硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用

1.本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，突变体酶制剂的制备，以及突变体酶制剂在制备手性拉唑药物中的应用。


背景技术：

2.质子泵抑制剂(proton pump inhibitors，ppis)是一类广泛用于治疗胃酸性消化疾病的首选药物。ppis药物主要有1988年在瑞典上市的奥美拉唑、1995年在日本上市的兰索拉唑、1997年在德国上市的泮托拉唑以及1999年在美国上市的雷贝拉唑等，这些药物最初都以外消旋体的形式上市，在药物市场上占有举足轻重的地位。到了2001年，第一个手性ppi艾司奥美拉唑(奥美拉唑的左旋异构体)在美国重磅上市，之后持续多年占据全球药物销量前十位。2009年，右兰索拉唑被美国fda批准上市，这也是继艾司奥美拉唑的第二个手性ppi。通常，与外消旋的ppis相比，手性ppis具有更强的抑酸强度，更长的抑酸时间以及更高的生物利用度。因此，手性ppis正逐渐成为治疗胃酸性消化疾病的特效药物。
3.虽然目前手性ppis在工业上均以化学法合成，但是化学法合成中普遍存的手性催化剂昂贵、立体选择性差等问题还无法避免；化学法合成中使用的大量过氧酸、h2o2、有机催化剂和有机溶剂等物质会对工作人员的身心健康及人类生活环境造成严重的伤害；化学反应条件相对苛刻，对生产设备的要求也很高，生产投入成本也随之增加。为响应绿色生活、绿色制造的时代号召，具有催化选择性好、反应条件温和、反应体系绿色环保等优点的生物合成法逐渐成为化学合成法的有益补充。
4.目前ppis的生物法合成途径中主要以前手性硫醚为底物，利用整细胞、游离酶等作为催化剂催化其不对称氧化，得到光学纯的ppis。目前已报道的可以用于ppis合成的生物催化剂主要有：1)霉菌cunninghamella echinulata mk40，可以催化7.5mm雷贝拉唑硫醚转化，反应144小时后转化率为92％，产物为(s)-雷贝拉唑，而以奥美拉唑硫醚和兰索拉唑硫醚作为底物时，转化率分别仅为45％和0.6％；2)赖氨酸芽孢杆菌lysinibacillus sp.b71生长细胞，可以催化0.1g/l奥美拉唑硫醚和泮托拉唑硫醚生成埃索美拉唑，但转化率分别仅为70％和8％，对测试的艾普拉唑硫醚和兰索拉唑硫醚均无催化活性；3)来自acinetobacter calcoaceticus的环己酮单加氧酶突变体，可以催化15mm奥美拉唑不对称氧化，生成艾司奥美拉唑(99％ee)；4)专利wo2011/071982中公开的由美国codexis公司通过定向进化改造来源于acinetobacter calcoaceticus ncimb 9871的环己酮单加氧酶突变体可以高效催化奥美拉唑硫醚合成艾司奥美拉唑，但对兰索拉唑活力非常低，且立体选择性较差；5)专利cn 112725297 a公开了来自cupriavidus basilensis的硫醚单加氧酶cbsmo，对所测的14种拉唑硫醚化合物均有氧化活力，其可催化10mm兰索拉唑硫醚的不对称氧化，生成右旋兰索拉唑(99％ee)。与cbsmo的母本相比，突变体cbsmo
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虽然具有更高的催化活力及热稳定性，但仍难满足工业生产的需求。
5.虽然目前已有的生物催化剂可以催化包括兰索拉唑硫醚在内的底物氧化，但是其
氧化活性普遍较低、热稳定性差、底物特异性较差(产物亚砜会被进一步氧化生成副产物砜)、底物上载量低等问题，很难满足工业生产的要求。


技术实现要素：

6.针对生物法合成手性亚砜药物右旋兰索拉唑亚砜存在的生物催化剂催化活性低、热稳定性差、底物特异性差及底物上载量低等问题，本发明选择专利cn 112725297 a中对兰索拉唑硫醚具有较高活性的cbsmo
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(即专利cn 112725297 a中seq id no.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸gly替换为asp，第313位的氨基酸leu替换为pro)作为目标，通过蛋白质工程的手段对其进行进一步的分子改造，提供一种对兰索拉唑硫醚催化活性、底物特异性及热稳定性显著提升的硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组硫醚单加氧酶突变体催化剂，以及重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
8.技术方案之一，本发明提供对兰索拉唑硫醚催化活性、底物特异性及热稳定性显著提升的硫醚单加氧酶突变体。以氨基酸序列如seq id no.2所示的(wt)，通过随机突变及半理性设计的方法，结合酶标仪高通量初筛和进一步摇瓶复筛，鉴别获得多个对兰索拉唑硫醚催化活性、底物特异性及热稳定性显著提升的硫醚单加氧酶突变体。
9.本发明提供的硫醚单加氧酶突变体，为将seq id no.2所示的氨基酸序列中的第98位asp、第252位gly、第253位met、第256位arg、第269位phe、第272位leu、第316位val、第485位leu、第486位met、第487位ala、第488位leu中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；所述衍生蛋白质对兰索拉唑硫醚的氧化活性显著提升，在底物特异性方面也有所提高。
10.优选地，硫醚单加氧酶突变体的氨基酸序列为如下中的一种：
11.(1)seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为met；
12.(2)seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为gly；
13.(3)seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为met；
14.(4)seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；
15.(5)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为val；
16.(6)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为pro；
17.(7)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；
18.(8)seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为met；
19.(9)seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为thr；
20.(10)seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为trp；
21.(11)seq id no.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸phe替换为his；
22.(12)seq id no.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸phe替换为ser；
23.(13)seq id no.2所示氨基酸序列中第272位氨基酸leu替换为lys；
24.(14)seq id no.2所示氨基酸序列中第272位氨基酸leu替换为glu；
25.(15)seq id no.2所示氨基酸序列中第316位氨基酸val替换为ala；
26.(16)seq id no.2所示氨基酸序列中第316位氨基酸val替换为asp；
27.(17)seq id no.2所示氨基酸序列中第485位氨基酸leu替换为phe；
28.(18)seq id no.2所示氨基酸序列中第485位氨基酸leu替换为trp；
29.(19)seq id no.2所示氨基酸序列中第486位氨基酸met替换为leu；
30.(20)seq id no.2所示氨基酸序列中第487位氨基酸ala替换为asp；
31.(21)seq id no.2所示氨基酸序列中第487位氨基酸ala替换为glu；
32.(22)seq id no.2所示氨基酸序列中第488位氨基酸leu替换为thr；
33.(23)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；
34.(24)seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为thr；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
35.(25)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第485位氨基酸leu替换为phe；第488位氨基酸leu替换为thr；
36.(26)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；第488位氨基酸leu替换为thr；
37.(27)seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为gly；第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为ala；
38.(28)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第256位氨基酸arg替换为met；第485位氨基酸leu替换为phe；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
39.(29)seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
40.(30)seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为pro；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为ala；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
41.(31)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第272位氨基酸leu替换为glu；第316位氨基酸val替换为asp；第486位氨基酸met替换为leu；第487位氨基酸ala替换为asp；第488位氨基酸leu替换为thr；
42.(32)seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为leu；第269位氨基酸phe替换为ser；第272位氨基酸leu替换为glu；第485位氨基酸leu替换为trp；第486位氨基酸met替换为leu；第488位氨基酸leu替换为thr；
43.(33)seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为gly；第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为ala；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
44.(34)seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为pro；第256位氨基酸arg替换为met；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；第486位氨基酸met替换为leu；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
45.(35)seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为val；第256位氨基酸arg替换为thr；第269位氨基酸phe替换为ser；第272位氨
基酸leu替换为glu；第485位氨基酸leu替换为phe；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr。
46.技术方案之二，本发明提供编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸。
47.所述核酸编码技术方案之一所述硫醚单加氧酶突变体中的任意一个。
48.所述编码硫醚单加氧酶突变体的核苷酸序列为编码如技术方案之一所述硫醚单加氧酶突变体的核酸序列。
49.技术方案之三，本发明提供一种重组表达载体。
50.所述重组表达载体包含本发明技术方案二所述的核酸。
51.所述重组表达载体可以通过本领域常规方法，将本发明所述的硫醚单加氧酶突变体基因的编码核酸序列连接于pet28a质粒。
52.技术方案四，本发明提供一种重组表达转化体。
53.所述重组表达转化体包含本发明技术方案三所述重组表达载体。
54.所述重组表达转化体可以通过本领域常规方法，将本发明所述的重组表达载体导入大肠杆菌e.coli bl21(de3)宿主细胞来制备重组表达转化体。
55.技术方案之五，本发明提供一种重组硫醚单加氧酶突变体催化剂，所述重组硫醚单加氧酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
56.(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述硫醚单加氧酶突变体的转化体细胞；
57.(2)对如(1)所述的转化体细胞进行破碎，分离含有所述硫醚单加氧酶突变体的粗酶液；
58.(3)对如(2)所属的粗酶液冷冻干燥得到的粗酶粉；
59.(4)技术方案之一所涉及的分离的硫醚单加氧酶突变体。
60.其中，为获得重组硫醚单加氧酶突变体催化剂，所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件。
61.在一些实施方式中，所述重组表达转化体的培养方法可以包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组硫醚单加氧酶突变体。对于重组大肠杆菌，优选培养基为lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，ph 6.5～7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(kanamycin)的lb培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入lb培养基(含卡那霉素)于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od
600
达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1～0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂在16～30℃诱导16～24h。将培养液离心，用生理盐水洗涤沉淀两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞冷冻干燥，即可获得含有所述硫醚单加氧酶突变体的冻干细胞。或将收获的重组细胞悬浮于5～10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组硫醚单加氧酶突变体粗酶液。收集的粗酶液置于-80℃下冷冻，使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干粗酶粉，保存在4℃冰箱，可以方便地使用。
62.技术方案之六，本发明提供了一种针对拉唑硫醚单加氧酶突变体的高通量筛选方法。所述高通量方法是根据产物拉唑亚砜遇酸降解显色，而前手性拉唑硫醚和过氧化副产物拉唑砜无此特性而建立的，见附图2。当以拉唑硫醚为筛选底物时，可以根据产物拉唑砜
的生成量对cbsmo的热稳定性及其对拉唑硫醚的活性进行筛选；若以拉唑亚砜作为筛选底物，可以根据拉唑亚砜的减少量对cbsmo的底物特异性进行筛选。
63.技术方案之七，本发明提供了所述硫醚单加氧酶突变体活力的高通量筛选方法，见附图3。具体的，使用挑菌落机器人将所述重组硫醚单加氧酶转化子从固体培养基中挑到含有200μl lb培养基(含卡那霉素)的96深孔板中(一级培养板)，在37℃、800rpm条件下过夜培养。使用自动移液系统从一级培养板转接到含有600μl lb培养基(含卡那霉素)的96深孔板中(二级培养板)，在37℃、800rpm条件培养2～5小时后将温度调至16～30℃并添加终浓度为0.1～0.5mm的iptg进行重组硫醚单加氧酶突变体的诱导表达。12～24小时后离心弃上清收集沉淀，添加400μl含0.1～1.0g/l溶菌酶的磷酸钾缓冲液(0.1m，ph 8.0)重悬细胞，置于25～40℃、800rpm条件下裂解细胞1～3小时获得细胞裂解液。添加0.2～1.0mm兰索拉唑硫醚作为筛选底物，10～50μl甲醇作为助溶剂，50～90μl溶有辅酶nadph(终浓度0.2～1.0mm)的磷酸钾缓冲液，在25～35℃、800rpm条件下反应。2小时后添加500μl乙酸乙酯振荡萃取，离心后取100μl上清与100μl甲酸混合并在酶标仪上读取330nm下的吸光值，吸光值高的表明硫醚单加氧酶突变体的活力较高。
64.技术方案之八，本发明提供了所述硫醚单加氧酶突变体热稳定性的高通量筛选方法。具体的，如本发明技术方案七所述方法获得细胞裂解液后，将细胞裂解液于40℃条件下静置温育5小时，后续同技术方案七所述方法添加反应物进行反应和筛选，吸光值高的表明硫醚单加氧酶突变体的热稳定性较高。
65.技术方案之九，本发明提供了所述硫醚单加氧酶突变体底物特异性的高通量筛选方法。具体的，如本发明技术方案七所述方法获得细胞裂解液后，添加0.2～1.0mm右旋兰索拉唑亚砜作为筛选底物，10～50μl甲醇作为助溶剂，50～90μl溶有辅酶nadph(终浓度0.2～1.0mm)的磷酸钾缓冲液，在25～35℃、800rpm条件反应。2小时后添加500μl乙酸乙酯振荡萃取，离心后取100μl上清与100μl甲酸混合并在酶标仪上读取330nm下的吸光值，吸光值高的表明拉唑亚砜被氧化的量少，即硫醚单加氧酶突变体对兰索拉唑硫醚的底物特异性较高。
66.技术方案之十，本发明提供技术方案五所述重组硫醚单加氧酶突变体催化剂在催化前手性拉唑硫醚底物不对称氧化中的应用。
67.在本发明的一些实施方式中，酶促反应在ph 6.0～10.0的缓冲液中，25～40℃条件下进行，反应体系中包括终浓度为1～30g/l的兰索拉唑硫醚、1～20％(v/v)的甲醇、10～300mmol/l的甲酸钠和0-1mmol/l的nadp

，10～100u/l如技术方案五所述重组硫醚单加氧酶突变体催化剂和10～200u/l脱氢酶粗酶粉。
68.优选的，反应在通空气、搅拌状态下进行，通气速率为0～2vvm，反应时间以底物完全转化或产物浓度不再继续上升为准。
69.反应过程中间隙取样0.5ml反应液，加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，用0.22μm孔径的滤膜过滤后进行液相分析，测定底物的转化率及产物的ee值，具体分析条件如下：
70.色谱柱为大赛璐chiralpak ia，流动相为正庚烷:乙醇＝70:30(v/v)，流速为0.5ml
·
min-1
；柱温为40℃，紫外检测波长为300nm。
71.其中，所述前手性拉唑硫醚底物选自以下任一个化学结构式所示的化合物：
[0072][0073]
在本发明的一些实施方式中，反应过程中，辅酶nadph氧化为nadp

，使用脱氢酶催化nadp

还原再生为nadph。
[0074]
在本发明的一些实施方式中，所述的脱氢酶是甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶中的任意一种。
[0075]
进一步地，本发明所述的脱氢酶是以下脱氢酶中的任意一种：
[0076]
(1)甲酸脱氢酶fdh(appl biochem biotech 2020,192,530
–
543)，以甲酸盐和nadp

为底物，催化甲酸氧化，同时nadp

还原为nadph；
[0077]
(2)葡萄糖脱氢酶gdh(chembiochem 2020,21:2680
–
2688)，以葡萄糖和nadp

为底物，催化葡萄糖氧化，同时nadp

还原为nadph；
[0078]
(3)醇脱氢酶adh(tetrahedron lett 2021,84:153455)，以短链醇和nadp

为底物，催化短链醇氧化，同时nadp

还原为nadph。
[0079]
与现有技术相比，本发明的技术效果主要体现在以下方面：
[0080]
与其他制备光学纯拉唑类药物的生物催化剂相比，本发明提供的硫醚单加氧酶突变体具有催化活性高、底物特异性强、热稳定性好、催化底物范围广、立体选择性高的优点，在工业应用中显示出广泛的应用前景。
附图说明
[0081]
图1为本发明中硫醚单加氧酶突变体催化前手性拉唑硫醚不对称氧化及手性亚砜过氧化的反应过程示意图。
[0082]
图2为本发明中高通量筛选原理示意图。
[0083]
图3为本发明中高通量筛选流程示意图。
具体实施方式
[0084]
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
[0085]
下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：
[0086]
lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l(固体培养基加入2％琼脂粉)。
[0087]
手性hplc分析方法如下：
[0088]
仪器：岛津hplc 2010a；色谱柱型号：chiralpak ia；流动相：正庚烷:乙醇＝70:30(v/v)；流速：0.5ml
·
min-1
；柱温：40℃；进样量：10μl；检测器：紫外检测器；检测波长：300nm。
[0089]
实施例1：随机突变筛选对兰索拉唑硫醚活力提高的cbsmo突变体
[0090]
根据cbsmo的开放阅读框，设计上游、下游引物如下：
[0091]
上游引物，如seq id no.3所示。
[0092]
下游引物，如seq id no.4所示。
[0093]
其中上游引物下划线所示序列为nde i的酶切位点，下游引物下划线所示序列为hind iii的酶切位点。
[0094]
以重组质粒pet28a-cbsmo
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为模板，按专利cn 112725297 a实施例7中所描述的方法建立随机突变体库。
[0095]
其中，cbsmo
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的氨基酸序列如seq id no.2所示，对应的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0096]
简单来说，用rtaq dna聚合酶进行易错pcr，构建随机突变库。经过pcr扩增后回收目的片段，将目的片段与线性化空载质粒pet28a连接后转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板上，倒置于37℃培养箱中培养约12h。使用单克隆自动挑选仪qpix 450将转化平板上的转化体挑入含lb培养基的96孔深孔板中，于37℃，800rpm摇床中培养过夜。使用全自动化液体处理工作站freedom evo从一级孔板转接种子液至二级孔板进行突变体蛋白的诱导表达。发酵液离心去上清后向每个孔中加入细胞裂解液裂解细胞，然后添加25μl兰索拉唑硫醚的甲醇溶液(兰索拉唑硫醚终浓度1mm)，75μl溶有辅酶nadph(终浓度1mm)的磷酸钾缓冲液，在25℃、800rpm条件反应。2小时后添加500μl乙酸乙酯振荡萃取，离心后取100μl上清与100μl甲酸混合并在酶标仪上读取330nm下的吸光值，吸光值高的表明硫醚单加氧酶突变体的活力较高。将筛选到的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
[0097]
实施例2：随机突变筛选对兰索拉唑硫醚底物特异性提高的cbsmo突变体
[0098]
由于母本cbsmo
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在催化兰索拉唑硫醚氧化的过程中会将氧化产物右旋兰
索拉唑亚砜识别为底物进行过氧化生成副产物兰索拉唑砜，表现出对兰索拉唑硫醚底物特异性差的现象。为了解决这一问题，使用随机突变的方式筛选对兰索拉唑硫醚底物特异性提高的cbsmo突变体。
[0099]
将实施例1的操作步骤做微小的修改即可实现对兰索拉唑硫醚底物特异性提高的cbsmo突变体的筛选。具体的，将实施例1中活力检测反应的底物兰索拉唑硫醚更换为右旋兰索拉唑亚砜，吸光值高的表明右旋兰索拉唑亚砜残留的多，即cbsmo突变体对兰索拉唑硫醚的底物特异性更强。
[0100]
实施例3：随机突变筛选热稳定性提高的cbsmo突变体
[0101]
将实施例1的操作步骤做微小的修改即可实现对热稳定性提高的cbsmo突变体的筛选。具体的，将实施例1中裂解后的粗酶液于40℃条件下静置5h，然后进行活力检测反应，吸光值高的表明cbsmo突变体的残余活力高，即cbsmo突变体的热稳定性强。
[0102]
实施例4：cbsmo有益突变体的组合突变
[0103]
在实施例1、实施例2和实施例3突变的基础上，分别获得了多个活力、底物特异性和热稳定性好的优势突变体，采用专利cn 112725297 a中描述的dna shuffling的方法随机组合所述的优势突变体，获得dna shuffling突变体库。
[0104]
采用实施例1的高通量筛选程序对dna shuffling突变体库进行筛选得到一批对兰索拉唑硫醚活力提高的突变体(命名为“突变库a”)，采用实施例2的高通量筛选程序对突变库a进行筛选得到一批对兰索拉唑硫醚底物特异性提高的突变体(命名为“突变库b”)，采用实施例3的高通量筛选程序对突变库b进行筛选，得到一批热稳定性提高的突变体(命名为“突变库c”)，进而对这些突变体的纯酶比活、底物特异性及热稳定性进行了表征。优选对兰索拉唑硫醚活力显著增高、对兰索拉唑硫醚与右旋兰索拉唑亚砜活力比值显著增高的系列突变体，且这些突变体的热稳定性都较良好，这些突变体的序列以及这些突变体对兰索拉唑硫醚、右旋兰索拉唑亚砜的活性和蛋白的热熔温度列于表1中，序列标号分别对应于表1后面的一系列序列。在兰索拉唑硫醚活性列中，与母本cbsmo
g266d/l313p
(序列表中seq id no.2所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，“ ”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚的活性提高了0.5～1倍；“ ”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚的活性提高了1～5倍；“ ”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚的活性提高了5～10倍。在活力比值列中，与母本cbsmo
g266d/l313p
相比，“ ”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚与右旋兰索拉唑亚砜活力比值提高了0.1～1倍；“ ”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚与右旋兰索拉唑亚砜活力比值提高了1～2倍；“ ”表示突变体蛋白对兰索拉唑硫醚与右旋兰索拉唑亚砜活力比值提高了2～5倍。在热熔温度列中，与母本cbsmo
g266d/l313p
相比，“ ”表示突变体蛋白的热熔温度提高了1～5℃；“ ”表示突变体蛋白的热熔温度提高了5～10℃；“ ”表示突变体蛋白的热熔温度提高了10～20℃。
[0105]
表1硫醚单加氧酶突变体序列、对兰索拉唑硫醚活力提高倍数、对兰索拉唑硫醚与右旋兰索拉唑亚砜活力比值提高倍数、热熔温度提高度数
[0106]
[0107][0108][0109]
对应序列标号的硫醚单加氧酶突变体的氨基酸序列分别如下：
[0110]
(1)如seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为met；
[0111]
(2)如seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为gly；
[0112]
(3)如seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为met；
[0113]
(4)如seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；
[0114]
(5)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为val；
[0115]
(6)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为pro；
[0116]
(7)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；
[0117]
(8)如seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为met；
[0118]
(9)如seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为thr；
[0119]
(10)如seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为trp；
[0120]
(11)如seq id no.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸phe替换为his；
[0121]
(12)如seq id no.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸phe替换为ser；
[0122]
(13)如seq id no.2所示氨基酸序列中第272位氨基酸leu替换为lys；
[0123]
(14)如seq id no.2所示氨基酸序列中第272位氨基酸leu替换为glu；
[0124]
(15)如seq id no.2所示氨基酸序列中第316位氨基酸val替换为ala；
[0125]
(16)如seq id no.2所示氨基酸序列中第316位氨基酸val替换为asp；
[0126]
(17)如seq id no.2所示氨基酸序列中第485位氨基酸leu替换为phe；
[0127]
(18)如seq id no.2所示氨基酸序列中第485位氨基酸leu替换为trp；
[0128]
(19)如seq id no.2所示氨基酸序列中第486位氨基酸met替换为leu；
[0129]
(20)如seq id no.2所示氨基酸序列中第487位氨基酸ala替换为asp；
[0130]
(21)如seq id no.2所示氨基酸序列中第487位氨基酸ala替换为glu；
[0131]
(22)如seq id no.2所示氨基酸序列中第488位氨基酸leu替换为thr；
[0132]
(23)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；
[0133]
(24)如seq id no.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸arg替换为thr；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0134]
(25)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第485位氨基酸leu替换为phe；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0135]
(26)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0136]
(27)如seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为gly；第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为ala；
[0137]
(28)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第256位氨基酸arg替换为met；第485位氨基酸leu替换为phe；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0138]
(29)如seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0139]
(30)如seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨
基酸met替换为pro；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为ala；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0140]
(31)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为gln；第272位氨基酸leu替换为glu；第316位氨基酸val替换为asp；第486位氨基酸met替换为leu；第487位氨基酸ala替换为asp；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0141]
(32)如seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为leu；第269位氨基酸phe替换为ser；第272位氨基酸leu替换为glu；第485位氨基酸leu替换为trp；第486位氨基酸met替换为leu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0142]
(33)如seq id no.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸asp替换为gly；第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为gln；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为ala；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0143]
(34)如seq id no.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸met替换为pro；第256位氨基酸arg替换为met；第269位氨基酸phe替换为ser；第316位氨基酸val替换为asp；第486位氨基酸met替换为leu；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr；
[0144]
(35)如seq id no.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸gly替换为pro；第253位氨基酸met替换为val；第256位氨基酸arg替换为thr；第269位氨基酸phe替换为ser；第272位氨基酸leu替换为glu；第485位氨基酸leu替换为phe；第487位氨基酸ala替换为glu；第488位氨基酸leu替换为thr。
[0145]
实施例5：硫醚单加氧酶突变体cbsmo
m34
对兰索拉唑硫醚的活力测定
[0146]
测定cbsmo
m34
对一系列拉唑硫醚底物的活力，测定步骤如下：0.5ml反应体系(0.1m kpb缓冲液，ph 8.0)中加入0.2mm拉唑硫醚底物，0.2mm nadph，30℃保温2分钟后加入纯化得到的适量纯酶液，迅速混匀，在30℃,1000rpm条件下反应10min，用0.5ml乙酸乙酯终止并萃取，离心上清用0.22μm孔径的滤膜过滤后进行液相分析，测定底物的转化率及产物的ee值。
[0147]
底物转化率及ee值的具体分析条件如下：
[0148]
仪器：岛津hplc 2010a；色谱柱型号：chiralpak ia；流动相：正庚烷:乙醇＝70:30(v/v)；流速：0.5ml
·
min-1
；柱温：40℃；进样量：10μl；检测器：紫外检测器；检测波长：300nm。
[0149]
酶活单位定义为：上述条件下，每分钟催化1μmol拉唑硫醚底物转化生成拉唑亚砜所需的酶量。
[0150]
测得突变体cbsmo
m34
对一系列拉唑硫醚底物的比活力及产物ee值及底物特异性结果如表2所示。
[0151]
表2.cbsmo
m34
纯酶活力、立体选择性、底物特异性测定
[0152]
[0153]
[0154][0155]
a“ ”:500～1000u/g；“ ”:1000～2000u/g；“ ”:》2000u/g
[0156]
b“ ”:10～20；“ ”:20～50；“ ”:》50
[0157]
实施例6：硫醚单加氧酶粗酶液的制备
[0158]
以硫醚单加氧酶cbsmo
m34
粗酶液的制备作为示例。将含有cbsmo
m34
的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(kanamycin)的lb培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有100ml lb培养基(含卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od
600
达到0.6时，加入终浓度为0.2mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞悬浮于10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组硫醚单加氧酶cbsm
m34
的粗酶液。
[0159]
实施例7：硫醚单加氧酶粗酶粉的制备
[0160]
以硫醚单加氧酶cbsmo
m34
粗酶粉的制备作为示例。收集实施例6获得的硫醚单加氧酶突变体cbsmo
m34
的粗酶液，置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到硫醚单加氧酶突变体cbsmo
m34
粗酶粉，其对兰索拉唑硫醚的比活力为122u/g，对雷贝拉唑硫醚的比活力为198u/g。将所获得的粗酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
[0161]
实施例8：cbsmo
g266d/l313p
催化20g/l兰索拉唑硫醚不对称氧化
[0162]
硫醚单加氧酶突变体催化前手性拉唑硫醚不对称氧化及手性亚砜过氧化的反应过程如图1所示。
[0163]
在100ml反应体系(磷酸钾缓冲液，200mmol/l，ph 8.0)中，加入cbsmo
g266d/l313p
粗酶粉6u(如实施例7所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶fdh粗酶粉12u，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和nadp

至终浓度分别为20g/l、10％(v/v)、150mmol/l和0.2mmol/l。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5ml反应液加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，按实施例5所述hplc分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应32h底物转化率大于97％，产物的ee值大于99％(r)，副产物兰索拉唑砜占总产物比例为10.5％。
[0164]
实施例9：cbsmo
m31
催化20g/l兰索拉唑硫醚不对称氧化
[0165]
在100ml反应体系(磷酸钾缓冲液，200mmol/l，ph 8.0)中，加入cbsmo
m31
粗酶粉6u(如实施例7所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶fdh粗酶粉12u，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和nadp

至终浓度分别为20g/l、10％(v/v)、150mmol/l和0.2mmol/l。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5ml反应液加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，按实施例5所述hplc分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应24h底物转化率大于
99％，产物的ee值大于99％(r)，副产物兰索拉唑砜占总产物比例为1.8％。
[0166]
实施例10：cbsmo
m31
催化20g/l雷贝拉唑硫醚不对称氧化
[0167]
在100ml反应体系(磷酸钾缓冲液，200mmol/l，ph 8.0)中，加入cbsmo
m31
粗酶粉6u(如实施例7所述方法制备的粗酶粉)和葡萄糖脱氢酶gdh粗酶粉12u，继续向上述体系中加入雷贝拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和nadp

至终浓度分别为20g/l、10％(v/v)、150mmol/l和0.2mmol/l。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5ml反应液加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，按实施例5所述hplc分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应19h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(r)，副产物雷贝拉唑砜占总产物比例为2.1％。
[0168]
实施例11：cbsmo
m31
催化20g/l泮托拉唑硫醚不对称氧化
[0169]
在100ml反应体系(磷酸钾缓冲液，200mmol/l，ph 8.0)中，加入cbsmo
m31
粗酶粉6u(如实施例7所述方法制备的粗酶粉)和醇脱氢酶adh粗酶粉12u，继续向上述体系中加入泮托拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和nadp

至终浓度分别为20g/l、10％(v/v)、150mmol/l和0.2mmol/l。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5ml反应液加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，按实施例5所述hplc分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应16h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(r)，副产物泮托拉唑砜占总产物比例为2.4％。
[0170]
实施例12：cbsmo
m27
催化30g/l兰索拉唑硫醚不对称氧化
[0171]
在100ml反应体系(磷酸钾缓冲液，200mmol/l，ph 8.0)中，加入cbsmo
m27
粗酶粉6u(如实施例7所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶fdh粗酶粉12u，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和nadp

至终浓度分别为30g/l、10％(v/v)、200mmol/l和0.2mmol/l。在30℃，220rpm条件下振荡反应。间歇取样0.5ml反应液加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，按实施例5所述hplc分析方法测定底物转化率和产物ee值。反应30h底物转化率大于98％，产物的ee值大于99％(r)，副产物兰索拉唑砜占总产物比例为1.3％。
[0172]
实施例13：cbsmo
m27
催化30g/l兰索拉唑硫醚不对称氧化
[0173]
在1l反应体系(磷酸钾缓冲液，200mmol/l，ph 8.0)中，加入cbsmo
m27
粗酶粉100u(如实施例7所述方法制备的粗酶粉)和甲酸脱氢酶fdh粗酶粉200u，继续向上述体系中加入兰索拉唑硫醚、甲醇、甲酸钠和nadp

至终浓度分别为30g/l、10％(v/v)、200mmol/l和0.2mmol/l。在30℃，150rpm、通空气速率为0.4vvm的条件下搅拌反应。间歇取样0.5ml反应液加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取，取0.3ml萃取液加入无水硫酸钠干燥后，挥发除去乙酸乙酯，然后加入0.3ml乙醇溶解，按实施例5所述hplc分析方法测定底物转化率、产物ee值及副产物砜的含量。反应32h底物转化率大于99％，产物的ee值大于99％(r)，副产物兰索拉唑砜占总产物比例为1.8％。
[0174]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。