一种提高灵芝低极性灵芝三萜含量的方法

1.本发明属于真菌栽培技术领域，涉及一种提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量的方法，具体是指柠檬酸在提高灵芝菌株总灵芝三萜中低极性灵芝三萜化合物含量中的应用，通过在灵芝液体发酵培养的过程中加入适量的柠檬酸而提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量。
2.相关背景
3.灵芝(ganoderma lucidum(curtis)p.karst)是我国传统药用真菌，能够合成大量生物活性化合物，如三萜、多糖、核苷酸、甾醇甾体等。其中灵芝三萜(ganoderic acid，ga)类物质在灵芝的药理方面发挥着重要的作用，因此其含量为衡量灵芝品质的重要指标之一。研究表明，多种灵芝三萜化合物具有抗hiv病毒、抗肿瘤、保肝排毒以及降低体内胆固醇含量等重要的药用功效，是一种具有多重效能的天然有机化合物。因此，提高灵芝三萜化合物的产量将进一步提高灵芝的药用潜力和商业价值。同时，不同极性或种类的灵芝三萜具有不同的作用，根据需求获得相应功能的灵芝三萜能够进一步降低培养成本，提高产品价值。已有研究显示，灵芝酮a、灵芝醇a和灵芝醇f等低极性灵芝三萜化合物单体在体外具有显著的抗肿瘤活性。在对肿瘤细胞sw620和l1210的增殖的抑制作用中发现，低极性三萜部分与总三萜的ic50相近，说明低极性三萜化合物具有显著的体外抗肿瘤和抗炎活性。此外,极性较低的灵芝烯酸f、灵芝醇b和灵芝酸dm对于巨噬细胞raw264.7的呼吸爆发也有较好的抑制作用。因此对低极性灵芝三萜含量的提高，具有显著的经济价值。
4.提供一种提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量的方法是本发明要解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供柠檬酸在提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量中的应用。揭示了柠檬酸对于不同种类灵芝三萜含量的影响。
6.本发明的另一目的在于提供一种提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量的方法。
7.为了实现发明目的，其技术方案如下：
8.柠檬酸在提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量中的应用。作为一种优选的方案：向灵芝液体发酵培养基中加入柠檬酸进行处理来提高灵芝总灵芝三萜中低极性灵芝三萜化合物的含量。
9.进一步优选的：所述的柠檬酸在灵芝液体发酵培养基中的添加浓度为：400～800mm；最优选为：400mm。
10.作为一种优选的方案：所述处理的时间为48h。
11.所述的灵芝液体发酵培养基为cym液体培养基。
12.一种提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物含量的方法，向灵芝液体发酵培养基中加入柠檬酸进行处理来提高灵芝中低极性灵芝三萜化合物的含量。
13.上述的方法中，其所述的柠檬酸在灵芝液体发酵培养基中的添加量为：400～
800mm；优选为：400mm。所述处理的时间为48h。
14.上述的方法中，其所述的柠檬酸配制成柠檬酸溶液，然后通过高压蒸汽灭菌法灭菌后加入到灵芝液体发酵培养基中。
15.上述方法的操作过程具体包括以下步骤：
16.(1)菌种活化：将保存在pda甘油保种管中的灵芝菌种接入cym固体培养基，于28℃培养箱中培养活化，待其菌丝体长到一定大小用打孔器转接，共转接两次。
17.(2)种子液制备：将活化好的灵芝用打孔器打6个小孔接入cym液体培养基中，放入150rpm，28℃摇床中培养。
18.(3)发酵处理：将种子液粉碎，然后接入cym液体培养基中发酵，加入柠檬酸溶液处理。
19.按重量百分含量计，所述cym液体培养基的配方为：麦芽糖1％、葡萄糖2％，酵母提取物0.2％、蛋白胨0.2％、mgso4·
7h2o 0.05％、kh2po
4 0.46％，其余用水不足100％。
20.菌种活化在28℃培养箱培养14-20d，种子液制备在28℃摇床中培养7d，发酵处理在28℃摇床中培养7d，最后48h加入柠檬酸溶液处理。
21.本发明的有益效果：
22.灵芝三萜含量为衡量灵芝品质的重要指标之一，通过在灵芝菌种的液体培养基中加入柠檬酸可对不同极种类灵芝三萜含量产生影响。当柠檬酸处理浓度为400mm，处理时间为48h时，灵芝三萜总含量有一定程度的提高。灵芝三萜不单单是一种物质，其中包含多种不同种类的生物活性物质，通过hplc法分析柠檬酸处理与未处理组三萜物质含量和种类的不同，结果表明野生型灵芝菌种中，总三萜含量提升约24.68％，hplc结果中42min之前峰面积所表示的高极性和中极性灵芝酸含量，提升约11.12％，差异性并不显著。但是hplc过程中42min之后的低极性灵芝三萜化合物含量占总灵芝三萜化合物含量的峰面积增加较显著，增长幅度约为13.78％。
附图说明：
23.图1为不同浓度柠檬酸处理总灵芝三萜含量。
24.图2为柠檬酸处理与未处理总灵芝三萜含量。
25.图3为柠檬酸处理与未处理灵芝三萜指纹图谱。
26.图4为高极性灵芝三萜峰面积与总峰面积比例。
27.图5为低极性灵芝三萜峰面积与总峰面积比例。
具体实施方式：
28.下面结合实例对本发明做进一步详细说明：
29.实施例1
30.(1)菌种活化：将保存在甘油pda保种管中的灵芝菌株(菌株编号：accc53264)接入cym固体培养基中，然后放在28℃培养箱中活化，待菌落约长满整个平板时用打孔器在边缘打孔转接至cym固体培养基，共转接两次。
31.(2)种子液制备：在活化的灵芝菌种菌落边缘用打孔器打6个直径为5mm的小孔，用接种针接入cym液体培养基中，并在温度28℃，转速为150r/min摇床中培养制备种子液，培
养7天。
32.(3)发酵处理：将发酵好的灵芝菌丝种子液用粉碎机破碎，然后接入100ml cym液体培养基中，按体积百分含量计，每瓶接入5％的量，放入28℃，转速150r/min摇床中发酵。
33.(4)发酵5天后分别加入400mm、800mm和1200mm的柠檬酸(将柠檬酸配制成5mol/l的母液按比例添加)处理后继续发酵培养48h；以加入同体积的无菌水作为对照。
34.(5)将处理好的和对照组菌丝体和胞外滤液通过滤网分离收集，菌丝烘干后磨成粉末。
35.(6)三萜含量测定：准确称取菌丝干粉0.03g，加入1.5ml 95％乙醇，超声破碎2h，间或混匀，离心(4000rpm，10min)吸取上清100μl，加入200μl香草醛和500μl高氯酸混匀水浴(60℃，20min)，冷却10min点板(每孔32μl样品 200μl冰醋酸)于λ＝550nm时检测吸光度。
36.根据od值计算出总三萜含量，计算公式为：
[0037][0038]
其中x为平均od值。
[0039]
按重量百分含量计，所述cym液体培养基的配方为：麦芽糖1％、葡萄糖2％、酵母提取物0.2％、蛋白胨0.2％、mgso4·
7h2o 0.05％、kh2po
4 0.46％，其余用水补足100％。
[0040]
所述的pda固体培养基的配方为：1l培养基中含去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g；其制备方法为本领域技术人员公知的。
[0041]
图1为不同浓度柠檬酸处理总灵芝三萜含量，结果显示，柠檬酸的处理浓度显著影响总灵芝三萜含量，400mm处理时总灵芝三萜含量最高。
[0042]
实施例2
[0043]
(1)菌种活化：将保存在甘油pda保种管中的灵芝菌株(菌株编号：accc53264)接入cym固体培养基中，然后放在28℃培养箱中活化，待菌落约长满整个平板时用打孔器在边缘打孔转接至cym固体培养基，共转接两次。
[0044]
(2)种子液制备：在活化的灵芝菌种菌落边缘用打孔器打6个直径为5mm的小孔，用接种针接入cym液体培养基中，并在温度28℃，转速为150r/min摇床中培养制备种子液，培养7天。
[0045]
(3)发酵处理：将发酵好的灵芝菌丝种子液用粉碎机破碎，然后接入100ml cym液体培养基中，按体积百分含量计，每瓶接入5％的量，放入28℃，转速150r/min摇床中发酵。
[0046]
(4)发酵5天后加入400mm的柠檬酸处理后继续发酵培养48h；以加入同体积的无菌水作为对照。
[0047]
(5)将处理好的和对照组菌丝体和胞外滤液通过滤网分离收集，菌丝烘干后磨成粉末。
[0048]
(6)三萜含量测定：准确称取菌丝干粉0.03g，加入1.5ml 95％乙醇，超声破碎2h，间或混匀，离心(4000rpm，10min)吸取上清100μl，加入200μl香草醛和500μl高氯酸混匀水浴(60℃，20min)，冷却10min点板(每孔32μl样品 200μl冰醋酸)于λ＝550nm时检测吸光度。
[0049]
根据od值计算出总三萜含量，计算公式为：
[0050]
[0051]
其中x为平均od值。
[0052]
所述培养基的配方同实施例1。
[0053]
根据实施例1的实验结果，选取效果最佳的柠檬酸处理浓度进行处理并验证效果，验证结果见图2。
[0054]
实施例3：hplc法分析三萜种类和含量
[0055]
步骤(1)～(5)的实验过程同实施例2。
[0056]
(6)取菌丝体干粉0.1g于10ml离心管中，加入2ml乙酸乙酯水浴超声2h，离心(4000g，10min)取上清烘干，加入600μl甲醇震荡溶解，通过膜(0.22μm)过滤。
[0057]
(7)色谱柱：shim-pack gist c18 5μm(4.6i.d.
×
250mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测器波长252nm，进样量5μl。用乙腈(b)和含有乙酸(0.01％)的水溶液(a)进行梯度洗脱，a中水和乙酸的体积比为100：0.01，梯度洗脱程序b泵：20-26.5％，8min；2.5-65％，12min；65-75％，10min；75-100％，20min；100％，16min，100-20％，2min，20％，4min梯度洗脱一共持续72min。
[0058]
(8)使用国家药典委员会发布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)进行数据的分析，对照图谱生成方式采用均值法。对峰面积数据进行方差分析和多重比较，用以表示不同极性灵芝酸含量。
[0059]
所述培养基的配方同实施例1。
[0060]
柠檬酸处理与未处理灵芝三萜指纹图谱见图3。高极性灵芝三萜峰面积与总峰面积比例见图4。低极性灵芝三萜峰面积与总峰面积比例见图5。
[0061]
实验结果显示，当柠檬酸处理浓度为400mm，处理时间为48h时，灵芝三萜总含量有一定程度的提高。灵芝三萜不单单是一种物质，其中包含多种不同种类的生物活性物质，通过hplc法分析柠檬酸处理与未处理组三萜物质含量和种类的不同，结果表明野生型灵芝菌种中，总三萜含量提升约24.68％，hplc结果中42min之前峰面积所表示的高极性和中极性灵芝酸含量，提升约11.12％，差异性并不显著。但是hplc过程中42min之后的低极性灵芝三萜化合物含量占总灵芝三萜化合物含量的峰面积增加较显著，增长幅度约为13.78％。