一种超高压制取黄大茶多糖的方法及其应用

1.本发明属于功能食品领域，具体涉及一种超高压制取黄大茶多糖的方法及其应用。


背景技术：

2.超高压(uhp)是一种以水为介质，对密封容器中的样品施加100-1000mpa压力的处理技术。目前，uhp作为常规热处理的可行替代方法已广泛用于食品加工领域。研究证实，150mpa以上的高压处理会影响蛋白质的分子内或分子间非共价键，改变生物大分子的理化性质和功能特性，使得蛋白质变性、酶失活、淀粉糊化和大多数微生物的失活。然而，超高压不会影响食品中的小分子物质，如氨基酸、多肽、α-羟基酸、单糖、维生素、香料等，uhp加工可有效保留其原有的营养成分和风味物质。
3.近年来，uhp不仅用于食品加工，还用于天然生物活性大分子的提取和改性。有研究报道，超高压提取的黄芪多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率较热水浸提的黄芪多糖提高了69％，其空间构象受到影响。绿茶多糖经uhp处理后，其空间结构及功能特性受到一定程度影响。迄今未见超高压可改变多糖一级结构、组成及增强其生物活性研究的报道。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种超高压制取黄大茶多糖的方法及其应用。经超高压制备的黄大茶多糖，多糖分子降解、空间构象发生改变，糖醛酸含量增加，生物活性增强。蛋白质在超高压作用下变性除去，进一步提高了多糖纯度。
5.本发明超高压制取黄大茶多糖的方法，包括如下步骤：
6.步骤1：将黄大茶与无水乙醇按照1g：10ml的比例混合，60℃水浴环境下浸泡12h，除去乙醇，干燥、粉碎过80目筛，得到黄大茶干粉。
7.步骤2：向步骤1得到的黄大茶干粉中按照料液比1g：10ml的比例加入蒸馏水，真空封装后放入超高压设备，设定压力为200-600mpa，保压时间为5min，提取温度为25℃，得到的提取液经固液分离、减压浓缩、醇沉和冻干，制得黄大茶多糖。
8.本发明获得的黄大茶多糖，简记为uhp-lytp，其化学成分如表1所示。
9.相较于传统热水浸提的黄大茶多糖lytp，本发明所述黄大茶多糖的糖醛酸含量由31.62％增加到53.65％，半乳糖醛酸摩尔比提高1.5倍，分子量下降，其空间结构由致密状转变为具有网孔的海绵体结构。
10.本发明超高压制得的黄大茶多糖的应用，是用于制备具有保肝功效的制剂。所述制剂对酗酒导致的酒精性肝损伤有显著的保护作用。
11.本发明的有益效果体现在：
12.1、采用超高压技术提取黄大茶多糖，可改变黄大茶多糖的一级结构和空间结构，增加糖醛酸含量，其保肝活性提高。
13.2、本发明所述多糖制备方法可替代传统有机溶剂(sevage试剂法)去除蛋白脱色
素，制备方法操作简单、高效环保。
附图说明
14.图1是标准单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖醛酸，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，6-半乳糖，7-阿拉伯糖，8-岩藻糖)。
15.图2是lytp与uhp-lytp的单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖醛酸，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，6-半乳糖，7-阿拉伯糖，8-岩藻糖)
16.图3是lytp与uhp-lytp的相对分子质量检测色谱图，色谱条件为安捷伦1260hplc-elsd，tskgel-g6000-pwxl(7.8mm
×
30cm，13μm)。
17.图4是lytp与uhp-lytp的保肝活性图：a为alt含量；b为ast含量；c为tc含量；d为tg含量。
具体实施方式
18.以下通过具体的实施例描述本发明的制备方法及其保肝功效，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
19.实施例1：黄大茶多糖的超高压提取
20.步骤1：将黄大茶与无水乙醇按照1：10比例混合，60℃水浴环境下浸泡12h，除去乙醇，干燥、粉碎过80目筛，得到黄大茶干粉。
21.步骤2：将步骤1得到的黄大茶干粉，按照料液比1：10加入蒸馏水，真空封装后放入超高压设备，设定压力为200、400及600mpa，保压时间为5min，提取温度为25℃，得到的提取液经固液分离、减压浓缩、醇沉和冻干，制得黄大茶多糖uhp-lytp。
22.步骤3：lytp与uhp-lytp的化学组成测定。总糖含量以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定；蛋白质含量以牛血清白蛋白(bsa)为标准品，考马斯亮蓝g-250法测定；咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量，之后分别在490nm、595nm、520nm处测量吸光值。
23.表1所示，与热水浸提的黄大茶多糖lytp相比，uhp-lytp的总糖和糖醛酸含量显著增加，蛋白质含量明显下降，结果表明超高压相较于传统的提取方法，其制备的多糖纯度高、杂质少。
24.表1 lytp与uhp-lytp的化学组成
[0025][0026]
实施例2：lytp与uhp-lytp单糖组成和分子量测定
[0027]
步骤1：lytp与uhp-lytp的单糖组成分析采用酸水解-柱前pmp衍生化方法处理样品，高效液相色谱法分析测定。称取lytp与uhp-lytp(5mg)溶于5ml的2mol/l的三氟乙酸中，氮气封管，110℃油浴8h使充分水解。旋转蒸发仪旋出水分，加适量的去离子水，如此反复旋蒸至溶液ph显示中性为止，加入1ml蒸馏水，备用。
[0028]
步骤2：标准单糖和已水解的样品溶液中加入50μl，0.5mol/lpmp甲醇溶液和50μl，0.3mol/lnaoh溶液，在70℃的水浴锅中反应30min进行pmp柱前衍生化，然后用50μl0.3mol/lhcl中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用dad检测器。hplc柱温为30℃，色谱柱为zorboxeclipsexdb-c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，波长为245nm下检测。检测流动相a为乙腈，流动相b为0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液。时间梯度洗脱0-60min，初始设置为流动相a:流动相b＝17％:83％，最终洗脱到比例为流动相a:流动相b＝20％:80％，进样量为10μl。
[0029]
步骤3：采用去离子水洗脱，安捷伦高效液相色谱-蒸发光散射检测器(hplc-elsd)检测lytp与uhp-lytp的分子量。配制2mg/ml的lytp、uhp-lytp和葡聚糖标准品(t5、t12、t41、t100、t200)的溶液1ml，采用tskgelg6000pwxl色谱柱(300
×
7.0mm，13μm)，载气为n2，气体流速为2.5l/min，进样量为10μl。以标准品相对分子质量的对数(lgmw)和保留时间(rt)作标准曲线，测得的lytp与uhp-lytp的分子量范围。
[0030]
表2 lytp与uhp-lytp的分子量
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附注：n.d为未检测到或低于定量限。
[0033]
表3 lytp与uhp-lytp的单糖组成
[0034][0035]
附注：n.d为未检测到或低于定量限。
[0036]
结果如上表，相较于热水浸提的黄大茶多糖，超高压提取的黄大茶多糖的发生降解，产生分子量更小的组分。如图2所示，uhp-lytp单糖组成中含有更多半乳糖醛酸，而未检测到葡萄糖醛酸的存在。结果表明，超高压可改变黄大茶多糖的单糖组成及其一级结构。
[0037]
实施例3：lytp与uhp-lytp的保肝活性测定
[0038]
步骤1：实验动物分组
[0039]
经过为期一周的适应性喂养后，将56只小鼠随机分为7组(n＝8)，分别为空白对照组(nc)、联苯双酯对照组(pc)、热水浸提黄大茶组(lytp)、200mpa提取黄大茶多糖组(200mpa-lytp)、400mpa提取黄大茶多糖组(400mpa-lytp)、600mpa提取黄大茶多糖组(600mpa-lytp)。灌胃量统一为每天400mg/kg
·
d，其中空白组给予对应的生理盐水。除空白
组外所有小鼠乙醇灌胃诱导酒精性肝损伤(0.025ml/10g，2天；0.05ml/10g，3天；0.08ml/10g，5天；0.10ml/10g，7天；0.12ml/10g，10天；0.14ml/10g，1天)，持续四周，每周称体重一次。
[0040]
步骤2：小鼠血清生化指标测定
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最后一次给药后，所有小鼠禁食过夜，麻醉，眼球取血，4℃离心(3000r/min，10min)收集血清，颈椎脱位法处死小鼠。按照试剂盒说明书测定小鼠血清谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、总胆固醇含量(tg)及总甘油三酯(tc)含量。
[0042]
正常状态下alt和ast主要分布于肝细胞中，血清浓度较低。当肝脏受损时，alt、ast会由细胞质释放到血液中，导致血清alt、ast浓度升高。结果如图4a-b所示，酗酒导致小鼠血清转氨酶含量显著升高，uhp-lytp组小鼠血清alt、ast均明显低于模型组，400mpa-lytp组效果最佳，与阳性药联苯双酯相当。
[0043]
如图4c-d显示模型组小鼠血清tc、tg含量较空白组显著升高，uhp-lytp干预可明显降低血清tc、tg含量，且效果均优于lytp组。