优化的GIP肽类似物的制作方法

优化的gip肽类似物
技术领域
1.本发明涉及葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)衍生的肽类似物，所述肽类似物是gip受体的拮抗剂。这些gip肽类似物通过包含氨基酸取代a13aib和/或n24e而进行优化，并且在使用/不使用接头的情况下进行脂肪酸缀合，从而具有改善的溶解度和/或物理稳定性，同时保留或甚至改善对gip受体的拮抗作用。


背景技术：

2.葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)是餐后从肠道k细胞分泌的激素1。与其姐妹激素胰高血糖素样肽1(glp-1)一样，gip是一种强效胰岛素促分泌剂2。与glp-1的胰高血糖素抑制作用
3，4
相反，已显示，gip在某些条件下展示出胰高血糖素释放特性(
3，5-13
)。啮齿动物gipr(gip受体)与肥胖之间的关联增强了人们对了解gip的生物学的兴趣
14-21
。在人中，虽然尚不太清楚，但是也有证据表明gip在脂肪代谢中的作用，证明了脂肪组织中的gipr表达
22
、高bmi与升高的gip水平之间的关联
22，23
、在高胰岛素和高葡萄糖状态下gip施用后脂肪组织血流量和tag(三酰甘油)沉积增加
24
、在节食的肥胖儿童中观察到基础和餐后gip水平下降
25
、以及在高脂饮食的健康青年男性中观察到空腹gip水平升高
26
。
3.因此，除了在发现glp-1受体拮抗剂激动肽(9-39)
27，28
后见证了对glp-1的理解的进步的研究人员的一般需求之外，作为一种抗肥胖剂的潜力也已引起了对开发强效gipr拮抗剂的更多关注。已经采取了许多不同的策略来拮抗gip的功能，例如小分子受体拮抗剂
29
、针对gip的免疫
30-32
、具有拮抗特性的gip分子的各种截短和突变
33-39
以及最近针对gipr的强效拮抗剂抗体
40
。
4.在生理条件下，42个氨基酸的激素gip被二肽基肽酶4(dpp-4)降解，所述酶在gip分子的第三位置处切割，得到gip(3-42)。人工合成的猪gip3-42在生理浓度下在猪体内或灌注的大鼠胰脏中未展示出拮抗剂特性，但其在体外拮抗人gipr
41
。许多肽激素经过翻译后修饰，得到了具有不同长度和氨基酸修饰的各种生物形式
42，43
。因此，已显示gip(1-30)是因翻译后加工而产生
44
，并且它是对gipr的激动剂
33，45
。如果将gip(1-30)分泌到人体循环中，则通过dpp-4催化的切割将产生gip(3-30)。天然gip(3-30)的序列是egtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqk(seq id no:68)。
5.然而，gip(3-30)在约7.5的中性ph值下难溶，并且因此不适合药物施用。
6.在此基础上，对于这样的gip肽类似物存在需要，其除了对gip受体具有令人满意的高拮抗活性外，也要在水性液体介质中充分溶解(尤其是在生理ph值下，例如约7.5的ph，在这种情况下gip(3-30)不溶解)并且稳定，如在物理上稳定。这些类似物可以有利地以适应即时注射的即用型液体药物配制品的形式来提供，并且可以能够在使用前储存令人满意的长时间段。


技术实现要素：

7.本发明人已经鉴定了这样的酰化gip肽，其包含氨基酸取代a13aib和/或n24e并且
是gipr的拮抗剂，其出乎意料地导致了优化的特性，如改善的溶解度和/或物理稳定性以及保留的或甚至改善的拮抗特性。这使得它们在一系列治疗应用中是潜在有用的。
8.本公开文本的gip肽与天然gip(1-42)相比是n末端截短的，并且至少不包含gip(1-42)的第1位和第2位中的前两个氨基酸。
9.在一方面，本公开文本涉及一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物，其由氨基酸序列seq id no:1组成：
[0010][0011]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0012]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:1的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代，
[0013]
其中seq id no:1或其功能性变体的第24位n被e取代和/或其中seq id no:1或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代，
[0014]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽或被省略，并且
[0015]
其中所述肽通过在seq id no 1或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰。
[0016]
在gip肽类似物包含氨基酸取代a13aib和/或n24e的情况下，上述方面的一个重要优点是，与例如天然gip(3-30)相比，溶解度和/或稳定性得到改善。
[0017]
改善的溶解度可以包括或构成与例如在ph 7(例如，在ph 7的50mm磷酸盐缓冲液中)、ph 7.5(例如，在ph 7.5的50mm磷酸盐缓冲液中)、ph 8(例如，在ph 8的milliq水中)和/或ph 8.5(例如，在ph 8.5的milliq水中)下的gip(3-30)相比改善的溶解度。可以在“溶解度的评估”中所示的条件下进行确定。大于1mg/ml或5mg/ml或大于7.5mg/ml、大于10mg/ml、或甚至大于15mg/ml的溶解度可以是所需要的。
[0018]
改善的稳定性可以包括或构成例如与gip(3-30)相比改善的物理稳定性和/或改善的化学稳定性。
[0019]
改善的物理稳定性可以包括或构成降低的聚集(例如形成可溶性或不溶性聚集体，例如原纤维)的趋势。例如，可以在ph 7.5和25摄氏度下以1mg/ml溶解肽的起始浓度确定聚集(例如原纤维形成)。可以使用适当的时间段，例如24小时、50小时或96小时。可以在“物理稳定性的评估”中所示的条件下在搅动或不搅动的情况下确定聚集。在搅动的情况下在96小时内未检测到原纤维可能是所需要的。
[0020]
上述方面的另一个重要优点是gip肽类似物的拮抗作用优选被保留或甚至改善。在gip肽类似物包含氨基酸取代a13aib的情况下尤其可能如此。
[0021]
在另一方面，本发明涉及此类gip肽类似物作为药剂的用途。
[0022]
在又另一方面，本发明涉及此类gip肽类似物在治疗选自以下的病症的方法中的用途：代谢综合征、肥胖症、前驱糖尿病、i型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、空腹血糖升高、高血糖症、空腹血清甘油三酯水平升高、极低密度脂蛋白(vldl)水平低、高密度脂蛋白(hdl)水平低、血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇水平高、脂质异常沉积、心血管疾病、血压升高和动脉粥样硬化。
附图说明
[0023]
图1.在形成原纤维的具有较低物理稳定性的参考gip类似物(磷酸盐缓冲液中的at364-图1a)与不形成原纤维的具有高物理稳定性的gip肽类似物(磷酸盐缓冲液中的at763-图1b)之间进行比较。注意，两条曲线均在0-40吸光度单位(au)开始，这指示没有原纤维，但是仅在图1a中观察到吸光度增加，这是由于原纤维的形成所致。还注意y轴上的不同标度。曲线中的缺口是由于在开始测量后约16小时与板读取器软件再启动相关的不幸问题。在整个测量期间，甚至在数据丢失的16h期间，板读取器使样品经历定轨旋转。记录前13个循环，并且可以用于确定过渡前基线(参见起点)。重新开始测量数据收集，并且再运行764个循环，总共约94h。
[0024]
定义
[0025]
术语“亲和力”是指在受体与其一个或多个配体之间的结合强度。在本上下文中，肽拮抗剂对其结合位点的亲和力(ki)将决定激动剂活性抑制的持续时间。拮抗剂的亲和力可以实验方式利用功能性研究的schild回归或通过放射性配体结合研究来确定，如：1)使用cheng-prusoff方程的竞争性结合实验，2)使用scatchard方程的饱和结合实验或者3)确定结合和解离速率(分别为k
on
和k
off
)的动力学研究。
[0026]
术语“ic50”表示半最大抑制浓度(ic50)，其是物质在抑制特定的生物功能或生化功能方面的有效性的量度。这种定量量度指示需要多少特定的药物或其他物质(例如拮抗剂)才能将给定的生物过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。在药理学研究中，它通常用作拮抗剂药效的量度。ic50表示体外抑制50％所需的药物浓度。在本上下文中，所述ic50值也可以指50％的放射性标记配体从受体转移的药物浓度，其是在竞争结合实验中进行的对药物亲和力的表征。
[0027]
在本上下文中，术语“激动剂”是指能够与受体结合并且激活所述受体的下游信号传导级联的肽或其类似物。
[0028]
在本上下文中，术语“拮抗剂”是指如本文定义的gip肽类似物，其能够与受体结合并阻断或减少所述受体的激动剂介导的反应。在与受体结合后，拮抗剂通常自身不会引起生物学反应。拮抗剂对它们的同源受体具有亲和力但是没有功效，并且拮抗剂与其受体的结合会抑制激动剂或反向激动剂对受体的功能。拮抗剂通过与受体的活性(正构)位点或变构位点结合来介导其作用，或者它们可以在通常不参与受体活性的生物学调节的独特结合位点相互作用。拮抗剂活性可以是可逆的或不可逆的，这取决于拮抗剂-受体复合物的寿命，而拮抗剂-受体复合物的寿命又取决于拮抗剂-受体结合的性质。大多数药物拮抗剂典型地通过与内源性配体或底物在受体上结构确定的结合位点处竞争来实现其效力。拮抗剂可以是竞争性、非竞争性、无竞争性、沉默拮抗剂、部分激动剂或反向激动剂。
[0029]
竞争性拮抗剂(也称为可克服的拮抗剂)可逆地与受体在与内源性配体或激动剂
相同的结合位点(即在活性位点)结合，但不激活所述受体。激动剂和拮抗剂因此“竞争”受体上的相同结合位点。一旦被结合，拮抗剂将阻断激动剂结合。受体的活性水平由每个分子对所述位点的相对亲和力及其相对浓度决定。高浓度的竞争性拮抗剂会增加拮抗剂占据的受体的比例。
[0030]
术语“非竞争性拮抗作用”(也称为不可克服的或不能克服的拮抗作用)描述了两种在功能上具有相似结果的不同现象：一种现象中拮抗剂结合至受体的活性位点，且另一种现象中拮抗剂结合至受体的变构位点。与影响实现最大反应所需的激动剂的量，但不影响该最大反应的强度的竞争性拮抗剂不同，非竞争性拮抗剂降低可以通过任何量的激动剂达到的最大反应的强度。
[0031]
术语“沉默拮抗剂”是指绝对没有激活受体的内在活性的竞争性受体拮抗剂。
[0032]
术语“部分激动剂”是指在给定的受体中在最大受体占有率后引发的功能反应的幅值可能不同的激动剂。在完全激动剂(或更有效的激动剂)的存在下，部分激动剂可以作为竞争性拮抗剂起作用，因为它与完全激动剂竞争受体占据，从而与单独使用完全激动剂观察到的相比，产生受体激活的净减少。
[0033]
术语“反向激动剂”是指能够与激动剂结合至相同的受体结合位点并且拮抗其作用的配体，如gip肽类似物。此外，反向激动剂还可以抑制组成型活性受体的基础活性。
[0034]
如本文所用，术语“葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体(gipr)拮抗剂”是指能够结合至gipr并且阻断或减少gipr的激动剂介导的反应的化合物，如肽。
[0035]
术语“个体”是指脊椎动物，哺乳动物物种的特定成员，优选为包括人类的灵长类动物。如本文所用，“受试者”和“个体”可以互换使用。
[0036]“分离的肽”是从其自然环境(典型地是细胞环境)的组分中分离和/或回收的肽，其基本上不含在自然界中与所述多肽相连的污染性细胞组分，如碳水化合物、脂质或其他蛋白质杂质。典型地，分离的肽的制剂包含高度纯化形式(即至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、大于95％纯或大于99％纯)的肽。术语“分离的”不排除呈替代性物理形式(如二聚体、四聚体或可替代地糖基化或衍生的形式)的相同肽的存在。
[0037]“氨基酸残基”可以是通过肽键或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨基酸残基可以呈d-构型或l-构型。氨基酸残基包含被包含碳原子或碳原子链的中心部分隔开的氨基末端部分(nh2)和羧基末端部分(cooh)，其中的至少一个包含至少一个侧链或官能团。nh2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基，并且cooh是指存在于氨基酸或肽的羧基末端的羧基。通用术语氨基酸包含天然氨基酸和非天然氨基酸二者。如j.biol.chem.,243:3552-59(1969)所列出并且在37c.f.r.,第1.822(b)(2)节中采用的标准命名法的天然氨基酸属于此处列出的氨基酸组：y、g、f、m、a、s、i、l、t、v、p、k、h、q、e、w、r、d、n和c。非天然氨基酸是紧接上文未列出的那些。而且，非天然氨基酸残基包括但不限于经修饰的氨基酸残基、l-氨基酸残基、以及d-氨基酸残基的立体异构体。
[0038]“等效氨基酸残基”是指能够替代多肽中的另一个氨基酸残基而基本不改变所述多肽的结构和/或功能性的氨基酸残基。因此，等效氨基酸具有类似的特性，如侧链的体积、侧链极性(极性的或非极性的)、疏水性(疏水的或亲水的)、ph(酸性的、中性的或碱性的)和碳分子的侧链组构(芳族的/脂肪族的)。因此，“等效氨基酸残基”可以被视为“保守氨基酸取代”，并且它是侧链具有相似的生物化学特性并且因此不影响肽的功能的氨基酸的取代。
[0039]
在常见氨基酸中，例如，“保守氨基酸取代”也可以通过以下组的每个组内氨基酸之间的取代来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
[0040]
在本文应用的术语“等效氨基酸取代”的含义内，一个氨基酸可以取代(在一个实施方案中，在下文所示的氨基酸的组内的)另一个氨基酸：
[0041]
i)具有极性侧链的氨基酸(asp、glu、lys、arg、his、asn、gln、ser、thr、tyr和cys)
[0042]
ii)具有非极性侧链的氨基酸(gly、ala、val、leu、ile、phe、trp、pro和met)
[0043]
iii)具有脂肪族侧链的氨基酸(gly、ala、val、leu、ile)
[0044]
iv)具有环形侧链的氨基酸(phe、tyr、trp、his、pro)
[0045]
v)具有芳族侧链的氨基酸(phe、tyr、trp)
[0046]
vi)具有酸性侧链的氨基酸(asp、glu)
[0047]
vii)具有碱性侧链的氨基酸(lys、arg、his)
[0048]
viii)具有酰胺侧链的氨基酸(asn、gln)
[0049]
ix)具有羟基侧链的氨基酸(ser、thr、tyr)
[0050]
x)具有含硫侧链的氨基酸(cys、met)
[0051]
xi)中性、弱疏水性氨基酸(pro、ala、gly、ser、thr)
[0052]
xii)亲水性、酸性氨基酸(gln、asn、glu、asp)，和
[0053]
xiii)疏水性氨基酸(leu、ile、val)
[0054]
此外，本公开文本的肽的丝氨酸残基可以被选自gln、asn和thr(所有氨基酸均具有极性无电荷的侧链)的氨基酸取代；并且与其独立地，甘氨酸残基(gly)被选自ala、val、leu和ile的氨基酸取代；并且与其独立地，精氨酸残基(arg)被选自lys和his(均具有带正电荷的侧链)的氨基酸取代；并且与其独立地，赖氨酸残基(lys)可以被选自arg和his的氨基酸取代；并且与其独立地，甲硫氨酸残基(met)可以被选自leu、pro、ile、val、phe、tyr和trp(均具有疏水性侧链)的氨基酸取代；并且与其独立地，谷氨酰胺残基(gln)可以独立地被选自asp、glu和asn的氨基酸取代；并且与其独立地，丙氨酸残基(ala)可以被选自gly、val、leu和ile的氨基酸取代。
[0055]
在未指定l或d形式(光学异构体)的情况下，应理解，所讨论的氨基酸具有天然的l形式(参见pure&appl.chem.第56(5)卷第595-624页(1984))或d形式，使得所形成的肽可以由l形式、d形式或混合l形式和d形式序列的氨基酸构成。
[0056]
如本文所用，谷氨酸(glu)模拟物是具有被三个碳原子隔开的两个羧基官能团的部分。例子是β-glu、γ-glu或戊二酸。戊二酸(glutaric acid)也称为戊二酸(pentanedioic acid)。
[0057]
肽的“功能性变体”是能够与其作为功能性变体的肽执行基本上相同的功能的肽。具体地，功能性变体可以基本上与其作为功能性变体的肽结合相同的分子(如受体)或执行相同的受体介导的反应。“葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物”的功能性变体是能够与gipr结合并且激活或抑制gipr下游信号传导(如camp生成)的肽。葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体(gipr)拮抗剂的功能性变体是能够与gipr结合并且抑制或降低激动剂介导的gipr信号传导(如camp生成)的肽。
[0058]“生物活性剂”(即在生物学活性物质/药剂)是提供可以在体内或体外证明的一些药理学作用(通常为有益作用)的任何药剂、药物、化合物、物质组合物或混合物。它是指如本文定义的gip肽类似物以及包含其的化合物或组合物。如本文所用，此术语还包括在个体中产生局部或全身作用的任何生理学或药理学活性物质。
[0059]
如本文所用的术语“药物”或“药剂”包括在人或动物体内局部或全身作用的生物学、生理学或药理学活性物质。
[0060]
如本文所用的术语“治疗(treatment和treating)”是指出于对抗病症、疾病或障碍的目的对患者进行的管理和护理。所述术语旨在包括对患者所患给定病症的全系列治疗，同等地是指治愈性疗法、预防性(prophylactic/preventative)疗法以及减轻或缓和性疗法，如出于以下目的施用肽或组合物：减轻或缓解症状或并发症；延迟病症的进展，部分阻止临床表现、疾病或障碍；治愈或消除病症、疾病或障碍；病症或症状的减轻或缓和、以及消退(不论是部分还是总体)，不论是可检测的还是不可检测的；和/或预防病症、疾病或障碍或降低获得病症、疾病或障碍的风险，其中“预防(preventing或prevention)”应理解为是指出于阻碍病症、疾病或障碍发展的目的对患者的管理和护理，并包括活性化合物的施用，以预防症状或并发症或降低症状或并发症的发作风险。如本文所用，术语“缓和”及其变式意指与不施用本发明组合物相比，生理状况或症状的程度和/或不期望的表现减轻和/或进展的时间进程变缓或延长。
[0061]
待治疗的个体优选是哺乳动物，具体而言是人。然而，对动物(如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、绵羊和猪)的治疗也包括在本文中。
[0062]“有需要的个体”是指可以从本公开文本受益的个体。在一个实施方案中，所述有需要的个体为患病个体，其中所述疾病可以是代谢性疾病或障碍(如肥胖症或糖尿病)、骨密度障碍或癌症。
[0063]
根据本发明的治疗可以是预防型、减轻型和/或治愈型。
[0064]
生物活性剂的“药理学有效量”、“药学有效量”或“生理学有效量”是在施用如本文所述的药物组合物时，在待治疗的个体的血流中或作用部位(例如，肺、胃系统、结直肠系统、前列腺等)中提供所希望水平的活性剂以产生预期的生理反应所需的这样的组合物中存在的活性剂的量。在本上下文中，生物活性剂是指本文公开的gip肽类似物。
[0065]
如本文所用的“共施用(co-administering或co-administration)”是指本发明的一种或多种gip肽类似物和最先进的药物组合物的施用。可以分开、顺序或同时施用所述至少两种组分。
[0066]
如本文所用的“物理稳定性”是指肽(例如本发明的gip肽类似物)形成所述肽的可溶性或不溶性聚集体的趋势的量度，例如由于肽对压力和/或与去稳定的界面和表面(如疏水性表面和界面)的相互作用。可以借助在使合适的筒(例如筒或小瓶)中填充的组合物暴露于机械/物理压力(例如搅动)不同时间段后的目视检查和/或浊度测量来评价水性肽溶液的物理稳定性。当组合物表现出可见混浊时，可以将所述组合物归类为在肽聚集方面在物理上不稳定。可替代地，可以通过技术人员熟知的简单浊度测量来评价组合物的浊度。还可以通过使用充当肽构象状态的光谱探针的试剂来评价水性肽组合物的物理稳定性。所述探针优选地是优先与肽的非天然构象异构体结合的小分子。此类小分子光谱探针的一个例子是硫磺素t，它是一种广泛用于检测淀粉样蛋白原纤维的荧光染料。在存在原纤维以及可
能还有其他肽构型存在的情况下，硫磺素t当与肽的原纤维形式结合时在约450nm处产生新的激发最大值，并且在约482nm处产生增强的发射。未结合的硫磺素t在所讨论的波长下基本无荧光。
具体实施方式
[0067]
gip是指葡萄糖依赖性促胰岛素多肽，也称为抑胃肽(或抑胃多肽)。如本文所用的缩写gip或hgip是人gip(uniprot登录号p09681)。gip衍生自153个氨基酸的蛋白质原，并作为具有生物学活性的42个氨基酸的肽循环。它由胃肠道中十二指肠和空肠的粘膜的k细胞合成。
[0068]
gipr(或gip受体)是指抑胃多肽受体。这些七跨膜蛋白至少在胰腺中的β细胞上发现。如本文所用的缩写gipr或hgipr是人gipr(uniprot登录号p48546)。
[0069]
在一个实施方案中，激动肽-4是具有氨基酸序列
[0070]
hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps(seq id no:69)的肽。
[0071]
在一个实施方案中，gip(3-30)是具有氨基酸序列
[0072]
egtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqk(seq id no:68；gip3-30)的肽。
[0073]
本发明人已经鉴定了这样的酰化gip肽类似物，其包含氨基酸取代a13aib和/或n24e并且是gipr的拮抗剂，其出乎意料地导致了改善的溶解度和/或物理稳定性以及保留的或改善的拮抗特性。这使得它们在一系列治疗应用中是潜在有用的。
[0074]
gip肽
[0075]
经取代的gip肽类似物
[0076]
本公开文本的一方面提供了一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物，其由氨基酸序列seq id no:1组成：
[0077][0078]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0079]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:1的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代，
[0080]
其中seq id no:1或其功能性变体的第24位n被e取代和/或其中seq id no:1或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代，
[0081]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽或被省略，并且
[0082]
其中所述肽通过在seq id no 1或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰。
[0083]
本公开文本的一方面还提供了一种gip类似物，其由选自以下的氨基酸序列组成：
[0084][0085]
(seq id no:2)、
[0086][0087]
(seq id no:3)、以及
[0088][0089]
(seq id no:4)，
[0090]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0091]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:2(第24位的e除外)；seq id no:3(第13位的aib除外)；和seq id no:4(第13位的aib和第24位的e除外)的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代；
[0092]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽，并且
[0093]
其中所述肽通过在seq id no:2-4或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰。
[0094]
在第13位被aib取代和/或第24位被e取代的情况下，上述方面的一个重要优点是，溶解度和/或物理稳定性似乎得到改善。当第13位被aib取代并且第24位被e取代时，可以获得溶解度和/或物理稳定性的优异或甚至协同改善。
[0095]
在一个实施方案中，本公开文本提供了一种如上文定义的gip肽类似物，其中所述gip肽类似物是gipr的拮抗剂。
[0096]
与天然gip肽相比已经被修饰的gip肽被称为gip肽类似物。根据本公开文本的gip肽类似物优选是gipr拮抗剂。
[0097]
在一个实施方案中，根据本公开文本的gip肽类似物或其功能性变体是分离的肽。
[0098]
在本公开文本的一个实施方案中，例如与在第13位没有aib和/或在第24位没有e的相应序列相比，所述gip肽类似物具有改善的溶解度。
[0099]
在本公开文本的一个实施方案中，与天然gip(3-30)相比和/或与at364(seq id no:6；gip(3-30)[h18k]c16二酸 cex(31-39))相比，gip肽类似物具有改善的溶解度。
[0100]
在本公开文本的一个实施方案中，在ph 7至9，如在ph 7至8.5下、如在ph 7.0至
8.0或ph 7.5至8.5下，与gip(3-30)相比和/或与at364(seq id no:6)相比，所述gip肽类似物具有改善的溶解度，如经由目视检查测量的或例如在uv微孔板中测量的，其中可以将≥1mg/ml的肽溶解度的浊度吸光度标准设置为325nm下的吸光度≤0.02吸光度单位(例如，板中的8个缓冲液样品的标准差的5至6倍)。
[0101]
在一个实施方案中，所述gip肽类似物具有至少1mg/ml，如至少5mg/ml、如至少7.5mg/ml、如至少10mg/ml、如至少15mg/ml的水溶解度。
[0102]
在一个实施方案中，所述gip肽类似物在ph 7至9之间，如约ph 7.5或约8下具有至少1mg/ml，如至少5mg/ml、如至少7.5mg/ml、如至少10mg/ml、如至少15mg/ml的水溶解度。
[0103]
在一个实施方案中，所述gip肽类似物具有改善的物理稳定性，如通过大于约24小时的tht测定中的原纤化延迟时间，如大于约50小时的tht测定中的原纤化延迟时间、如大于约96小时的tht测定中的原纤化延迟时间、如大于约168小时的tht测定中的原纤化延迟时间测量的。
[0104]
在一个实施方案中，即使在约24小时内，如在约50小时内、如在约96小时内搅动，所述gip肽类似物也不形成原纤维。
[0105]
在一个实施方案中，在ph 7至8.5，如约ph 7.5下，所述gip肽类似物具有改善的物理稳定性，如通过大于约24小时的tht测定中的原纤化延迟时间，如大于约50小时的tht测定中的原纤化延迟时间、如大于约96小时的tht测定中的原纤化延迟时间、如大于约168小时的tht测定中的原纤化延迟时间测量的。
[0106]
在本公开文本的一个实施方案中，在ph 7至9，如ph 7至8.5、如ph 7.0至8.0或ph 7.5至8.5下，与gip(3-30)相比和/或与at364(seq id no:6)相比，所述gip肽类似物具有改善的物理稳定性，如在确定聚集的测定中，如经由硫磺素t(tht)测定测量的，其例子描述于“物理稳定性的评估”部分中。
[0107]
在本公开文本的一个实施方案中，所述gip肽类似物通过在seq id no 1或其所述功能性变体的第3位至第29位处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰。
[0108]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物，其中：
[0109]
第3位的氨基酸选自e、戊二酸、琥珀酸和己二酸；
[0110]
第9位的氨基酸选自d和e；
[0111]
第11位的氨基酸选自s、k和a；
[0112]
第12位的氨基酸选自i和k；
[0113]
第13位的氨基酸选自a、2-氨基异丁酸(aib)和k；
[0114]
第14位的氨基酸选自m、l和nle；
[0115]
第15位的氨基酸选自d和e；
[0116]
第16位的氨基酸选自k和r；
[0117]
第17位的氨基酸选自i和k；
[0118]
第18位的氨基酸选自h和k；
[0119]
第20位的氨基酸选自q和k；
[0120]
第21位的氨基酸选自d和e；
[0121]
第24位的氨基酸选自n、q和e；
[0122]
第34位的氨基酸如果存在则选自p和k；和/或
[0123]
第40位的氨基酸如果存在则是k或不存在。
[0124]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物，其中：
[0125]
第4位的氨基酸是g；
[0126]
第5位的氨基酸是t；
[0127]
第6位的氨基酸是f；
[0128]
第7位的氨基酸是i；
[0129]
第22位的氨基酸是f；
[0130]
第23位的氨基酸是v；
[0131]
第25位的氨基酸是w；
[0132]
第26位的氨基酸是l；和/或
[0133]
第27位的氨基酸是l。
[0134]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第4位的氨基酸是g。
[0135]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第5位的氨基酸是t。
[0136]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第6位的氨基酸是f。
[0137]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第7位的氨基酸是i。
[0138]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第10位的氨基酸是y。
[0139]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第22位的氨基酸是f。
[0140]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第23位的氨基酸是v。
[0141]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第25位的氨基酸是w。
[0142]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第26位的氨基酸是l。
[0143]
在一个实施方案中，提供了选自seq id no:1-4中任一个的gip肽类似物或其功能性变体，其中第27位的氨基酸是l。
[0144]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述功能性变体具有在seq id no:1-4中任一个的任何氨基酸残基处的1个单独的氨基酸取代，如2个单独的氨基酸取代、例如3个单独的氨基酸取代、如4个单独的氨基酸取代、或如在seq id no:1-4中任一个的任何氨基酸残基处的1至4个单独的氨基酸取代。
[0145]
在一个实施方案中，所述功能性变体具有在seq id no:1-4中任一个的任何氨基酸残基处的1至2个单独的氨基酸取代，如2至3个单独的氨基酸取代、如3至4个单独的氨基
酸取代、如4至5个单独的氨基酸取代、如5至6个单独的氨基酸取代、如6至7个单独的氨基酸取代、如7至8个单独的氨基酸取代。
[0146]
在一个实施方案中，所述功能性变体具有在seq id no:1-4中任一个的任何氨基酸残基处的1个单独的氨基酸取代，如2个单独的氨基酸取代、例如3个单独的氨基酸取代、如4个单独的氨基酸取代，其中所述取代是保守的氨基酸取代。
[0147]
在一个实施方案中，所述功能性变体具有在seq id no:1-4中任一个的氨基酸残基3至30中的任一个处的1至7个单独的氨基酸取代，如1个单独的氨基酸取代、如2个单独的氨基酸取代、如3个单独的氨基酸取代、如4个单独的氨基酸取代、如5个单独的氨基酸取代、如6个单独的氨基酸取代、如7个单独的氨基酸取代。
[0148]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个的所述gip肽类似物的至少一个氨基酸残基被e取代，如其中seq id no:1-4中任一个的第9位、第15位和第21位中的任一个处的至少一个氨基酸残基被e取代。
[0149]
如本文定义的seq id no:1-4中任一个的肽的第9位、第15位和第21位中的任一个处的一个或多个氨基酸残基被e取代可以导致经取代的肽的增加的拮抗作用、增加的溶解度和/或增加的稳定性。
[0150]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中x1是选自e、戊二酸、琥珀酸和己二酸的氨基酸残基。
[0151]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中x1是e。
[0152]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中x1是戊二酸。
[0153]
在一个实施方案中，提供了根据前述权利要求中任一项所述的gip肽类似物，其中x1是琥珀酸。
[0154]
在一个实施方案中，提供了根据前述权利要求中任一项所述的gip肽类似物，其中x1是己二酸。
[0155]
第3位具有e的根据本公开文本的gip肽类似物可以是对gipr非常强效的拮抗剂。然而，第3位具有e也可能导致化合物不稳定。不希望受理论束缚，第3位的e可以通过n末端的氨基与e的侧链羧酸之间的环化形成pyroglu。因此，取代第3位的e可能是有利的。本发明人已经发现，n末端处的氨基可能不是获得强效拮抗剂所必需的。
[0156]
用戊二酸取代第3位的e(即，从n末端的第一个氨基酸)可能是有利的，因为戊二酸没有氨基并且因此不可能形成n末端的pyroglu。pyroglu的形成对于谷氨酸可能是不需要的副反应。在第3位用戊二酸取代可能也增加效力。戊二酸在体内一些氨基酸(包括赖氨酸和色氨酸)的代谢过程中自然产生。可以使用琥珀酸和己二酸代替戊二酸。
[0157]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第9位d被任何氨基酸取代，如被e取代。
[0158]
第9位具有e的优点是效力和/或稳定性和/或溶解度可能提高。
[0159]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第11位s被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代或如被选自a和k的氨基酸残基取代。
[0160]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第12位i被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，或如被k取代。
[0161]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1和seq id no:2或其功能性变体的第13位a被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被2-氨基异丁酸(aib)或k取代。
[0162]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1和seq id no:2或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代。
[0163]
第13位具有aib的优点是gipr拮抗作用可能显著提高。此外，第13位的aib还可以增加肽的稳定性，如体内稳定性或物理稳定性。
[0164]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第14位m被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被选自l和正亮氨酸(nle)的氨基酸残基取代。
[0165]
由于m易于氧化，因此将其用另一种氨基酸(如l或nle)取代可能是有利的，这也可能保留效力。
[0166]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第15位d被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被e取代。第15位具有e的优点是效力和/或稳定性和/或溶解度可能提高。
[0167]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第16位k被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被r取代。
[0168]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第17位i被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被k取代。
[0169]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第18位h被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被k取代。
[0170]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第20位q被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代或如被k取代。
[0171]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第21位d被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被e取代。第21位具有e的优点是效力和/或稳定性和/或溶解度可能提高。
[0172]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中seq id no:1和seq id no:3或其功能性变体的第24位n被任何氨基酸取代，如保守氨基酸取代，如被q取代或如被e取代。
[0173]
在一个实施方案中，所述gip肽类似物在seq id no:1-4中任一个的氨基酸残基3至30中的任一个处包含至少一个取代为k和一个取代为e或aib。
[0174]
在一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其选自seq id no:1-4中任一个，其中：
[0175]
第3位的氨基酸残基是e、戊二酸、琥珀酸或己二酸，
[0176]
第4位的氨基酸残基是g，
[0177]
第5位的氨基酸残基是t，
[0178]
第6位的氨基酸残基是f，
[0179]
第7位的氨基酸残基是i，
[0180]
第8位的氨基酸残基是s，
[0181]
第9位的氨基酸残基是d或e，
[0182]
第10位的氨基酸残基是y，
[0183]
第11位的氨基酸残基是s、k或a，
[0184]
第12位的氨基酸残基是i或k，
[0185]
第13位的氨基酸残基是a、aib或k，
[0186]
第14位的氨基酸残基是m、l或nle，
[0187]
第15位的氨基酸残基是d或e，
[0188]
第16位的氨基酸残基是k或r，
[0189]
第17位的氨基酸残基是i或k，
[0190]
第18位的氨基酸残基是h或k，
[0191]
第19位的氨基酸残基是q，
[0192]
第20位的氨基酸残基是q或k，
[0193]
第21位的氨基酸残基是d或e，
[0194]
第22位的氨基酸残基是f，
[0195]
第23位的氨基酸残基是v，
[0196]
第24位的氨基酸残基是n、q或e，
[0197]
第25位的氨基酸残基是w，
[0198]
第26位的氨基酸残基是l，
[0199]
第27位的氨基酸残基是l，
[0200]
第28位的氨基酸残基是a，
[0201]
第29位的氨基酸残基是q，和/或
[0202]
第30位的氨基酸残基是k，
[0203]
或其功能性变体。
[0204]
在一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其选自seq id no 1-4中任一个，其中：
[0205]
第3位的氨基酸残基是e、戊二酸、琥珀酸或己二酸，
[0206]
第4位的氨基酸残基是g，
[0207]
第5位的氨基酸残基是t，
[0208]
第6位的氨基酸残基是f，
[0209]
第9位的氨基酸残基是d或e，
[0210]
第10位的氨基酸残基是y，
[0211]
第11位的氨基酸残基是s、k或a，
[0212]
第12位的氨基酸残基是i或k，
[0213]
第13位的氨基酸残基是a、aib或k，
[0214]
第14位的氨基酸残基是m、l或nle，
[0215]
第15位的氨基酸残基是d或e，
[0216]
第16位的氨基酸残基是k或r，
[0217]
第18位的氨基酸残基是h或k，
[0218]
第19位的氨基酸残基是q，
[0219]
第20位的氨基酸残基是q或k，
[0220]
第21位的氨基酸残基是d或e，
[0221]
第22位的氨基酸残基是f，
[0222]
第23位的氨基酸残基是v，
[0223]
第24位的氨基酸残基是n、q或e，
[0224]
第25位的氨基酸残基是w，
[0225]
第26位的氨基酸残基是l，和/或
[0226]
第27位的氨基酸残基是l，
[0227]
或其功能性变体。
[0228]
在一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其选自seq id no:1-4中任一个，其中
[0229]
第3位的氨基酸残基是e、戊二酸、琥珀酸或己二酸，
[0230]
第4位的氨基酸残基是g，
[0231]
第5位的氨基酸残基是t，
[0232]
第6位的氨基酸残基是f，
[0233]
第9位的氨基酸残基是d或e，
[0234]
第13位的氨基酸残基是a、aib或k，
[0235]
第14位的氨基酸残基是m、l或nle，
[0236]
第15位的氨基酸残基是d或e，
[0237]
第18位的氨基酸残基是h或k，
[0238]
第21位的氨基酸残基是d或e，
[0239]
第22位的氨基酸残基是f，
[0240]
第23位的氨基酸残基是v，
[0241]
第24位的氨基酸残基是n、q或e，
[0242]
第25位的氨基酸残基是w，
[0243]
第26位的氨基酸残基是l，和/或
[0244]
第27位的氨基酸残基是l，
[0245]
或其功能性变体，其中所述功能性变体具有在seq id no:1-4中任一个的任何氨基酸残基处的1个单独的氨基酸取代，如2个单独的氨基酸取代、例如3个单独的氨基酸取代、如4个单独的氨基酸取代、或如在seq id no:1-4中任一个的任何氨基酸残基处的1至4个单独的氨基酸取代。
[0246]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中z包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个连续氨基酸残基。
[0247]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中z由激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个连续氨基酸残基组成。
[0248]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中z由激动肽-4(30-39)(gpssgappps；seq id no:61；ce30-39)的c末端的一个或多个连续氨基酸残基组成。
[0249]
在一些实施方案中，z包含至少一个g或一个p。在一些实施方案中，z包含至少两个p。
[0250]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中z是选自以下的肽：
[0251]-甘氨酸或脯氨酸，
[0252]-gp、gps、gpss、gpssg、gpssga、gpssgap、gpssgapp、gpssgappp和gpssgappps，
[0253]-ps、pss、pssg、pssga、pssgap、pssgapp、pssgappp和pssgappps，
[0254]-gpssga、gpssgap、gpssgapp、gpssgappp、gpssgappps，或其在所述氨基酸残基中的任一个处包含1或2个单独的氨基酸取代的变体，或
[0255]-pssg、pssga、pssgap、pssgapp、pssgappp和pssgappps，
[0256]
或其在所述氨基酸残基中的任一个处包含1或2个单独的氨基酸取代的变体。
[0257]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述脂肪酸分子不附接在seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第3位氨基酸残基处或第3位氨基酸残基的n末端氨基处。
[0258]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述gip肽类似物具有游离的n末端。因此，gip肽类似物的n末端包含未取代(如未乙酰化、酰化或烷基化)的氨基(-nh2)部分。因此，gip肽类似物的n末端可以包含游离的氨基(-nh2)部分。
[0259]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述脂肪酸分子附接到所述gip肽类似物(如seq id no:1-4中任一个或其功能性变体)的第11位、第12位、第13位、第16位、第17位、第18位、第20位、如果存在的第34位或如果存在的第40位处的氨基酸残基的侧链。
[0260]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述脂肪酸分子附接到seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第12位、第13位、第16位、第17位、第18位、如果存在的第34位或如果存在的第40位中的任一个处的氨基酸残基上。
[0261]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述脂肪酸分子附接到seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第18位氨基酸残基上。
[0262]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中脂肪酸分子附接到所述gip肽类似物(如seq id no:1-4中任一个或其包含至少一个k残基的功能性变体)的k残基的ε-氨基上。
[0263]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中脂肪酸分子附接到seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第18位氨基酸残基的侧链氨基上，其中在seq id no:1-4中任一个中，第18位h已经被k或orn取代。
[0264]
在使用或不使用接头的情况下，脂肪酸附接至第18位的氨基酸残基的侧链氨基可能导致gip肽类似物具有特别高的拮抗效力。
[0265]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中脂肪酸分子附接到seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第11位氨基酸残基的侧链氨基上，其中在seq id no:1-4中任一个中，第11位s已经被k或orn取代。
[0266]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中脂肪酸分子附接到seq id no:1-4中任一个或其功能性变体的第12位氨基酸残基的侧链氨基上，其中在seq id no:1-4中任一个中，第12位i已经被k或orn取代。
[0267]
在一个实施方案中，提供了如上文所定义的gip肽类似物，其中所述gip肽类似物具有选自以下的氨基酸序列：
[0268]
egtfiseysaibanleekikqqdfvewllaqk-z；seq id no:70；gip(3-30)[d9e；i12aib；m14nle；d15e；h18k；n24e]，
[0269]
egtfiseysiaibmekikqqdfvewllaqk-z；seq id no:72；gip(3-30)[d9e；a13aib；d15e；h18k；n24e]，
[0270]
egtfisdysiamdkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:46；gip(3-30)[h18k；n24e]，
[0271]
egtfisdysiaibmdkikqqdfvewllaqk-z；seq id no73；gip(3-30)[a13aib；h18k；n24e]，
[0272]
egtfisdysiaibldkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:74；gip(3-30)[a13aib；m14l；h18k；n24e]，
[0273]
egtfisdysiaibnledkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:75；gip(3-30)[a13aib；m14nle；h18k；n24e]，
[0274]
egtfisdysialdkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:76；gip(3-30)[m14l；h18k；n24e]，
[0275]
egtfisdysianledkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:77；gip(3-30)[m14nle；h18k；n24e]，
[0276]
egtfisdysiakdkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:78；gip(3-30)[m14k；h18k；n24e]，
[0277]
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[0278]
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[0283]
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[0287]
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[0288]
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[0289]
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[0290]
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[0291]
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[0292]
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[0293]
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[0294]
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[0295]
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[0296]
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[0297]
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[0298]
xgtfiseysiaiblekikqqefvewllaqk-z；seq id no:98；gip(3-30)[e3琥珀酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0299]
xgtfiseysiaiblekikqqefvewllaqk-z；seq id no:99；gip(3-30)[e3己二酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0300]
egtfisdysiaibmdkikqqdfvnwllaqk-z；seq id no:100；gip(3-30)[a13aib；h18k]，
[0301]
xgtfisdysiamdkikqqdfvewllaqk-z；seq id no:101；gip(3-30)[e3戊二酸；h18k；n24e]，和
[0302]
xgtfisdysiaibmdkikqqdfvnwllaqk-z；seq id no:102；gip(3-30)[e3戊二酸；a13aib；h18k]，
[0303]
其中所述肽通过在以上序列中任一个的任何位置处附接脂肪酸分子而被修饰，并且其中所述肽可以被c末端羧化。
[0304]
在一个实施方案中，所述gip肽类似物被c末端酰胺化(-nh2)或c末端羧化(-cooh)。
[0305]
在一个实施方案中，所述gip肽类似物被c末端羧化(-cooh)。
[0306]
不受任何理论的束缚，游离的c末端羧酸可能能够帮助增加溶解度。
[0307]
功能性变体-突变体
[0308]
在一个实施方案，所述氨基酸取代中的一个或多个或全部是保守氨基酸取代(或同义取代)。保守取代是侧链具有相似的生物化学性质且因此不影响肽的功能的氨基酸的取代。
[0309]
如本文公开的特定的氨基酸取代是k到r；e到d、戊二酸；m到l；q到e；i到v；i到l,aib；a到aib；y到w；s到t；n到s；m到nle；h到k；d到e；n到q。
[0310]
在另一个实施方案中，如本文定义的功能性变体包括如下序列：其中烷基氨基酸
取代烷基氨基酸，其中芳族氨基酸取代芳族氨基酸，其中含硫氨基酸取代含硫氨基酸，其中含羟基氨基酸取代含羟基氨基酸，其中酸性氨基酸取代酸性氨基酸，其中碱性氨基酸取代碱性氨基酸，和/或其中二碱基一羧酸氨基酸取代二碱基一羧酸氨基酸。
[0311]
保守取代可以被引入选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4中任一个的gip肽类似物的上述指定位置的任一个或多个中，只要所得的变体保持功能性即可。然而，也可能期望在一个或多个位置引入非保守取代(非同义取代)。
[0312]
在一个实施方案中，导致形成选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4中任一个的gip肽类似物的变体的非保守取代包括如下氨基酸残基的取代：i)极性基本上不同，例如具有非极性侧链的残基(ala、leu、pro、trp、val、ile、leu、phe或met)取代具有极性侧链的残基(如gly、ser、thr、cys、tyr、asn、或gln)或带电荷氨基酸(如asp、glu、arg或lys)，或者带电荷或极性残基取代非极性残基；和/或ii)对肽骨架取向的作用基本上不同，如pro或gly被另一个残基取代或取代另一个残基；和/或iii)电荷基本上不同，例如带负电荷残基(如glu或asp)取代带正电荷残基(如lys、his或arg)(并且反之亦然)；和/或iv)空间体积基本上不同，例如体积大的残基(如his、trp、phe或tyr)取代具有较小侧链的残基(例如，ala、gly或ser)(并且反之亦然)。
[0313]
在一个实施方案中，氨基酸的取代可以基于以下来进行：其疏水性值和亲水性值，以及氨基酸侧链取代基的相对相似度，包括电荷、大小等。
[0314]
如本文定义的gip肽类似物或其功能性变体对应物包含蛋白原或天然氨基酸，即天然掺入多肽中的22种氨基酸。在这些氨基酸中，20种由通用遗传密码编码，并且其余2种(硒代半胱氨酸(sec，u)和吡咯赖氨酸(pyl，o))通过独特的合成机制掺入蛋白质中。
[0315]
在一个实施方案中，如本文定义的gip肽类似物包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基(非天然、非蛋白原或非标准氨基酸)或氨基酸模拟物(如戊二酸)。非天然存在的氨基酸包括例如但不限于，aib、β-2-萘基-丙氨酸、反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基脯氨酸(methanoproline)、顺式-4-羟基脯氨酸、鸟氨酸(orn)、反式-4-羟基脯氨酸、n-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺、哌可酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-甲基脯氨酸和4-甲基脯氨酸、3,3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸(nle)、甲氧胺(methoxinine)(mox)、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
[0316]
在一个实施方案中，氨基酸met被抗氧化的氨基酸类似物取代，例如正亮氨酸(nle)或leu，其保留了对疏水性相互作用而言重要的氨基酸侧链的长度，但不保留其氢键合特性；或者甲氧胺(mox)，它是一种与nle相比更接近地类似于met的电子性质的非典范氨基酸；或者lys。
[0317]
标准和/或非标准氨基酸可以通过肽键连接(以形成线性肽链)，或者通过非肽键连接(例如通过氨基酸的可变侧链)。优选地，本文定义的肽的氨基酸通过肽键连接。
[0318]
如本领域所知，术语肽还包括通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰。这些翻译后修饰包括一个或多个氨基酸残基的乙酰化、磷酸化、甲基化、糖基化、糖化、酰胺化、羟基化、脱亚胺基化、脱酰胺化、氨甲酰化和硫酸化，还包括由已知的蛋白酶进行的蛋白水解修饰，包括溶酶体组织蛋白酶以及钙蛋白酶、分泌酶和基质-金属蛋白酶。
[0319]
同样，肽的功能性等效物可以包含化学修饰，如泛素化、标记(例如，用放射性核
素、各种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)、或者通过插入(或者通过化学合成取代)通常在人蛋白质中不存在(非蛋白原)的氨基酸(如鸟氨酸)。
[0320]
可以配制空间上相似的化合物来模拟肽结构的关键部分。这可以通过本领域技术人员已知的建模和化学设计技术来实现。例如，可以采用酯化和其他烷基化来修饰例如二精氨酸肽骨架的氨基末端以模拟四肽结构。应理解，所有这些空间上相似的构建体均落入本发明的范围内。具有n末端和c末端烷基化和酯化的肽也包括在本发明内。例如，戊二酸是模拟谷氨酸的空间上相似的化合物。
[0321]
在一个实施方案中，本公开文本的gip肽类似物的n末端氨基酸不具有任何化学修饰。可能有利的是，gip肽类似物的n末端的氨基是游离的，即未被取代，因为取代可能导致对gipr的激动作用。
[0322]
在一个实施方案中，n末端(即在n末端处的nh2基团)不存在，例如，当第3位被不含氨基的戊二酸取代时。
[0323]
似乎延长脂肪酸或接头(如果存在)的长度可能降低拮抗效力。然而，第13位同时掺入aib残基似乎补偿了降低的效力的一些或全部，尤其是与第9位、第15位、第21位和第24位中的一个或多个处的e组合，如与第24位的e组合。
[0324]
脂肪酸分子的附接
[0325]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到具有侧链氨基-烷基(-c
nh2n
nh2)的一个或多个氨基酸残基上。
[0326]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到具有侧链氨基(nh2)的一个或多个氨基酸残基上。
[0327]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到氨基酸残基的氨基(nh2)上。
[0328]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到氨基酸残基的侧链氨基上。
[0329]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到赖氨酸残基(lys，k)的ε(伊普西隆)侧链氨基上。
[0330]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到鸟氨酸残基(orn)的δ(德耳塔)侧链氨基上。
[0331]
在一个实施方案中，附接有脂肪酸分子的氨基酸残基选自lys和orn。
[0332]
在一个实施方案中，附接有脂肪酸分子的氨基酸残基是lys。
[0333]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到所述gip肽类似物(如seq id no:1-4中任一个)或包含orn氨基酸残基的功能性变体的orn残基的δ-氨基上。
[0334]
在一个实施方案中，脂肪酸分子附接到所述gip肽类似物(如seq id no:1-4中任一个)或其功能性变体的k残基的ε-氨基上。
[0335]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子是直链脂肪酸。
[0336]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子是支链脂肪酸。
[0337]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子是包含一个酰基的单酰基脂肪酸分子。优选地，羧基位于脂肪酸分子的一个末端。
[0338]
例如，gip肽可以经由接头l与单酰基脂肪酸(如十六酰基)缀合，如式i所描绘的：
[0339][0340]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子是二酰基脂肪酸分子。二酰基脂肪酸分子是包含两个羧基的脂肪酸分子。优选地，一个或两个羧基位于脂肪酸分子的一个末端或每个末端。
[0341]
例如，gip肽可以经由接头l与二酰基脂肪酸(也称为“二酸”)(如15-羧基-十五酰基)缀合，如式ii所描绘的：
[0342][0343]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子包含式ch3(ch2)nco-的酰基，其中n是4至24的整数。
[0344]
在一个实施方案中，所述脂肪酸分子包含选自以下的一个或多个酰基：ch3(ch2)6co-、ch3(ch2)8co-、ch3(ch2)
10
co-、ch3(ch2)
12
co-、ch3(ch2)
14
co-、ch3(ch2)
16
co-、ch3(ch2)
18
co-、ch3(ch2)
20
co-和ch3(ch2)
22
co-。
[0345]
在一个实施方案中，所述脂肪酸分子包含选自以下的酰基：ch3(ch2)
10
co-(月桂基，c12)、ch3(ch2)
12
co-(肉豆蔻酰基，c14)、ch3(ch2)
14
co-(棕榈酰基，c16)、ch3(ch2)
16
co-(硬脂酰基，c18)、ch3(ch2)
18
co-(花生基，c20)和ch3(ch2)
20
co-(山嵛基，c22)。
[0346]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，所述脂肪酸分子包含单独地选自以下的两个酰基：hooc-ch3(ch2)
10
co-(十二酰基，c12)、hooc-ch3(ch2)
12
co-(1-十四酰基，c14)、hooc-ch3(ch2)
14
co-(十六酰基，c16)、hooc-ch3(ch2)
15
co-(15-羧基-十五酰基，c17)、hooc-ch3(ch2)
16
co-(十八酰基，c18)、hooc-ch3(ch2)
17
co-(17-羧基-十七酰基，c19)、hooc-ch3(ch2)
18
co-(二十酰基，c20)、hooc-ch3(ch2)
19
co-(19-羧基-十九酰基，c21)和hooc-ch3(ch2)
20
co-(山嵛基，c22)。
[0347]
在一个实施方案中，所述脂肪酸分子包含式cooh(ch2)nco-(二羧酸)的酰基，其中n是4至24的整数。
[0348]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，所述脂肪酸分子包含选自以下的酰基：cooh(ch2)
14
co-、cooh(ch2)
16
co-、cooh(ch2)
18
co-和cooh(ch2)
20
co-。
[0349]
在一个实施方案中，所述脂肪酸分子包含cooh(ch2)
14
co-或由其组成。
[0350]
在一个实施方案中，所述脂肪酸分子包含cooh(ch2)
16
co-或由其组成。
[0351]
在一个实施方案中，所述脂肪酸分子包含cooh(ch2)
18
co-或由其组成。
[0352]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子直接附接到所述gip肽类似物的氨基酸残基的侧链
的ε氨基上。
[0353]
脂肪酸分子经由接头的附接
[0354]
脂肪酸分子附接到本文中的肽可以直接或间接(即经由接头或间隔子)进行。
[0355]
在本公开文本的一个实施方案中，提供了一种gip肽类似物，其通过附接一个脂肪酸分子而被修饰，其中所述脂肪酸分子经由接头附接到氨基酸残基上。
[0356]
在一个实施方案中，根据本公开文本的脂肪酸分子经由接头或间隔子附接到氨基酸残基上，如式iii中所描绘的：
[0357][0358]
在一个实施方案中，脂肪酸分子经由接头以使所述脂肪酸分子的羧基与所述接头的氨基形成酰胺键的方式附接到氨基酸残基上。
[0359]
在一些实施方案中，所述接头包含一个或多个部分，所述一个或多个部分独立地选自：
[0360]
a.一个或多个α,ω-氨基酸，
[0361]
b.一个或多个选自琥珀酸、lys、glu、asp的氨基酸，
[0362]
c.4-abu，
[0363]
d.y-氨基丁酸
[0364]
e.二肽，如如下二肽，其中c末端氨基酸残基是lys、his或trp，优选lys，并且其中n末端氨基酸残基选自ala、arg、asp、asn、gly、glu、gln、ile、leu、val、phe和pro，如gly-lys，
[0365]
f.γ-氨基丁酰基(γ-氨基丁酸)、γ-谷氨酰基(γ-谷氨酸)、β-天冬酰胺酰基、β-丙氨酰基和甘氨酰基中的一个或多个，以及
[0366]
g.γ-谷氨酸-[8-氨基-3,6-二氧杂辛酸]n(γglu-aeeacn)，其中n是在1与50之间的整数，如在1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50之间的整数。
[0367]
在一些实施方案中，所述接头包含一个或多个部分，所述一个或多个部分独立地选自：
[0368]
a.α-氨基酸、γ-氨基酸或ω-氨基酸，
[0369]
b.一个或多个选自琥珀酸、lys、glu、asp的氨基酸，
[0370]
c.一个或多个选自gly和ser的氨基酸，
[0371]
d.一个或多个选自ala、glu、lys和leu的氨基酸，
[0372]
e.γ-氨基丁酰基(γ-氨基丁酸)、γ-glu(γ-谷氨酸)、β-asp(β-天冬酰胺酰基)、β-ala(β-丙氨酰基)、2-氨基异丁酸(aib)和gly中的一种或多种，以及
[0373]
f.[8-氨基-3,6-二氧杂辛酸]n(aeeacn)，其中n是在1与50之间的整数，如在1-4、1-3或1-2之间的整数。
[0374]
在一个实施方案中，所述接头包含γ-glu、一个或多个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(aeeac)或其组合。
[0397]
viii.[15-羧基-十五酰基]-y-glu-aeeac-[0398]
ix.[15-羧基-十五酰基]-y-glu-aeeac-aeeac-[0399]
x.[15-羧基-十五酰基]-y-glu-aeeac-aeeac-aeeac-[0400]
xi.十八酰基-y-glu-[0401]
xii.十八酰基-y-glu-y-glu-[0402]
xiii.十八酰基-y-glu-aeeac-[0403]
xiv.十八酰基-y-glu-aeeac-aeeac-[0404]
xv.十八酰基-y-glu-aeeac-aeeac-aeeac-[0405]
xvi.[17-羧基-十七酰基]-y-glu-[0406]
xvii.[17-羧基-十七酰基]-y-glu-y-glu-[0407]
xviii.[17-羧基-十七酰基]-y-glu-aeeac-[0408]
xix.[17-羧基-十七酰基]-y-glu-aeeac-aeeac-[0409]
xx.[17-羧基-十七酰基]-y-glu-aeeac-aeeac-aeeac-[0410]
xxi.二十酰基-y-glu-[0411]
xxii.二十酰基-y-glu-y-glu-[0412]
xxiii.二十酰基-y-glu-aeeac-[0413]
xxiv.二十酰基-y-glu-aeeac-aeeac-[0414]
xxv.二十酰基-y-glu-aeeac-aeeac-aeeac-[0415]
xxvi.[19-羧基-十九酰基]-y-glu-[0416]
xxvii.[19-羧基-十九酰基]-y-glu-γ-glu-[0417]
xxviii.[19-羧基-十九酰基]-γ-glu-aeeac-[0418]
xxix.[19-羧基-十九酰基]-γ-glu-aeeac-aeeac-[0419]
xxx.[19-羧基-十九酰基]-γ-glu-aeeac-aeeac-aeeac-。
[0420]
在本公开文本的一个实施方案中，脂肪酸分子经由接头附接到氨基酸残基上，并且其中接头与脂肪酸的组合选自：
[0421]
i.[15-羧基十五酰基]-yglu
[0422]
ii.[17-羧基-十七酰基]-γ-glu-aeeac-aeeac-，以及
[0423]
iii.[17-羧基-十七酰基]-yglu-yglu。
[0424]
具有脂肪酸的gip肽
[0425]
在本公开文的一个实施方案中，提供了如本文定义的gip肽类似物，其中所述gip肽类似物选自：
[0426]
egtfiseysiamekikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:10；gip(3-30) cex(31-39)[d9e；d15e；h18k；n24e]，
[0427]
egtfiseysaibanleekikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:71；gip(3-30) cex(31-39)[d9e；i12aib；m14nle；d15e；h18k；n24e]，
[0428]
egtfiseysiaibmekikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:33；gip(3-30) cex(31-39)[d9e；a13aib；d15e；h18k；n24e]，
[0429]
egtfisdysiamdkikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:47；gip(3-30) cex(31-39)[h18k；n24e]，
id no:25；gip(3-30) cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0449]
xgtfiseysiaibnleekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:26；gip(3-30)-cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；a13aib；m14nle；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0450]
xgtfiseysialekikqqefvewllaqkpssgappps-oh-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:27；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0451]
xgtfiseysiaibmekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:28；gip(3-30-cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；a13aib；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0452]
egtfiseysiaibmekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:29；gip(3-30)-cex(31-39)[d9e；a13aib；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0453]
egtfiseysiamekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:9；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0454]
egtfiseysiaibldkikqqdfvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:30；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；h18k；n24e]，
[0455]
xgtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:25；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0456]
egtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:18；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0457]
xgtfisdysiaibmdkikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:32；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；a13aib；h18k；n24e]，
[0458]
egtfiseysiaibmekikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:33；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；d15e；h18k；n24e]，
[0459]
xgtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:25；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0460]
egtfiseysialekikqqefvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:21；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；m14l；d15e；h18k；n24e]，
[0461]
egtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-(gggs-c16-二酸/18k)；seq id no:18；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0462]
egtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-(alea-c16-二酸/18k)；seq id no:18；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0463]
egtfisdyskamdkihqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/12k；seq id no:36；gip(3-30)cex(31-39)[i12k；n24e]，
[0464]
egtfisdysikmdkihqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/13k；seq id no:37；gip(3-30)cex(31-39)[a13k；n24e]，
[0465]
egtfisdysiamdkihqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/16k；seq id no:38；gip(3-30)cex(31-39)[n24e]，
[0466]
egtfisdysiamdkkhqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/17k；seq id no:39；gip(3-30)cex(31-39)[i17k；n24e]，
[0467]
egtfisdysiamdkihqqdfvewllaqkpsskappps c16-二酸/34k；seq id no:40；gip
(3-30)cex(31-39)[n24e；34k]，
[0468]
egtfisdysiamdkihqqdfvewllaqkpssgapppsk-c16-二酸/40k；seq id no:41；gip(3-30)cex(31-39)[n24e；40k]，
[0469]
egtfisdyaiamdkikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:43；gip(3-30)cex(31-39)[s11a；h18k；n24e]，
[0470]
egtfisdysiamdkikqqdfvewllaqk-c16-二酸/18k；seq id no:46；gip(3-30)[h18k；n24e]，
[0471]
egtfisdysiamdkikqqdfvewllaqkpssgappps-c20-二酸/18k；seq id no:47；gip(3-30)cex(31-39)-oh[h18k；n24e]，
[0472]
egtfisdysiamdkikqqdfvewllaqkpssgappps-c16/18k；seq id no:47；gip(3-30)cex(31-39)[h18k；n24e]，
[0473]
egtfiseysiaiblekikqqdfvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:50；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；n24e]，
[0474]
xgtfiseysiaibnleekikqqefvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k)；seq id no:26；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；d9e；a13aib；m14nle；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0475]
egtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-(aib-c16-二酸/18k)；seq id no:18；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0476]
egtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-(kaaaekaaaekaaae-c16-二酸/18k)；seq id no:18；gip(3-30)cex(31-39)[d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0477]
xgtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:48；gip(3-30)cex(31-39)[e3琥珀酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0478]
xgtfiseysiaiblekikqqefvewllaqkpssgappps-2xaeeac yglu-c18-二酸/18k；seq id no:49；gip(3-30)cex(31-39)[e3己二酸；d9e；a13aib；m14l；d15e；h18k；d21e；n24e]，
[0479]
egtfisdysiaibmdkikqqdfvnwllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:52；gip(3-30)cex(31-39)[a13aib；h18k]，
[0480]
xgtfisdysiamdkikqqdfvewllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:53；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；h18k；n24e]，和
[0481]
xgtfisdysiaibmdkikqqdfvnwllaqkpssgappps-c16-二酸/18k；seq id no:54；gip(3-30)cex(31-39)[e3戊二酸；a13aib；h18k]，
[0482]
或其功能性变体，
[0483]
其中所述脂肪酸直接或通过如本文定义的接头附接。
[0484]
因此，c16是脂肪酸ch3(ch2)
14
co-(棕榈酰基)并且c18是脂肪酸ch3(ch2)
16
co-(硬脂酰基)。后缀
“‑
二酸”意指所述脂肪酸分子是二酰基脂肪酸分子。没有这样的后缀是指单酰基脂肪酸分子。
[0485]
因此c20是脂肪酸ch3(ch2)
18
co-(花生基)。后缀
“‑
二酸”意指所述脂肪酸分子是二酰基脂肪酸分子。没有这样的后缀是指单酰基脂肪酸分子。
[0486]
因此，c22是脂肪酸ch3(ch2)
20
co-(山嵛基)。后缀
“‑
二酸”意指所述脂肪酸分子是二酰基脂肪酸分子。没有这样的后缀是指单酰基脂肪酸分子。
[0487]
确定拮抗剂特性和亲和力
[0488]
为了确定肽是否是gipr的拮抗剂，可以采用本领域已知的方法，例如通过确定所述肽的ic50。这可以通过构建剂量反应曲线并检查不同浓度的肽对逆转激动剂活性的作用来完成。所述激动剂可以是gip1-42，例如hgip-1-42或hgip1-30。所述gipr可以是hgipr、rgipr、mgipr、犬gipr、猪gipr或恒河猴(macaca mulatta)gipr。可以通过确定抑制激动剂的最大生物学反应的一半所需的浓度来计算给定拮抗剂的ic50值。实施例4中描述了确定肽是否为拮抗剂的方法，但是也可以使用本领域已知的其他方法。例如，可以对gip衍生肽的浓度渐增的hgip1-42 camp剂量反应曲线进行schild绘图分析。通过这种方式，也可以确定拮抗剂活性的类型。
[0489]
本公开文本的gip肽类似物的特征在于对gipr具有拮抗活性。具体地，本公开文本的gip肽类似物是gipr的强效拮抗剂。
[0490]
在本公开文本的一个实施方案中，所述gip肽类似物抑制至少80％，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如约100％的gipr活性，如经由确定细胞内camp的减少的测定测量的，如经由cisbio camp测定(替代方案1)和/或经由“gaddum”测定(替代方案2)测量的，所述测定描述于“材料和方法”中。
[0491]
在本公开文本的一个实施方案中，所述gip肽类似物抑制至少80％，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如约100％的gipr活性，其中gipr活性的抑制确定为细胞内camp的减少，如经由确定细胞内camp的减少的测定测量的，如经由cisbio camp测定(替代方案1)和/或经由“gaddum”测定(替代方案2)测量的，所述测定描述于“材料和方法”中。抑制％是emax的抑制％，其意指如果肽抑制85％的emax，则gipr剩余15％的活性。
[0492]
在本公开文本的一个实施方案中，所述gip肽类似物具有对应于小于50nm的ic50值，如小于10nm的ic50值、如小于5nm的ic50值、如小于1nm的ic50值、如0.001nm至1nm之间的ic50值的gipr拮抗效力，其中拮抗活性(也称为“效力”)是经由确定细胞内camp减少的测定测量的，如经由cisbio camp测定和/或经由“gaddum”测定测量的，所述测定描述于“材料和方法”中。
[0493]
用于确定化合物(如gip肽类似物)的拮抗活性的方法是本领域技术人员已知的。可用于确定化合物(如gip肽类似物)的拮抗活性的示例性方法可以在本文中的“实施例”中找到，例如，这些方法包括测量细胞内camp以及确定由于用gip肽类似物处理细胞引起的细胞内camp的减少。
[0494]
本公开文本的gip肽类似物的特征还在于对gipr具有低或无激动活性。对gipr具有低或无激动活性(如20％或更少、优选10％或更少、甚至更优选5％或更少的激动活性)的gip肽类似物也称为“沉默拮抗剂”。
[0495]
在一个实施方案中，本公开文本的gip肽类似物能够刺激至多30％，如至多25％、如至多20％、如至多15％、如至多10％、如至多5％的gipr活性，在一个实施方案中，本公开文本的gip肽类似物对gipr没有激动活性，即它刺激约0％的gipr活性。
[0496]
可以以与拮抗活性相同的方式确定gip肽类似物对gipr的激动活性，但是测量细胞内camp的增加而不是减少，如“材料和方法”中所述。
[0497]
治疗方法
[0498]
在一方面还提供了如本文定义的gip肽类似物或包含所述gip肽类似物的组合物，其用作药剂。
[0499]
在一个实施方案中，提供了一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物，其由氨基酸序列seq id no:1组成：
[0500][0501]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0502]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:1的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代，
[0503]
其中seq id no:1或其功能性变体的第24位n被e取代和/或其中seq id no:1或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代，
[0504]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽或被省略，并且
[0505]
其中所述肽通过在seq id no 1或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用作药剂。
[0506]
在一个实施方案中，提供了选自以下的gip类似物：
[0507][0508][0509]
(seq id no:2)、
[0510][0511]
(seq id no:3)、以及
[0512][0513]
(seq id no:4)，
[0514]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0515]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:2(第24位的e除外)；seq id no:3(第13位的aib除外)；和seq id no:4(第13位的aib和第24位的e除外)的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代；
[0516]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽，并且
[0517]
其中所述肽通过在seq id no:2-4或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用作药剂。
[0518]
在一个实施方案中，提供了一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物，其由氨基酸序列seq id no:1组成：
[0519][0520]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0521]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:1的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代，
[0522]
其中seq id no:1或其功能性变体的第24位n被e取代和/或其中seq id no:1或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代，
[0523]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽或被省略，并且
[0524]
其中所述肽通过在seq id no:1或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用于抑制或减少以下中的一项或多项的方法中：i)gip诱导的胰高血糖素分泌，ii)gip诱导的胰岛素分泌，iii)gip诱导的生长抑素分泌，iv)gip诱导的葡萄糖摄取，v)gip诱导的脂肪酸合成和/或脂肪酸掺入，vi)高或增加的gipr表达或活性，vii)餐后gip释放，viii)游离脂肪酸和/或甘油三酯的血清水平，ix)gip诱导的食欲增加，x)gip诱导的能量消耗降低，xi)gip诱导的肠道营养吸收增加，xii)gip诱导的glp-1的食欲抑制作用的降低，xiii)gip诱导的瘦素抵抗。
[0525]
在一个实施方案中，提供了选自以下的gip类似物：
[0526][0527]
(seq id no:2)、
[0528][0529]
(seq id no:3)、以及
[0530][0531]
(seq id no:4)，
[0532]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0533]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:2(第24位的e除外)；seq id no:3(第13位的aib除外)；和seq id no:4(第13位的aib和第24位的e除外)的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代；
[0534]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽，并且
[0535]
其中所述肽通过在seq id no:2-4或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用于抑制或减少以下中的一项或多项的方法中：i)gip诱导的胰高血糖素分泌，ii)gip诱导的胰岛素分泌，iii)gip诱导的生长抑素分泌，iv)gip诱导的葡萄糖摄取，v)gip诱导的脂肪酸合成和/或脂肪酸掺入，vi)高或增加的gipr表达或活性，vii)餐后gip释放，viii)游离脂肪酸和/或甘油三酯的血清水平，ix)gip诱导的食欲增加，x)gip诱导的能量消耗降低，xi)gip诱导的肠道营养吸收增加，xii)gip诱导的glp-1的食欲抑制作用的降低，xiii)gip诱导的瘦素抵抗。
[0536]
在一个实施方案中，提供了一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物，其由氨基酸序列seq id no:1组成：
[0537][0538][0539]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0540]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:1的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代，
[0541]
其中seq id no:1或其功能性变体的第24位n被e取代和/或其中seq id no:1或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代，
[0542]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽或被省略，并且
[0543]
其中所述肽通过在seq id no:1或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用于治疗选自以下的病症的方法中：代谢综合征、肥胖症、前驱糖尿病、i型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、空腹血糖升高、高血糖症、空腹血清甘油三酯水平升高、极低密度脂蛋白(vldl)水平低、高密度脂蛋白(hdl)水平低、血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇水平高、脂质异常沉积、心血管疾病、血压升高和动脉粥样硬化。
[0544]
在一个实施方案中，提供了选自以下的gip类似物：
[0545][0546]
(seq id no:2)、
[0547][0548]
(seq id no:3)、以及
[0549][0550]
(seq id no:4)，
[0551]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0552]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:2(第24位的e除外)；seq id no:3(第13位的aib除外)；和seq id no:4(第13位的aib和第24位的e除外)的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代；
[0553]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽，并且
[0554]
其中所述肽通过在seq id no:2-4或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用于治疗选自以下的病症的方法中：代谢综合征、肥胖症、前驱糖尿病、i型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、空腹血糖升高、高血糖症、空腹血清甘油三酯水平升高、极低密度脂蛋白(vldl)水平低、高密度脂蛋白(hdl)水平低、血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇水平高、脂质异常沉积、心血管疾病、血压升高和动脉粥样硬化。
[0555]
在一个实施方案中，提供了一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)类似物，其由氨基酸序列seq id no:1组成：
[0556][0557]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0558]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:1的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代，
[0559]
其中seq id no:1或其功能性变体的第24位n被e取代和/或其中seq id no:1或其功能性变体的第13位a被2-氨基异丁酸(aib)取代，
[0560]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽或被省略，并且
[0561]
其中所述肽通过在seq id no 1或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用于制造用于以下的药剂：
[0562]-治疗选自以下的病症：代谢综合征、肥胖症、前驱糖尿病、i型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、空腹血糖升高、高血糖症、空腹血清甘油三酯水平升高、极低密度脂蛋白(vldl)水平低、高密度脂蛋白(hdl)水平低、血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇水平高、脂质异常沉积、心血管疾病、血压升高和动脉粥样硬化，或者
[0563]-诱导体重减轻。
[0564]
在一个实施方案中，提供了选自以下的gip类似物：
[0565][0566]
(seq id no:2)、
[0567][0568]
(seq id no:3)、以及
[0569][0570]
(seq id no:4)，
[0571]
其中x1是任何氨基酸或被省略；
[0572]
或其功能性变体，其中所述变体在seq id no:2(第24位的e除外)；seq id no:3(第13位的aib除外)；和seq id no:4(第13位的aib和第24位的e除外)的任何氨基酸处具有1至8个单独的氨基酸取代；
[0573]
其中z是包含激动肽-4(31-39)(pssgappps；seq id no:67；ce31-39)的c末端的一个或多个氨基酸残基的肽，并且
[0574]
其中所述肽通过seq id no 2-4或其所述功能性变体的任何位置处的一个氨基酸残基处或z seq id no:67；ce31-39的任何位置处的一个氨基酸残基处附接一个脂肪酸分子而被修饰，其用于制造用于以下的药剂：
[0575]-治疗选自以下的病症：代谢综合征、肥胖症、前驱糖尿病、i型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、空腹血糖升高、高血糖症、空腹血清甘油三酯水平升高、极低密度脂蛋白(vldl)水平低、高密度脂蛋白(hdl)水平低、血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇水平高、脂质异常沉积、心血管疾病、血压升高和动脉粥样硬化，或者
[0576]-诱导体重减轻。
[0577]
在一个特定的实施方案中，提供了一种如本文定义的gip肽类似物，其用于治疗肥胖症的方法中。
[0578]
在一个特定的实施方案中，提供了一种如本文定义的gip肽类似物，其用于治疗糖尿病(包括i型和ii型糖尿病)的方法中。
[0579]
在一个特定的实施方案中，提供了一种如本文定义的gip肽类似物，其用于治疗胰岛素抵抗的方法中。
[0580]
肥胖症相关障碍可以是以下中的任一种：食物摄入增加、食欲增加、暴饮暴食、神经性贪食、由抗精神病药或类固醇的施用引起的肥胖症、胃动力降低/增加、胃排空延迟/增加、身体活动能力下降、骨关节炎、血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇水平高、和脂质异常沉积。
[0581]
在一些实施方案中，血脂异常、低密度脂蛋白(ldl)升高/降低、胆固醇、和脂质异常沉积被称为脂肪酸代谢障碍。
[0582]
糖尿病相关障碍可以是以下中的任一种：葡萄糖耐量减低(igt)、从igt进展为2型糖尿病、不需要胰岛素的2型糖尿病进展为需要胰岛素的2型糖尿病、β细胞功能降低、β细胞质量降低、β细胞凋亡增加、葡萄糖对β细胞的敏感性降低。
[0583]
心血管疾病可以是以下中的任一种：冠心病、心肌梗塞、再灌注损伤、中风、脑缺血、左心室肥大、冠状动脉疾病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律失常、心脏心律失常、昏厥、心绞痛、心脏转流(cardiac bypass)和/或支架再闭塞、间歇性跛行(也称为动脉粥样硬化闭塞)、舒张功能异常和收缩功能异常及其组合。
[0584]
还提供了一种用于治疗代谢综合征、肥胖症、超重、糖尿病、胰岛素抵抗、如本文定义的肥胖症相关障碍或如本文定义的糖尿病相关障碍的方法；所述方法包括向有需要的个体施用有效量的如本文定义的肽的步骤。
[0585]
本文提及的有需要的个体是可以从根据本公开文本的肽或药物组合物的施用中受益的个体。这样的个体可能患有代谢综合征，和/或患有代谢障碍(如肥胖症、超重、糖尿
病、胰岛素抵抗、如本文定义的肥胖症相关障碍或如本文定义的糖尿病相关障碍)，或具有患上这些的风险。所述个体可以是任何人，男性或女性，婴儿、中年人或老年人。个体的待治疗或预防的障碍可能与以下相关：个体的年龄、个体的总体健康状况、用于治疗个体的药物以及个体是否患有可能诱发或已经诱发代谢综合征和/或代谢障碍(如肥胖症、超重、糖尿病、胰岛素抵抗、如本文定义的肥胖症相关障碍或如本文定义的糖尿病相关障碍)的疾病或障碍的既往史。在一些实施方案中，待治疗的障碍与以下相关联：gip诱导的胰高血糖素分泌、gip诱导的胰岛素分泌、gip诱导的生长抑素分泌、gip诱导的葡萄糖摄取、gip诱导的脂肪酸合成和/或脂肪酸掺入、gipr的高表达或活性、餐后gip的释放；其中术语“高”应解释为是指高于在不需要治疗的个体中观察到的相应水平的水平。
[0586]
制备方法(肽)
[0587]
可以通过本领域已知的任何方法来制备根据本公开文本的肽。因此，可以通过标准的肽制备技术(如溶液合成或merrifield型固相合成)来制备gip衍生肽。
[0588]
在一个实施方案中，本文定义的肽是非天然存在的肽；源自天然存在的天然gip，如gip(1-42)。
[0589]
在一个实施方案中，根据本公开文本的肽是合成制备或生产的。
[0590]
合成生产肽的方法是本领域公知的。可在synthetic peptides:a user's guide(advances in molecular biology),grant g.a.编辑,oxford university press,2002，或者在pharmaceutical formulation:development of peptides and proteins,frokjaer和hovgaard编辑,taylor and francis,1999中找到生产合成肽的详细说明和实践建议。
[0591]
在一个实施方案中，本发明的肽或肽序列是合成产生的，特别是通过序列辅助肽合成(saps)方法、通过溶液合成、通过固相肽合成(spps)如merrifield型固相合成、通过重组技术(由宿主细胞产生，所述宿主细胞包含编码肽的第一核酸序列，所述第一核酸序列与第二核酸可操作地缔合，所述第二核酸能够引导在所述宿主细胞中表达)或酶促合成。这些是技术人员公知的。
[0592]
可以使用9-芴基甲氧羰基(fmoc)或叔丁氧羰基(boc)作为n-a-氨基保护基团和侧链官能团的合适的常见保护基团在全自动肽合成仪上分批合成肽。
[0593]
在如通过反相hplc纯化之后，可以进一步加工肽以获得例如环形或c末端或n末端修饰的异形体。用于环化和末端修饰的方法是本领域公知的。
[0594]
根据本发明的肽可以合成为单体或多聚体(如二聚体或四聚体)。
[0595]
药物组合物和配制品
[0596]
尽管本公开文本的生物活性剂可以作为化学原料(肽)施用，但是有时优选以药物配制品的形式呈递它们。这样的药物配制品可以称为药物组合物、药学上可接受的组合物或药学上安全的组合物。
[0597]
因此，进一步提供一种药物配制品，其包含本发明的生物活性剂、或其药学上可接受的盐或酯，以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。所述药物配制品可以通过常规技术制备，例如在remington:the science and practice of pharmacy 2005,lippincott,williams&wilkins中所述。
[0598]
本发明还意图包括本发明肽化合物的药学上可接受的盐，在它们可被制备的情况
下。这些盐将是在其药物用途的应用中可接受的盐。这意味着所述盐将保留母体化合物的生物活性，并且所述盐在其用于治疗疾病的应用和用途中不会产生不良或有害的影响。
[0599]
以标准方式制备药学上可接受的盐。如果母体化合物是碱，则可以例如在合适的溶剂中用过量的有机酸或无机酸处理它。如果母体化合物是酸，则可以例如在合适的溶剂中用无机碱或有机碱处理它。
[0600]
本文公开的肽化合物可以按有效量以其碱金属盐或碱土金属盐的形式与药学上可接受的载体或稀释剂并行、同时或一起施用，尤其并且优选以其药物组合物形式施用，无论通过口服、直肠或肠胃外(包括皮下)途径。
[0601]
例如，用于本发明的药物组合物的药学上可接受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)以及有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸、对甲苯磺酸和芳基磺酸)的酸加成盐。
[0602]
在特定的实施方案中，将根据本公开文本的肽配制为乙酸盐、cl-(盐酸)盐或na (钠)盐。
[0603]
在本发明的某些实施方案(例如液体组合物)中，所述组合物在至少4天的使用中是稳定的，例如在物理上稳定。在进一步的实施方案中，所述组合物在至少2周的使用和至少6个月的储存中是稳定的。在仍进一步的实施方案中，所述组合物在至少2周的使用和至少一年的储存中是稳定的。在甚至进一步的实施方案中，所述组合物在至少4周的使用和至少2年的储存中是稳定的。
[0604]
在这方面，用于本段的目的的术语“使用”是指出于将药物组合物用于治疗目的的目的而将所述组合物从储存中取出，并且从而使其经历环境条件(光、暗、温度、搅动等的条件)，而用于本段的目的的术语“储存”是指在不超过约5摄氏度的温度下在冰箱或冷冻器中在非搅动条件下储存。技术人员将理解这些药物组合物可能经历的使用和储存条件的典型范围。
[0605]
施用和剂量
[0606]
根据本公开文本，将本文定义的肽或包含本文定义的肽的组合物以药学有效剂量或治疗有效量施用至需要治疗的个体。剂量要求将随所用的特定药物组合物、施用途径和正在治疗的特定受试者而变化，这取决于障碍的严重程度和种类以及受试者的体重和一般状况。本领域技术人员还将认识到，肽化合物的单独剂量的最佳量和间隔将取决于所治疗病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位以及所治疗的特定患者，并且这样的最优条件可以用常规技术来确定。本领域技术人员还应该理解，可使用常规疗程确定测试来确定最佳疗程，即在限定天数内每天给予化合物的剂量数。
[0607]
在一个实施方案中，生物活性剂每天施用至少一次，如每天一次、如每天两次、如每天三次、如每天四次、如每天五次。
[0608]
剂量也可以以间歇性间隔或借此不每天施用剂量的间隔来施用。相反，可以每隔一天、每隔两天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每周、每隔一周、每隔两周、每隔三周、每隔四周、每隔五周或以那些范围内的间隔(如每2至4周或每4至6周)施用一个或多个剂量。
[0609]
在一个实施方案中，剂量每周施用一次，如每周一次，如每周一个剂量。
[0610]
施用途径
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[0671]
实施例
[0672]
本发明实施例支持以下结论：
[0673]
1)根据本公开文本的实施方案的包含取代a13aib和/或n24e的gip肽类似物具有增加的溶解度和/或稳定性，如物理稳定性。
[0674]
2)某些位点处的单独氨基酸取代，如第13位的aib，导致对gip受体的改善的拮抗作用。
[0675]
3)几个酰化位点对具有取代a13aib和/或n24e的gip(3-30) z显示出巨大的潜力，如第18位。
[0676]
材料和方法
[0677]
wo 2016/034186披露了gip(3-30)肽本身的产生和作用。
[0678]
材料
[0679]
人gip(1-42)购自phoenix pharmaceuticals inc.，而其余gip肽类似物则由以下合成：caslo
tm
(灵比，丹麦)和almac group(克雷加文，英国)、peptides&elephants gmbh(汉宁斯多夫，德国)和wuxi apptec，中国。人gip受体的cdna购自origene(罗克维尔，马里兰州，美国(sc110906))，并且克隆到pcmv-script载体中。
[0680]
转染和细胞培养
[0681]
在10％co2和37℃下在补充有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、180单位/ml青霉素和45g/ml链霉素的杜尔贝科氏改良伊格培养基1885中培养cos-7细胞。使用磷酸钙沉淀法通过添加氯喹进行cos-7细胞的瞬时转染以供camp积累
46-47
。
[0682]
在10％co2和37℃下在补充有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、180单位/ml青霉素和45g/ml链霉素的杜尔贝科氏改良伊格培养基中培养hek293细胞。通过使用lipofectamine2000进行表2c中的用于cisbio测定的使用hgipr的瞬时转染。
[0683]
camp测定
[0684]
替代方案1(也称为cisbio测定)：
[0685]
还可以在瞬时表达人gip受体的hek-293细胞中确定化合物对所述受体的体外功能活性。在测定当天，将细胞重悬在补充有20mm hepes(gibco，15630-106)、0,1％pluronic f-68(gibco，24040-032)和0,1％酪蛋白(sigma，c4765)的hbss缓冲液(gibco，14025-50)中，并且以5000个细胞/孔的密度在384孔板中铺板。将本公开文本的gip肽类似物在补充有20mm hepes、0,1％pluronic、0,1％酪蛋白和500um ibmx的hbss缓冲液中稀释。为了测试拮抗特性，将待测试的gip肽类似物各自独立地添加到细胞并且在37℃下孵育20min，然后以ec50浓度添加激动剂(gip1-42)并且随后在37℃下孵育30min。使用cisbio camp dynamic 2htrf测定试剂盒定量确定所得的细胞内camp的减少。所述测定基于细胞产生的天然camp与用染料d2标记的camp之间竞争与穴醚络合物(cryptate)标记的抗体结合。特定信号(即能量传递信号)与样品中camp的浓度成反比。
[0686]
根据制造商的方案，将camp-d2缀合物和抗体抗camp-穴醚络合物(均在试剂盒中提供的裂解缓冲液中稀释)添加到细胞。将所得的竞争性测定在室温下孵育60分钟，并且通过使用perkinelmer仪器用在320nm下的激发以及在665nm和620nm下的发射来检测信号。htrf比率(在665nm/620nm下的发射*10,000)与存在的camp的量成反比，并且使用camp标准曲线将所述htrf比率转换为nm camp/孔。在graphpad prism中使用非线性回归分析(四逻辑参数方程)拟合剂量反应曲线，从而估计pic50值。
[0687]
为了测试对gip受体的激动特性，如上所述将化合物稀释并且添加到细胞，并且在37℃下孵育30min。如上所述，使用cisbio camp dynamic 2htrf测定试剂盒确定所得的细胞内camp的增加。
[0688]
在graphpad prism中使用非线性回归分析(四逻辑参数方程)拟合剂量反应曲线，从而估计pic50值。
[0689]
替代方案2(也称为gaddum测定)：
[0690]
在功能设置中估计拮抗剂效力(pkb)。估计的pkb值是使用gaddum方程(pkb＝log(dr-1)-log(b))在存在单剂量gip肽拮抗剂的情况下从激动剂-浓度-反应曲线的变化来计
算的，其中dr(ec50'/ec50)是由在存在和不存在拮抗剂的(ec50)的情况下获得的gip1-42的ec50计算的剂量比率，并且b是使用的拮抗剂浓度。
[0691]
在瞬时表达人gip受体的hek-293细胞中确定化合物对所述受体的体外功能评估。在测定当天，将细胞重悬在补充有20mm hepes(gibco，15630-106)、0,1％pluronic f-68(gibco，24040-032)和0,1％酪蛋白(sigma，c4765)的hbss缓冲液(gibco，14025-50)中，并且以3500个细胞/孔的密度在384孔板中铺板。将本公开文本的gip肽类似物在补充有20mm hepes、0,1％pluronic、0,1％酪蛋白和500um ibmx的hbss缓冲液中稀释。将待测试的gip肽类似物以3.16nm(对于化合物at705-at718)、31,6nm(对于化合物at719-at725和at745-at755)以及100nm(对于化合物at739-at744)的浓度各自独立地添加到细胞，并且在37℃下孵育20min。随后将渐增剂量的激动剂(gip1-42)添加到细胞，并且在37℃下再孵育30min。使用cisbio camp dynamic 2htrf测定试剂盒定量确定细胞内camp。所述测定基于细胞产生的天然camp与用染料d2标记的camp之间竞争与穴醚络合物标记的抗体结合。特定信号(即能量传递信号)与样品中camp的浓度成反比。
[0692]
根据制造商的方案，将camp-d2缀合物和抗体抗camp-穴醚络合物(均在试剂盒中提供的裂解缓冲液中稀释)添加到细胞。将所得的竞争性测定在室温下孵育60分钟，并且通过使用perkinelmer仪器用在320nm下的激发以及在665nm和620nm下的发射来检测信号。htrf比率(在665nm/620nm下的发射*10,000)与存在的camp的量成反比，并且使用camp标准曲线将所述htrf比率转换为nm camp/孔。
[0693]
替代方案3(也称为schild分析)：
[0694]
也通过schild分析确定拮抗剂效力。在不存在拮抗剂的情况下测量gip1-42 ec50，并且在存在渐增浓度的拮抗剂的情况下测量ec50'。将这些值用于计算每个拮抗剂浓度的剂量比率(dr＝ec50'/ec50)，并且将log(dr-1)针对log(拮抗剂浓度)绘图。所得线的斜率固定为1，并且pkb确定为横坐标的截距。
[0695]
在瞬时表达人gip受体的hek-293细胞中确定化合物对所述受体的体外功能评估。在测定当天，将细胞重悬在补充有20mm hepes(gibco，15630-106)、0,1％pluronic f-68(gibco，24040-032)和0,1％酪蛋白(sigma，c4765)的hbss缓冲液(gibco，14025-50)中，并且以3500个细胞/孔的密度在384孔板中铺板。将本公开文本的gip肽类似物在补充有20mm hepes、0,1％pluronic、0,1％酪蛋白和500um ibmx的hbss缓冲液中稀释。在37℃下孵育20min后，将待测试的gip肽类似物以10、100和1000nm(对于gip3-30、at759)的浓度；以3.16、31.6和316nm(对于at158、at364、at760、at761)的浓度；以1、10和100nm(对于化合物at762和at763)的浓度以及以31.6、316和3160nm(对于at758)的浓度各自独立地添加到细胞。随后将渐增剂量的激动剂(gip1-42)添加到细胞，并且在37℃下再孵育30min。使用cisbio camp dynamic 2htrf测定试剂盒定量确定细胞内camp。所述测定基于细胞产生的天然camp与用染料d2标记的camp之间竞争与穴醚络合物标记的抗体结合。特定信号(即能量传递信号)与样品中camp的浓度成反比。
[0696]
根据制造商的方案，将camp-d2缀合物和抗体抗camp-穴醚络合物(均在试剂盒中提供的裂解缓冲液中稀释)添加到细胞。将所得的竞争性测定在室温下孵育60分钟，并且通过使用perkinelmer仪器用在320nm下的激发以及在665nm和620nm下的发射来检测信号。htrf比率(在665nm/620nm下的发射*10,000)与存在的camp的量成反比，并且使用
camp标准曲线将所述htrf比率转换为nm camp/孔。在graphpad prism中使用非线性回归分析(四逻辑参数方程)拟合剂量反应曲线，从而估计pic50值。
[0697]
还在功能上评估gip肽类似物，其中使用与上述相同的测定(但有一些修改)确定效力。在用gipr稳定转染的cho细胞中测量功能评估。将细胞重新悬浮在含有5mm hepes、0.1％酪蛋白和500um ibmx的hbss缓冲液中。将渐增剂量的待测试的gip类似物各自独立地添加到细胞，并且在37℃下孵育20min，然后以ec50-ec80浓度添加激动剂(gip1-42)，随后在37℃下孵育30min。如上节所述，对所得的camp的减少进行定量。
[0698]
表1：gip肽类似物的名称和结构，包括一些参考肽用于比较。当接头由多于一个单元组成时，意图使第一个命名的单元与肽连接，并且使最后一个命名的单元与脂肪酸连接：
[0699]
[0700]
[0701]
[0702][0703]
表2a：参考gip肽的拮抗作用。cisbio测定(以上替代方案1)用于确定表2a中列出的gip肽类似物的拮抗作用：
[0704][0705]
表2b：gip肽类似物的拮抗作用，包括一些参考肽。cisbio测定(以上替代方案1)用于确定表2b中列出的gip肽类似物的拮抗作用：
[0706]
[0707][0708]
表2c：gip肽类似物和一些用于比较的参考肽的拮抗作用。gaddum测定(以上替代方案2)用于确定表2c中列出的gip肽类似物的拮抗作用：
[0709][0710][0711]
表2d
[0712][0713]
结果
[0714]
从表2b和表2c可以看出，gip肽类似物中的a13aib取代可能增加对gip受体的拮抗作用。
[0715]
溶解度和物理稳定性
[0716]
物理稳定性的评估
[0717]
使用淀粉样蛋白特异性染料硫磺素t(tht)检测呈原纤维形成形式的聚集，所述染料经常用于证明溶液中原纤维的存在。
[0718]
tht在约527nm处发出微弱的荧光，但是在与富含β折叠的结构结合后展示发射光谱中至约486nm的红移以及发射光强度的增加。486nm处的荧光发射的连续测量可用作肽和蛋白质的原纤化行为的量度。此处通过将延迟时间(t延迟)定义为相对于过渡前基线的信号达到过渡后基线的10％的时间点来估计直到原纤化开始的时间或原纤化延迟时间。
[0719]
化学品：
[0720]
磷酸氢二钠(na2hpo4无水，sigma，批号：slbl9126v)磷酸二氢钠(nah2po4，无水，sigma，批号：slbp1516v)
[0721]
用于溶解一些样品的50mm磷酸钠缓冲液在电阻率为18.2mω
·
cm的超纯水(reference a system，merck)中制备。将缓冲液调节至ph 7.4并且过滤。
[0722]
在样品制备前，将用于溶解一些样品的超纯水(milliq)用naoh调节至ph 7.4并且过滤。
[0723]
样品制备
[0724]
将肽溶解在磷酸钠缓冲液(50mm，ph 7.4，过滤的)中或溶解在超纯(milliq)水(用naoh调节至ph 7.4，过滤的)中(参见表3)。将所有肽样品制备成浓度为1、5、7.5或15mg/ml。所有样品(参考肽gip(3-30)、at158和at482除外)均容易溶解，并且在温和混合的情况下产生澄清且无色的溶液。随后将肽样品通过0.22μm尼龙过滤器(rr注射式过滤器，13mm，frisenette，丹麦)过滤以产生无颗粒溶液。在t＝0时，将所有样品添加到96孔板读取器中进行tht测定。
[0725]
对于每个样品，将22μl tht(1mm)添加到1.2ml肽溶液中。从此样品混合物中，将200ul/孔的量移液到四个或五个孔中(n＝4或5)。还包括空白样品(缓冲液 tht)。将一个3mm的二氧化硅珠添加到每个含有样品的孔中，并且使板经历在300rpm下的定轨旋转以搅动样品并且对样品施加压力。在整个测量过程中，将温度保持在25℃。
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板读取器设置：
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激发波长：450nm
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分色滤光器：465nm
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发射波长：486nm
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焦高：3.5mm
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增益：1000
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循环次数：960
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循环时间：360s
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每孔闪光次数：20
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结果
[0736]
结果概述可以参见表3。此外，图1示出了不形成原纤维的高稳定性gip肽类似物(磷酸盐缓冲液中的at763-图1b)与形成原纤维的物理稳定性较低的参考gip类似物(磷酸盐缓冲液中的at364-图1a)之间的比较。
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从表3中可以看出，gip肽类似物中的a13aib和/或n24e取代增加了gip肽类似物的物理稳定性，如通过tht测定中降低的原纤维形成趋势来测量的。参见例如at760相比于at364、at762相比于at677、以及at763相比于at677。根据本发明的实施方案的gip肽类似物在96小时测量时间的过程中显示吸光度强度没有增加，表明样品没有原纤化并且肽在水溶液中是物理稳定的。参见例如at673、at695和at696相比于at364，以及例如at749相比于at158和at719。还参见at677相比于at717和at755。
[0738]
从表3还可以看出，脂肪酸可以附接在不同的位置(如12、13、16、17、18、34和40)，并且保留增加的物理稳定性。参见例如at739、at740、at741、at742、at743、at744和at668，它们在96小时内没有原纤化。
[0739]
溶解度的评估
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澄清的视觉外观可以作为肽的即时溶解度的指标。因此可以看出，与gip(3-30)、at158和at482相比，根据本发明的实施方案的所有肽都展示增加的溶解度。因此，a13aib和/或n24e取代似乎增加了溶解度。
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表3：测试的gip肽类似物的溶解度(如通过目视检查测量)和物理稳定性(如通过tht测定中估计的延迟时间测量)。
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fnd＝在搅动的情况下在实验时间(96小时)内未检测到原纤维。
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#大部分肽沉淀并且在过滤期间被捕获在过滤器中。