一种脐带血提取免疫细胞的培养方法与流程

1.本发明涉及细胞生物学技术领域，具体为一种脐带血提取免疫细胞的培养方法。


背景技术：

2.脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源；随着医学的发达，脐带血的功能也被逐渐的发掘，目前就会对脐带血中的免疫细胞进行一个提取并培养，进而储存后方便后期基因病的治疗；但是目前脐带血提取免疫细胞的培养过于复杂化，而且培养出来的免疫细胞数量较少，很难满足后期的临床使用；再者就是整体的培养较为昂贵，从而难以达到节省培养成本的目的。


技术实现要素：

3.(一)解决的技术问题
4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种脐带血提取免疫细胞的培养方法，解决了目前脐带血提取免疫细胞的培养过于复杂化，而且培养出来的免疫细胞数量较少以及难以达到节省培养成本的问题。
5.(二)技术方案
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种脐带血提取免疫细胞的培养方法，包括如下步骤：
7.s1、将脐带血单个核细胞用第一培养基培养至细胞生长状态稳定，后续改用第二培养基进行培养，第二培养基中添加胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液；
8.s2、第一培养基对单个核细胞进行原代培养及传代培养至第2-3代，后续传代培养改用第二培养基；最终得到免疫细胞；
9.s3、将制得的培养液导入培养袋中，然后将s2中得到的免疫细胞装入进行最后一步的培养；
10.s4、对最终培养的免疫细胞进行收集，然后进行冷存。
11.作为本发明的一种优选技术方案，所述s2中的单个核细胞接种于培养瓶中后放于34℃，饱和湿度，3％co培养箱中培养2-5天。
12.作为本发明的一种优选技术方案，所述培养瓶中的培养液，单个核细胞接种于细胞培养瓶后，2-3天后半量换液，一周时间后首次全量换液。
13.作为本发明的一种优选技术方案，所述s1中的抗cd3单克隆抗体的细胞密度3
×
96-1
×
118个/ml。
14.作为本发明的一种优选技术方案，所述s1中il-1a是在所述脐带血核细胞加入所
述胎牛血清和抗生素后15min内加入，且加入时的温度控制在 10-20℃为最佳。
15.作为本发明的一种优选技术方案，所述s1中的诱导培养组合物包括纤维连接蛋白、il-2、il-1a、抗cd3单克隆抗体，优选地，还含有il-15。
16.作为本发明的一种优选技术方案，所述s2中的培养袋体积大于培养液总体积。
17.(三)有益效果
18.与现有技术相比，本发明提供了一种脐带血提取免疫细胞的培养方法，具备以下有益效果：
19.该脐带血提取免疫细胞的培养方法，对同一种免疫细胞来说，在总的培养液用量不变的情况下，改变培养液体积和培养袋容积的比例关系，细胞的扩增能力和细胞数量会发生改变，从而让培养液体积和培养袋容积比例的降低，使得免疫细胞的扩增能力有一定提高，使得整个培养方法可以得到更多数量的免疫细胞，更好的满足后期的临床使用；再这就是整体的培养中，通过添加相应的诱导培养组合物，一是加快了培养速度，二是降低了整体的培养成本，更好的有利于大规模培养所需。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1
22.本发明提供以下技术方案：一种脐带血提取免疫细胞的培养方法，包括如下步骤：
23.s1、将脐带血单个核细胞用第一培养基培养至细胞生长状态稳定，后续改用第二培养基进行培养，第二培养基中添加胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液；
24.s2、第一培养基对单个核细胞进行原代培养及传代培养至第2-3代，后续传代培养改用第二培养基；最终得到免疫细胞；
25.s3、将制得的培养液导入培养袋中，然后将s2中得到的免疫细胞装入进行最后一步的培养；
26.s4、对最终培养的免疫细胞进行收集，然后进行冷存。
27.本实施方案中，胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液分别采用3份、2.5 份、4.7份、2.3份、1.3份和2.9份，通过不同比例的添加，得到不同程度的免疫细胞培养的增加。
28.具体的，所述s2中的单个核细胞接种于培养瓶中后放于34℃，饱和湿度， 3％co培养箱中培养2-5天。
29.具体的，所述培养瓶中的培养液，单个核细胞接种于细胞培养瓶后，2-3 天后半量换液，一周时间后首次全量换液。
30.具体的，所述s1中的抗cd3单克隆抗体的细胞密度3
×
96-1
×
118个/ml。
31.具体的，所述s1中il-1a是在所述脐带血核细胞加入所述胎牛血清和抗生素后15min内加入，且加入时的温度控制在10-20℃为最佳。
32.具体的，所述s1中的诱导培养组合物包括纤维连接蛋白、il-2、il-1a、抗cd3单克隆抗体，优选地，还含有il-15。
33.具体的，所述s2中的培养袋体积大于培养液总体积。
34.实施例2
35.本发明提供以下技术方案：一种脐带血提取免疫细胞的培养方法，包括如下步骤：
36.s1、将脐带血单个核细胞用第一培养基培养至细胞生长状态稳定，后续改用第二培养基进行培养，第二培养基中添加胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液；
37.s2、第一培养基对单个核细胞进行原代培养及传代培养至第2-3代，后续传代培养改用第二培养基；最终得到免疫细胞；
38.s3、将制得的培养液导入培养袋中，然后将s2中得到的免疫细胞装入进行最后一步的培养；
39.s4、对最终培养的免疫细胞进行收集，然后进行冷存。
40.本实施方案中，胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液分别采用2.6份、2.3 份、4.3份、2.1份、1.1份和2.5份，通过不同比例的添加，得到不同程度的免疫细胞培养的增加。
41.具体的，所述s2中的单个核细胞接种于培养瓶中后放于34℃，饱和湿度， 3％co培养箱中培养2-5天。
42.具体的，所述培养瓶中的培养液，单个核细胞接种于细胞培养瓶后，2-3 天后半量换液，一周时间后首次全量换液。
43.具体的，所述s1中的抗cd3单克隆抗体的细胞密度3
×
96-1
×
118个/ml。
44.具体的，所述s1中il-1a是在所述脐带血核细胞加入所述胎牛血清和抗生素后15min内加入，且加入时的温度控制在10-20℃为最佳。
45.具体的，所述s1中的诱导培养组合物包括纤维连接蛋白、il-2、il-1a、抗cd3单克隆抗体，优选地，还含有il-15。
46.具体的，所述s2中的培养袋体积大于培养液总体积。
47.实施例3
48.本发明提供以下技术方案：一种脐带血提取免疫细胞的培养方法，包括如下步骤：
49.s1、将脐带血单个核细胞用第一培养基培养至细胞生长状态稳定，后续改用第二培养基进行培养，第二培养基中添加胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液；
50.s2、第一培养基对单个核细胞进行原代培养及传代培养至第2-3代，后续传代培养改用第二培养基；最终得到免疫细胞；
51.s3、将制得的培养液导入培养袋中，然后将s2中得到的免疫细胞装入进行最后一步的培养；
52.s4、对最终培养的免疫细胞进行收集，然后进行冷存。
53.本实施方案中，胎牛血清、诱导培养组合物、抗生素、间充质干细胞生长添加物、il-1a和抗cd3单克隆抗体得到最终的培养液分别采用2.2份、2.1 份、3.9份、1.8份、0.8份和2.2份，通过不同比例的添加，得到不同程度的免疫细胞培养的增加。
54.具体的，所述s2中的单个核细胞接种于培养瓶中后放于34℃，饱和湿度， 3％co培养箱中培养2-5天。
55.具体的，所述培养瓶中的培养液，单个核细胞接种于细胞培养瓶后，2-3 天后半量换液，一周时间后首次全量换液。
56.具体的，所述s1中的抗cd3单克隆抗体的细胞密度3
×
96-1
×
118个/ml。
57.具体的，所述s1中il-1a是在所述脐带血核细胞加入所述胎牛血清和抗生素后15min内加入，且加入时的温度控制在10-20℃为最佳。
58.具体的，所述s1中的诱导培养组合物包括纤维连接蛋白、il-2、il-1a、抗cd3单克隆抗体，优选地，还含有il-15。
59.具体的，所述s2中的培养袋体积大于培养液总体积。
60.最后应说明的是：上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。此外，除非权利要求中明确说明，本说明书所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本说明书流程和方法的顺序。