使用直接重编程的诱导性多巴胺能神经元祖细胞的生产方法与流程

1.本公开涉及一种通过从成体细胞直接重编程来制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的方法。此外，本公开涉及通过该方法制备的诱导性多巴胺能神经元祖细胞及其用途。


背景技术：

2.帕金森病(pd)的发生是由于黑质致密部(substania nigra pars compacta，snpc)中多巴胺能神经元(dn)的损失，并且这会导致运动活动逐渐恶化。目前，治疗pd患者的主要过程是使用增加多巴胺浓度的药物和直接刺激大脑深部神经元的电子设备来缓解症状。虽然这种方法在缓解pd的运动症状中是有效的，但它的具有无法阻止pd恶化的局限性。
3.最近，作为一种新型pd治疗方法，报道了一种细胞替代疗法，其中使用人胎儿中脑来移植多巴胺分泌细胞。特别地，这种疗法即使在一些患者停止施用药物后也改善运动症状，并且超过18年没有恶化非运动症状。此外，在移植受体的死后组织分析中，显示供体来源的dn在移植后可在纹状体中维持广泛的神经支配长达24年。这些结果表明，移植受体大脑中供体来源的功能性dn的长期存活与pd治疗的积极结果存在关联。
4.然而，在对有严重症状的pd患者进行的双盲研究中，仅观察到短暂且轻微的临床效果。经确认，免疫抑制剂施用终止后活细胞数量少，这是由于移植组织的免疫排斥所致，并且预计这成为临床试验失败的主要原因。此外，移植物诱导的运动障碍发生在一些受体上，并且他们的大脑包含移植物中的血清素神经元。它还具有与使用胎儿组织有关的伦理问题和细胞数量有限的技术问题。因此，为了提高pd细胞治疗方案的有效性，需要一种新的方法来获得均质且低免疫原性的dn。
5.重编程技术是一种可以将体细胞的细胞命运转化为诱导性多能干细胞(ipsc)的技术。考虑到人ipsc(hipsc)具有分化成所有细胞类型的能力和它们的无限的自我更新特性，人ipsc(hipsc)是自体细胞疗法的合适细胞来源。
6.在使用多能干细胞来源的多巴胺能神经元祖细胞(psc-dp)治疗pd的临床前实验中，移植物在啮齿动物和非人灵长类动物pd模型中显示出良好的活力并有效地起到多巴胺分泌细胞的作用。尽管有如此明显的功效，但未分化的psc有可能保留在分化的细胞中，并且由于潜在的致瘤性，临床使用中关于psc来源的多巴胺能神经元(psc-dn)的安全问题仍然存在。此外，据报道，从psc分化的dp的增殖能力有限，并在重复继代培养过程中向dn分化的能力逐渐消失。因此，对于成功的pd治疗，需要能够更安全、更稳定地增殖的新细胞。
7.同时，直接重编程技术是另一种转化细胞命运的方法，并且其可以通过目标细胞特异性和/或多能因子的异位表达来进行。有趣的是，据报道，用至少一种多能因子直接重编程可以产生可增殖的干细胞/祖细胞。重要的是，越来越清楚的是，通过多能细胞-特异性因子介导的直接重编程(pdr)方法进行重编程的细胞不会形成肿瘤。此外，人诱导性神经干细胞(hinsc)具有使增殖能力稳定、在冷冻保存时长期储存而增殖分化不发生变化、和分化过程容易成为可能等优点。因此，预期pdr可以克服psc-dp的有限增殖和稳定性问题。
8.此前，本公开人已通过pdr方法(韩国专利公开第10-2015-0015294号)成功地产生了小鼠诱导性多巴胺能神经元祖细胞(midp)。因此，本公开人通过引入多能因子随后激活中脑特异性信号传导进行了人成体细胞是否直接重编程为人idp(hidp)的实验。


技术实现要素：

9.技术问题
10.本公开的目的是提供一种制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的方法，该方法能够通过直接重编程从成体细胞连续继代培养，具有出色的分化为多巴胺能神经元的能力，并且在体内没有致瘤性的风险。
11.本公开的另一目的是提供由上述方法制备的诱导性多巴胺能神经元祖细胞。
12.本公开的又一目的是提供可与多能干细胞来源的多巴胺能神经元祖细胞区分开的诱导性多巴胺能神经元祖细胞。
13.本公开的又一目的是提供一种用于预防或治疗帕金森病的药物组合物。
14.本公开的又一目的是提供一种预防或治疗帕金森病的方法。
15.本公开的又一目的是提供诱导性多巴胺能神经元祖细胞的用途。
16.本公开的又一目的是提供一种筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的方法。
17.本公开的又一目的是提供一种用于制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的混合物或培养基组合物。
18.本公开的又一目的是提供一种制备多巴胺能神经元的方法。
19.解决方案
20.为实现上述目的，本公开提供一种制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞(idp)的方法，该方法包括：a)将选自由oct4、sox2、klf4和myc组成的组中的一种或多种基因引入成体细胞；b)在包含egf和fgf2的培养基中培养该细胞；以及c)在包含fgf8、shh、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂的培养基中培养该细胞。
21.本公开还提供通过上述方法制备的多巴胺能神经元祖细胞。
22.本公开还提供诱导性多巴胺能神经元祖细胞，其中，(i)与源自多能干细胞的多巴胺能神经元祖细胞相比，选自由corin、foxa2和lmx1a组成的组中的一种或多种基因表现出降低的表达；(ii)与源自多能干细胞的多巴胺能神经元祖细胞相比，选自由en1、pax2、pax5、pax8和spry1组成的组中的一种或多种基因表现出增加的表达；或者(iii)表现出(i)中的降低的表达和(ii)中的增加的表达。
23.本公开还提供一种用于预防或治疗帕金森病的药物组合物，该药物组合物包含诱导性多巴胺能神经元祖细胞作为活性成分。
24.本公开还提供一种预防或治疗帕金森病的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的药物组合物。
25.本公开还提供诱导性多巴胺能神经元祖细胞用于预防或治疗帕金森病的用途。
26.本公开还提供诱导性多巴胺能神经元祖细胞在制备用于预防或治疗帕金森病的药物中的用途。
27.本公开还提供一种筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的方法，包括用预防或治疗帕金森病的候选物质处理诱导性多巴胺能神经元祖细胞。
28.本公开还提供一种用于筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的组合物，该组合物包含诱导性多巴胺能神经元祖细胞。
29.本公开还提供诱导性多巴胺能神经元祖细胞用于筛选预防或治疗帕金森病的药剂的用途。
30.本公开还提供一种用于制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的混合物，该混合物包含：人成体细胞，该人成体细胞中引入了选自由oct4、sox2、klf4和myc组成的组中的一种或多种基因；egf；fgf2；wnt信号传导激动剂；和tgf-β抑制剂。
31.本公开还提供一种混合物，该混合物包含诱导性多巴胺能神经元祖细胞、fgf8、shh、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
32.本公开还提供一种用于制备诱导性多巴胺能祖细胞的培养基组合物，该培养基组合物含有egf、fgf2、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
33.本公开还提供一种用于制备或维持诱导性多巴胺能祖细胞的培养基组合物，该培养基组合物包含fgf8、shh、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
34.本公开还提供一种制备多巴胺能神经元的方法，该方法包括在神经元分化培养基中培养诱导性多巴胺能神经元祖细胞。
35.有益效果
36.由于使用了患者的成体细胞，本公开制备的诱导性多巴胺能神经元祖细胞几乎没有副作用(例如，免疫排斥和运动障碍)的风险，并且不存在伦理问题。此外，本公开的诱导性多巴胺能神经元祖细胞能够通过连续继代培养稳定增殖，能够通过直接重编程进行体内移植而没有致瘤性的风险，并且具有极好的分化成神经元的能力，因此可用于细胞疗法。
附图说明
37.图1示出了说明用于hidp的直接重编程方案开发的因素组合的示意图。
38.图2示出了在图1所示的每种条件下直接重编程hidp的结果的代表性明场图像。在sev转导后第22天获得明场图像。
39.图3示出了在直接重编程hidp的初期(d1至d8)，由指定因素的不同组合得到的神经集落样形式的集落数量的定量分析结果。
40.图4示出了在直接重编程hidp的后期(d8至d21)，由指定因素的不同组合得到的神经集落样形式的集落数量的定量分析结果。
41.图5示出了在用于直接重编程hidp的培养基中，在shh浓度为200ng/ml或800ng/ml的情况下，foxa2、shh和lmx1a的表达水平的测量结果。
42.图6示出了显示hidp的直接重编程方案的示意图和指定天数的代表性明场图像。ef4c表示用egf、fgf2、chir99021、a83-01、2-磷酸-l-抗坏血酸和nab处理，而sf3c表示用shh、fgf8、chir99021、a83-01和2-磷酸-l-抗坏血酸处理。
43.图7示出了通过免疫细胞化学染色所确认的本公开实施方式中获得的hinsc和hidp中corin(其为中脑基底板特异性标志物)表达的结果。
44.图8示出了在本公开的实施方式中获得的hinsc和hidp中的中脑dp特异性标志物(corin、foxa2、lmx1a和en1)的表达水平的qrt-pcr的结果。使用gapdh的ct值计算dct值。
45.图9示出了通过针对en1(其为中脑特异性标志物)和hoxb1(其为后脑特异性标志
物)进行免疫细胞化学染色确认在本公开实施方式中获得的hidp的局部识别的结果。
46.图10示出了在本发明实施例中获得的hidp的连续继代培养期间细胞总数的计数结果。数据表示相对于起始细胞数的倍数变化的对数值。
47.图11示出了通过免疫细胞化学染色确认在中后期继代培养的hidp中有无corin、ki-67、pax2、pax5、foxa2、lmx1a和pax6表达的结果。
48.图12示出了本公开实施例中获得的hidp中corin和foxa2的流式细胞术分析的结果。
49.图13示出了本公开实施例中获得的hidp和psc-dp的tom20的免疫细胞化学染色的结果(上)。下部示出了通过image j的骨架化函数对荧光图像进行变换的结果。
50.图14示出了从本公开实施例中获得的hidp和psc-dp的骨架化图像定量分析每个细胞的线粒体数量的结果。箱线图中的每个点代表一个细胞的值。水平条表示中值。**表示p＜0.01，使用学生t检验获得。
51.图15示出了本公开实施例获得的hidp和psc-dp的每个线粒体的分支数的定量分析的结果。数据表示所有线粒体中存在的分支数。
52.图16示出了使用热图可视化deg分析结果的图。
53.图17示出了通过pca图分析说明起始细胞、中期细胞和最终细胞的不同基因表达谱的结果。
54.图18示出了使用deg对亲本成纤维细胞(fb)与本公开实施例中获得的hidp之间进行注释聚类分析的结果。
55.图19示出了在“有丝分裂细胞周期”go术语中通过热图分析hidp的直接重编程期间基因表达水平的可视化结果。
56.图20示出了通过转录组谱的散射分析确认在本公开实施方式中获得的hidp与fb高度可区分的图。
57.图21示出了为比较在本公开实施例中获得的hidp的质量而进行的相关分析的结果。使用根据iap分类的有无的源自esc的dp的转录组谱作为对照。
58.图22示出了在直接重编程hidp期间分析的基因的h3k4me3和h3k27ac热图结果。基因列表表示从fb在启动子区域中获得h3k4me3标记的基因。
59.图23示出了在直接重编程hidp期间通过微阵列分析说明基因表达水平变化的图。基因列表从图22的基因列表中排除不存在于微阵列基因列表中的基因。
60.图24示出了从fb在启动子区域中获得h3k4me3标记的基因的go生物学过程的分析结果。
61.图25和图26示出了在直接重编程hidp期间属于“中脑发育”和“神经系统发育”的go术语的所有基因的h3k4me3和h3k27ac标记的变化。箱内的粗黑线代表中值。chip-seq信号代表读取次数。
62.图27示出了说明直接重编程hidp期间代表性中脑多巴胺能谱系基因的表观遗传变化的图。
63.图28示出了在直接重编程hidp期间h3k4me3和h3k27ac的热图分析结果。基因列表通过从fb在启动子区域中丢失h3k4me3标记的基因获得。
64.图29示出了在直接重编程hidp期间来自微阵列数据集的基因表达变化的分析结
果。基因列表从图28的基因列表中排除不存在于微阵列基因列表中的基因。
65.图30示出了从fb在启动子区域中丢失h3k4me3标记的基因的go生物学过程的分析结果。
66.图31示出了与成纤维细胞相关的基因的基因组浏览器照片(genome browser shot)，其示出了直接重编程hidp期间的h3k4me3和h3k27ac组蛋白标记变化的分析结果。
67.图32示出了通过免疫细胞化学染色确认在本公开实施方式中获得的hidp和hinsc分化成th

和tuj1

神经元的结果。
68.图33示出了说明th

多巴胺能神经元的定量分析结果的图。
69.图34示出了说明tuj1

神经元的定量分析结果的图。
70.图35示出了从hidp开始向神经元分化后第12周时针对每种标志物的免疫细胞化学染色的结果。
71.图36示出了用抗gfap抗体染色后分化成神经元的hidp的整个板的扫描图像。
72.图37示出了gfap

星形细胞的定量分析的结果。
73.图38示出了hidp来源的神经元中针对中脑多巴胺能神经元标志物(th、foxa2、nurr1、lmx1a和en1)的免疫细胞化学染色的结果。
74.图39示出了为了比较从hinsc和hidp分化的神经元中foxa2、nurr1、en1和hoxa2的表达水平所进行的qrt-pcr的结果。
75.图40示出了通过对tph2

、vglut1

、gaba

、和chat

神经元的免疫细胞化学染色确认hidp-神经元的纯度的结果。
76.图41示出了hidp来源的神经元中tph2

、vglut1

、gaba

、和chat

神经元的定量分析的结果。
77.图42示出了转录组谱的散射分析结果，其表明hidp来源的神经元与hidp是不同的。
78.图43示出了hidp来源的神经元中与hidp相比上调5倍的基因的david功能注释聚类的分析结果。
79.图44示出了针对成熟神经元标志物(map2、neun和syn)和单胺转运蛋白(vmat2)的免疫细胞化学染色结果以确认hidp来源的神经元的成熟度和特异性。
80.图45示出了hidp来源的神经元和hinsc来源的神经元中多巴胺分泌的测量结果。
81.图46示出了在膜片钳套件的浴上(左)培养的和具有附接到膜的膜片微电极的(右)hidp来源的神经元的相衬图像。
82.图47示出了说明hidp来源的神经元的自发激活电位(ap)的图。
83.图48示出了说明在用na

通道阻滞剂河豚毒素(ttx)处理之前(中间)和之后(下部)由电流注入步骤(当前方案：上部)引起的膜电位变化的记录的图。
84.图49示出了说明响应于电流注入量而引起的ap记录的图。
85.图50示出了说明在ap之后由重复的短超极化触发的反冲去极化(recoiled depolarization)(箭头)的记录。
86.图51示出了相对于内侧na

(ina)和外侧k

电流(ik)的记录的全细胞电流的记录，该内侧na

(ina)和外侧k

电流(ik)在ttx存在之前(中间；具有内侧na

电流)和ttx存在之后(下部；阻断na

电流)根据电压阶段(方案：顶部)通过去极化诱导。
87.图52示出了来自hidp和psc-dp微阵列数据集的可预测标志物和常见dp标志物的基因表达水平。
88.图53示出了对常见dp标志物(foxa2、lmx1a和corin)进行的qrt-pcr结果。
89.图54示出了对预测性标志物(en1、pax2、pax5、pax8和spry1)进行的qrt-pcr结果。
90.图55示出了来自hidp和psc-dp微阵列数据集的头端(rostral)和尾端(caudal)基因的基因表达水平。
91.图56示出了从hidp开始向神经元分化后的指定天数针对细胞周期(ki-67)标志物的免疫细胞化学染色的结果。
92.图57示出了hidp来源的神经元的ki-67

细胞的定量分析的结果。
93.图58示出了说明了在所有染色体中直接重编程hidp期间从fb到第22代继代培养的hidp的突变丰度、并代表性地说明了第14号染色体上的结果的图。snv是通过与性别匹配的参考人基因组进行比较来鉴定的。
94.图59示出了继代培养24次的hidp的核型。
95.图60示出了说明根据hidp移植的有无，阿扑吗啡在帕金森病诱导的小鼠中诱导的旋转次数的图。
96.图61示出了用th和dat染色的移植物的免疫细胞化学染色的结果。出于染色目的，移植后12周处死各个小鼠。
97.图62示出了pd模型小鼠中th

神经元的定量分析的结果。
98.图63示出了说明小鼠纹状体中的nissl染色以确认移植物诱导的肿瘤形成的图像。
99.图64示出了说明人特异性线粒体的dab染色以确认移植物诱导的肿瘤形成的图像。
100.图65示出了确认在免疫缺陷小鼠中通过皮下移植的hidp(n＝6)和分化的hidp(5dpd，n＝8，和7dpd，n＝10)的肿瘤形成能力的结果。同质hipsc(n＝6)用作阳性对照。
101.图66示出了实验组中免疫缺陷小鼠的图像。在hipsc注射组的图像中，除了最右边的在第10周获得的图像之外，其余图像都是在6wpi下获得的。所有其他组的照片都是在10wpi时获得的。虚线表示肿瘤。
102.图67示出了用于确认在本公开实施方式中获得的a-hidp的特征的dp标志物的免疫细胞化学染色的代表性结果。
103.图68示出了在本公开实施例中获得的a-hidp的连续继代培养期间细胞总数的计数结果。数据表示相对于起始细胞数的倍数变化的对数值。
104.图69示出了本公开实施例中获得的a-hidp长期培养后的核型分析结果。
105.图70示出了通过流式细胞术确认在本公开实施例中获得的a-hidp的后期(p20至p21)在继代培养的a-hidp中的corin和foxa2的表达的结果。
106.图71示出了从本公开的实施例中获得的a-hidp分化的细胞的中脑多巴胺能神经元标志物的免疫细胞化学染色结果。
107.图72示出了从本公开实施例中获得的a-hidp分化的细胞中th

神经元的定量分析的结果。
108.图73示出了对从本公开实施例中获得的a-hidp分化的细胞中的tph2

、vglut1

、
gaba

、和chat

神经元的免疫染色结果。
109.图74示出了通过测量hidp来源的神经元和a-hidp来源的神经元中的多巴胺分泌来确认体外功能的结果。
110.图75示出了免疫细胞化学染色的结果，以确认在本公开实施例中获得的pbmc来源的hidp中corin、foxa2、ki-67、pax6和lmx1a的表达。
111.图76示出了通过qrp-pcr确认在本公开实施例中获得的pbmc来源的hidp中的中脑dp标志物的表达水平的结果。
112.图77示出了将在本公开实施例中获得的pbmc来源的hidp分化为神经元的结果的代表性明场图像。
113.图78示出了在将本公开实施方式中获得的pbmc来源的hidp分化为神经元之后，通过qrp-pcr确认中脑多巴胺能神经元和神经元成熟标志物的表达水平的结果。
114.图79示出了这样的图像，在该图像中，除了在本公开实施方式中使用的chir99021(即wnt信号传导激动剂)和a83-01(即tgf-β抑制剂)之外，尝试使用chir98014(即wnt信号传导激动剂)和sb431542(即tgf-β抑制剂)直接重编程hidp，并且确认了在每种条件下分离的hidp。
115.图80示出了确认使用chir98014和sb431542制备的hidp中主要标志物基因的表达的图。作为对照，使用了用毛发成纤维细胞与chir99021、a83-01制备的hidp。
116.图81示出了说明在重编程hidp和hipsc期间通过qrt-pcr测量的多能标志物oct4和nanog的表达变化的图。
117.图82示出了说明在重编程hidp和hinsc期间通过qrt-pcr测量的dp标志物(en1、lmx1a和foxa2)和nsc标志物(pax6)的表达变化的图。
118.图83示出了根据热激有无的重编程hipsc和hidp的过程的示意图。
119.图84示出了通过碱性磷酸酶染色确认在重编程为hipsc进行的条件(图83中的前三个条件)下产生的hipsc的结果。
120.图85示出了在直接重编程为hidp的情况(图83下部的两个条件)下foxa2的免疫细胞化学染色的结果。
121.图86示出了通过碱性磷酸酶染色确认在重编程为hipsc进行的条件(图83中的第二和第三个条件)下产生的hipsc的结果。
122.图87示出了用于确认小鼠idp的直接重编程条件在人成纤维细胞中是否也有效的实验的示意图。
123.图88示出了通过将小鼠idp的直接重编程条件应用到人成纤维细胞进行的实验而最终形成的细胞的形状。
124.最佳实施方式
125.在下文中，将详细说明本公开。
126.制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的方法
127.在一方面，本公开涉一种制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞(idp)的方法，该方法包括：a)将选自由oct4、sox2、klf4和myc组成的组中的一种或多种基因引入成体细胞；b)在包含egf和fgf2的培养基中培养该细胞；以及c)在包含fgf8、shh、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂的培养基中培养该细胞。
128.如本文所用，术语“成体细胞”是指已经发生分化的细胞，并且是指处于多能性(指分化成各种类型细胞的能力)完全丧失或大部分丧失的状态的细胞。在本公开中，它可以指已经完成分化的细胞，并且可以指通过增加多能因子的表达水平而成为能够恢复一些多能性或全能性的目标的细胞。
129.具体而言，成体细胞包括成纤维细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、间充质干细胞(msc)等，但不限于此。
130.此外，成体细胞可以来源于人。
131.在本公开的一个实施方式中，对于人新生儿成纤维细胞、人成体成纤维细胞和人外周血单个核细胞，通过应用本公开的制备idp的方法可以成功获得人idp(hidp)。
132.如本文所用，表述“选自由八聚体结合转录因子4(oct4)、性别决定区y(sry)-box 2sox2、kruppel样因子4(klf4)和myc组成的组中的一种或多种基因”，即公知的重编程因子oskm因子(yamanaka因子)，是指在分化细胞去分化以再次获得多能性的过程中起重要作用的因子。也就是说，该表述是指起到维持或获得细胞自我更新能力或多能性作用的因子。特别地，这些因子可以在将已经经历分化的细胞重编程成全能或多能细胞中发挥作用。此外，myc可以是l-myc或c-myc。
133.在本公开的一个实施方式中，可以将oct4、sox2、klf4和c-myc引入成体细胞。重编程因子的引入可以通过本领域公知的方法进行，例如可以使用仙台病毒载体。
134.如本文所用，术语“表皮生长因子(egf)”是一种表皮生长因子，是指促进上皮细胞增殖的肽中的一种。
135.如本文所用，术语“成纤维细胞生长因子2(fgf2)”是指成纤维细胞生长因子2，并且已知通过刺激成纤维细胞在内皮细胞或平滑肌细胞的增殖和血管生成中起重要作用。
136.如本文所用，术语“成纤维细胞生长因子8(fgf8)”是指成纤维细胞生长因子8，它是刺激成纤维细胞以诱导增殖的生长因子，并且已知在胎儿颅神经的发育中起重要作用。
137.如本文所用，术语“音速刺猬(sonic hedgehog，shh)”是指构成被称为刺猬的哺乳动物信号传导通路的蛋白质，它是刺猬信号传导通路中研究最多的配体，并且已知它在调节脊椎动物的器官形成中起重要作用。
138.如本文所用，术语“wnt信号传导激动剂”是指激活wnt信号传导通路中的信号传导的物质。至少存在三种类型的通过wnt和受体之间的结合来激活的细胞内信号传导通路(即β-连环蛋白通路、平面细胞极性通路和ca
2
通路)。
139.在β-连环蛋白通路中，通过β-连环蛋白的稳定性来调节各种目标基因的表达。该通路调节细胞增殖或分化，构成该通路的蛋白质的遗传异常在人癌症中以高频率出现。在平面细胞极性通路中，插入了低分子量g蛋白rho家族，从而激活jun激酶或rho激酶。在ca
2
通路中，细胞内ca
2
动员蛋白介入，从而激活磷酸化酶c或钙调蛋白磷酸化酶。平面细胞极性通路和ca
2
通路调节细胞的极性或运动。已知调节这些信号传导通路的激活的wnt调节若干细胞反应。
140.wnt信号传导激动剂可以是选自由以下组成的组中的一种或多种化合物，但不限于此：
141.1)19种wnt蛋白：wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11和wnt16b；
142.2)增加β-连环蛋白的物质：大多数细胞通过增加β-连环蛋白来响应wnt信号传导；
143.3)磷酸化散乱蛋白(dishevelled)的物质：当wnt和卷曲蛋白(frizzled)(wnt的受体)结合时，这导致磷酸化从而激活β-连环蛋白或激活平面细胞极性通路中的rho或ras；
144.4)糖原合酶激酶3(gsk3)抑制剂：锂(li)、licl、二价zn、6-溴靛玉红-3'-肟(bio)、sb216763、sb415286、chir99021、chir98014、qs11水合物、tws119、kenpaulllone、alsterpaullone、靛玉红-3'-肟、tdzd-8、ro 31-8220甲基磺酸盐(ro31-8220甲基磺酸盐)等；
145.5)wnt信号传导通路的负调节剂的抑制剂(例如，轴蛋白(axin)、apc等)，rnai等；
146.6)激活wnt信号传导通路的蛋白质：norrin与卷曲蛋白4结合，r-脊椎蛋白2(r-spondin2)与卷曲蛋白8和lrp6反应；以及
147.7)可以使用通过基因转移(包括转染等)的wnt过表达构建体或β-连环蛋白过表达构建体。
148.在本公开的一个实施方式中，wnt信号传导激动剂是由下式i表示的chir99021：
[0149][0150]
在本公开的另一个实施方式中，wnt信号传导激动剂是由下式ii表示的chir98014：
[0151][0152]
tgf-β抑制剂可以是选自由a83-01、sb431542、repsox、ly364947和sb525334组成的组中的一种或多种化合物，但不限于此。
[0153]
在本公开的一个实施方式中，tgf-β抑制剂是由下式iii表示的a83-01：
[0154][0155]
在本公开的另一个实施方式中，tgf-β抑制剂是由下式iv表示的sb431542：
[0156][0157]
在本公开中，在步骤b)的培养之后，可以进一步包括通过添加y-27632(其为rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂)进一步培养的步骤。额外培养可进行12小时至36小时，特别是24小时。
[0158]
在本公开中，步骤b)的培养基还可以包含选自由wnt信号传导剂、tgf-β抑制剂、2-磷酸-l-抗坏血酸和丁酸钠(nab)组成的组中的一种或多种化合物。特别地，步骤b)的培养基可以进一步包含wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
[0159]
在本公开中，步骤c)的培养基还可以包含2-磷酸-l-抗坏血酸。
[0160]
在本公开中，步骤b)的培养基可以包含1ng/ml至100ng/ml的egf和1ng/ml至100ng/ml的fgf2。
[0161]
在本公开的一个实施方式中，步骤b)的培养基可以包含20ng/ml的egf、20ng/ml的fgf2、3.0μm的chir9902、0.5μm的a83-01、50ng/ml的2-磷酸-l-抗坏血酸和0.2mm的nab。作为基础培养基，可以使用人神经元重编程培养基(repm-neural)。
[0162]
在本公开中，步骤c)的培养基可以包括10ng/ml至1000ng/ml的fgf8、100ng/ml至2000ng/ml的shh、0.1μm至50.0μm的wnt信号传导激动剂、0.01μm至10.0μm的tgf-β抑制剂。
[0163]
在本公开的一个实施方式中，步骤c)的培养基可以包含100ng/ml的fgf8、800ng/ml的shh、3.0μm的chir9902、0.5μm的a83-01和50ng/ml的2-磷酸-l-抗坏血酸。作为基础培养基，可以使用repm-neural。
[0164]
在本公开中，步骤a)可以进行12小时至36小时，特别是24小时。
[0165]
在本公开中，步骤b)可以进行5天至9天，特别是7天。
[0166]
在本公开的一个实施方式中，可以进行步骤b)，使得在包含egf、fgf2、chir99021和a83-01的培养基中培养7天，然后将y-27632进一步添加到同一培养基中并再培养24小时。
[0167]
在本公开中，步骤c)可以进行10天至18天，特别是13天至15天。
[0168]
在本公开中，制备方法可以从成体细胞直接重编程idp。特别地，该制备方法不经过由成体细胞制备多能中间体的步骤。
[0169]
在本公开的一个实施方式中，作为测量多能细胞特异性标志物、insc特异性标志物和中脑基板特异性标志物的表达水平变化的结果，可以确认hidp重编程途径与hipsc和hinsc重编程途径是不同的，并且可以确认本公开的hidp是由成纤维细胞直接产生的，而没有通过根据热激步骤的有无执行hipsc和hidp重编程过程的多能中间体步骤。
[0170]
诱导性多巴胺能神经元祖细胞
[0171]
另一方面，本公开涉及通过上述制备方法制备的诱导性多巴胺能神经元祖细胞(idp)。
[0172]
在本公开的另一方面，本公开涉及一种诱导性多巴胺能神经元祖细胞，其中，(i)与源自多能干细胞的多巴胺能神经元祖细胞相比，选自由corin、foxa2和lmx1a组成的组中的一种或多种基因表现出降低的表达；(ii)与源自多能干细胞的多巴胺能神经元祖细胞相比，选自由en1、pax2、pax5、pax8和spry1组成的组中的一种或多种基因表现出增加的表达；或者(iii)表现出(i)中的降低的表达和(ii)中的增加的表达。
[0173]
在本公开的一个实施方式中，基于idp的表达水平比较公知的多巴胺能神经元特异性标志物(foxa2、lmx1a和corin)的相对表达水平，结果确认了idp的表达水平比psc-dp的表达水平低1000至100000倍。此外，基于psc-dp的表达水平比较移植结果的预测性标志物(en1、pax2、pax5、pax8和spry1)的相对表达水平，结果确认了idp的表达水平比psc-dp的表达水平高3至300倍。
[0174]
在诱导性多巴胺能神经元祖细胞中，与来源自多能干细胞的多巴胺能神经元祖细胞相比，选自由corin、foxa2和lmx1a组成的组中的一种或多种基因可以表现出1000至100000倍的降低的表达。具体地，lmx1a可以表现出1000至100000倍、10000至100000倍、10000至90000倍、10000至80000倍、10000至70000倍、10000至60000倍、10000至50000倍、10000至40000倍、10000至30000倍或10000至20000倍的降低的表达；和corin和foxa2可以表现出1000至100000倍、1000至10000倍、1000至9000倍、1000至8000倍、1000至7000倍、1000至6000倍、1000至5000倍、1000至4000倍、1000至3000倍或1000至2000倍的降低的表达。更具体地，foxa2可以表现出1000至10000倍、2000至9000倍、3000至8000倍、4000至7000倍或5000至6000倍的降低的表达；lmx1a可表现出10000至100000倍、20000至90000倍、30000至80000倍、30000至70000倍或35000至65000倍的降低的表达；corin可以表现出1000至5000倍、1200至4500倍、1500至4000倍、1700至3500倍或2000至3000倍的降低的表达。
[0175]
在诱导性多巴胺能神经元祖细胞中，与来源自多能性干细胞的多巴胺能神经元祖细胞相比，选自由en1、pax2、pax5、pax8和spry1组成的组中的一种或多种基因可以表现出3至300倍的增加的表达；具体地，3至300倍、3至200倍、3至100倍、3至90倍、3至80倍、3至70倍、3至60倍、3至50倍、3至40倍、3至30倍、3至20倍、3至10倍的增加的表达；更具体地，3至300倍、3至270倍、3至260倍、3至250倍、3至240倍、3至230倍或3至220倍的增加的表达。
[0176]
诱导性多巴胺能神经元祖细胞可能不表达hoxb1。在本公开的一个实施方式中，idp表达corin(一种多巴胺能神经元祖细胞特异性标志物)和foxa2、lmx1a和en1(中脑基板特异性标志物)，并且可能不表达hoxb1(一种后脑特异性标志物)。从这些结果可以看出，本
公开的idp具有高纯度的中脑特异性性质。
[0177]
此外，idp可以在mrna水平上表达lmx1a，但在蛋白质水平上可能不表达lmx1a。此外，从诱导性多巴胺能神经元祖细胞分化的多巴胺能神经元不仅可以在mrna水平上表达lmx1a，而且可以在蛋白质水平上表达lmx1a。
[0178]
从这些结果可以看出，本公开的idp是与已知可在体内植入用于治疗帕金森病的psc-dp可区分开的不同的细胞，并且更适合于通过体内移植治疗pd。
[0179]
此外，idp可以显示，与ipsc相比，内源性oct4和nanog的表达降低；可以显示，与insc相比，pax6的表达降低；并且可以显示，与insc相比，en1、lmx1a和foxa2的表达增加。
[0180]
在本公开的一个实施方式中，可以看出，idp表现出：与ipsc相比，内源性oct4和nanog(它们是多能细胞特异性标志物)的表达降低；与insc相比，pax6(它是insc特异性标志物)的表达降低，以及与insc相比，en1、lmx1a和foxa2(它们是中脑基板特异性标志物)的表达增加。
[0181]
从这些结果可以看出，hidp重编程过程与hipsc和hinsc重编程途径是不同的。
[0182]
包含诱导性多巴胺能神经元祖细胞的药物组合物
[0183]
另一方面，本公开涉及一种用于预防或治疗帕金森病的药物组合物，该药物组合物包含诱导性多巴胺能神经元祖细胞作为活性成分。
[0184]
如本文所用，术语“帕金森病(pd)”是由分布在大脑的黑质(substania nigra)中的多巴胺能神经元逐渐丧失引起的疾病，是神经系统的慢性进行性退行性疾病。据估计，帕金森病患者约占60岁以上人群中的1％。帕金森病的病因尚未阐明，但根据一般理论，它是一种诸如遗传因素、突变诱发因素、蛋白质功能障碍等多因性的疾病。虽然确切的原因尚未确定，但由于中脑多巴胺能神经元的丧失而出现症状是很常见的。因此，正在通过预防多巴胺能神经元的丧失、替换多巴胺能神经元、减轻多巴胺能神经元丧失引起的症状等来治疗帕金森病。
[0185]
在本公开的一个实施方式中，在pd小鼠模型中移植分化为神经元超过10天的hidp后第4周可以观察到运动缺陷的显著改善。
[0186]
从这些结果可以看出，植入体内的本公开的hidp分化成功能性多巴胺能神经元，这很可能有助于pd小鼠模型中的运动恢复。
[0187]
本公开的药物组合物可以包含根据常规方法制备成制剂的常规且无毒的药学上可接受的添加剂。例如，药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0188]
本公开的组合物中使用的添加剂的实例包括甜味剂、粘合剂、溶剂、溶解助剂、润湿剂、乳化剂、等渗剂、吸收剂、崩解剂、抗氧化剂、防腐剂、润滑剂、助流剂、填充剂、调味剂等。例如，添加剂可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸、二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂、硬脂酸镁、硅铝酸镁、淀粉、明胶、黄蓍胶、海藻酸、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、琼脂、水、乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、氯化钙等。
[0189]
本公开的组合物可以以用于肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、皮下或颅内施用)的各种制剂形式制备。特别地，本公开的组合物可以颅内施用(例如，脑血管内、鞘内或脑室内施用)。具体地，本公开的组合物可以通过侧脑室注射施用到个体的大脑中。例如，可以通过脑室内导管系统进行注射，该心室内导管系统包括在对象的颅骨中制备的钻孔(burrhole)
和枕大池(cisternal)，或植入对象颅骨中的储液器，以及连接到该储液器的导管。
[0190]
具体地，用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、注射用酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基底，可以使用withepsol、macrogol、tween61、可可脂、月桂脂(laurinum)、甘油明胶等。同时，注射剂可以含有常规添加剂(例如，增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂等)。
[0191]
本公开的组合物可以以治疗有效量或药学有效量施用于患者。
[0192]
特别地，术语“治疗有效量”或“药学有效量”是指有效预防或治疗对象疾病的化合物或组合物的量，该量足以以适用于医疗的合理的益处/风险比治疗疾病，且不会引起副作用。有效量的水平可根据包括以下的因素来确定：患者的健康状况、疾病的类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、施用方法、施用时间、施用途径和排泄率、治疗持续时间、联合或同时使用的药物以及医学领域公知的其他因素。
[0193]
本公开的组合物可以作为单独的治疗剂施用或者可以与其他治疗剂一起联合施用，并且可以与常规治疗剂依次施用或同时施用，并且可以施用一次或多次。考虑到上述所有因素，施用能够以最小量获得最大效果而没有副作用的量是重要的，这可由本领域技术人员容易地确定。
[0194]
具体地，本公开的组合物中的化合物的有效量可根据患者的年龄、性别和体重而变化，一般可每日或隔日施用每kg体重约0.1mg至约1000mg，或约5mg至约200mg，或分成每日1至3次施用。然而，由于有效量可根据施用途径、疾病的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少，因此本公开的范围不限于此。
[0195]
预防或治疗帕金森病的方法
[0196]
在另一个方面，本公开涉及一种预防或治疗帕金森病的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的药物组合物。
[0197]
在又一方面，本公开涉及诱导性多巴胺能神经元祖细胞用于预防或治疗帕金森病的用途。
[0198]
在又一方面，本公开涉及诱导性多巴胺能神经元祖细胞在制备用于预防或治疗帕金森病的药物中的用途。
[0199]
筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的方法
[0200]
在又一方面，本公开涉及一种筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的方法，该方法包括：用预防或治疗帕金森病的候选物质处理诱导性多巴胺能神经元祖细胞；和测量与没用候选材料处理的对照组相比的诱导性多巴胺能神经元祖细胞向多巴胺能神经元的增殖能力、活性或分化能力。
[0201]
在又一方面，本公开涉及一种用于筛选用于预防或治疗含有诱导性多巴胺能神经元祖细胞的帕金森病的药剂的组合物。
[0202]
在又一方面，本公开涉及诱导性多巴胺能神经元祖细胞用于筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的用途。
[0203]
如本文所用，术语“作为用于预防或治疗帕金森病的药剂的候选物质”可以指根据常规选择方法，随机选择的被认为具有预防或治疗帕金森病的可能性的单独的核酸、蛋白质、其他提取物或天然产物、化合物等。
[0204]
如本文所用，术语“对照组”是包含未用用于预防或治疗帕金森氏病的候选物质处理的诱导性多巴胺能神经元祖细胞的组，是指包含与用候选物质处理的组属于平行关系的细胞的组。
[0205]
在本公开中，筛选用于预防或治疗帕金森病的药剂的方法可以这样的方式设计：用候选物质处理本公开的诱导性多巴胺能神经元祖细胞，并与未用候选物质处理的对照组进行比较。
[0206]
在本公开中，在诱导性多巴胺能神经元祖细胞用用于预防或治疗帕金森病的候选物质处理的情况下，如果idp的增殖能力或活性增加或者idp分化成神经元的能力增加，则可以进一步包括确定候选物质作为用于预防或治疗帕金森病的药剂的步骤。
[0207]
通过这种筛选方法选择的物质用作帕金森病预防或治疗的后续开发的先导化合物，并且通过对先导物质的修饰和优化，可以开发一种用于预防或治疗帕金森病的新药。
[0208]
用于制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的混合物或培养基组合物
[0209]
在又一方面，本公开涉及一种用于制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的混合物，该混合物包含：成体细胞，该成体细胞引入了选自由oct4、sox2、klf4和myc组成的组中的一种或多种基因；egf；和fgf2。
[0210]
用于制备诱导性多巴胺能神经元祖细胞的混合物还可包含wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
[0211]
诱导性多巴胺能神经元祖细胞、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂的描述与上述相同。
[0212]
在又一方面，本公开涉及一种混合物，该混合物包含诱导性多巴胺能神经元祖细胞、fgf8、shh、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
[0213]
在又一方面，本公开涉及一种用于制备诱导性多巴胺能祖细胞的培养基组合物，该培养基组合物包含egf、fgf2、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
[0214]
在又一方面，本公开涉及一种用于制备或维持诱导性多巴胺能祖细胞的培养基组合物，该培养基组合物包含fgf8、shh、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂。
[0215]
在本公开的一个实施方式中，可以看出在从成体细胞直接重编程hidp的过程中，egf和fgf2在初期是必不可少的，并且shh、fgf8、wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂的同时处理在后期最有效。
[0216]
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。这些实施例仅用于说明目的，并且本公开的内容不受这些实施例的限制。
[0217]
实施例1.直接重编程hidp
[0218]
实施例1.1.用于hidp的直接重编程方案的开发
[0219]
基于先前在小鼠模型中的研究(韩国专利公开第10-2015-0015294号)，为了开发用于制备人诱导性多巴胺能神经元祖细胞的方案，与诱导oskm(oct4、sox2、klf4、c-myc)因子的表达一起，通过结合若干因素来进行直接重编程hidp(图1的条件1至4)。
[0220]
在不包括egf和fgf2处理的条件4的情况下，没有形成细胞集落(图2)。因此，确认egf和fgf2的处理对于hidp的直接重编程的初期阶段是必不可少的。
[0221]
此外，为了建立hidp的直接重编程方案，在直接重编程的初期和后期测试了若干因素的组合。结果，在初期，确认了当与egf和fgf2一起使用chir99021(wnt信号传导激动
剂)和a83-01(tgf-β抑制剂)的组合(以下统称为cha)时集落数最多(图3)。同时，还要求在初期处理egf、fgf2、chir99021、a83-01后，后期也需要cha处理，并且当shh和fgf8一起处理时，形成了显著增加的集落数(图4)。
[0222]
由于shh信号传导在中脑发育过程中增加了foxa2的表达，它使shh的浓度增加至高达800ng/ml，这上调了foxa2和shh的表达水平，但对lmx1a的表达水平没有影响(图5)。通过这些过程，建立了用于hidp的直接重编程的方案(图6)。
[0223]
实施例1.2.从人新生儿成纤维细胞直接重编程hidp
[0224]
人新生儿成纤维细胞(crl-2097)购自美国典型培养物保藏中心(rockville，md，usa)，crl-2097在补充有10％胎牛血清(fbs)和0.1mm非必需氨基酸的hfm培养基(改良伊格尔培养基，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中维持。
[0225]
将crl-2097以30000个细胞/孔的密度铺在24孔板中。第二天(转导后第0天，0dpt)，使用仙台病毒(sev)混合物(cytotune
tm-ips 2.0sendai重编程试剂盒；thermo fisher scientific)以适合细胞的转导倍数(moi；kos:m:k＝4.2:4.2:2.5)用oksm因子转导细胞。
[0226]
将转导的crl-2097培养24小时后，将含有sev混合物的培养基更换为人神经元重编程培养基(补充有repm-neural：0.05％albumax-i、1x n2、1x b27减维生素a、2mm谷氨酰胺和0.11mmβ-巯基乙醇，其中advanced dmem/f12和神经基础培养基以1:1的比例混合；均购自thermo fisher scientific)一周，该人神经元重编程培养基含有3.0μm的chir99021(tocris)、0.5μm的a83-01(tocris)、50μg/ml的2-磷酸-l-抗坏血酸(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)、0.2mm nab(sigma-aldrich)、20ng/ml上皮生长因子(egf；peprotech)和20ng/ml成纤维细胞生长因子2(fgf2；peprotech)。
[0227]
一周后，将培养的细胞用accutase(millipore)和10μm的y-27632(tocris)解离，并在7dpt以含有10μm y-27632的相同培养基重铺在geltrex包被的6孔板上。
[0228]
第二天，将培养基更换为repm-neural，其中还添加了3.0μm chir99021、0.5μm a83-01、50μg/ml 2-磷酸-l-抗坏血酸、100ng/ml fgf8(peprotech)和800ng/ml sonic hedgehog(shh；r&d systems，minneapolis，mn，usa)。13至15天后，分离出一些集落得到hidp，使用具有降低的shh浓度(200ng/ml)的培养基使hidp在geltrex包被的板上维持。
[0229]
实施例1.3.从成体成纤维细胞直接重编程hidp
[0230]
人成体成纤维细胞(hdf4)获自国立忠南国立大学医院(national chungnam national university hospital)(韩国大田)，并以与实施例1.2中所述相同的方式进行直接重编程hidp，并由此获得成体体细胞来源的hidp(a-hidp)。
[0231]
实施例1.4.从人外周血单个核细胞直接重编程hidp
[0232]
人外周血单个核细胞(pbmc；pbmnc015c)购自stemexpress(folsom，ca，usa)。
[0233]
通过与sev混合物(cytotune
tm
)以合适转导倍数(moi；kos:m:k＝4.2:4.2:2.5)混合并在室温下以2250rpm离心90分钟来转导30000个pbmc。移去转导的pbmc的上清液，转移到包被有imatrix511的培养皿中，在37℃下于培养箱中培养24小时。
[0234]
孵育后，将所得物在室温下以2250rpm离心10分钟并移去上清液。在解离细胞后，将细胞在人神经元重编程培养基(补充有repm-neural：0.05％albumax-i、1x n2、1x b27减维生素a、2mm谷氨酰胺和0.11mmβ-巯基乙醇，其中advanced dmem/f12和基础培养基以1:1
biosystems 7500快速实时pcr系统(thermo fisher scientific)对该混合物进行qrt-pcr。qrt-pcr中使用的引物序列如下表1所示。
[0249]
[表1]
[0250][0251][0252]
实施例3.免疫细胞化学分析
[0253]
将用于分析的样本用4％多聚甲醛(electron microscopy sciences，hatfield，pa，usa)和0.15％苦味酸(sigma-aldrich)固定，并在室温下用含有3％牛血清白蛋白(bsa；thermo fisher scientific)和0.3％tritonx-100(sigma-aldrich)的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)封闭所得物1小时，然后透化。随后，将所有样本在4℃下与在含有1％bsa的dpbs中稀释的一抗溶液一起孵育过夜。使用的一抗如下表2中所述。
[0254]
[表2]
[0255][0256][0257]
将样本用含有0.1％bsa的dpbs洗涤3次，然后在室温下与alexa fluor 488缀合的二抗或alexa fluor 594缀合的二抗(均来自thermo fisher scientific)一起孵育1小时。使用hoechst 33342(ho.；thermo fisher scientific)对细胞核进行染色，并使用leica dmi4000b显微镜(leica，wetzlar，germany)和olympus fv1000共聚焦显微镜(olympus，tokyo，japan)获得荧光图像。
[0258]
实施例4.染色质免疫沉淀测序的表现
[0259]
为了进行染色质免疫沉淀测序(chip-seq)，使用了samplechip酶染色质ip试剂盒(cell signaling technology，danvers，ma，usa)。
[0260]
在室温下用1％甲醛交联400万个细胞10分钟后，向其中加入0.125m甘氨酸并培养细胞10分钟。随后，将细胞用dpbs洗涤并根据制造商的说明与三种细胞裂解物连续培养以破坏细胞从而分离染色质。
[0261]
使用bioruptor pico(diagenode，seraing，belgium)对分离的染色质进行10到18个循环(30秒开/30秒关)的超声处理，然后在4℃下与组蛋白和igg对照抗体一起孵育过夜。在将免疫沉淀的染色质与蛋白g磁珠交联后，使所得物进行dna纯化过程。使用用于illumina平台(new england biolabs，ipswich，ma，usa)的nebnext ultra dna文库制备试剂盒构建chip-seq文库，并使用illumina hiseq 2000(illumina，sandiego，ca，usa)进行测序。
[0262]
chip-seq的原始数据使用bowtie2(版本2.2.6)进行预处理，并使用macs软件(版本1.4.2)进行分析(feng et al.,2011；langmead and salzberg,2012)。
[0263]
此外，为了选择在直接重编程hidp期间在启动子区域中获得或丢失h3k4me3标记的基因，使用r以热图格式分析并可视化标准化标签。
[0264]
使用获得或丢失h3k4me3标记的基因列表，用david(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)进行go分析，并使用microsoft excel(版本16.16.11)可视化上层go生物过程。
[0265]“中脑发育”和“神经系统发育”的基因列表获得自quickgo(https://www.ebi.ac.uk/quickgo/)，所有列出的基因的chip-seq的结果都使用r通过箱线图可视化。
[0266]
使用整合基因组学查看器(integrative genomics viewer)(igv；version2.3.91)来分析特定基因组位置上的chip-seq信号。
[0267]
实施例5.微阵列分析
[0268]
使用agilent human ge 4x 44k(v2)芯片(agilent technologies，santa clara，ca，usa)分析整体基因表达谱。简言之，使用agilent 2100生物分析仪系统检查所有样本的rna质量，然后进行扩增、标记和杂交步骤。使用agilent的genespringgx软件(版本7.3.1)对原始数据进行标准化。
[0269]
将原始数据的数值转换为log2-转换数据或z评分后进行进一步分析。使用r(版本3.2.3，https://cran.r-project.org/bin/windows/base)包“gplot”以热图格式使所选基因的表达谱可视化。
[0270]
主成分分析(pca)和散点图使用r进行分析并可视化。使用cytoscape软件平台(笨笨3.3.0，http://www.cytoscape.org/what_is_cytoscape.html)与cluego插件(版本2.2.5，http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)一起分析功能分类的基因本体(gene ontology，go)/信号路径(通路)。为了比较获得的数据，从ncbi geo下载并使用已发布的微阵列数据(gse74991)。
[0271]
实施例6.电生理学分析
[0272]
进行全细胞膜片钳记录以测量自发或诱发动作电位(ap)和电压门控的钠/钾电
流。将铺在盖玻片上的细胞置于记录室中，并用含有137mm nacl、2.0mm cacl2、10mm hepes和20mm葡萄糖(用naoh调节至ph 7.3)的35℃浴溶液连续灌注(5ml/min)。
[0273]
贴片微电极用硼硅酸盐玻璃毛细管(clark electromedical instruments，uk)制造，并使用pp-830微电极拉制仪(pipette puller)(narishige scientific instrument lab.；tokyo，japan)进行操作。当用含有140mm k-葡萄糖酸盐、5mm nacl、1mm mgcl2、0.5mm egta和10mm hepes(用koh调节至ph 7.25)的微电极溶液填充时，微电极的电阻为5-6mω。
[0274]
电压或电流钳方案生成和数据采集由计算机控制，该计算机配备有digidata 1440a/d转换器(molecular devices，sanjose，ca，usa)和pclamp 10.3软件(molecular devices)。使用axopatch 200b放大器(molecular devices)以5khz频率过滤信号并以10khz频率对信号采样。
[0275]
在没有电流注入的i钳模式(i＝0)下记录自发ap放电，并通过短时间注入超极化电流(-20pa，0.2s)诱导反跳ap。此外，通过在1秒内将电流从-0.1na逐步增加0.02na直到0.2na来记录诱导的ap。为了测量电压-切换电流，在1秒内通过从-70mv逐步增加20mv直到 110mv来注入电流。
[0276]
实施例7.cgh阵列分析
[0277]
为了通过直接重编程和长期继代培养来测量拷贝数改变(cna)，进行了基因组杂交微阵列(比较基因组杂交阵列；cgh阵列)。
[0278]
使用wizard基因组dna纯化试剂盒(promega，madison，wi，usa)从细胞中提取基因组dna，并使用nd-1000分光光度计(nanodrop technologies，wilmington，de，usa)测量dna浓度和纯度。通过在2％琼脂糖凝胶上与参考dna(agilenttechnologies)一起进行电泳以查看是否发生dna降解来确认dna质量。
[0279]
为了测量拷贝数变化(cna)，使用了sureprint g3 human cgh microarray 4 y 180k试剂盒(agilent technologies)。使用agilent男性和女性基因组dna(欧洲正常个体)作为参考dna。使用alui和rsai在37℃下消化1.5μg dna 2小时。使用cy5-dutp和用于参考dna的cy3-dutp来标记从成纤维细胞和hidp(p7、p13和p22)获得的每个酶切后的样本。使用suretag dna标签试剂盒纯化柱(agilent technologies)分离标记的dna，并在65℃下用微阵列载玻片进行杂交24小时。随后，扫描微阵列载玻片并使用agilent特征提取软件v10.7.3.1提取原始数据。
[0280]
在稍作修改的默认设置下使用genomic workbench7.0.4.0软件(agilent technologies)分析原始数据。在adm-2算法中将阈值设置为6，并根据uucsc基因组浏览器(人ncbi37/hg19)中的基因组位置进行探针映射。
[0281]
实施例8.单核苷酸突变和插入/缺失有无的确认
[0282]
为了确认基因突变、单核苷酸变异(snv)和插入/缺失(indel)的有无，从细胞中提取基因组dna并使用包括与肿瘤和干细胞的特征相关的基因的定制的组进行ngs。
[0283]
使用刮刀收获培养的细胞，裂解，然后根据制造商的说明使用dneasy blood&tissue试剂盒(qiagen)提取基因组dna。
[0284]
使用qubit 3.0荧光计(thermo fisher scientific)和qubit dsdna hs分析试剂盒(qiagen)通过定量荧光分析测量提取的基因组dna。输入dna的最终浓度调整为0.67ng/μl。根据制造商的说明制备文库以符合ion chef系统(thermo fisher scientific)。随后，
使用ion 540芯片(thermo fisher scientific)和ion 540kit-chef kit(thermo fisher scientific)对精细化的文库进行测序。
[0285]
将获得的测序原始数据使用torrent suite软件(thermo fisher scientific，v5.10)的torrent mapping alignment program比对器以fastq格式调整为hg19人参考基因组。使用oncomine variant annotator v2.3(thermo fisher scientific)插件进行snv调用以生成变体调用格式文件。根据以下标准来分析从tsv格式中提取的未过滤文件：仅选择snv和mnv(多核苷酸变异)作为突变类型，并且分析位点处包括外显子和剪接位点，但排除内含子和utr。
[0286]
实验例1.从人新生儿成纤维细胞产生的hidp的表征
[0287]
实验例1.1.中脑特异性基因标志物的表达的分析
[0288]
对于实施例1.2中获得的hidp和比较例1中获得的hinsc，比较了中脑特异性基因标志物的表达与否以及表达水平。
[0289]
corin是dp的特异性标志物，并且用作表面抗原以在从多能干细胞(psc)分化的间充质细胞中仅富集dp。据报道，使用针对corin的抗体富集和分离的corin

细胞的移植在pd啮齿动物和灵长类动物模型中显示出良好的治疗效果。
[0290]
将实施例1.2中获得的hidp和比较例1中获得的hinsc通过实施例3中描述的方法针对corin进行免疫细胞化学染色。结果，在hidp中检测到阳性信号，但在源自相同神经外胚层谱系的hinsc中未检测到阳性信号(图7)。
[0291]
此外，为了比较实施例1.2中获得的hidp和比较例1中获得的hinsc的中脑特异性标志物的表达水平，通过实施例2中描述的方法进行qrt-pcr。确认了不仅corin，而且已知在底板细胞中富含的foxa2、lmx1a和en1在hidp中也表现出比在hinsc中更高的表达水平(图8)。
[0292]
为了确认实施例1.2中获得的hidp的区域特性(regional identity)，通过实施例3中描述的方法针对中脑(en1)和后脑(hoxb1)特异性标志物进行免疫细胞化学染色。结果，确认en1在大多数hidp中表达，但未检测到hoxb1表达(图9)。
[0293]
从这些结果，确认了本公开的hidp具有中脑特异性特性。
[0294]
实验例1.2.评估增殖潜力
[0295]
如前所述，由于psc来源dp(psc-dp)的临床应用的主要问题之一是细胞特性(例如，有限的增殖和特异性标志物表达)的逐渐变化，因此进行了实验以确认本公开的hidp是否可以在整个连续继代培养中实现增殖。
[0296]
测量了在培养实施例1.2中获得的hidp 120天或更久的过程中增加的细胞数，结果发现增值速率是恒定的，并且细胞数增加了10
24
倍或更高，因此确认了增殖潜力(图10)。
[0297]
为了评估hidp本身的特性在长期培养过程中是否保持不变，对中期(7-9)和后期(18-20)继代培养中的hidp进行了分析。
[0298]
在实施例1.2中获得的hidp的中期和后期继代培养中，通过实施例3中描述的方法针对ki-67(细胞周期标志物)和corin、pax2、pax5和foxa2(dp特异性标志物)进行免疫细胞化学染色。结果，确认了这些标志物是恒定表达的(图11)。特别地，已知pax2和pax5在中脑-后脑边界表达，这与体内移植后分化成多巴胺能神经元的能力密切相关。同时，如实验例1.1中所述，在mrna水平上确认表达的lmx1a在蛋白质水平上不能确认其表达(图8和图11)。
[0299]
此外，通过流式细胞术对corin和foxa2进行定量分析，结果确认即使在7次或更多次的继代培养和20次或更多次的继代培养之后，实施例1.2中获得的hidp的corin和foxa2的阳性率分别为62％或更多和99％或更多(图12)。
[0300]
由这些结果，确认了本公开的hidp能够增殖，同时即使通过多次继代培养也能维持高纯度的中脑特异性特征。
[0301]
实验例1.3.线粒体结构分析
[0302]
众所周知，高度增殖的细胞(例如psc、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和癌细胞)具有高度依赖于糖酵解的代谢反应，以便生产用于合成细胞能量需求的成分和其他必需产物。此外，糖酵解与未成熟的线粒体结构密切相关。因此，对实施例1.2中得到的hidp和作为对照的比较例3中得到的psc-dp的线粒体结构进行了分析。
[0303]
为了比较线粒体形态，使用实施例1.2中得到的hidp和比较例3中得到的psc-dp通过实施例3中描述的方法针对tom20(线粒体特异性标志物)进行免疫细胞化学染色。为了进行分析，将tom20的原始荧光图像骨架化。结果确认，与psc-dp相比，hidp中每个细胞的线粒体数更多(图13和图14)。
[0304]
另外，分析了每个线粒体的分支数，结果确认了hidp与psc-dp相比具有更简单的线粒体结构(少于40个分支)(图15)。
[0305]
从这些结果确认，本公开的hidp与psc-dp相比具有用于糖酵解的未成熟的线粒体，该特征与hidp的非常高的增殖特性有关。
[0306]
实验例2.直接重编程hidp期间细胞特征变化的分析
[0307]
实验例2.1.遗传特征变化的分析
[0308]
为了比较从亲本成纤维细胞(crl-2097；fb)直接重编程过程(8dpt和16dpt)和在实施例1.2中获得的hidp的转录组，通过实施例5中描述的方法进行微阵列。通过差异表达基因(deg)分析和pca确认了在直接重编程hidp期间整体基因表达发生了变化(图16和图17)。
[0309]
为了获得deg的功能信息，通过david功能注释聚类进行go术语丰富度(go terms enrichment)分析。结果确认，hidp中显著上调(变化5倍或更高)的基因与神经系统的发育、神经元的生成、突触组织化和有丝分裂细胞周期过程(与长期增殖潜力一致)有关(图18)。
[0310]
为了评估包括在有丝分裂细胞周期过程的go术语中的基因的表达水平，进行了基因热图分析，并确认了随着从成纤维细胞直接重编程为hidp的进行，观察到相关基因的表达的总体增加(图19)。
[0311]
从这些结果来看，确认了hidp在直接重编程期间获得了能够增殖的神经系统细胞、特别是中枢神经系统的遗传特征。
[0312]
此外，通过散射分析比较了亲本成纤维细胞(fb)和由其产生的hidp的转录组谱，结果显示出明显的差异(图20)。
[0313]
为了比较实施例1.2中获得的hidp和先前报道可植入的dp的特性，在hidp转录组数据和可公开获得的胚胎干细胞(esp)来源的dp数据；即，整合相关蛋白(integrated associated protein，iap)阳性分类、iap阴性分类和未分类数据之间进行了聚类分析。iap是中脑中存在的多巴胺能细胞的可靠标志物，与pd大鼠模型中的未分类细胞相比，iap阳性分类细胞显示出改善的功能恢复。分析结果确认了，与iap阴性分类的dp和未分类的dp相
比，实施例1.2中获得的hidp更类似于iap阳性分类的dp(图21)。
[0314]
从这些结果，确认了本公开的hidp在用于pd患者的再生医学中的潜力。
[0315]
实验例2.2.表观遗传特征变化的分析
[0316]
由于细胞命运的变化涉及表观遗传机制，因此假设实施例1的hidp的直接重编程条件可以促进表观遗传变化为能够接受神经源性信号的开放染色质结构。为了证明这一点，通过对16dpt的亲本成纤维细胞(fb)和实施例1.2中获得的hidp中的活性(h3k4me3和h3k27ac)染色质标记进行chip-seq分析，分析了基因组范围的表观遗传变化。
[0317]
chip-seq分析的结果确认了，在直接重编程期间，h3k4me3在多个基因的转录起始位点(tss)附近显著增加。此外，这些区域显示出同时积累h3k27ac的趋势，包括中脑标志物基因(例如，en1、en2、sox2、lmx1b、fgf8、lmx1a和rfx4)的启动子区域(图22)。此外，通过热图分析，确认了与这些区域相关的基因的表达在直接重编程hidp期间被上调(图23)。
[0318]
go术语分析表明，这些基因组位置与“转录调控”、“神经发育”和“中脑发育”go术语特别相关，这意味着整体神经元基因表达的诱导(图24)。此外，在与“中脑发育”和“神经系统发育”相关的基因的启动子区域中检测到h3k4me3和h3k27ac的增加(图25和图26)。
[0319]
具体而言，分析了h3k4me3和h3k27ac组蛋白标记的变化，结果确认了中脑-后脑边界特异性基因(en1、en2和pax5)和中脑基板特异性基因(fgf8、foxa2和lmx1a)的启动子区域在直接重编程hidp期间获得h3k4me3和h3k27ac，而多巴胺能神经元基因(vamt2、girk2和neurod1)的启动子显示出在分化前已经开放的染色质结构(图27)。
[0320]
确认了在tss附近的基因组中也有许多h3k4me3逐渐消失的基因。在这些基因中，h3k27ac逐渐消失，hidp在直接重编程期间被下调(图28和图29)。已确认这些基因与成纤维细胞中高表达的胶原原纤维组织化的基因集有关(图30)。
[0321]
具体而言，col1a1、col5a1和thy1的基因组位置逐渐失去其活性染色质标记(图31)。
[0322]
从这些结果，确认了染色质状态的转换促进了中脑发育信号对与中脑发育相关的基因位置的可及性，从而实现了hidp的直接重编程。
[0323]
实验例3.从hidp分化中脑dn
[0324]
实验例3.1.确认分化为中脑dn的可能性
[0325]
为了评估分化成多巴胺能神经元(dn)的可能性，将实施例1.2中获得的hidp和比较例1中获得的hinsc在神经元分化培养基中培养。具体地，将hidp和hinsc以30000个细胞/mm2的密度铺在geltrex包被的塑料盖玻片(直径：13mm，thermo fisher scientific)上。第二天，将培养基更换为基于dmem/f-12的神经元分化(nd)培养基，其中含有1x b27(不含维生素a)、1x青霉素/链霉素(thermo fisher scientific)、20ng/ml脑源性神经营养因子(peprotech)、20ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(peprotech)、0.5mm dbcamp(enzo-lifesciences，basel，switzerland)和50μg/ml 2-磷酸-l-抗坏血酸。为了启动分化，添加0.2mm丁酸钠和0.1μm化合物-e(一种γ-分泌酶抑制剂；millipore)维持1周。培养基每3天更换总量的一半。
[0326]
分化开始后21天，hidp(62.9
±
5.3％)产生的th

多巴胺能神经元的比例高于hinsc(15.3
±
8.0％)(图32和33)。然而，在用表现出这两种细胞之间的所有神经元的tuj1进行免疫细胞化学染色后的定量分析结果中，tuj1

神经元的量没有显著差异(图34)。
[0327]
当实施例1.2中获得的hidp在神经元分化条件下培养10周或更长时间时，确认产生了gfap

星形细胞(星形胶质细胞)(图35)。此外，确认了也出现了极少数的o4

少突胶质细胞(在总细胞中约2个至4个)(图35)。为了量化这些胶质细胞的比例，使用实施例3中描述的方法进行免疫细胞化学染色，然后对整个区域进行荧光图像扫描(图36)。结果确认了从实施例1.2中获得的hidp分化的细胞中的11.7
±
0.7％是gfap 星形细胞(图37)。
[0328]
从这些结果确认了，本公开的hidp有效地分化成了中脑特异性dn和胶质细胞。
[0329]
实验例3.2.分化的中脑dn的表征
[0330]
实验例3.2.1.遗传表征
[0331]
为了表征从实施例1.2中获得的hidp分化的dn，通过实施例3中描述的方法针对中脑dn的关键标志物进行免疫细胞化学染色。结果，大多数th

dn共表达中脑标志物foxa2、nurr1、lmx1a和en1(图38)。在hidp的中期和后期继代培养中，针对lmx1a进行免疫细胞化学染色，结果没有确认lmx1a的表达(图11)，但在从hidp分化的dn中确认了lmx1a的表达。
[0332]
确认了，hidp在分化后与分化前相比具有相对高水平的中脑标志物(foxa2、nurr1和en1)的表达，以及hoxa2(后脑标志物)无论是否分化都类似地表达(图39)。
[0333]
为了研究从hidp中分化的dn的不同神经元亚型的比例，针对血清素能(tph2)、谷氨酸能(vglut1)、gaba能(gaba)和胆碱能(chat)神经元的特异性标志物进行了免疫细胞化学染色。结果，检测到一些chat

神经元，而没有检测到vglut1

、gaba

或tph2

神经元(图40和图41)。
[0334]
此外，通过散射分析比较hidp和hidp来源的神经元的转录组谱，结果显示了基因表达模式的明显差异(图42)。
[0335]
通过david功能注释聚类分析，确认了在hidp来源的神经元中最显著上调(5倍或更多变化)的基因是与“神经发育”和成熟相关的go术语(例如“突触信号传导”、“化学突触传递”和“神经元分化”)(图43)。
[0336]
考虑到在分化为dn之前hidp的chip-seq数据(图27)，预测与神经元分化和成熟相关的基因表达的快速变化是可能的，因为表观遗传状态的变化在分化之前已经发生。
[0337]
由这些结果，确认了本公开的hidp具有高纯度的中脑特异性dn的分化潜能，并且这种可能性是在分化之前确定的。
[0338]
实验例3.2.2.体外功能特性的分析
[0339]
为了评估从实施例1.2中获得的hidp分化的中脑dn的体外功能特性，通过实施例3中描述的方法针对成熟神经元标志物进行免疫细胞化学染色。
[0340]
大多数th

神经元与map2(成熟神经元标志物)共染色，map2

神经元与神经元核(neun)(另一种成熟神经元标志物)共染色(图44)。此外，map2

神经元表达突触前标志物synapsin-i(syn)(图44)。
[0341]
此外，进行了定量分析以比较分化了42天的hidp来源的神经元和hinsc来源的神经元之间分泌的多巴胺水平。具体地，将分化了42天的细胞用56mm kcl(sigma-aldrich)处理10分钟。然后，获得全部培养基并使用多巴胺研究elisa试剂盒(ldn，nordhorn，germany)进行酶联免疫测定。将样本的吸光度值与使用标准浓度样本制作的标准曲线进行比较。结果，从hidp分化的神经元分泌的多巴胺的水平比从hinsc分化的神经元高得多(图45)。
[0342]
为了评估hidp来源的神经元是否具有与原始神经元相似的功能膜特性，在分化开
始后的第100天至第120天，通过实施例6中描述的方法进行全细胞膜片钳记录(图46)。结果，在总细胞中的20个细胞中检测到自发ap(50％，n＝40；图47)。
[0343]
在注入去极化电流后大多数细胞中也诱导了ap(图48)，这被na

离子通道特异性抑制剂河豚毒素(ttx)阻断(图48)，并且增加通过增加注入电流的量来增加ap放电(图49)。此外，反跳去极化由膜超极化诱导(图50)。自发和诱导性ap是表现出神经元功能性的特征，并且已知反跳ap是中脑多巴胺能神经元的特征。
[0344]
在电压钳模式下，观察到内侧和外侧电流的快速去激活，这与电压依赖性k
-和na
-通道电流相对应。内侧na

通道电流被ttx完全阻断(图51)。静息膜电位范围为-43.6mv至-68.4mv，平均大约为-56.9mv(n＝20)。
[0345]
由这些结果确认了，从本公开的hidp分化的神经元具有在分泌多巴胺的能力和体外膜特性方面的功能性。
[0346]
实验例4.hidp移植到pd小鼠模型中
[0347]
实验例4.1.hidp的移植适宜性评估
[0348]
最近报道了一些可以预测未移植过的细胞进行细胞移植后的pd治疗效果的标志物(kirkeby et al.,2017)。研究发现，公知的dp特异性标志物(foxa2、lmx1a和corin)与移植结果的预测性标志物(en1、pax2、pax5、pax8和spry1)的表达呈负相关。
[0349]
在将细胞移植到pd动物模型之前，为了评估实施例1.2中获得的hidp和实施例1.3中获得的a-hidp的移植适宜性，通过使用实施例5中描述的方法进行微阵列来比较(转录组谱中公知的)dp特异性标志物和疗效预测性标志物的表达水平。
[0350]
结果确认，与psc-dp相比，实施例1.2中获得的hidp中公知的dp标志物的表达水平较低，而预测性标志物的水平较高(图52)。这些结果通过qrt-pcr再次确认(图53和图54)。具体地，基于hidp的表达水平比较公知的dp特异性标志物(foxa2、lmx1a和corin)的相对表达水平，结果确认了psc-dp的表达水平比hidp的表达水平高1000至100000倍。相反，基于psc-dp1的表达水平比较移植结果预测性标志物(en1、pax2、pax5、pax8和spry1)的相对表达水平，结果确认了hidp的表达水平比psc-dp的表达水平高3至300倍。
[0351]
此外，由于具有预测性标志物表达的dp被报道具有中脑-后脑边界的特征，因此通过使用实施例5中描述的方法进行微阵列来分析hidp和psc-dp中特异性区域标志物的表达水平。hidp显示出尾端基因的表达水平高于头端基因，表明尾中脑特性(图55)。
[0352]
由这些结果确认了，本公开的hidp是可与psc-dp区分开来的不同的细胞，并且与psc-dp相比更适合通过体内移植治疗pd。
[0353]
实验例4.2.确定移植hidp的合适时间
[0354]
为了避免由于高度增殖的hidp的性质而在体内形成肿瘤，假设当细胞分裂不再发生时进行hidp移植是合适的。
[0355]
为了确认细胞分裂不发生的时间点，通过实施例3中描述的方法针对ki-67进行免疫细胞化学染色，并定量分析所得物。结果，表现出增殖特性的ki-67

细胞根据分化成神经元的条件逐渐减少，并且在分化后第8天便无法找到(图56和图57)。因此，决定在分化到pd小鼠模型中后的第7天进行移植hidp。
[0356]
同时，为了确认在长期继代培养后是否仍能保持基因组的稳定性，通过实施例7中描述的方法进行cgh阵列，以比较和分析长期培养的hidp及其亲本成纤维细胞的拷贝数的
变化。与亲本成纤维细胞相比，在经过22代继代培养的hidp中没有发现cnv(图58)。此外，通过核型分析结果确认了经过24代继代培养的hidp的染色体结构没有异常(图59)。
[0357]
由这些结果确认，hidp的基因组结构即使在长时间重复分裂后仍然保持稳定，从而确认了hidp适用于体内移植。
[0358]
实验例4.3.hidp移植对pd治疗的效果的确认
[0359]
在avertin麻醉下将6-羟基多巴胺(6-ohda；sigma-aldrich)注射到正常小鼠的中脑黑质中以产生单侧病变(ap：-3.1mm；ml：
±
1.1mm；dv：-4.4mm)。在6-ohda诱发病变形成前和形成后4周和6周注射阿扑吗啡(0.4mg/kg；sigma-aldrich)以诱导旋转行为，并进行测量以评估是否产生了帕金森病模型。在施用阿扑吗啡60分钟后，向病变旋转400
±
50圈的动物被确定为产生了帕金森病模型，并用于移植hidp。
[0360]
将总共1
×
105个分化的hidp细胞移植到6-ohda处理的小鼠的病变纹状体中(ap： 0.4mm；ml：
±
1.5mm；dv：-2.8mm)。细胞移植后每天腹膜内注射环孢菌素a，持续7天。移植后每两周测量一次阿扑吗啡诱导的旋转行为。计算顺时针和逆时针旋转的次数，并表示为相对大脑半球每60分钟的总旋转次数。为了尽量减少偏差，pd小鼠模型的行为分析由两名实验者以盲法独立评估。
[0361]
在6-ohda诱导的pd小鼠模型中，在分化成神经元的hidp移植10天或更长时间后，行为缺陷逐渐恢复，而在假手术组和溶媒对照组中没有观察到恢复(图60)。此外，从移植后第4周起，注射hidp的小鼠在运动缺陷方面表现出显著改善(图60)。
[0362]
为了直接评估hidp移植的效果，将小鼠进行安乐死以针对纹状体的th和dat进行免疫细胞化学染色。在模拟(mock)和溶媒对照组中施用6-ohda没有发现阳性信号，但在hidp移植小鼠的纹状体中发现th

dat

细胞(图61和图62)。
[0363]
由这些结果确认，在体内移植的本公开的hidp分化成功能性dn，这很有可能有助于pd小鼠模型中的运动恢复。
[0364]
实验例4.4.hidp移植的致瘤性评价
[0365]
为了进一步确认hidp移植的大鼠中不存在致瘤性，将hidp移植到正常大鼠的纹状体中，同时每天注射免疫抑制剂。通过对大鼠纹状体的nissl染色和对人特异性线粒体的dba染色结果，确认了移植物维持在注射部位没有扩散，与对侧方向相比，移植物周围的脑结构没有塌陷，并且包括在细胞大小和形状的可变性方面的多态性，因此在移植物中没有显示出神经花环(neural rosette)或恶性肿瘤(图63和图64)。
[0366]
由这些结果确认，当将本公开的hidp移植到正常大鼠中时，在移植部位没有形成肿瘤，这与pd小鼠模型中的数据一致。
[0367]
此外，使用免疫缺陷的nsg小鼠来确认hidp的致瘤性。具体地，将实施例1.2中获得的hidp、用于移植的分化的hidp和同质hipsc皮下注射到nsg小鼠中。在hipsc注射组中，在注射后4周开始形成肿瘤，并且在注射后第9周在所有小鼠中形成肿瘤(图65和图66)。相反，在hidp注射组中，无论hidp是否分化，均没有形成肿瘤(图65和图66)。
[0368]
从这些结果确认，本公开的hidp移植具有对pd的治疗功效和对肿瘤形成的安全性。
[0369]
实验例5.从成体成纤维细胞产生的a-hidp的表征
[0370]
为了确认corin、pax2、pax5和foxa2(代表性dp标志物)、ki-67(细胞周期标志物)
和pax6(hinsc关键标志物)在实施例1.3中获得的a-hidp中的表达，使用实施例3中描述的方法进行免疫细胞化学染色。结果确认表达了corin、pax2、pax5、foxa2和ki-67，但不表达pax6(图67)。
[0371]
测量了在培养a-hidp 100天或更久的过程中增加的细胞数的结果，确认增值速率保持恒定，并且细胞数增殖了10
20
倍或更高，因此确认了增殖潜力(图68)。此外，通过核型分析结果确认，即使经过20代或更多代的继代培养，a-hidp的染色体也没有出现结构异常(图69)，并且通过流式细胞术确认了dp的关键标志物corin和foxa2的表达即使在20代或更多代继代培养后也维持在高水平(分别为61.2％和99.5％)(图70)。
[0372]
为了确认分化成dn的能力，在实验例3.1中描述的神经元分化条件下培养a-hidp。将从a-hidp分化的th

神经元与lmx1a、nurr1和foxa2共染色，显示出中脑特异性特征(图71)。此外，a-hidp以高产率(52％)产生th

神经元(图72)。
[0373]
为了研究从a-hidp分化的dn的不同神经元亚型的比例，对血清素能(tph2)、谷氨酸能(vglut1)、gaba能(gaba)和胆碱能(chat)神经元特异性标志物进行了免疫细胞化学染色。结果，确认不存在相应的细胞(图73)。
[0374]
将从a-hidp分化的dn与从实施例1.2中获得的hidp(y-hidp)分化的dn进行比较，确认分泌了相似量的多巴胺(图74)。
[0375]
根据这些结果，确认了实施例1.2中描述的用于hidp的直接重编程方案的可重现性。
[0376]
实验例6.从人外周血单个核细胞产生的hidp的表征
[0377]
为了确认corin、lmx1a和foxa2(代表性dp标志物)、ki-67(细胞周期标志物)和pax6(hinsc关键标志物)在实施例1.4中获得的pbmc-hidp(70262-01和70262-02)中的表达，使用实施例3中描述的方法进行免疫细胞化学染色。结果确认表达了corin、foxa2和ki-67，但不表达lmx1a和pax6(图75)。
[0378]
此外，为了比较pbmc-hidp中与实施例1.2中获得的成纤维细胞来源的hidp(fb-hidp)中的中脑dp特异性标志物(corin、en1、pax5、pax8、spry1和cnpy1)的表达水平，使用实施例2中描述的方法进行qrt-pcr。结果确认，与fb-hidp相比，corin、en1、pax5、pax8、spry1和cnpy1的表达水平没有显著差异(图76)。
[0379]
为了确认分化成dn的能力，在实验例3.1中描述的神经元分化条件下培养a-hidp。作为在分化后第21天拍摄明场图像的结果，确认了a-hidp分化成神经元特异性形式(图77)。此外，进行qrt-pcr以测量与fb-hidp相比的中脑dn特异性标志物(th、en1和nurr1)和与神经元成熟相关的标志物(map2、neuron；neun)的表达水平，结果确认没有显著差异(图78)。
[0380]
从这些结果确认了，实施例1.2中描述的hidp的直接重编程方案可以同样地应用于包括pbmc在内的其他体细胞以及成纤维细胞。
[0381]
实验例7.使用低分子量化合物替代chir99021和a83-01直接重编程hidp
[0382]
使用与实施例1.2中描述的相同的直接重编程hidp的方案，但使用其他小分子化合物替代chir99021(wnt信号传导激动剂)或a83-01(tgf-β抑制剂)来进行直接重编程hidp。具体地，用2.0μm chir98014替代3.0μm chir99021(stemcell technologies)，或用2.0μmsb431542替代0.5μm a83-01。
[0383]
使用实施例1.2中描述的方案和每个修改的方案执行直接重编程hidp的方案，结果确认了在所有条件下都产生了hidp形式的细胞(图79)。
[0384]
为了比较亲本成纤维细胞中和在每种条件下形成的hidp中的中脑dp特异性标志物(en1、pax2、pax5和pax8)的表达水平，使用实施例2中描述的方法进行qrt-pcr。结果确认，与亲本成纤维细胞相比，所有四种基因的表达水平都增加了(图80)。
[0385]
从这些结果确认，在实施例1.2中描述的hidp直接重编程方案中，即使在使用其他已知具有wnt信号传导激动剂和tgf-β抑制剂的作用的低分化化合物时，也可以成功地直接重编程hidp。
[0386]
实验例8.在重编程hidp期间绕过多能步骤
[0387]
由于hidp的重编程依赖于多能性诱导剂oskm的异位表达，因此通过实施例1获得的hidp有可能在获得瞬时多能性后通过分化过程产生。为了测试这种可能性，使用实施例2中描述的方法进行qrt-pcr，并分别比较了hidp、hinsc和hipsc的关键标志物基因的表达水平。
[0388]
对hipsc的关键标志物进行分析，结果确认了内源性oct4的表达水平从hipsc重编程的14dpt开始上调，但在整个hidp重编程过程中没有发生变化；以及nanog的表达水平在hipsc重编程的整个过程中上调，但在hidp重编程的7dpt至14dpt时暂时升高，然后再次降低，与最终获得的hipsc相比处于较低水平(图81)。
[0389]
hinsc的关键标志物之一pax6的表达最初在hinsc重编程的14dpt时检测到，然后在hinsc重编程期间继续增加(图82)。对hidp的关键标志物进行分析，结果确认了en1、lmx1a和foxa2的表达水平在hidp重编程的14dpt或更早时增加，但在整个hinsc重编程过程中表达水平都非常低(图82)。由这些结果确认了，hidp重编程过程与hipsc和hinsc的重编程途径是不同的。
[0390]
同时，由于hidp重编程使用oskm，因此多能细胞有可能在重编程过程中短暂产生，之后再分化以产生hidp。为了检验这种可能性，考虑到实施例1和比较例1和2中使用的sev具有热失活的特性，在重编程过程中，oskm的表达降低到不能通过热激产生hipsc的水平，然后，对实施例1的hidp和比较例2的hipsc进行重编程(图83)。
[0391]
在5dpt至7dpt的热激下第20天在hipsc中未观察到alp

集落，而从未经热激处理的对照细胞中产生了alp

集落(图84)。此外，在不可能产生alp

细胞的热激条件下对hidp进行重编程，结果检测到了foxa2

集落(图85)，这表明这些集落的细胞命运转变为hidp。
[0392]
此外，当从多能中间体产生hidp时，假设经过hidp重编程的中间体可以随着转变为诱导多能性的培养环境而转化为hipsc。
[0393]
当在重编程hidp期间施加热激48小时时，即使在8dpt的时间点将重编程hidp的培养条件改变为重编程hipsc的培养条件，也没有检测到alp

集落(图84)。由于重编程过程可能由于热激引起细胞老化而延迟，重编程条件从现有的20天维持到30天，但仍然没有检测到alp

集落(图86)。
[0394]
从这些结果中，确认了实施例1的hidp的重编程使从体细胞直接生产成为可能而无需经历多能中间体步骤。
[0395]
实验例9.将小鼠idp直接重编程施用于人成纤维细胞
[0396]
本发明人已经验证了先前用于将小鼠成纤维细胞直接重编程为idp的条件是否可
用于人成纤维细胞以产生人诱导性多巴胺能神经元祖细胞(hidp)。
[0397]
将人成纤维细胞(crl2097)接种到包被有matrigel(bd biosciences，usa)的培养容器中，并在含有10％fbs、1％非必需氨基酸(neaa)和1％青霉素/链霉素(p/s)的dmem(dulbecco改良eagle培养基)中培养，然后转导oskm因子(d0)。在转导后的第6天(d5)，将细胞培养在repm-n培养基中并再培养19天，该repm-n培养基含有在混合培养基中的200ng/ml shh或100ng/ml shh和100ng/ml fgf8作为诱导因子，该混合培养基中advanced dmem/f12(含有1x n2、1x b27、0.05％bsa、2mm谷氨酰胺和0.11mmβ-巯基乙醇)和基础培养基以1:1的比例混合(图87)。
[0398]
结果确认，在使用200ng/ml和100ng/ml的shh的两种条件下，只产生了不能被视为包括hidp的神经元谱系的细胞形式的细胞(图88)。
[0399]
从这些结果确认了，小鼠idp的直接重编程条件对将人成纤维细胞直接重编程为hidp没有效果。