用于检测结核分枝杆菌的引物探针组合及其试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及用于检测结核分枝杆菌的引物探针组合及其试剂盒。


背景技术：

2.分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌。结核分枝杆菌复合群主要包括人型结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、鼠型分枝杆菌、非洲型分枝杆菌。其中人型、牛型和非洲型为人类致病菌，鼠型分枝杆菌不引起人类的结核病，主要引起鼠类的结核病。人类感染的结核病90％以上为人型结核分枝杆菌所致，牛型分枝杆菌主要引起牛的结核病，但同时也可引起人类的结核病，但所占临床比例较小。
3.结核病是结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，可累及全身多个器官。结核病是一个全身性的疾病，肺结核是结核病的主要类型，此外还有其他系统的结合也不容忽视，如淋巴结结核、骨关节结核、消化系统结核、泌尿系统结核、生殖系统结核以及中枢神经系统结核。如果细分还包括，肠结核、肠系膜淋巴结结核、输卵管结核、肾结核、膀胱结核、结核性脑膜炎等。
4.结核病是威胁人类健康的重要公共卫生问题之一，据who估计2020年全球约有1000万例新发结核病患者，其中超过140万例死于结核病。特别是2018年以来，伴随着耐多药结核病和广泛耐药结核病患者的日益增多，结核病的防控工作面临前所未有的挑战。我国是全球30个结核病高负担国之一，每年新发结核病患者90万例，位居世界第三位；耐多药结核病患者5.8万例，位居世界第二，因此，结核病成为制约我国社会经济发展的重大公共问题之一。
5.结核病治疗的原则是早诊断、早隔离、早治疗，这是减少肺结核发病和死亡的关键环节，诊断的滞后导致个体化治疗的延误和结核分枝杆菌的传播。结核病实验室诊断是发现结核病患者的重要途径，痰涂片检查价格低廉、操作简便，但敏感度不高；痰培养敏感度较高，一直作为结核病实验室诊断的金标准，但因其检测周期过长，不能为临床提供时效性检测结果。鉴于现有细菌学检测方法的诸多不足，who于2013年修订了结核病的诊断标准，将分子生物学方法检测阳性的患者纳入病原学阳性的范畴。我国也于2017年重新修订了肺结核诊断标准，此标准中将分子生物学诊断阳性作为病原学阳性的诊断依据。
6.目前国际上结核分枝杆菌核酸检测厂家主要有美国赛沛和法国梅里埃、日本荣研等，国内生产厂家有达安基因、北京博奥，杭州优思达、上海仁度、厦门致善等。整体来看，进口检测产品自动化程度高，操作简便，生物安全性高，比如美国赛沛，普通综合性医院均可开展，占结核分子检测市场份额的50％以上；但是使用成本高，对样本处理要求较高；国产试剂操作相对较复杂，使用成本较低，但自动化程度低，生物安全性较低，一般只在专科医院进行使用。
7.对于结核分枝杆菌或者结核分枝杆菌复合群的检测，目前核酸检测以dna为主，绝大多数厂家均采用dna作为靶标进行检测。常用的dna靶标有is6110、is1081、mbp64、rpob、
hsp65等相关基因序列；以dna作为靶标，能够实现对于结核菌感染的初筛，但是由于菌体死亡后的较长一段时间内，dna仍然存在，所以，在检测过程中不能区分出是阳性感染病人还是潜伏感染病人，无法确定其传染性及对周边人员的安全威胁。2012年03月14日中国专利号cn 102373273 a“一种结核分枝杆菌核酸的检测试剂盒及其方法”公开了一种利用核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的快速检测技术，以及定性检测的试剂盒。该试剂盒包含无仪器dna提取试剂盒、结核分枝杆菌核酸恒温扩增反应液、防污染核酸扩增物检测装置、结核分枝杆菌阳性对照、结核分枝杆菌阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1～1.5小时；可同时满足中通量和低通量的样品检测，特别适合现场检测以及基层医院使用，且整个反应过程只需一个恒温仪器。但是该检测试剂盒无法对潜伏结核感染和阳性感染患者进行区分，无法确定病人的传染性，只能够用于结核分枝杆菌的初步筛查。
8.目前也有少数厂家是以rna作为检测目标，2011年9月14日中国专利号cn 102181572a“一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒”公开了一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，试剂盒包含tb稀释液、tb反应液、tb检测液、sat酶液、tb阳性对照、tb阴性对照；结核分枝杆菌经液化处理后通过加药培养和不加药培养，利用两种方法培养后的结核分枝杆菌之间存在的差异，利用免疫共沉淀或naoh再处理两种培养后的结核分枝杆菌菌液，并对处理后的菌液进行sat检测，根据检测结果来分析结核分枝杆菌的耐药性。本发明能简单有效的对结核分枝杆菌耐药性进行分析，简便，省时。因为rna只能存在于具有活性的菌株内，因此，该试剂盒只能用于阳性感染病人的检测，不能用于潜伏感染患者的检测。


技术实现要素：

9.有鉴于此，本发明提供了用于检测结核分枝杆菌的引物探针组合及其试剂盒。将该引物探针组合用于检测结核分枝杆菌，具有灵敏度高(检测限达10cfu/ml)、特异性强，检测性能优越，操作方便、安全高效等突出特点。
10.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
11.引物探针组合，其特征在于，包括：
12.如seq id no.1～2所示的引物对和seq id no.3所示的探针；和
13.如seq id no.4～5所示的引物对和seq id no.6所示的探针。
14.本发明以结核杆菌复合群is6110序列和16s rrna保守序列为目标序列设计引物探针。seq id no.1～6seq id no.6所示的核苷酸序列(5’—3’)：
15.seq id no.1：gaccacggatttcccgacag；
16.seq id no.2：cggtaacaaagcccatcacg；
17.seq id no.3：ccgccgtctgttcgacatgggt；
18.seq id no.4：gtccacgccgccaactac；
19.seq id no.5：atgccctcacggttcagg；
20.seq id no.6：agtccacgccgtaaacggtg。
21.其中，seq id no.1和seq id no.2所示的引物和seq id no.3所示的探针用于检测结核分枝杆菌复合群插入序列is6110基因；seq id no.4和seq id no.5所示的引物和
seq id no.6所示的探针用于检测结核分枝杆菌16srrna保守序列基因。
22.一些实施方案中，seq id no:3所示的探针的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1：
23.fam-ccgccgtctgttcgacatgggt-bhq1(seq id no.3)；
24.seq id no:6所示的探针的5’端标记有荧光报告基团hex，3’端标记有荧光淬灭基团mgb：
25.hex-agtccacgccgtaaacggtg-mgb(seq id no:6)。
26.本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测结核分枝杆菌中的应用。
27.本发明还提供一种用于检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括本发明上述引物探针组合。
28.一些实施方案中，本发明试剂盒还包括tris-hcl、kcl、吐温20、丙三醇、dmso、rtth酶、udg酶、dntp、mnso4、edta、dtt、mgcl2、peg2000、rna聚合酶、amv反转录酶中的一种或几种。
29.本发明还提供一种非诊断目的检测结核分枝杆菌的方法，以权利要求本发明所述的试剂盒对样品进行real time pcr检测，根据荧光信号判断样品是否存在结核分歧杆菌。
30.本发明中，所述pcr检测的体系包括30μlpcr扩增液和50μl样本核酸；所述pcr扩增液为pcr扩增液1或pcr扩增液2；
31.所述pcr扩增液1包括如下浓度的组分：
[0032][0033]
所述pcr扩增液2包括如下浓度的组分：
[0034][0035]
本发明中，所述pcr扩增液1中各组分选择如下：10～60mm tris-hcl(ph8.2)，优选20mm tris-hcl(ph8.2)；5～30mm kcl，优选15mm kcl；20～80mm吐温20，优选65mm吐温20；100～200mm丙三醇，优选120mm丙三醇；10～100mm dmso，优选75mm dmso；2～10u rtth酶，优选3u rtth酶；1～5.5u udg酶，优选2.5u udg酶；0.1～0.5mm dntp(datp，dctp，dutp，dgtp或dttp)，优选0.3mm dntp；0.15～0.6mm引物seq id no.1，优选0.2mm seq id no.1；0.2～0.7mm引物seq id no.2，优选0.4mm seq id no.2；10～50mm mnso4，优选30mm mnso4；0.1～0.6mm探针seq id no.3，优选0.3mm探针seq id no.3。pcr扩增液2的荧光pcr反应体系各组分浓度如：20～100mm tris-hcl(ph7.5)，优选60mm tris-hcl(ph7.5)；0.1～1mm edta，优选0.2mm edta；1-10mm dtt，优选4mmdtt；和50％甘油；2-10mm mgcl2，优选4mm mgcl2；10～60mm kcl，优选30mm kcl；1～15mmpeg2000，优选10mm peg2000；100～200mm丙三醇，优选150mm丙三醇；100～300u rna聚合酶，优选250u rna聚合酶；100-800u amv反转录酶，优选550u amv反转录酶；1～10u udg酶，优选4u udg酶；0.1～0.5mm dntp(datp，dctp，dutp，dgtp或dttp)，优选0.3mm dntp；0.15～0.6mm引物seq id no.4，优选0.2mm seq id no.4；0.2～0.7mm引物seq id no.5，优选0.4mm seq id no.5；10～50mm mnso4，优选30mm mnso4；0.1～0.6mm探针seq id no.6，优选0.3mm探针seq id no.6。
[0036]
一些实施方案中，所述pcr检测的程序包括：
[0037][0038]
60℃时设置fam荧光通道和hex荧光通道分别进行荧光信号采集。
[0039]
本发明提供的引物探针组合的序列如seq id no.1～6所示。本发明具有如下优势：
[0040]
1、在同一产品体系内分别设计了针对结核分枝杆菌复合群dna靶标和rna靶标的荧光检测系统，既能够实现对于结核感染人群的全员筛查，又能够对阳性感染者的传播风险进行识别和控制，同时，dna靶标和rna靶标同时检测，对于阳性患者结果相互复核，保证了阳性测定的准确性，也促进who制定的2035年基本消灭结核病的目标；
[0041]
2、该反应体系配套于本公司全自动化核酸检测仪，能够在同一仪器上实现自动化样本处理，核酸提取和扩增，极大地提高了检验实验室的自动化水平，充分解放了人工，有利于检验标准化的实现，同时，极大的降低了由于人员操作不当导致的实验室污染等风险的发生。
[0042]
3、引物探针设计性能优异，检测灵敏度高达98％以上，达到了国际先进检验水平；检测限低低至10cfu/ml)，达到国际先进水平，有效避免了漏检的发生；特异性强，国家标准质控品检测特异性为100％；检测系统稳定；
[0043]
4、操作简便、配备独有的针对结核分枝杆菌核酸提取体系，提取效率高，反应过程安全高效。
附图说明
[0044]
图1示本发明检测试剂盒中试剂卡条的外观结构示意图；
[0045]
图2示本发明检测试剂盒中试剂卡条的俯视图；
[0046]
图3示本发明检测试剂盒配套自动化提纯合扩增检测仪器外观结构示意图；
[0047]
图4是本发明检测试剂盒的最低检测限验证结果；
[0048]
图5是本发明检测试剂盒的灵敏度验证结果；
[0049]
图6是本发明检测试剂盒的特异性验证结果。
具体实施方式
[0050]
本发明提供了用于检测结核分枝杆菌的引物探针组合及其试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0051]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0052]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0053]
实施例1
[0054]
本发明试剂盒的外观结构示意图如图1～2所示，图1为结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂条的外观，共分为两个部分：手柄和试剂仓。手柄的设置是为了便于操作人员取用，试剂仓用来进行扩增试剂的分装，比如，扩增试剂1位于第一个试剂仓内，扩增试剂3位于第三个试剂仓，试剂仓顶部由铝塑膜进行热封以保证试剂不会撒漏，剩余试剂仓的作用是根据试剂盒不同的检测规格需要，盛装扩增试剂1和扩增试剂2。图2为结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂条的俯视图。
[0055]
利用结核分枝杆菌复合群化学处理试剂(含有异丙醇，氢氧化钠，胍盐等)对痰样本进行消化灭活处理，无需离心，处理时间为30分钟；处理后进行震荡20秒，取处理后的匀质试剂600微升加入样本管，利用全自动核酸提纯及扩增仪器(见图3)完成后续自动化反应过程，所使用的引物及探针序列如表1所示。
[0056]
表1引物和探针序列
[0057][0058]
试剂盒中其他组分如下：
[0059]
pcr扩增液1的各组分浓度如：20mm tris-hcl(ph8.2)，15mm kcl，5mm吐温20，120mm丙三醇，75mm dmso，3u rtth酶，2.5u udg酶，0.3mm dntp，0.2mm seq id no.1，0.4mm seq id no.2，30mm mnso4，0.3mm探针seq id no.3。针对16s rrna保守序列设计的引物探针适配pcr扩增反应体系为：60mm tris-hcl(ph7.5)，0.2mm edta，4mmdtt，4mm mgcl2，30mm kcl，10mmpeg2000，150mm丙三醇，250u rna聚合酶，550uamv反转录酶，4u udg酶，0.3mm dntp，0.2mm seq id no.4，0.4mm seq id no.5，30mm mnso4，0.3mm探针seq id no.6。
[0060]
实施例2最低检测限及灵敏度验证
[0061]
为考察本发明mtb实时荧光pcr检测法灵敏度，应用实施例1的试剂盒及反应体系，对结核分枝杆菌国家标准品的最低检出量参考品进行核酸提取后扩增验证，结果如图4所示。结果显示，本发明试剂盒最低检测限为10个菌/ml。使用结核分枝杆菌国家标准品的15种结核分枝杆菌阳性参考品进行检测灵敏度的验证，如图5所示，所有给出的阳性参开品均能检出。
[0062]
实施例3特异性验证
[0063]
选择mtb荧光pcr检测试剂盒国家标准品中阴性参考品的15种非结核分枝杆菌dna作为模板，包括：鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、堪萨斯分支杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌。以mtb标准株h37rv dna作为本
次实验阳性对照。用本发明实施例1的试剂盒进行检测，模板量均为50ul。结果如图6所示，国家标准品的15种阴性参考品菌株均为检出。
[0064]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。