以PD-L1通路为靶点的PET分子探针及其应用

以pd-l1通路为靶点的pet分子探针及其应用
技术领域
1.本发明涉及影像分子探针技术领域，尤其涉及以pd-l1通路为靶点的pet分子探针及其应用。


背景技术：

2.程序性死亡受体1(programmed death 1；pd-1)是一种淋巴细胞上的跨膜受体，pd-1主要在激活的t细胞和b细胞上表达。pd-1及其配体(programmed death-ligand 1；pd-l1)是肿瘤细胞逃避机体的免疫监视的重要机制。许多肿瘤细胞膜上高表达pd-l1分子，当其与t细胞等免疫细胞上的pd-1结合后，肿瘤细胞发出抑制信号，进而t细胞不能有效识别和杀伤肿瘤细胞，发生肿瘤免疫逃逸。阻断pd-1与其配体pd-l1之间的相互作用已成为治疗癌症的一种有前途的免疫疗法。
3.目前市场上针对pd-1/pd-l1通路的药物包括单克隆抗体以及小分子抑制剂。在已报道的肽和拟肽中，aunp-12是活性最强的多肽之一。研究表明，在临床前模型中，aunp-12抑制小鼠b16黑色素瘤和小鼠4t1乳腺癌肿瘤细胞增殖。基于免疫检查点(immune checkpoints)的免疫治疗已经成为肿瘤治疗的重要手段目前，针对pd-1或pd-l1和其他免疫检查点(如抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic t lymphocyte-associated protein 4，ctla-4)的抗体治疗正在进行临床研究。
4.活体显示肿瘤微环境中的pd-l1的表达水平可为以pd-l1为靶点的抑制药物的患者选择提供重要参考，同时可以实时检测体内pd-l1的表达情况，以便于临床可及时调整治疗方案。因此提供一种能够对多种肿瘤微环境中的pd-l1表达水平进行高效、准确活体显像的分子探针具有重要临床应用价值。鉴于目前基于pd1/pd-l1通路的免疫治疗对于临床上多种肿瘤的响应不高，研究发现患者pd1/pd-l1表达水平不一致或者在免疫治疗过程中pd1/pd-l1表达出现波动所致，因此通过pet显像的方式提前对患者的pd1/pd-l1表达进行实时，无创的精确显像是目前研究的热点。但是目前对pd1/pd-l1的通路进行显像主要是是以单抗类pet分子探针为主，这类pet分子探针虽然具备一定的显像能力，但是抗体来源成本高，而且核素
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cu、
89
zr不仅非常难以获得，且极其昂贵，无论是科研单位还是患者都难以承受。pd1/pd-l1多肽类的pet分子探针因为分子小，成本低且标记方便是目前研究的重点方向，目前仅有
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ga-wl12用于临床，但是显像效果难以满足临床需求，存在靶向性低，对比度差的缺点，因为无法在持续较长的时间内观察到肿瘤细胞的聚集情况，所以无法为治疗选择提供实时参考；无法活体全身实时显像，亦无法协助免疫抑制剂进行免疫治疗时的疗效评价，并且可检测的肿瘤种类少，标记困难，针对肿瘤的显像效果差。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供以pd-l1通路为靶点的pet分子探针及其应用。以pdl-1通路为靶点的能够对多种肿瘤微环境中的pdl-1通路的活化程度进行高效、准确的活体显像。
6.本发明提供了式i所示化合物，
[0007][0008]
其中，r为螯合基团，所述螯合基团选自nota、dota或dtpa。
[0009]
本发明还提供了以pd-l1通路为靶点的pet分子探针，包括式i化合物和放射性同位素；
[0010][0011]
其中，r为螯合基团，所述螯合基团选自nota、dota或dtpa。
[0012]
本发明实施例中，以nota为螯合基团，记做nota-aunp12。其结构为：
[0013][0014]
本发明所述的pet分子探针，其结构如式ii所示：
[0015][0016]
其中，r为螯合基团，所述螯合基团选自nota、dota或dtpa；
[0017]
x为放射性同位素，所述放射性同位素选自
68
ga、al
18
f、
177
lu、
89
zr、
64
cu或
99
mtc。
[0018]
一些实施例中，所述pet分子探针中，螯合基团为nota，放射性同位素为
68
ga，记做
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ga-nota-aunp12。
[0019]
本发明还提供了所述pet分子探针的制备方法，其包括将式i化合物与放射性同位素于酸性环境中反应，制备获得pet分子探针。
[0020]
本发明所述酸性环境包括盐酸环境。
[0021]
本发明所述反应溶液还包括醋酸离子等弱酸盐形成的水溶液。
[0022]
本发明中，本发明提供的所述pet分子探针的制备方法包括：将式i化合物以naoac水溶液溶解制得溶液a，将
68
ga经hcl溶液淋洗至溶液a，经反应制得所述pet分子探针。
[0023]
一些实施例中，所述naoac水溶液的浓度为0.1～0.5m；所述hcl溶液的浓度为0.01
～0.1m。一些具体实施例中，所述naoac水溶液的浓度为0.25m；所述hcl溶液的浓度为0.05m。
[0024]
一些实施例中，所述溶液a中式i化合物的浓度为10～50μg/ml；所述淋洗至放射性活度10mci～55mci。一些具体实施例中，所述溶液a中式i化合物的浓度为30μg/ml；所述淋洗至放射性活度30mci～35mci。
[0025]
所述反应的条件包括：ph为3.5～4.5，温度为80℃～100℃，反应时间为10min～15min。一些实施例中，所述反应的条件包括：ph为4.0～4.5，温度为90℃～1.00℃，反应时间为8min～10min。一些具体实施例中，所述反应的条件包括：ph为4.0～4.5，温度为90℃，反应时间为10min。
[0026]
本发明提供了所述的pet分子探针在制备成像剂中的应用。
[0027]
本发明提供的pet分子探针，能够很好的对多种肿瘤微环境中的pdl-1通路表达水平进行活体显像，不仅可以用于多种肿瘤微环境中的pdl-1通路表达检测，还能协助免疫抑制剂进行免疫治疗时的疗效评价，并为治疗选择提供实时参考。
[0028]
本发明还提供了一种成像剂，其包括所述的pet分子探针。
[0029]
本发明还提供了所述的成像剂在制备pd-l1通路相关疾病的诊断试剂中的应用。
[0030]
本发明所述的应用，其中所述pd-l1通路相关疾病包括黑色素瘤、肝癌、结肠癌、胰腺癌和/或淋巴瘤。
[0031]
本发明所述的应用，其中所述pd-l1通路相关疾病还包括其他能影响pd-l1通路表达变化的肿瘤。
[0032]
本发明还提供了一种无创检测pd-l1通路表达水平的试剂，所述试剂包括所述的pet分子探针。
[0033]
本发明提供了一种协助免疫抑制剂评价免疫治疗疗效的试剂，所述试剂包括所述的pet分子探针。
[0034]
本发明还提供了所述的pet分子探针在评价免疫药物治疗pd-l1通路相关疾病的效果中的应用。
[0035]
本发明还提供了pd-l1通路相关疾病的检测、诊断或疗效评价方法，其包括以本发明所述的pet分子探针进行显像。
[0036]
本方案的nota-aunp12是在免疫抑制剂aunp12的结构基础上衍生得来，其对pd1/pd-l1通路的靶向性比较明确，预实验结果也标明此pet分子探针不仅标记简单，而且对多种肿瘤的显像效果也比较好，具有较好的临床转化前景。
[0037]
本发明所述的pet分子探针能够很好的对多种肿瘤微环境中的pd-l1通路表达水平进行活体显像。动物实验中，使用本发明的pet分子探针可以发现在30分钟时即可清晰观察到小鼠的肿瘤位置，说明本发明所述的分子探针能够快速在肿瘤部分聚集，靶向性好且对比度高，且在持续较长的时间内可观察到肿瘤细胞的聚集情况，说明探针对肿瘤的靶向性非常好。不仅可以用于多种肿瘤微环境中的pd-l1通路表达检测，还能协助免疫抑制剂进行免疫治疗时的疗效评价，并为治疗选择提供实时参考。本发明应用于pet成像剂后可用于非入侵的无创检测，并且能活体全身实时显像，不仅标记简单，而且对多种肿瘤的显像效果也比较好，具有对比度高、高特异性和高灵敏度等特点，具有较好的临床转化前景。
附图说明
[0038]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
[0039]
图1示
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ga-nota-aunp12放射化学纯度hplc图；
[0040]
图2示
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ga-nota-aunp12分子探针的小鼠pet成像图；
[0041]
图3示nota-aunp12的质谱图；
[0042]
图4示探针
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ga-nota-aunp12在不同肿瘤中的靶本比值。
具体实施方式
[0043]
本发明提供了以pd-l1通路为靶点的pet分子探针及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0044]
nota-aunp12该分子结构是在免疫抑制剂aunp12的结构基础上衍生得来用于核医学诊断领域的pet活体成像研究，其合成是通过公司定制合成。
[0045]
本发明所述式i化合物(质谱见图3)购买自：吉尔生化(上海)有限公司
[0046]
本方案中靶向性和对比度的效果有两种表现方式，一种是动物显像图(如图2所示)，另一种是肿瘤摄取值suv值，该值越高显像效果越好。此外，还有肿瘤与肌肉的靶本比值图(如图4所示)。
[0047]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0048]
实施例1
[0049]
1)向含有30μg前体化合物(nota-aunp12)的ep管中加入1ml 0.25m naoac水溶液，混匀；
[0050]
2)nota-aunp12溶液转移至20ml反应管中；
[0051]
3)用4ml 0.05m hcl将
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ga淋洗至反应管中，放射性活度约为30mci～35mci；
[0052]
4)在反应管中，90℃的条件下反应10min；
[0053]
5)加入10ml去离子水淬灭反应；
[0054]
6)反应体系过c18 plus柱进行富集，并用10ml去离子水清洗c18 plus柱；
[0055]
7)依次用1ml乙醇和10ml生理盐水将产物淋洗至装有滤膜产品瓶中，形成
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ga-nota-aunp12产品注射液，放射性活度为24.8mci；
[0056]
8)
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ga-nota-aunp12产品注射液进行hplc纯度分析：流动相a为含0.1％tfa的蒸馏水，流动相b为含0.1％tfa的乙腈，色谱柱为zorbax sb-c18。洗脱方式为梯度洗脱(0min～2mim：5％乙腈；3min～20min：90％乙腈)，产品出峰时间为10.32min，纯度大于99％。
[0057]
得到的pet分子探针的放化纯度hplc结果如图1所示。
[0058]
实施例2动物显像
[0059]
1、购买40只c57小鼠，随机分为四组，每组10只小鼠，其中一组作为对照组，正常养殖，另外三组作为实验组，实验组分别构建皮下黑色素瘤b16模型，胰腺癌panc02模型和结直肠癌ct26模型，肿瘤大小为0.5cm左右时作为模型鼠备用。
[0060]
2、模型鼠尾静脉注射
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ga-nota-aunp12(0.1mci～0.2mci)。
[0061]
3、30min后进行小动物pet/ct显像，结果如图1所示，可以发现在30min时即可清洗观察到小鼠的肿瘤位置，说明本发明所述的分子探针能够快速在肿瘤部分聚集，且对比度高，且在持续较长的时间内可观察到肿瘤细胞的聚集情况，说明探针对肿瘤的靶向性较好。
[0062]
4、数据分析获取肿瘤部位的suv值，其中
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ga-nota-aunp12探针在黑色素瘤b16模型、胰腺癌panc02模型和结直肠癌ct26模型中肿瘤摄取suv值分别为5.6
±
1.2、4.5
±
0.9和3.9
±
1.2，表明
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ga-nota-aunp12能较好的对多种肿瘤模型中的pd-l1通路活性进行定量分析检测，且有较高的对比度(图4)。
[0063]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。