一种靶向GPC3嵌合抗原受体T细胞及其应用的制作方法

一种靶向gpc3嵌合抗原受体t细胞及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种细胞免疫治疗领域。具体地，涉及一种靶向gpc3嵌合抗原受体t细胞(car-t)及其应用。


背景技术：

2.car-t(chimeric antigen receptor t cell)的概念最早由以色列科学家zelig eshhar在1989发表的pnas文章中提出，包括抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号组成，经历了几代结构的发展和优化。2017年全球首款car-t产品kymriah获得fda批准震撼上市，用于儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(all)。截止目前有多款靶向cd19或bcma的car-t产品已在多个国家或地区获得上市，而且都达到了惊人的治疗效果；然而，这些产品都是针对血液肿瘤的，目前针对实体肿瘤还未有一款car-t产品获批准上市，大多数的实体肿瘤car-t临床结果，也没有血液肿瘤那么耀眼。
3.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)蛋白是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，在婴儿期的一些组织中，特别是肝脏和肾脏中表达，是与器官形成相关的胞外基质蛋白；在成人组织中几乎观察不到gpc3的表达，但是在肝细胞癌、黑素瘤、卵巢透明细胞癌、肺鳞状细胞癌等各种癌组织中高表达。因此gpc3是一种很好的肿瘤治疗靶点。
4.因此，本领域亟待开发一种针对实体肿瘤的、靶向gpc3嵌合抗原受体t细胞(car-t)产品。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种靶向gpc3嵌合抗原受体t细胞(car-t)及其应用。
6.在本发明的第一方面，提供了一种靶向gpc3的单链可变片段(scfv)，所述单链可变片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
7.seq id no.18所示的hcdr1，
8.seq id no.19所示的hcdr2，和
9.seq id no.20所示的hcdr3；和/或
10.所述轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
11.seq id no.21所示的lcdr1，
12.seq id no.22所示的lcdr2，和
13.seq id no.23所示的lcdr3。
14.在另一优选例中，所述单链可变片段包含seq id no：3所示氨基酸序列的vh和seq id no：7所示氨基酸序列的vl。
15.在另一优选例中，所述的scfv包含vh和vl之间的接头。
16.在另一优选例中，所述的scfv的结构如下式a或b所示：
[0017]vl-vhꢀꢀ
(a)；
[0018]vh-v
l
ꢀꢀ
(b)
[0019]
其中，vh为抗体重链可变区；v
l
为抗体轻链可变区；
“‑”
为连接肽或肽键。
[0020]
在另一优选例中，所述的接头为柔性接头，较佳地，所述接头为(g4s)n，中n为1-4，较佳地n为2-4，更佳地n为3。
[0021]
在本发明的第二方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)融合蛋白，其从n末端到c末端包含：
[0022]
(i)本发明的第一方面所述的scfv，
[0023]
(ii)跨膜结构域，
[0024]
(iii)至少一个共刺激结构域，和
[0025]
(iv)激活结构域。
[0026]
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体融合蛋白具有下式i结构：
[0027]
l-scfv-h-tm-c-cd3ζ(i)
[0028]
式中，
[0029]
各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
[0030]
l为任选的信号肽序列；
[0031]
scfv为本发明第一方面所述的scfv；
[0032]
h为任选的铰链区；
[0033]
tm为跨膜结构域；
[0034]
c为共刺激信号分子；
[0035]
cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
[0036]
在另一优选例中，所述的l包含如seq id no.1所示的氨基酸序列。
[0037]
在另一优选例中，所述的h为选自下组蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。
[0038]
在另一优选例中，所述的h为cd8来源的铰链区。
[0039]
在另一优选例中，所述的h包含如seq id no.9所示的氨基酸序列。
[0040]
在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
[0041]
在另一优选例中，所述的tm包括cd8来源的跨膜区。
[0042]
在另一优选例中，所述的tm包含如seq id no.11所示的氨基酸序列。
[0043]
在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
[0044]
在另一优选例中，所述的c包括4-1bb来源的共刺激信号分子。
[0045]
在另一优选例中，所述的c包括包含如seq id no.13所示的氨基酸序列。
[0046]
在另一优选例中，所述的car融合蛋白具有seq id no：17所示的氨基酸序列。
[0047]
在本发明的第三方面，提供了一种抗gpc3的抗体，所述抗体包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
[0048]
seq id no.18所示的hcdr1，
[0049]
seq id no.19所示的hcdr2，和
[0050]
seq id no.20所示的hcdr3；和/或
[0051]
所述轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
[0052]
seq id no.21所示的lcdr1，
[0053]
seq id no.22所示的lcdr2，和
[0054]
seq id no.23所示的lcdr3。
[0055]
在另一优选例中，所述抗体包含seq id no：3所示氨基酸序列的vh和seq id no：7所示氨基酸序列的vl。
[0056]
在另一优选例中，所述抗体结合于人gpc3蛋白。
[0057]
在另一优选例中，所述的抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
[0058]
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体或单链抗体。
[0059]
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
[0060]
在本发明的第四方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
[0061]
(i)如本发明的第一方面所述的scfv、本发明的第二方面所述的car融合蛋白、或本发明的第三方面所述的抗体；以及
[0062]
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0063]
在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签。
[0064]
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
[0065]
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
[0066]
在本发明的第五方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
[0067]
(a)如本发明的第一方面所述的scfv、本发明的第二方面所述的car融合蛋白、或本发明的第三方面所述的抗体；以及
[0068]
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
[0069]
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
[0070]
在本发明的第六方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码如本发明的第一方面所述的scfv、本发明的第二方面所述的car融合蛋白、或本发明的第三方面所述的抗体。
[0071]
在另一优选例中，所述核酸分子编码本发明的第一方面所述的scfv，且具有seq id no.:4所示的编码vh的核酸序列和seq id no.:8所示的编码vl的核酸序列。
[0072]
在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第六方面所述的核酸分子。
[0073]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
[0074]
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
[0075]
在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明的第七方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明的第六方面所述的核酸分子、或表达如本发明的第一方面所述的scfv、本发明的第二方面所述的car融合蛋白、或本发明的第三方面所述的抗体。
[0076]
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
[0077]
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0078]
在另一优选例中，所述细胞为t细胞。
[0079]
在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。
[0080]
在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括t细胞或nk细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)；或(ii)嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)。
[0081]
在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明的第二方面所述的car融合蛋白，包括以下步骤：将本发明的第六方面所述的核酸分子或本发明的第七方面所述的载体转导入t细胞或nk细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。
[0082]
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
[0083]
在本发明的第十方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明的第一方面所述的scfv、本发明的第二方面所述的car融合蛋白、或本发明的第七方面所述的载体、或本发明的第八方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0084]
在本发明的第十一方面，提供了一种用途，将本发明的第一方面所述的scfv、本发明的第二方面所述的car融合蛋白、本发明的第三方面所述的抗体、本发明的第四方面所述的重组蛋白、或本发明的第五方面所述的抗体药物偶联物、或本发明的第八方面所述的细胞，用于制备预防和/或治疗gpc3相关的癌症或肿瘤的药物或制剂。
[0085]
在另一优选例中，所述gpc3相关的癌症或肿瘤为实体瘤。
[0086]
在另一优选例中，所述gpc3相关的癌症或肿瘤选自下组：肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌、或其组合。
[0087]
在本发明的第十二方面，提供了一种用于制备本发明的第八方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于所述容器内的本发明的第六方面所述的核酸分子、或本发明的第七方面所述的载体。
[0088]
在本发明的第十三方面，提供了一种如本发明的第八方面所述细胞、或本发明的第十方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗gpc3相关的癌症或肿瘤。
[0089]
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明的第八方面所述的细胞、或本发明的第十方面所述的制剂。
[0090]
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤，较佳地，为gpc3相关的癌症或肿瘤。
[0091]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0092]
图1显示了gc76bbζ结构示意图。
[0093]
图2显示了huh7-luc、hepg2-luc细胞构建与检测。
[0094]
图3显示了gc76bbζ阳性率检测。其中，a图表示未转染慢病毒的t细胞和b图表示转导慢病毒的carr-t，同样的制备工艺和流式检测的car阳性率结果。
[0095]
图4显示了gc76bbζ体外杀伤huh7-luc细胞。其中，a图和b图分别显示了e/t(效靶比)为4、e/t为1的杀伤活性结果。bm为gpc3抗体gc33的scfv构建的car-t；un-t为未转导慢病毒的t细胞。
[0096]
图5显示了gc76bbζ体外杀伤hepg2-luc细胞。其中，a图和b图分别显示了e/t为4、e/t为1的杀伤活性结果。
[0097]
图6显示了gc76bbζ体内抑瘤效果。其中，a图显示了给药1x106car-t细胞/小鼠的结果；b图显示了给药3x106car-t细胞/小鼠的结果。
具体实施方式
[0098]
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，首次获得一种靶向gpc3的嵌合抗原受体t细胞，其以高亲和力、高特异性地靶向gpc3的scfv作为car的抗原结合结构域。本发明的car-t细胞具有优异的靶细胞杀伤活性，能够很好的浸润至实体肿瘤内部，在动物体内发挥优异的抑瘤效果。在此基础上完成了本发明。
[0099]
术语
[0100]
如本文所用，“cdr”是抗体vh或vl链的互补决定区，其对与抗原的结合至关重要。
[0101]
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特定结构的区域。
[0102]
如本文所用，“单链可变区片段(scfv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scfv的实例包括通过重组dna技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。工程化scfv的各种方法是本领域技术人员熟知的。
[0103]
如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
[0104]
gpc3
[0105]
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)蛋白是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，在婴儿期的一些组织中，特别是肝脏和肾脏中表达，是与器官形成相关的胞外基质蛋白；在成人组织中几乎观察不到gpc3的表达，但是在肝细胞癌、黑素瘤、卵巢透明细胞癌、肺鳞状细胞癌等各种癌组织中高表达。因此gpc3是一种很好的肿瘤治疗靶点。
[0106]
嵌合抗原受体(car)
[0107]
如本文所用，“嵌合抗原受体(car)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域、与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(car)”有时也称为“嵌合受体”、“t-body”或“嵌合免疫受体(cir)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
[0108]
具体地，本发明的嵌合抗原受体(car)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0109]
在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。
[0110]
如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。较佳地，接头为柔性接头，例如，所述接头为(g4s)n，其中n为1-4。
[0111]
本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与cd28信号传导结构域、和cd3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
[0112]
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的fab片段，fab’片段，f(ab’)2片段，或单一fv片段。fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，fv抗体还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scfv(single-chain variable fragment)。scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scfv包含特异性识别肿瘤高表达抗原gpc3的抗体，较佳地为单链抗体。
[0113]
在本发明优选的实施方式中，所述抗原为gpc3。在本发明优选的实施方式中，本发明的car的抗原结合结构域靶向gpc3。
[0114]
优选地，本发明的car中的抗原结合结构域包含靶向gpc3的单链可变片段(scfv)，其结构如下式(n端至c端)所示：
[0115]vl
－vh[0116]
其中，vh为重链可变区；v
l
为轻链可变区；“－”为接头或肽键。
[0117]
在本发明优选的实施方式中，所述单链可变片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
[0118]
seq id no.18所示的hcdr1，
[0119]
seq id no.19所示的hcdr2，和
[0120]
seq id no.20所示的hcdr3；和/或
[0121]
所述轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
[0122]
seq id no.21所示的lcdr1，
[0123]
seq id no.22所示的lcdr2，和
[0124]
seq id no.23所示的lcdr3。
[0125]
在另一优选例中，所述单链可变片段包含seq id no：3所示氨基酸序列的vh和seq id no：7所示氨基酸序列的vl。
[0126]
在本发明中，本发明的scfv还包括其保守性变异体，指与本发明scfv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
[0127]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
[0128]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
[0129]
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。
[0130]
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(car)(gc76bbζ)的氨基酸序列如下所示：
[0131]
malpvtalllplalllhaarpgsqvqlqqsgaelvrpgasvtlsckasgytftdyemhwvkqtpvhglewigaiapktgntaynqkfkdkailtadkssstaymelrsltsedsavyyctryysyaywgqgtlvtvsaggggsggggsggggsdvvmtqtplslsvslgdqasiscrssqspvhsngntylqwflqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpytfgggtklekksgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no.17)
[0132]
载体
[0133]
本发明还提供了编码本发明car序列的dna构建物。
[0134]
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
[0135]
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
[0136]
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0137]
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0138]
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0139]
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0140]
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病
laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
[0147]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0148]
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
[0149]
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0150]
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性地使用基因组编辑技术来完成本发明，例如crispr-cas9、zfn或talen。
[0151]
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
[0152]
dna构建物进一步包含信号肽编码序列。优选地，该信号肽序列连接在抗原结合结构域的核酸序列上游。
[0153]
治疗性应用
[0154]
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(lv)转导的细胞。转导的t细胞可以诱导car介导的t细胞反应。
[0155]
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的car-t细胞。
[0156]
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中t细胞经基因修饰以表达本发明的car，并且将car-t细胞输注给需要的受体。输注的细胞能够杀死受体体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0157]
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。
[0158]
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗gpc3 scfv、铰链和跨膜区、和4-1bb和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
[0159]
可被治疗的适应疾病包括gpc3相关的癌症或肿瘤，例如gpc3阳性肿瘤或癌症。
gpc3相关的癌症或肿瘤可以包括实体瘤，特别是肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌或其组合。
[0160]
用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0161]
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
[0162]
本发明的car-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0163]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
[0164]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0165]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0166]
通常，如本文所述的激活和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中产生的疾病。特别地，本发明的car修饰的t细胞用于ccl的治疗。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗有患ccl风险的患者。因此，本发明提供治疗或预防ccl的方法，包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的car修饰的t细胞。
[0167]
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0168]
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0169]
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域
技术人员容易地确定。
[0170]
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0171]
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0172]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本发明经修饰的t细胞(如，gc76bbζ细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
[0173]
本发明的主要优点包括
[0174]
(1)本发明car-t中的car结构中靶向gpc3的scfv具有高亲和力和高特异性，能够很好的浸润至实体肿瘤内部，在动物体内发挥优异的抑瘤效果。
[0175]
(2)本发明car-t具有更好的安全性，无或微弱的非靶细胞杀伤。
[0176]
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0177]
实施例1gc76bbζ的结构
[0178]
通过特定的抗体库筛选，从约60个的克隆中，筛选获得一种性能优异的靶向gpc3的scfv，将所述scfv的重链可变区(seq id no：3)和轻链可变区(seq id no：7)作为car的抗原结合结构域。
[0179]
本发明car-t中的car结构包括信号肽sp、胞外抗原结合结构域scfv、绞链区cd8、跨膜区cd8、胞内结构域4-1bb和cd3zeta，并将此car结构命名为gc76bbζ，具体结构如图1所示。
[0180]
其中，各部分具体的序列如下所示：
[0181]
gc76bbζ序列：
[0182]
malpvtalllplalllhaarpgsqvqlqqsgaelvrpgasvtlsckasgytftdyemhwvkqtpvhglewigaiapktgntaynqkfkdkailtadkssstaymelrsltsedsavyyctryysyaywgqgtlvtvsaggggsggggsggggsdvvmtqtplslsvslgdqasiscrssqspvhsngntylqwflqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpytfgggtklekksgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no.17)
[0183]
信号肽sp氨基酸(seq id no.1)
[0184]
malpvtalllplalllhaarpgs
[0185]
信号肽sp核酸(seq id no.2)
[0186]
atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctccacgccgctagacccggaagc
[0187]
scfv的重链vh氨基酸(seq id no.3)
[0188]
qvqlqqsgaelvrpgasvtlsckasgytftdyemhwvkqtpvhglewigaiapktgntaynqkfkdkailtadkssstaymelrsltsedsavyyctryysyaywgqgtlvtvsa
[0189]
scfv的重链vh核酸(seq id no.4)
[0190]
caggtgcagctgcagcagtccggcgccgagctggtgagacccggagcttccgtgaccctgtcctgtaaggccagcggctacaccttcaccgattacgagatgcactgggtgaagcagacccctgtgcacggcctggagtggatcggcgccatcgccccaaagaccggcaatacagcctacaatcagaagttcaaggataaggccatcctgaccgccgataagtcctccagcaccgcctacatggagctgaggtccctgacatccgaggatagcgccgtgtactactgtaccagatactacagctacgcctactggggccagggcaccctggtgacagtgagcgcc
[0191]
接头linker氨基酸(seq id no.5)：
[0192]
ggggsggggsggggs
[0193]
接头linker核酸(seq id no.6)：
[0194]
ggcggaggcggaagcggaggaggaggaagcggcggaggcggtagc
[0195]
scfv的轻链vl氨基酸(seq id no.7)：
[0196]
dvvmtqtplslsvslgdqasiscrssqspvhsngntylqwflqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpytfgggtklekk
[0197]
scfv的轻链vl核酸(seq id no.8)：
[0198]
gatgtggtgatgacacagacccccctgagcctgcctgtgtccctgggcgaccaggcctccatcagctgtaggagcagccagtcccctgtgcactccaatggcaacacatacctgcactggtacctgcagaagcccggccagagccctaagctgctgatctacaaggtgagcaacagattctccggcgtgcccgacagattctccggaagcggcagcggcacagacttcaccctgaagatctccagggtggaggccgaggatctgggcgtgtacttctgctcccagagcacacacgtgccttacaccttcggcggcggcacaaagctggagatcaag
[0199]
铰链区hinge氨基酸(seq id no.9)：
[0200]
sgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiy
[0201]
铰链区hinge核酸(seq id no.10)：
[0202]
tccggcacaaccacccctgcccccagaccccctaccccagctcctacaatcgccagccagcccctgagcctcaggcctgaggcctgcaggcccgctgctggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgtgacatctac[0203]
跨膜区tm氨基酸(seq id no.11)：
[0204]
iwaplagtcgvlllslvitlyc
[0205]
跨膜区tm核酸(seq id no.12)：
[0206]
atctgggcccccctggccggcacctgtggagttctgctgctgtccctggtgatcacactgtactgc
[0207]
共刺激结构域4-1bb氨基酸(seq id no.13)：
[0208]
rfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0209]
共刺激结构域4-1bb核酸(seq id no.14)：
[0210]
agattctccgtggtgaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgaggcctgtgcagacaacacaggaggaggatggctgttcctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgtgagctg
[0211]
胞内信号cd3-ζ氨基酸(seq id no.15)：
[0212]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0213]
胞内信号cd3-ζ核酸(seq id no.16)：
[0214]
agagtgaagttcagcagatccgccgatgcccccgcctaccagcagggacagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgatgtgctggataagaggaggggcagggaccctgagatgggcggcaagcccaggaggaagaacccccaggagggcctgtacaacgaactgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgtccacagccaccaaggacacatacgacgccctgcacatgcaggccctgcctcccagatga
[0215]
实施例2 huh7-luc、hepg2-luc细胞构建与检测
[0216]
通过查询luciferase基因(genbank:acf93193.1)序列，在cro公司合成并构建至plvx-puro载体中，构建好的载体命名为plvx-luc-puro。通过慢病毒转染的方式构建稳转细胞系，即使用pgpol、pvsvg包装质粒和目的质粒plvx-luc-puro，在公司自有慢病毒包装平台，生产出高低度慢病毒，然后按照moi＝1分别感染靶细胞huh7、hepg2。通过几轮purmycin的加压筛选后进行检测，合格的细胞系luciferase信号值应为转染慢病毒原始细胞100倍以上，将合格的细胞分别命名为huh7-luc、hepg2-luc；检测结果如图2所示。
[0217]
结果表明，huh7-luc、hepg2-luc细胞的luciferase信号值(luc值)均为转染慢病毒原始细胞100倍以上。
[0218]
实施例3慢病毒制备
[0219]
1、病毒制备前一天，在15cm细胞培养皿中接种1.5*107个293t细胞，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。
[0220]
2、第二天，从冰箱中取出pei及慢病毒包装质粒(pgpol、pvsvg)和目的质粒gc76bbζ，室温解冻
[0221]
3、取1支干净15ml离心管，加入2ml opti-mem培养基，然后分别加入10μg gc76bbζ、4μg pgpol和2μg pvsvg，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μl pei，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置15分钟。
[0222]
4、将上述dna/pei复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。
[0223]
5、连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，然后4℃条件20000g离心2小时；离心结束后，小心将离心管中的液体吸去，加入400μl pbs缓冲液将沉淀重悬，分装病毒至1.5ml离心管中，每管100μl，将病毒置于-80℃条件保存。
[0224]
实施例4 t细胞的分选与激活
[0225]
1、取1只冻存pbmc细胞，37℃水浴复苏；将复苏的pbmc加入到已预先加入10ml预热培养基的15ml离心管中；然后500g离心5分钟
[0226]
2、用分选缓冲液重选细胞后，进行细胞计数
[0227]
3、500g离心5分钟，调整细胞密度为1.0*107/ml
[0228]
4、按照1.0*107的细胞加入20μl体积的分选磁珠量，加入分选磁珠
[0229]
5、4℃条件，孵育15分钟
[0230]
6、将孵育好的细胞加入分选柱中执行分选操作
[0231]
7、收集分选柱中流出液，500g离心5分钟
[0232]
8、将细胞重悬于x-vivo 15培养基(含300u/ml il-2)中，计数，并调整细胞密度为1.0*106/ml
[0233]
9、按照1.0*106细胞，加入10μl激活磁珠的比例，加入激活磁珠，然后将细胞置于37℃、5％co2培养箱培养48小时。
[0234]
实施例5 t细胞感染
[0235]
1、收集激活后的t细胞，500g离心5分钟，将细胞重悬于x-vivo 15培养基(含300u/ml il-2)中，计数，并调整细胞密度为1.0*106/ml
[0236]
2、按照moi＝10，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(ml)＝(moi*细胞数量)/病毒滴度
[0237]
3、从-80℃冰箱取出病毒后，室温融化；加所需病毒至激活后的t细胞中
[0238]
4、每2-3天取样计数，维持细胞密度在1.0*106/ml，继续培养6-10天
[0239]
实施例6 car-t阳性率检测
[0240]
1、500g离心5分钟，收集感染慢病毒第7天后的car-t细胞
[0241]
2、500μl pbs重悬，500g离心5分钟洗涤细胞一次
[0242]
3、1ml pbs重悬，取20μl重悬后细胞于细胞计数仪上计数
[0243]
4、按照细胞计数结果，取5*105/反应细胞进行car-t阳性率检测
[0244]
5、按照2μg/ml浓度加检测抗体，反应体积为100μl，然后4℃条件，孵育30分钟
[0245]
6、孵育结束后，500g离心5分钟
[0246]
7、500μl pbs重悬，500g离心5分钟洗涤细胞一次
[0247]
8、重复步骤7操作
[0248]
9、200μl pbs重悬，进行上机检测
[0249]
如图3所示，结果表明，gc76bbζ阳性率为52.13％，而未转染慢病毒的t细胞为0.31％。
[0250]
实施例7 car-t细胞对靶细胞杀伤
[0251]
1、收集对数生长期靶细胞(huh7-luc细胞或hepg2-luc细胞)，调整靶细胞密度至2*105/ml，取一块新的96孔板，按照50μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加
入100μl培养基，以防中间的实验孔水分蒸发
[0252]
2、离心收集上述制备的car-t细胞，用x-vivo 15培养基；然后按照设计的e/t比例，加入50μl car-t细胞
[0253]
3、将孔板置于5％co
2 37℃培养箱中，培养14-18小时
[0254]
4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，加入50μl one-glo luciferase检测底物300g室温离心96孔板3分钟，轻轻的将板取出，在酶标仪上读数
[0255]
5、数据计算公式，杀伤％＝1-(样品读值-min)/(max-min)
[0256]
gc76bbζ体外杀伤人肝癌细胞系的huh7-luc细胞、hepg2-luc细胞的结果如图4、图5所示。
[0257]
bm为gpc3抗体gc33的scfv构建的car-t；un-t为未转导慢病毒的t细胞。
[0258]
图4的结果表明，针对huh7-luc细胞，gc76bbζ体外杀伤活性在e/t(效靶比)为4时，gc76bbζ能够杀伤将近90％的肿瘤细胞，而bm阳参car-t只有60％的杀伤效果；即使在e/t(效靶比)为1时，gc76bbζ也有将近60％的杀伤能力，此时的bm阳参car-t几乎看不出或无杀伤效果。
[0259]
图5的结果表明，针对hepg2-luc细胞，gc76bbζ体外杀伤活性在e/t(效靶比)为4时，略优于bm阳参car-t的杀伤活性；在e/t(效靶比)为1时，gc76bbζ有近90％的杀伤能力，此时的bm阳参car-t只有接近48％的杀伤效果。
[0260]
实施例8 car t体内药效实验
[0261]
1、收集对数生长期的huh7细胞，并用pbs洗涤细胞两次后，计数，调整细胞密度为1x108/ml
[0262]
2、通过皮下接种ncg小鼠，每只小鼠接种100ul上述密度为1x108/ml的huh7细胞
[0263]
3、继续培养小鼠，每周测量肿瘤体积，当小鼠肿瘤体积长至100mm3左右时，根据肿瘤体积进行随机化分组。每组5只，分组当天定义为d0天，并在分组当天给药处理。每只老鼠分别给药1x106或3x106的car-t细胞。
[0264]
4、实验观察和数据采集，给药后，每周常规监测肿瘤对动物正常行为的影响。具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。测量并记录肿瘤大小和小鼠体重。瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5
×
(肿瘤长径
×
肿瘤短径2)。
[0265]
gc76bbζ体内抑瘤效果如图6所示。
[0266]
结果表明，car-t细胞在较低的给药剂量下(1x106细胞/小鼠)，就具有优异的抑瘤效果。
[0267]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。