花素flowering locus t(ft)，ft进而促进花分生组织特异基因表达，诱导成花(刘丽敏等，2016；bl
ü
mel等，2015)。ft合成于叶片韧皮部的伴细胞中，在转运到sam后才能促进成花转化。2012年liu等的研究发现，拟南芥ftip1会影响ft蛋白从叶片运输到顶端分生组织的过程，进而调控拟南芥开花；song等(2017)的研究也同样表明，osftip1通过影响rft1(rice flowering locus t 1)的转运影响长日照下水稻的开花，osftip1表现出明显的晚花现象。2019年，liu等发现在拟南芥中quirky(qky)可以和syntaxin of plants121(syp121)互作共同调控ft的转运。成花素作为水稻开花过程中最关键的调控因子，水稻中成花素其基因功能缺失后水稻将无法抽穗结实，严重影响着水稻的产量。此外，成花素转运同样影响着水稻的抽穗期，对于调控不同地域水稻的抽穗期以及分子设计育种同样具有重要的理论和实践意义。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供水稻基因ostpr075的突变体及应用。本发明研究发现了一种能够直接用于调控水稻抽穗期的基因及其突变体，为水稻抽穗期的调控提供了新的途径和方式。
6.为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.在第一个方面，本发明提供一种水稻基因ostpr075的突变体，所述突变体为seq id no.1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代、缺失和/或添加而获得的功能改变的突变体。
8.本发明水稻基因ostpr075的全长cdna序列(如seq id no.1所示)，编码724个氨基酸(如seq id no.6所示)。本发明发现与野生型相比，当该基因(ostpr075)被突变或敲除时，水稻抽穗期延迟；当该基因过表达时，水稻抽穗期提前，表明该基因及其突变体能够直接用于调控水稻抽穗期。在本发明中，水稻基因ostpr075的突变体也指水稻基因ostpr075的突变基因，当基因突变后所编码的蛋白的功能与正常基因编码蛋白的功能出现差异，也即基因功能发生缺失或改变。
9.在一个实施方案中，所述突变体的核苷酸序列如seq id no.2～seq id no.5任一项所示。
10.在本发明中，本发明也旨在涵盖与本发明所述核苷酸序列具有88％以上相似度，且功能相同的突变体。
11.在一个实施方案中，所述突变体编码的蛋白具有如seq id no.7～seq id no.10任一项所示的氨基酸序列。
12.当所述突变体的核苷酸序列如seq id no.2所示时，其蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示，其余情况于此类似。
13.在第二个方面，本发明提供了包含前述的水稻基因ostpr075的突变体的生物材料，所述生物材料包括表达盒、重组载体或重组细胞。
14.在一个实施方案中，所述重组载体包括pcambia1300载体。
15.在一个实施方案中，所述重组细胞包含所述重组载体；在一个具体的实施方案中，所述重组细胞包括农杆菌，优选为农杆菌eha105。
16.在第三方面，本发明提供了水稻基因ostpr075或其突变体在调控水稻抽穗期中的应用，所述应用包括使水稻过表达基因ostpr075或使水稻包含前述的水稻基因ostpr075的突变体。
17.所述应用可采取包括转基因、杂交或无性繁殖等手段实现。在一个实施方案中，含有所述突变体的转基因植物的制备方法包括将突变基因插入表达载体，并将表达载体导入宿主菌(如农杆菌)；用所述宿主菌转化目标植物，获得转基因植株；所述的目标植物为水稻。
18.在第四方面，本发明提供了一种调控水稻抽穗期的方法，所述方法包括通过上调或下调目的植物中水稻基因ostpr075的表达量和/或活性来使抽穗期提早或延迟。
19.在一个实施方案中，所述方法包括通过构建过表达载体ubi：ostpr075，经转基因的方法获得过表达转基因植株，使目的植物中水稻基因ostpr075的表达量和/或活性上调。
20.在一个实施方案中，所述方法包括通过对所述基因进行敲除或突变来下调目的植物中水稻基因ostpr075的表达量和/或活性。
21.在一个实施方案中，采用含有实施突变体的生物材料转染植物组织，经筛选得到表达ostpr075突变体编码蛋白的植物。
22.在一个实施方案中，通过对ostpr075基因进行人为干预，导致无法表达蛋白、蛋白氨基酸发生改变或蛋白缺失部分片段的表达。
23.在一个优选实施方案中，以基因ostpr075为靶标，设计基于crispr/cas9的sgrna序列，构建ostpr075基因突变体的载体，获得所述基因功能缺失的转基因水稻。
24.在一个具体的实施方案中，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.14或seq id no.18所示。
25.本发明还提供了水稻基因ostpr075或其突变体在水稻种植领域中，例如水稻改良育种、制种中的应用。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
27.本发明提供了一种具有调控水稻抽穗期功能的基因ostpr075，并给出了该基因及其突变体的具体核苷酸序列。此外，应用所述ostpr075或其突变体或含有其的生物材料可以调控水稻抽穗期，并给出了具体的调控方法，当将所述基因过表达时，水稻抽穗期提前；当所述基因被敲除或突变时，水稻抽穗期延迟。本发明为改良水稻品种在不同地域的适应能力和提高作物产量提供了清晰简单、推广性强的技术方案，具有潜在的经济价值。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明提供的四个ostpr075基因突变体突变位置序列示意图；
30.图2为本发明提供的与野生型植株相比，ostpr075基因突变体植株的表型和抽穗期时间统计(短日照条件下)；
31.图3为本发明提供的与野生型植株相比，ostpr075基因突变体植株的表型和抽穗期时间统计(长日照条件下)；
32.图4为本发明提供的与野生型植株相比，ostpr075过表达转基因植株ostpr075基因的表达情况；
33.图5为本发明提供的与野生型植株相比，ostpr075基因过表达植株的表型和抽穗期时间统计(短日照条件下)；
34.图6为本发明提供的与野生型植株相比，ostpr075基因过表达植株的表型和抽穗期时间统计(长日照条件下)。
具体实施方式
35.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
37.实施例1：ostpr075基因的克隆
38.使用omega公司的植物rna提取试剂盒从水稻中提取水稻总rna。然后以1μg的总
rna为模板，按照cdna合成试剂盒(yeasen)操作说明将rna反转录为cdna。
39.根据(http：//rice.plantbiology.msu.edu/expression.shtml)网站得到ostpr075的完整orf，设计特异引物：5’端引物为atgccggcaattatgttatgcagtt(seq id no.11)；3’端引物为tcattgcagcatgatggggaggtgc(seq id no.12)。
40.pcr反应体系为2xmix 25μl，正向/反向引物10μm各1μl，模板(cdna)5μl，灭菌水补齐至50μl。反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性30s，tm退火30s，72℃延伸2kb/min，35～40个循环，72℃延伸5min。最终扩增得到ostpr075的2175bp(含终止密码子)全长cdna序列(如seq id no.1所示)，编码724个氨基酸(如seq id no.6所示)。
41.实施例2：ostpr075基因突变体的构建
42.基于crispr-cas9技术，构建两种ostpr075基因突变体的载体pcambia1300-cas9-os-ostpr075：
43.2.1选取ostpr075基因cds序列的66～88位(gcctgaatctcttgcgacgcggg，如seq id no.13所示，其中下划线部分为符合ngg的pam序列)序列为靶位点1(命名为cas9-1)，合成sgrna-1，核苷酸序列为gcctgaatctcttgcgacgc(如seq id no.14所示)。
44.用bbsi酶切基因编辑载体psgr-cas9-os，先将引物退火，退火反应体系包括，10μl正向引物f：tgtgtgcctgaatctcttgcgacgc(如seq id no.15所示)，10μl反向引物r：aaacgcgtcgcaagagattcaggca(如seq id no.16所示)和80μl10
×
t4 buffer，反应体系混匀后，95℃孵育10min后置于冰上降温，再与酶切后的载体psgr-cas9-os进行连接，连接体系包括2μl退火产物，2μl回收酶切载体，0.5μl 10
×
t4 buffer和0.5μl t4连接酶室温连接30min，并将连接产物转化入大肠杆菌感受态dh5α。
45.转化程序如下：将连接产物加入感受态大肠杆菌中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激1min，再冰上静置2min，加入400μl lb，37℃复苏摇菌1h，8000rpm离心1min，吸掉大部分上清，留100μl液体吸打均匀，涂在lb平板(含50μg/ml kan)培养，第二天挑选单克隆进行测序鉴定，分析载体是否构建成功。
46.2.2选取ostpr075基因上的ccacgaatgactactgctattgc序列(如seq id no.17所示)为靶位点2(命名为cas9-2)，合成sgrna-2(cgaatgactactgctattgc，如seq id no.18所示)，而后采用与实施例2.1相同的方法构建ostpr075基因突变体，退火反应体系所用到的引物包括，正向引物f：tgtgtcgaatgactactgctattgc(如seq id no.19所示)，反向引物r：aaacgcaatagcagtagtcattcga(如seq id no.20所示)。其余连接方法与实施例2.1相同。
47.实施例3：ostpr075基因突变体的获得和鉴定
48.以水稻(日本晴)愈伤组织为实验材料。将实施例2得到的ostpr075的基因突变体载体通过冻融法转化至农杆菌eha105中。挑取含有ostpr075基因突变体载体的农杆菌单克隆于2ml含有利福平和壮观霉素的lb液体培养基中28℃200rpm培养过夜，再取1ml菌液到10ml含有利福平和壮观霉素lb中培养5h，4000rpm室温离心10min，弃上清，用50ml aam-as重悬液重悬菌体；将生长状态良好的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液中浸染30min，28℃暗培养2天。2天后用无菌水冲洗愈伤直至清洗液澄清，然后将愈伤转移到含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上筛选两周左右。将筛选出的抗性愈伤转移到含50mg/l潮霉素的分化培养基上培养。2～3周后将变绿的水稻幼芽转移到生根培养基上诱导生根。对于突变体阳性植株，需要提取t0代植株的gdna，pcr鉴定并测序。
49.ostpr075突变体的鉴定：提取t0代转基因植株叶片作为模板，设计特异正向引物f(aatgcctcgatcgcctgaat，如seq id no.21所示)和反向引物r(atggcctcgagaagcaaact，如seq id no.22所示)进行pcr扩增，筛选得到cas9-1 t0代阳性转基因植株(阳性植株pcr扩增产物大小为467bp)，测序并筛选发生突变的株系。设计特异正向引物f(ccattggtctggtggggaga，如seq id no.23所示)和反向引物r(attcgtggcatcaggcttct，如seq id no.24所示)进行pcr扩增，筛选得到cas9-2 t0代阳性转基因植株(阳性植株pcr扩增产物大小为463bp)，测序并筛选发生突变的株系。
50.t0代自花授粉得到t1代，t1代自花授粉得到t2代。对t2代植株再次进行筛选，筛选出不含载体且纯合突变的独立株系，最终得到了四个突变体，分别命名为ostpr075-1，ostpr075-2，ostpr075-3和ostpr075-4，其中靶位点1处发生了两种突变，ostpr075-1在此位置发生了1个碱基的增添( t)，突变后核苷酸序列如seq id no.2所示，ostpr075-2在同样位置也发生了1个碱基缺失(-a)，突变后核苷酸序列如seq id no.3所示，突变体ostpr075-1和ostpr075-2的核苷酸序列变化导致编码蛋白相应位置后移码突变；靶位点2处发生了两种突变，ostpr075-3在此位置发生了1个碱基的缺失(-t)，突变后核苷酸序列如seq id no.4所示，ostpr075-4在同样位置发生了1个碱基的缺失(-a)，突变后核苷酸序列如seq id no.5所示，共计四个突变体，如图1所示。
51.实施例4
52.4.1 ostpr075过表达载体的构建
53.构建了ostpr075基因过表达载体ubi：ostpr075，具体步骤包括，先将实施例1中扩增得到的全长的不含终止密码子的目的基因pcr产物(2172bp)进行纯化(omega胶回收试剂盒)。将所需载体超表达载体质粒用hind iii进行酶切，电泳检测后纯化产物，用同源重组(vazyme)的方法进行连接，反应体系如下：线性化载体2μl，插入片段3μl，5
×
buffer 4μl，exnase ii 2μl，灭菌水补齐至20μl。于pcr仪中37℃孵育30min。将产物转化大肠杆菌感受态dh5α，涂抹在lb平板(含50mg/l kan)，37℃过夜倒置培养。第二天挑取单菌落进行测序鉴定。
54.4.2 ostpr075过表达植株的获得和鉴定
55.以水稻(日本晴)愈伤组织为实验材料。将实施例4.1得到的植物表达载体通过冻融法转化农杆菌eha105。按照实施例3中的转基因方法获得过表达植株。最后通过qrt-pcr检测目的基因在野生型和转基因植株中的表达情况，初步筛选过表达阳性植株，分别命名为#1～#30。
56.ostpr075过表达植株的鉴定：
57.取14d的野生型和转基因水稻无菌苗进行rna提取，以1μg的rna做模板，按照cdna合成试剂盒(yeasen)操作说明合成第一链cdna。以ostpr075基因cdna设计特异定量pcr引物(正向引物f为aggtcttggtagagtgacagatgc，如seq id no.25所示，反向引物r为tggccatgcagactcgacaatg，如seq id no.26所示)，通过qrt-pcr检测ostpr075基因在野生型和转基因株系中的表达情况，结果发现获得的30株转基因植株均过表达，并随机从中挑选了5个株系#1、#6、#13、#15和#22作为示例。如图4所示，转基因株系#1、#6、#13、#15和#22，纵坐标代表分别上调了约5倍、10倍、15倍、6倍和5倍，证明构建的过表达载体均能在植株中促进ostpr075基因表达，并接下来用这5个株转基因株系进行抽穗期分析。
58.实验例突变体和过表达植株的抽穗期分析
59.将野生型(日本晴)、四种突变体ostpr075突变体种子(ostpr075-1，ostpr075-2，ostpr075-3和ostpr075-4)以及过表达株系种子(#1、#6、#13、#15和#22)在37℃黑暗浸种萌发后，每种植株分别种植于营养土中，然后放置于同一条件下进行培养。长日照为14h亮/10h暗，短日照条件为10h亮/14暗。待野生型日本晴抽穗时统计各个野生型和ostpr075突变体抽穗期。
60.结果表明，在长短日照条件下，与野生型相比，所有的ostpr075基因的突变体均表现出明显的抽穗期延迟现象。在短日照条件下，与野生型相比，ostpr075突变的抽穗期平均延迟7天左右(如图2所示)；在长日照条件下，与野生型相比，ostpr075突变的的抽穗期平均延迟15天左右(如图3所示)。
61.在长短日照条件下，与野生型相比，所有的ostpr075基因过表达均表现出明显的抽穗期提早现象。在短日照条件下，与野生型相比，ostpr075超表达株系抽穗期分别平均提前5天、10天、10天、5天、5天(如图5所示)；在长日照条件下，与野生型相比，ostpr075过表达株系抽穗期分别平均提前6天、12天、15天、7天、6天(如图6所示)。
62.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。