一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用

1.本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用。


背景技术：

2.病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，而生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上也没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。
3.引发病毒病的植物病毒种类繁多，例如烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒等。马铃薯y病毒属(potyvirus)病毒寄主范围较广，可侵染马铃薯、烟草、番茄和辣椒在内的多种茄科作物，造成巨大的经济损失。
4.马铃薯是我国第四大粮食作物，其种植面积与总产量均位列全球之首。而病毒病成为制约其产量和质量的重要限制因素，植株感病后马铃薯薯块商品价值降低，严重减产甚至绝收，造成重大经济损失，不利于民生。
5.为了提高作物的抗病毒能力，可以对作物植株进行优化培育。而传统育种方法时间周期长、效率低；转基因技术虽然高效，但因安全性存在较大争议目前应用受到限制。例如申请号为200910191952.5的中国专利公开一种利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法，将tm-22基因转入马铃薯，并通过筛选、鉴定而获得已表达tm-22基因的高抗病毒植株。该方案通过植物基因转化马铃薯，安全性存在争议，应用受到限制。
6.基因组编辑技术的出现，克服了以往方法的局限性，尤其是crispr/cas9技术的设计简便和低成本使其在全基因组水平进行定向编辑成为可能，可以高效地实现特定位点的编辑。通过基因组编辑调节特定的植物防御机制，是目前提高植物抗病性最有效的措施之一。
7.目前关于马铃薯基因编辑的报道较少。倘若能够通过基因工程的改造获得能够抗病毒的马铃薯植株，则能够防治马铃薯病毒病，可以减少经济损失。
8.有鉴于此特提出本发明。


技术实现要素：

9.本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用。本发明通过crispr/cas9基因编辑方式获得了抗病毒的马铃薯植株，能够显著减轻植物受病毒尤其是马铃薯y病毒属病毒侵染后的危害。
10.为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
11.本发明的第一目的是提供一种抗病毒马铃薯植株的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)以phse401为骨架，构建载体，以在stpcap1基因的第762位至第782位核苷酸引入插入、缺失或替换突变；
13.(2)将获得的载体转化农杆菌，将筛选出的农杆菌阳性转化子利用农杆菌介导的
叶盘转化法转化马铃薯，筛选stpcap1基因敲除的马铃薯植株；
14.(3)摩擦接种马铃薯病毒至stpcap1基因敲除的马铃薯植株，检测其抗病毒能力，得到抗病毒马铃薯植株。
15.ca
2
信号在植物细胞中具有多态性，在植物的生长发育周期中，种子萌发、生长、开花、结果、衰老、死亡等过程，都有ca
2
信号的参与，质膜相连阳离子结合蛋白1是新的ca
2
结合蛋白。马铃薯与质膜相连阳离子结合蛋白1(plasma membrane-associated cation-binding protein 1，stpcap1)基因在大多数组织中表达。而将病毒所依赖的寄主蛋白沉默或者敲除，则有可能使植物对病毒病产生抗性。
16.本发明中，采用crispr/cas9基因编辑的方式，在stpcap1基因的第762位至第781位核苷酸引入插入、缺失或替换突变，使stpcap1基因敲除，获得了抗病毒的马铃薯植株。经试验证明，采用本发明制备方法获得的抗病毒马铃薯植株line 80、81能明显抑制病毒的侵染，显著减轻植物受马铃薯y病毒感染后的伤害，显著减少损失。
17.本发明中，在进行基因突变编辑前，stpcap1基因的核苷酸序列如seq id no.18所示。
18.crispr/cas9基因编辑技术是第三代基因编辑技术，从2013年crispr/cas9的作用机制与使用方法得以明确后，逐步得到了广泛的应用。但是crispr/cas9基因编辑技术应用到具体某个基因的编辑时，编辑效率、编辑位点并无法预期，甚至对于某些基因无法编辑成功。
19.本发明根据stpcap1基因设计了至少7条guide rna(具体见表1中序列)，经过大量实验探索发现，仅有guiderna5(seq id no.5)具有编辑活性，而其他的guide rna均无法编辑成功，说明采用crispr/cas9基因编辑可以在stpcap1基因的第761位至第780位进行基因编辑，从而获得了stpcap1基因敲除的马铃薯植株，具有抗病毒能力。
20.进一步的方案，步骤(1)中，所述载体含有guide rna，所述guide rna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
21.进一步的方案，得到的抗马铃薯植株中，stpcap1基因的第775位-778位核苷酸缺失。
22.进一步的方案，得到的抗马铃薯植株中，stpcap1基因的第773位-777位核苷酸缺失。
23.本发明得到的stpcap1基因第775位-778位核苷酸、或第773位-777位核苷酸缺失的马铃薯植株，从western blotting检测结果看，接种病毒后病毒积累量显著低于阳性对照组，说明其能够显著抑制病毒侵染。
24.进一步的方案，步骤(3)中，检测抗病毒能力的方法包括：stpcap1基因敲除的马铃薯植株培养至适龄，摩擦接种马铃薯病毒，接种12天后，观察病毒侵染情况，并采集系统发病叶片进行病毒积累量检测，确定植株具有抗病性。
25.进一步的方案，步骤(3)中，摩擦接种的病毒为马铃薯y病毒属病毒；
26.马铃薯y病毒属主要包括马铃薯y病毒、马铃薯a病毒、和烟草脉带花叶病毒等。
27.优选的，摩擦接种的病毒为马铃薯y病毒；
28.更优选的，摩擦接种的病毒为pvy-gz-gfp(potato virus y isolate gz，genbank:mn381731)。
29.本发明的第二目的是提供一种在制备抗病毒马铃薯植株中使用的guide rna序列，所述guide rna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
30.采用上述核苷酸序列的guide rna，能够对stpcap1基因实现基因编辑，得到stpcap1基因敲除的马铃薯植株。
31.本发明的第三目的是提供一种载体，所述载体以phse401为骨架，并含有guide rna，所述guide rna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
32.本发明的第四目的是提供一种重组菌，重组菌中含有载体，所述载体以phse401为骨架，并含有guide rna，所述guide rna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
33.优选的，所述重组菌为重组农杆菌。
34.本发明的第五目的是提供一种如上所述的制备方法制备的抗病毒马铃薯植株，或如上所述的guide rna序列，或如上所述的载体，或如上所述的重组菌在防治病毒侵染植物方面的应用；
35.优选的，在防治马铃薯y病毒属病毒侵染植物方面的应用；
36.优选的，在防治马铃薯y病毒侵染植物方面的应用。
37.采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
38.1、本发明通过crispr/cas9基因编辑方式成功在stpcap1基因的第762位至第781位核苷酸引入了使基因功能敲除的突变，获得了抗病毒的马铃薯植株。
39.2、采用本发明的制备方法制备得到的抗病毒马铃薯植株，能够明显抑制马铃薯病毒，尤其是马铃薯y病毒的侵染，显著减轻植物受马铃薯y病毒感染后的伤害，能够显著减少损失。
40.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
41.附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
42.图1是本发明的抗病毒马铃薯植株的测序结果；
43.图2是本发明的抗病毒马铃薯植株的pcap1蛋白western blot检测结果；
44.图3是本发明的抗病毒马铃薯植株摩擦接种病毒后的叶片症状观察结果；
45.图4是本发明的抗病毒马铃薯植株摩擦接种病毒后，western blot检测叶片病毒蛋白含量结果。
46.需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
47.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
48.实验材料
49.1、植物材料
50.马铃薯品种desire，基于desire品种stpcap1基因编辑的马铃薯植株由本实验室保存。
51.2、主要菌株与载体
52.大肠杆菌菌株escherichia coli dh5α，农杆菌agrobacterium tumefaciens strain gv3101由本实验室保存。phse401、pcbc-dt1t2载体由天津吉诺沃生物科技有限公司提供。
53.实施例
54.一、靶位点grna的设计
55.利用crispr设计软件，以ncbi数据库stpcap1基因设计grna靶点，获得7条guide rna(grna)序列(如表1所示)。stpcap1 mrna的genbank登录号为xm_006352559.2，stpcap1基因的核苷酸序列如seq id no.18所示。
56.设计原则为：
57.(1)靶位点序列的长度为20bp；
58.(2)靶位点序列后面有ngg(n为任意碱基)三个碱基；
59.(3)靶位点最好设计在基因外显子靠前位置。
60.表1 guide rna序列
[0061][0062]
二、crispr/cas9表达载体的构建
[0063]
1.引物设计
[0064]
将上述编号为1和2的序列，即grna1和grna2构建在一个敲除载体上，命名stpcap-g12(引物1，2)；
[0065]
将上述编号为3和4的序列，即grna3和grna4构建在一个敲除载体上，命名stpcap-g34(引物3，4)；
[0066]
将上述编号为5、6和7的序列，即grna5、grna6、grna7分别构建在敲除载体上，命名为stpcap-g5(引物5，6)、stpcap-g6(引物7，8)、stpcap-g7(引物9，10)。
[0067]
引物列表如表2所示。
[0068]
表2引物序列
[0069][0070][0071]
2、载体构建
[0072]
(1)双grna载体pcr扩增片段：以pcbc-dt1t2为模板，分别利用上述表中引物，使用高保真dna聚合酶，通过pcr扩增获得片段。
[0073]
pcr反应体系为：
[0074][0075]
pcr程序为98℃预变性30s，98℃10s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，4℃保存。将扩增得到的片段用琼脂糖凝胶电泳回收。
[0076]
(2)单grna片段pcr退火获得
[0077]
pcr反应体系为：
[0078]
反应成分
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
加入体积
[0079]
引物f(100μmol/l)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0080]
引物r(100μmol/l)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0081]
65℃反应5分钟，退火至室温。
[0082]
(3)golden gate反应
[0083][0084]
轻弹混匀瞬离，pcr程序为37℃5min，16℃5min，30个循环；60℃5min，4℃保存。将连接产物转化e.coli dh5α感受态细胞，提取质粒测序验证，获得的质粒分别命名为phse401-stpcap1-12、phse401-stpcap1-34、phse401-stpcap1-5、phse401-stpcap1-6、phse401-stpcap1-7。
[0085]
三、农杆菌阳性转化子筛选
[0086]
分别吸取约1μg上述重组质粒加入到100μl农杆菌感受态细胞中(在感受态细胞刚刚溶解时加入)，轻弹混匀，冰浴30min。液氮速冻5min后，立即于37℃水浴热激5min，冰上5min。加入1ml lb液体培养基，28℃、220rpm培养3h。5000rpm离心5min，弃掉上清，用枪头吹打混匀，均匀涂布于卡那霉素(50μg/ml)、利福霉素(50μg/ml)的lb固体平板上，28℃，暗培养2天。
[0087]
然后分别以各靶位点的f引物与靶位点r引物对农杆菌阳性转化子进行菌液pcr鉴定。
[0088]
四、农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯
[0089]
无菌苗的培养：取栽培的健康幼嫩程度适中的desire品种马铃薯叶片于75％的乙醇中消毒30s，无菌水清洗1-2次，然后在10％的次氯酸钠中消毒8-10min，无菌水清洗5-6次，之后种在ms固体培养基上，25℃培养。剪取新鲜叶片，用打孔器打成直径约0.5cm的植物叶盘，于ms1培养基(ms 2.0mg/l naa 0.5mg/l 6-ba)上，28℃预培养3天。
[0090]
农杆菌的侵染：取农杆菌阳性转化菌接种于50ml lb液体培养基中(卡那霉素50μg/ml、利福霉素50μg/ml)，28℃、220rpm、暗培养1-2天，当菌液od
600
值达到0.4-0.6时，4000rpm、4℃离心15min，弃尽上清，菌体沉淀用40ml ms液体培养基(as的终浓度100mm/l)重悬。
[0091]
将预培养3天的叶盘转移至农杆菌菌液中，充分侵染8-10min，然后将叶盘置于无菌滤纸上，吸干叶片表面多余的菌液，将叶盘置于ms1固体培养基(ms 2.0mg/l生长素 0.5mg/l细胞分裂素)上，28℃、避光培养3天。
[0092]
说明：naa为萘乙酸；6-ba为6苄基腺嘌呤；as为乙酰丁香酮。
[0093]
五、马铃薯植株的获得
[0094]
愈伤组织培养：共培养3天的马铃薯叶盘，用含有500mg/l羧苄霉素的灭菌水洗涤4次，再将叶盘置于灭菌滤纸上，吸干叶片表面多余的水，将叶盘置于ms2固体培养基(ms 2.0mg/l生长素 0.5mg/l细胞分裂素 250mg/l羧苄霉素 50mg/l卡那霉素)培养，每两周更换一次培养基。
[0095]
生根培养：愈伤组织培养后，将分化出的小芽，转移至ms生根培养基(ms 250mg/l羧苄霉素 50mg/l卡那霉素)上继续生长，待植株根系发育好后，洗去根部培养基，将植株置于自来水中炼苗1-2周，直至长出新的根后，将植株转移至土壤中，温室中继续生长。
[0096]
六、pcr测序验证、western blot检测
[0097]
采集基因编辑植株叶片，提取植物基因组dna扩增pcap1基因，将其连接至pmd18-t载体测序，结果显示phse401-stpcap1-5质粒转化的line 80植株有-4bp缺失突变(stpcap1基因的第775位-778位核苷酸缺失)，line 81有-5bp缺失突变(stpcap1基因的第773位-777位核苷酸缺失)，说明只有guiderna5(seq id no.5)有编辑活性。line80、81植株的测序结果如图1所示。
[0098]
采集系统叶片提取植物总蛋白，利用实验室制备的stpcap1抗体进行检测，line 80、81植株pcap1蛋白未检测到目的条带(如图2所示)，说明phse401-stpcap1-5含有有活性的grna，line80、81植株pcap1基因编辑成功。
[0099]
七、抗病毒马铃薯植株的抗毒检测
[0100]
将基因编辑马铃薯移到温室培养至适龄，采集pvy-gz-gfp(genbank:mn381731)接种发病的本烟系统叶片，按1：10研磨稀释后作为毒源摩擦接种野生型及基因编辑马铃薯植株。在接种12天后，对照植株desire系统叶片出现较多荧光点，且面积较大，line 80、81植株尚未出现荧光点或荧光点数量较少，面积较小，结果如图3所示。
[0101]
采用现有技术中的方法采集系统叶片，对病毒蛋白进行western blotting检测，发现line80、81植株病毒积累量显著低于对照，说明其能显著抑制病毒侵染，如图4所示。
[0102]
对比例
[0103]
实验室前期研究《细胞膜阳离子结合蛋白调控马铃薯y病毒和烟草脉带花叶病毒侵染的分子机制》利用rnai瞬时沉默马铃薯中stpcap1基因并观察其对pvy侵染的影响。实验结果表明，沉默pcap1后植株系统叶片荧光强度变弱，病毒积累量降低，说明沉默stpcap1具有抵抗pvy侵染的作用。但是接种后72小时qrt-pcr检测pcap1基因沉默效率仅有20％，且后期病毒侵染的差异就会缩小直至消失。利用harpin结构只能瞬时沉默，不能长时间观察该基因沉默对病毒侵染的影响。本研究获得的stpcap1基因敲除植株，pcap1蛋白完全丧失功能，接种病毒后能显著抑制pvy-gz-gfp的侵染，能长时间观察该基因对病毒移动及侵染的影响，为后期实验研究提供了技术基础，也为抗病毒马铃薯植株培育提供理论指导。
[0104]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。