冻干方法与流程

1.本发明涉及用于冻干细菌产品的方法和设备，所述方法和设备将这个过程中活细胞的损失减到最少，使得那些产品能够以有效且经济的方式冻干。


背景技术：

2.冻干是广泛用于配制药物、生物技术和其他类型产品的方法。它是制备固体产品的有效方法，即使那些产品是指定要以液体形式施用给患者的药物产品。冻干也是生产含有活生物体的制剂或从生物体获得的化学敏感产品的便利途径。
3.虽然有许多商业操作的冻干方法，但这些方法通常牵涉三个阶段，即i)冷冻，ii)初步干燥或升华，iii)二次干燥或解吸。
4.在冷冻阶段和任选地还有升华阶段期间，产品通常在-20℃至-80℃之间冷冻。一旦产品达到目标低温，其暴露的压力就降低，并且施加适量的热量，这导致产品中存在的冷冻水升华。所述冻干方法的这第一步通常引起产品中存在的大部分水被去除。
5.在第三阶段即解吸中，升高温度以去除产品中存在的所有未冷冻的水分子。
6.一般来说，有效操作的冻干方法可用于生产含水量极低(例如低于5％)的产品。
7.在中试规模或工业规模上，冻干通常在冷冻干燥机中进行。冷冻干燥机按常规包括以下部件：a)真空泵，用于降低干燥机中的压力；和b)冷凝器，用于通过冷凝从冷冻干燥机中去除水分。冷冻干燥机之间在待冻干的产品如何布置方面存在差异。
8.在常规用于制备药物或生物技术产品的冷冻干燥机中，待冻干的产品可以散装装载到冷冻干燥机中。在此类布置中，将散装产品放置在托盘中，然后将托盘装载到冷冻干燥机中进行冻干。
9.托盘通常成形为使暴露于冷冻干燥机内部的产品的表面积最大化，以促进水从产品中升华和解吸。
10.虽然这种类型的托盘已经有效地使用了许多年，但是它们的使用并不适用于所有类型产品的制备。
11.已经确定的活生物体冻干的一个问题是冻干方法苛刻并且可引起不可接受的活细胞损失。虽然，对于某些类型的产品，操作者已经试图通过优化冻干周期和/或冻干保护剂配方(如果采用的话)来最小化此类损失，但是此类方法的成功因经历冻干的活细胞的类型而不同。
12.已经证明在没有不可接受的活细胞损失的情况下冻干特别有挑战性的一类活细胞是厌氧细菌，尤其是专性厌氧细菌。这种活力损失的一个潜在原因被认为是冻干设备中存在残余氧并且残余氧在冻干期间与冻干培养基接触。
13.虽然已经考虑清洗传统的冻干设备以使其内部厌氧，但是这样做的实践性具有挑战性，特别是对于商业规模的设备而言，这是由于该设备的内部体积大且复杂。另外，已经发现在冷冻干燥周期开始时经由施加真空来清洗设备在一些情况下会损坏正在经受冻干的产品。
14.因此，本领域仍然需要用于大规模冷冻干燥厌氧细菌，尤其是厌氧细菌的方法，该方法不会引起不可接受的活细胞损失。


技术实现要素：

15.因此，根据本发明的第一方面，提供了一种用于制备冻干产品的方法，其包括以下步骤：
16.在厌氧条件下提供包含厌氧细菌的冻干培养基，
17.在厌氧条件下冷冻所述冻干培养基以获得冷冻的冻干培养基，对所述冷冻的冻干培养基进行升华步骤
18.收集冻干产品。
19.如以上所解释的，冷冻和升华步骤在冷冻干燥方法中是常规的。然而，本发明人现在已经意外地发现，通过在厌氧条件下进行初始冷冻步骤，这使得厌氧细菌细胞对氧诱导的失活不太敏感。这意味着，有利的是，与不在厌氧条件下进行冷冻步骤的相应方法相比，活厌氧细胞的损失减少。这种方法的另一个益处是，减少了操作者将冻干设备中的含氧量降至最低的负担；冷冻干燥机内适度的含氧量是可以耐受的。
20.发明人已经发现并且实例证明，在常规冻干方法之前或作为常规冻干方法的一部分，在厌氧条件下冷冻冻干培养基提供了有效保持冻干培养基中存在的细菌细胞的活力的显著益处。在本发明的实施方案中，作为本发明方法的一部分提供的冻干培养基保持在厌氧条件下，直到冷冻冻干培养基的步骤完成。
具体实施方式
21.用于冻干的厌氧细菌
22.以下实例也证明本发明的方法可用于制备包含专性厌氧细菌的冻干制剂。本领域技术人员将认识到，专性厌氧生物是不具备使有氧生活成为可能的防御并且因此不能在甚至低至适度含氧量的环境中存活的细菌。细菌对氧的耐受性与细菌解除作为有氧呼吸副产物产生的超氧化物和过氧化氢的毒性的能力有关。有氧环境中葡萄糖的同化导致自由基超氧化物化物(o
2-)的最终生成。超氧化物被超氧化物歧化酶还原成氧气和过氧化氢(h2o2)。随后，在该反应中生成的有毒过氧化氢被在需氧菌和兼性厌氧细菌中发现的过氧化氢酶或被在几种耐氧厌氧生物中发现的各种过氧化物酶转化为水和氧。
23.本领域技术人员将认识到，在厌氧生物中，存在许多细菌亚群，其特征在于它们的加工能力，并因此在大气氧的存在下存活。如上所述，兼性厌氧生物和耐氧厌氧生物具有将氧(尽管在一些菌株中，只有相对适度的水平)加工成无毒副产物的分子机制。然而，对于专性厌氧生物来说，这种机制是不存在的，或者只能加工非常低水平的氧。根据本发明的方法，可以冻干任何类型的厌氧细菌。在优选的实施方案中，要在本发明的方法中冻干的细菌是专性厌氧生物。
24.可以根据本发明的方法冻干的耐氧厌氧细菌的实例包括属于链球菌属(streptococcus)、梭菌属(clostridium)和乳杆菌属(lactobacillus)的那些细菌。
25.可以根据本发明的方法冻干的兼性厌氧细菌的实例包括那些属于以下属的那些细菌：
26.·
肠球菌属(enterococcus)(例如鸡肠球菌(enterococcus gallinarum)、酪黄肠球菌(enterococcus caselliflavus)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)或屎肠球菌(enterococcus faecium))，以及
27.·
片球菌属(pediococcus)(例如乳酸片球菌(pediococcus acidilacticii))
28.可以根据本发明的方法冻干的专性厌氧细菌的实例包括那些属于以下属的那些细菌：
29.·
罗斯氏菌属(roseburia)(例如人罗斯氏菌(roseburia hominis)、肠道罗斯氏菌(roseburia intestinalis)或食葡糖罗斯氏菌(roseburia inulinivorans))，
30.·
拟杆菌属(bacteroides)(例如多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、马赛拟杆菌(bacteroides massiliensis)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、卵形拟杆菌(bacteroides ovatus)、普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)、杜雷拟杆菌(bacteroides dorei)、单形拟杆菌(bacteroides uniformis)或粪居拟杆菌(bacteroides copricola))，
31.·
双歧杆菌属(bifidobacterium)(例如短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)或长双歧杆菌(bifidobacterium longum))，
32.·
副拟杆菌属(parabacteroides)(例如狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis)、戈氏副拟杆菌(parabacteroides goldsteinii)、粪副拟杆菌(parabacteroides merdae)或约氏副拟杆菌(parabacteroides johnsonii))，
33.·
真杆菌属(eubacterium)(例如扭曲真杆菌(eubacteriumcontortum)、断链真杆菌(eubacterium fissicatena)、粘液真杆菌(eubacterium limosum)、挑剔真杆菌(eubacterium eligens)、庞大真杆菌(eubacterium hadrum)、霍氏真杆菌(eubacterium hallii)或直肠真杆菌(eubacterium rectale))，
34.·
栖粪杆菌属(faecalibacterium)(例如普氏栖粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii))，
35.·
肥胖症菌属(bariatricus)(例如马氏肥胖症菌(bariatricus massiliensis))，
36.·
巨球形菌属(megasphaera)(例如马赛巨球形菌(megasphaera massiliensis))，
37.·
黄杆菌属(flavonifractor)(例如普氏黄杆菌(flavonifractor plautii))，
38.·
厌氧棍状菌属(anaerotruncus)(例如人结肠厌氧棍状菌(anaerotruncus colihominis))，
39.·
瘤胃球菌属(ruminococcus)(例如扭链瘤胃球菌(ruminococcus torques)、活泼瘤胃球菌(ruminococcus gnavus)或布氏瘤胃球菌(ruminococcus bromii))，
40.·
假黄杆菌属(pseudoflavonifractor)(例如多毛假黄杆菌(pseudoflavonifractor capillosus))，
41.·
梭菌属(例如系结梭菌(clostridium nexile)、海氏梭菌(clostridium hylemonae)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、第三梭菌(clostridium tertium)、双孢梭菌(clostridium disporicum)、双酶梭菌(clostridium bifermentans)、无害梭菌
(clostridium inocuum)、马犹姆贝梭菌(clostridium mayombei)、鲍氏梭菌(clostridium bolteae)、巴氏梭菌(clostridium bartletti)、共生梭菌(clostridium symbiosum)或解黄酮梭菌(clostridium orbiscindens))，
42.·
粪球菌属(coprococcus)(例如陪伴粪球菌(coprococcus comes)或灵巧粪球菌(coprococcus cattus))，
43.·
醋弧菌属(acetivibrio)(例如产乙醇醋弧菌(acetovibrio ethanolgignens))，
44.·
多尔氏菌属(dorea)(例如长链多尔氏菌(dorea longicatena))
45.·
布劳特氏菌属(blautia)(例如产氢营养型布劳特氏菌(blautia hydrogenotrophica)、粪便布劳特氏菌(blautia stercoris)、韦氏布劳特氏菌(blautia wexlerae)或延长布劳特氏菌(blautia producta))，以及
46.·
丹毒荚膜菌属(erysipelatoclostridium)(例如多枝丹毒荚膜菌(erysipelatoclostridium ramosum))。
47.在某些实施方案中，冻干培养基可以包含一种以上的细菌菌株(诸如不同细菌菌株的聚生体)。在此类实施方案中，冻干培养基可以包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种不同的细菌菌株。另外或可替代地，冻干培养基可以包含50种或更少、40种或更少、30种或更少或20种或更少不同的细菌菌株。在某些实施方案中，聚生体仅包含专性厌氧细菌。在某些实施方案中，聚生体仅包含兼性或耐氧厌氧细菌。在某些实施方案中，聚生体包含专性厌氧细菌和兼性或耐氧厌氧细菌两种。
48.在一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于冻干属于以下属的专性厌氧细菌：艾克曼氏菌属(akkermansia)、罗斯氏菌属、拟杆菌属、副拟杆菌属、布劳特氏菌属、巨球形菌属和/或布劳特氏菌属。在一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于冻干属于以下种的专性厌氧细菌：嗜黏蛋白艾克曼氏菌(akkermansia muciniphila)、人罗斯氏菌、拟杆菌属的种、多形拟杆菌、狄氏副拟杆菌、粪便布劳特氏菌、马赛巨球形菌和/或产氢营养型布劳特氏菌。在一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于冻干属于以下种的专性厌氧细菌：嗜黏蛋白艾克曼氏菌、人罗斯氏菌、多形拟杆菌、狄氏副拟杆菌、粪便布劳特氏菌、马赛巨球形菌和/或产氢营养型布劳特氏菌。如实例中所示，根据本发明的方法适合于提供来自嗜黏蛋白艾克曼氏菌、人罗斯氏菌、拟杆菌属的种、多形拟杆菌、狄氏副拟杆菌、粪便布劳特氏菌、马赛巨球形菌和产氢营养型布劳特氏菌的专性厌氧细菌菌株的活冻干产品。
49.本领域技术人员将熟悉用于提供厌氧条件的设备和技术。为了避免任何疑问，如本文所用，术语“厌氧条件”用于意指其中氧水平保持在低于约1000ppm、低于约500ppm、低于约200ppm、低于约100ppm、低于约50ppm、低于约20ppm、低于约10ppm、低于约5ppm、低于约2ppm或低于约1ppm的环境。可以使用美国密苏里州兰辛市plas-labs公司销售的型号为#800-doi的数字氧分析仪来进行环境含氧量的评估。
50.本领域的技术人员也熟悉冻干培养基的典型组成以及它们制备的方法。在本发明的实施方案中，冻干培养基包含浓缩生物质形式的厌氧细菌。在此类实施方案中，生物质可以从收获时(例如从发酵罐中收获)开始储存在厌氧条件下，直到本发明方法中采用的冷冻步骤完成。
萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、焦硫酸盐、焦磷酸盐、丙酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丁酸盐、丙磺酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烯酸盐和二甲苯磺酸盐。
62.填充步骤
63.冷冻冻干培养基的步骤可以在任何类型的设备中进行，只要保持厌氧条件。有利的是，本发明的方法适用于常规的冻干设备。
64.在实施方案中，本发明的方法包括在厌氧条件下将冻干培养基填充到容器中的步骤。该步骤可以在冷冻冻干培养基的步骤之前或之后进行。另外或可替代地，在厌氧条件下将冻干培养基填充到容器中的步骤可以在与冷冻冻干培养基的步骤相同的设备或不同的设备中进行，例如填充步骤可以在填充设备中进行，而冷冻步骤可以在冻干设备中或在单独的冷冻设备中进行。
65.填充冻干培养基的容器可以是托盘，例如传统的开放式托盘或专用托盘，诸如以商标销售的那些托盘。可替代地，在填充步骤中可以采用冻干袋，诸如国际专利申请号pct/ib2018/055246(其内容通过引用并入本文)中公开的冻干袋。
66.在本发明的实施方案中，容器可以是不透氧的，以利于保持其中的厌氧条件。如本文所用，术语“不透氧的”用于标识如使用根据astm d3985操作的库仑传感器测量的透氧率(otr)为约10cc/m2/24小时或更低、约5cc/m2/24小时或更低、约1cc/m2/24小时或更低、约0.5cc/m2/24小时或更低、约0.1cc/m2/24小时或更低、约0.05cc/m2/24小时或更低、约0.01cc/m2/24小时或更低、约0.005cc/m2/24小时或更低或约0.001cc/m2/24小时或更低的容器。在本发明的实施方案中，容器的透氧率(otr)为约1cc/m2/24小时或更低。在本发明的某些实施方案中，容器的透氧率(otr)为约0.1cc/m2/24小时或更低。在本发明的优选实施方案中，容器的透氧率(otr)为约0.01cc/m2/24小时或更低。
67.在此类实施方案中，本发明的方法可以包括在填充步骤之后封闭容器(例如冻干袋)的步骤，以形成不透氧的密封，从而提供不透氧的密封容器。可以通过为容器中包含的开口(例如，填充口)提供封闭件和/或通过密封(例如，热封)部分容器壁来提供密封。在某些实施方案中，不透氧的密封容器是冻干袋。
68.优选地，在此类实施方案中，填充和封闭步骤在冷冻冻干培养基的步骤之前进行。此类方法是有利的，因为它容许冻干培养基的冷冻在厌氧条件下进行，即使其中进行冷冻步骤的设备不在厌氧条件下操作。换句话说，冷冻步骤可以在厌氧条件下在常规冻干设备中进行，冻干设备的内部不需要特殊处理来使其厌氧。i
69.在进行冷冻步骤之前将冻干培养基填充到不透氧的容器中的实施方案中，填充的容器可以在冷冻步骤之前储存。冷冻步骤之前的储存可以在厌氧条件下和/或在0℃至约10℃或约2℃至约8℃的温度下进行。在填充的、不透氧的容器封闭的实施方案中，填充的、不透氧的容器然后可以储存在厌氧条件或非厌氧条件下。
70.可替代地，容器可以是透氧的。在此类实施方案中，填充步骤可以在冷冻冻干培养基的步骤之后进行。这种步骤顺序有利地容许在常规冻干设备中使用常规的透氧容器，而没有不可接受的细菌活力损失，这是因为发现当所述细菌被冷冻时，因暴露氧气的细菌失活显著更低。
71.在替代实施方案中，可以将冻干培养基填充到透氧容器中并将冻干培养基冷冻，全部在厌氧条件下进行。
72.填充步骤期间的厌氧条件可以使用本领域技术人员已知的任何设备或技术来保持。例如，填充步骤可以在厌氧隔离器、室或罩中进行。在此类实施方案中，厌氧隔离器、室或罩可设置有一次性衬垫，诸如国际专利申请号pct/ib2018/054749(其内容通过引用并入本文)中公开的一次性衬垫。
73.在本发明的实施方案中，容器可以在填充之前或填充期间清除氧。
74.冷冻步骤
75.在本发明的冻干方法中，初始冷冻步骤是在厌氧条件下进行的。在厌氧条件下冷冻冻干培养基的步骤可以使用本领域技术人员已知的任何技术或设备进行。例如，冷冻步骤可以在能够在厌氧条件下操作的冻干设备中进行，所述冻干设备可以任选地包括能够在厌氧条件下操作的冷冻设备。
76.在替代布置中，在厌氧条件下冷冻冻干培养基的步骤可以使用冻干设备中不包含的冷冻设备来进行。此类设备可以是冷却反应器(例如低温反应器)或快速冷冻器。
77.在本发明的实施方案中，在提供冻干培养基后，冻干培养基可以保持在厌氧条件下，直到冷冻冻干培养基的步骤完成。
78.在本发明的某些实施方案中，在冷冻冻干培养基的步骤中，冻干培养基可以暴露于约-50℃或更低、约-70℃或更低或约-90℃或更低的温度。在本发明的某些实施方案中，在冷冻冻干培养基的步骤中，冻干培养基可以暴露于约-130℃或更高、约-150℃或更高或约-200℃或更高的温度。例如，在某些实施方案中，在冷冻步骤期间，冻干培养基可以暴露于约-50℃至约-200℃的温度。例如，在某些实施方案中，在冷冻步骤期间，冻干培养基可以暴露于约-70℃至约-150℃的温度。例如，在某些实施方案中，在冷冻步骤期间，冻干培养基可以暴露于约-90℃至约-130℃的温度。在某些实施方案中，冷冻步骤可持续约5分钟或更长时间，约10分钟或更长时间，约20分钟或更长时间，约30分钟或更长时间，约60分钟或更长时间。在某些实施方案中，冷冻步骤可持续约600分钟或更少时间、约300分钟或更少时间、约240分钟或更少时间或约180分钟或更少时间。例如，在某些实施方案中，冷冻步骤可持续约5分钟至约600分钟。例如，在某些实施方案中，冷冻步骤可持续约10分钟至约300分钟。例如，在某些实施方案中，冷冻步骤可持续约20分钟至约240分钟。例如，在某些实施方案中，冷冻步骤可持续约30分钟至约180分钟。此类冷冻步骤可以在冻干设备或单独的冷冻设备中进行。
79.在本发明的实施方案中，冷冻冻干培养基的步骤是快速冷冻步骤。在某些实施方案中，快速冷冻步骤牵涉在冷冻设备，例如液氮冷却的冷冻器中快速冷却冻干培养基(例如冷却至-110℃两小时)。
80.在某些实施方案中，冻干培养基暴露的温度可以在冷冻步骤期间变化。例如，冻干培养基可暴露于第一温度(例如，约20℃、约10℃或约0℃至约-20℃、约-30℃、约-40℃或约-50℃)并在该温度下保持第一时间段(例如，约1分钟、约5分钟或约10分钟至约30分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟)，然后冷却至第二较低温度(例如在前面段落中提出的那些温度)并在该第二温度下保持第二时间段(例如约10分钟、约20分钟、约30分钟或约60分钟至约120分钟、180分钟、240分钟、300分钟或更长时间)。在此类实施方案中，第二时间段
可以比第一时间段长。
81.冷冻冻干培养基的步骤可以在大气压下进行。可替代地，可以使用低于大气压或高于大气压的压力。在本发明的实施方案中，大气压或适度低于大气压或高于大气压的压力是优选的。例如，在某些实施方案中，在冷冻步骤期间采用的压力低于大气压约10kpa至高于大气压约10kpa。在某些实施方案中，在冷冻步骤期间采用的压力低于大气压约5kpa至高于大气压约5kpa。在某些实施方案中，在冷冻步骤期间采用的压力低于大气压约2kpa至高于大气压约2kpa。
82.升华步骤
83.在厌氧条件下冷冻冻干培养基的步骤可以在与进行升华步骤相同或不同的设备中进行。
84.在一些实施方案中，在厌氧条件下冷冻冻干培养基的步骤和升华步骤可以在同一设备中进行。例如，在已经在厌氧条件下将冻干培养基填充到不透氧的容器中，然后将容器封闭以形成不透氧的密封的布置中，冷冻步骤和升华步骤可以方便地在冻干设备中进行。在此类实施方案中，本发明的方法包括将密封容器装载到冻干设备中的步骤。在某些实施方案中，本发明的方法包括在升华步骤之前或期间打开密封容器的步骤。
85.在替代实施方案中，在厌氧条件下冷冻冻干培养基的步骤可以在第一设备(例如冷冻设备)中进行，而升华步骤可以在第二设备(例如冻干设备)中进行，其中补充的冷冻步骤可以作为冷冻-干燥方法的一部分进行。在此类实施方案中，本发明的方法包括将冷冻的冻干培养基从第一设备转移到第二设备的步骤。在容器中提供冷冻的冻干培养基的实施方案中，该步骤可以通过将容器装载到冻干设备中来进行。
86.冷冻的冻干培养基可以以任何形式提供，例如冷冻的冻干培养基可以是粉末、丸粒或块状物形式。
87.有利地，本发明人已经意外地发现，包含在厌氧条件下冷冻的厌氧细菌的冻干培养基对氧失活的敏感性低。这意味着在升华步骤之前和/或期间，没有必要将冷冻的冻干培养基保持在厌氧条件下。
88.因此，在冻干设备中进行升华步骤的实施方案中，冷冻的冻干培养基可以暴露于包含约100ppm或更高、约200ppm或更高、约500ppm或更高、约1000ppm或更高、约2000ppm或更高、约5000ppm或更高、约10000ppm或更高、约20000ppm或更高或约50000ppm或更高水平的氧的大气，或环境空气。冷冻的冻干培养基的此类暴露可以通过装有冷冻的冻干培养基的透氧容器产生，冷冻的冻干培养基从厌氧条件转移到此类大气中。可替代地，此类暴露可以通过在此类气氛中打开密封的不透氧容器(例如，通过移除容器中的开口(例如，填充口)的封闭件和/或移除容器壁的一部分)而产生。
89.因此，在本发明的实施方案中，进行升华步骤的环境的含氧量可以是约100ppm或更高、约200ppm或更高、约500ppm或更高、约1000ppm或更高、约2000ppm或更高、约5000ppm或更高、约10000ppm或更高、约20000ppm或更高或约50000ppm或更高。在某些实施方案中，升华步骤可以在环境空气中进行。
90.发明人还发现，升华步骤期间的操作条件不会显著影响冷冻的冻干培养基中包含的细菌细胞的活力，前提是冷冻的冻干培养基是在厌氧条件下冷冻的。因此，在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以是约50℃或更低、约30℃或更低或约10℃
或更低。在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以是约-30℃或更高、约-50℃或更高、约-70℃或更高、约-100℃或约-150℃或更高。在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以在约-150℃至约50℃之间。在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以在约-100℃至约30℃之间。在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以在约-70℃至约10℃之间。在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以在约-50℃至约10℃之间。在某些实施方案中，升华步骤期间冻干培养基暴露的温度可以在约-30℃至约10℃之间。
91.另外或可替代地，在某些实施方案中，进行升华步骤的压力可以是约5000μbar或更低、约2000μbar或更低、约1000μbar或更低或约500μbar或更低。在某些实施方案中，进行升华步骤时的压力可以是约50μbar或更高、约25μbar或更高、约10μbar或更高或约0μbar或更高。在某些实施方案中，进行升华步骤时的压力可以在约0μbar至约5000μbar之间。在某些实施方案中，进行升华步骤时的压力可以在约10μbar至约2000μbar之间。在某些实施方案中，进行升华步骤时的压力可以在约25μbar至约1000μbar之间。在某些实施方案中，进行升华步骤时的压力可以在约50μbar至约500μbar之间。
92.在容器中提供冷冻的冻干培养基的实施方案中，本发明的方法可以包括暴露容器内的冷冻的冻干培养基的步骤。这样做是为了促进升华步骤、解吸步骤(如果进行的话)或冻干方法的其他步骤。例如，可以移除容器壁的一部分，和/或容器中的封闭件的开口(例如填充口)。暴露冷冻的冻干培养基的这个步骤可以在将容器装载到冻干设备中之前进行，或者在将容器装载到冻干设备中之后并且在升华步骤之前或期间进行。
93.升华步骤可以使用冻干领域技术人员已知的任何技术或设备进行。例如，升华步骤可以在冻干设备中进行。在本发明的实施方案中，冻干设备可以是任何尺寸，而这不会影响冻干培养基中存在的细胞的活力。因此，在本发明的某些实施方案中，升华步骤在中试规模的冻干设备(例如，具有约0.1m2或更高、约0.2m2或更高、约0.5m2或约2m2或更低、约3m2或更低或约4m2或更低的操作架面积的冷冻干燥设备)中进行。在本发明的某些实施方案中，升华步骤在商业规模的冻干设备(例如，具有约5m2或更高、约10m2或更高、或约20m2或更高或约50m2或更低、约100m2或更低、约150m2或更低、或约200m2或更低的操作架面积的冷冻干燥设备)中进行。
94.解吸步骤
95.如本领域技术人员将认识到的，常规的冻干方法通常包括多个升华步骤，例如升华步骤和解吸步骤。因此，在本发明的某些实施方案中，所述方法包括一个或多个解吸步骤。
96.与升华步骤一样，进行解吸步骤的环境的含氧量可以是约100ppm或更高、约200ppm或更高、约500ppm或更高、约1000ppm或更高、约2000ppm或更高、约5000ppm或更高、约10000ppm或更高、约20000ppm或更高或约50000ppm或更高。在某些实施方案中，解吸步骤可以在环境空气中进行。
97.在某些实施方案中，在解吸步骤期间(如果进行的话)，冻干培养基可以暴露于约70℃或更低、约50℃或更低或约40℃或更低的温度。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约10℃或更高、约0℃或更高、约-10℃或更高或约-20℃或更高的温度。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约-20℃至约70℃的温度。
在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约-10℃至约50℃的温度。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约0℃至约40℃的温度。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约10℃至约40℃的温度。
98.另外或可替代地，在某些实施方案中，在解吸步骤期间(如果进行的话)，冻干培养基可以暴露于约2000μbar或更低、约1000μbar或更低、约500μbar或更低、或约300μbar或更低的压力。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约50μbar或更高、约25μbar或更高、约10μbar或更高、或约0μbar或更高的压力。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约0μbar至约2000μbar的压力。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约10μbar至约1000μbar的压力。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约25μbar至约500μbar的压力。在某些实施方案中，在解吸步骤期间，冻干培养基可以暴露于约50μbar至约300μbar的压力。
99.优选地，解吸步骤在与升华步骤相同的设备中进行。
100.附加加工步骤
101.正如冻干领域的技术人员所知，冷冻干燥方法中还有常规实践的附加加工步骤，例如再加压步骤，其中将冻干设备内的压力恢复到大气压(优选通过供给惰性气体诸如氮气)。在本发明的实施方案中，所述方法另外包括这个步骤。
102.冻干产品
103.在本发明的方法完成后，提供冻干产品。如以下实例所证明的，如果将该冻干产品中存在的细菌活细胞计数与冷冻前冻干培养基的活细胞计数进行比较，观察到的活细胞损失最小。因此，在本发明的实施方案中，冻干产品中的活细胞计数(以cfu/g计)比冷冻前(不包括水分)冻干培养基的活细胞计数(以cfu/g计)低不超过103cfu/g、102cfu/g或101cfu/g。
104.在一些实施方案中，冻干产品的活细胞计数(以干重cfu/g计)比冷冻前冻干培养基的活力(cfu/ml)低，等于或小于103cfu/g、等于或小于102cfu/g或等于或小于101cfu/g。
105.在本发明的一些实施方案中，冻干产品中的活细胞计数(以cfu/g计)比冷冻前(不包括水分)冻干培养基的活细胞计数(以cfu/g计)低不超过5cfu/g、不超过4cfu/g、不超过3cfu/g或不超过2cfu/g。
106.在一些实施方案中，冻干产品的活细胞计数(以干重cfu/g计)比冷冻前冻干培养基的活力(cfu/ml)低，等于或小于5cfu/g、等于或小于4cfu/g、等于或小于3cfu/g或等于或小于2cfu/g。
107.在一些实施方案中，与冷冻前(不包括水分)冻干培养基中的活细胞计数相比，冻干产品中活细胞计数减少1log或更少、0.5log或更少、0.4log或更少、0.3log或更少、0.2log或更少或0.1log或更少。在一个特定实施方案中，与冷冻前冻干培养基中的活细胞计数相比，冻干产品中活细胞计数减少0.3log或更少(不包括水分)。如实例所示，与冷冻前冻干培养基中的活细胞计数相比，本发明的方法特别适合保持冻干产品中的活细胞计数。
108.为了准确评估与冻干培养基中的活细胞计数(即以cfu/ml计)相比，冻干产品中活细胞计数(即以cfu/g计)的减少(例如对数损失)，技术人员将理解，有必要考虑与/ml冻干培养基相比，/g冻干产品中潜在活细胞浓度的增加(即由冻干方法中去除水分而引起的)。冻干产品中细胞浓度的增加可通过确定冻干产品的所谓理论活细胞计数(以cfu/g计)来考虑，该理论活细胞计数是根据冻干培养基的水分含量和活细胞计数来计算的。理论活细胞
计数假设在去除水分后没有发生活力损失，因此对应于冻干后冻干产品中的最大可能活细胞计数(以cfu/g计)。通过将理论活细胞计数(以cfu/g计)与冻干后测得的实际活细胞计数(以cfu/g计)进行比较，可以准确地确定冻干产品中活细胞计数的减少(例如对数损失)，从而考虑了在冻干期间去除水分后发生的细菌细胞浓度的增加。
109.考虑冻干培养基和冻干产品之间(即冻干之间和之后)的水分损失的这个过程可以用以下说明来解释。三种冻干培养基在冻干前具有相同的活细胞计数(以cfu/ml计)，但具有不同的含水量％。为了这个说明的目的，其中一半细菌死亡的冻干方法中，对于每种冻干培养基而言无论其原始含水量如何，活力的总体降低(例如对数损失)应该是同样的。如表1所证明的，下面通过计算各自每种冻干产品的理论活细胞计数(基于冻干培养基的水分含量和活细胞计数)(以cfu/g计)，并将该理论活细胞计数与冻干后测得的相应冻干产品的“真实”活细胞计数(以cfu/g计)进行比较，这是可能的。因此，不管初始含水量如何，每种冻干产品的活力的降低(例如对数损失)是同样的。因此，在计算中考虑了冻干后细菌细胞浓度的固有增加和/或冻干前不同冻干培养基水分含量的任何差异。这一因子分解至少确保(i)当比较冻干前(以cfu/ml计)和冻干后(以cfu/g计)的活细胞计数时确定的活细胞计数的减少(例如对数损失)准确地表示在冻干方法期间细菌细胞活力的损失，和(ii)可以直接比较对于来自具有不同水分含量的冻干培养基的冻干产品确定的活细胞计数的减少(例如对数损失)。
110.表1-活细胞计数的减少(例如对数损失)的确定
[0111][0112]
*如上所述，用于该实例目的的“真实”活细胞计数假设有一半细菌在冻干方法期间死亡。
[0113]
根据上述计算，可以直接比较冻干前(以cfu/ml计)和冻干后(以cfu/g计)的活力。
[0114]
本领域技术人员将熟悉进行活细胞计数的方法，例如使用螺旋平板仪，例如以商标pro销售的平板仪进行平板计数。
[0115]
冻干产品在以剂型提供之前可以与一种或多种赋形剂共混。此类赋形剂可以包含稀释剂、稳定剂、生长刺激剂、填充剂、润滑剂、助流剂等。此类合适的赋形剂的实例可以在handbook of pharmaceutical excipients中找到。用于治疗用途的可接受的赋形剂在制药领域是众所周知的
[0116]
可与冻干产品共混的示例性药学上可接受的赋形剂包括但不限于粘合剂、崩解剂、超级崩解剂、润滑剂、稀释剂、填充剂、调味剂、助流剂、吸附剂、增溶剂、螯合剂、乳化剂、增稠剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、吸附剂、制粒剂、防腐剂、缓冲剂、着色剂和甜味剂或其组
合。粘合剂的实例包括微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧乙烯基聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、角豆胶、壳聚糖、棉籽油、葡萄糖结合剂(dextrates)、糊精、乙基纤维素、明胶、葡萄糖、山嵛酸甘油酯、半乳甘露聚糖多糖、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、菊粉、乳糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、甲基纤维素、泊洛沙姆(poloxamer)、聚卡波非(polycarbophil)、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、海藻酸钠、山梨醇、淀粉、蔗糖、向日葵油、植物油、托可索仑(tocofersolan)、玉米醇溶蛋白(zein)或其组合。崩解剂的实例包括羟丙基甲基纤维素(hpmc)、低取代的羟丙基纤维素(l-hpc)、交联羧甲基纤维素钠、羟基乙酸淀粉钠、乳糖、硅酸镁铝、甲基纤维素、波拉克林钾(polacrilin potassium)、海藻酸钠、淀粉或其组合。润滑剂的实例包括硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、山嵛酸甘油酯、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、月桂基硫酸镁、矿物油、棕榈酸、肉豆蔻酸、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲酸钠、氯化钠、月桂基硫酸钠、滑石、硬脂酸锌、苯甲酸钾、硬脂酸镁或其组合。稀释剂的实例包括滑石、藻酸铵、碳酸钙、乳酸钙、磷酸钙、硅酸钙、硫酸钙、纤维素、醋酸纤维素、玉米淀粉、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、赤藓糖醇、乙基纤维素、果糖、富马酸、硬脂酸棕榈酸甘油酯、异麦芽酮糖醇、高岭土、乳糖醇、乳糖、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、麦芽糖、甘露醇、微晶纤维素、聚葡萄糖、聚甲基丙烯酸酯、西甲硅油(simethicone)、海藻酸钠、氯化钠、山梨醇、淀粉、蔗糖、磺基丁基醚β-环糊精、黄蓍胶、海藻糖、木糖醇或其组合。
[0117]
各种有用的填充剂或稀释剂包括但不限于无水磷酸氢钙、磷酸氢钙二水合物、磷酸三钙、硫酸钙、纤维素粉末、硅化微晶纤维素、醋酸纤维素、可压缩糖、糖果剂的糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、果糖、高岭土、乳糖醇、乳糖、乳糖一水合物、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、麦芽糖、甘露醇、微晶纤维素、聚葡萄糖、西甲硅油、海藻酸钠、氯化钠、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、海藻糖和木糖醇，或其混合物。
[0118]
合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、滑石、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷聚合物、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、油酸钠、硬脂基富马酸钠、dl-亮氨酸、胶体二氧化硅和本领域已知的其它润滑剂。
[0119]
各种有用的助流剂包括但不限于，磷酸三钙、硅酸钙、纤维素粉末、胶体二氧化硅、硅酸镁、三硅酸镁、淀粉和滑石，或其混合物。
[0120]
药学上可接受的表面活性剂包括但不限于适合用于药物剂型中的非离子表面活性剂和离子表面活性剂。离子表面活性剂可以包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性离子表面活性剂中的一种或多种。各种有用的表面活性剂包括但不限于月桂基硫酸钠，聚氧乙烯山梨醇酐的单油酸酯、单月桂酸酯、单棕榈酸酯、单硬脂酸酯或另一种酯，二辛基磺基琥珀酸钠(doss)、卵磷脂、硬脂酸醇、鲸蜡硬脂醇、胆固醇、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和泊洛沙姆。
[0121]
可以与冻干产品共混的赋形剂可以包含益生元。术语“益生元”意指不可消化的成分，其通过选择性刺激一种或有限数目的细菌的生长和/或活性而对活的生物治疗细菌(lbp)产生有益影响。益生元的实例包括寡糖、低聚果糖和低聚半乳糖。
[0122]
在本发明的实施方案中，所述方法包括制备包含冻干产品的剂型的步骤。包含冻干产品的剂型可以通过冲压或压制包含冻干产品的片芯来制备。在某些实施方案中，将片芯进行包衣(例如肠溶包衣)以提供片剂。在某些实施方案中，将冻干产品灌装到胶囊壳中
以提供胶囊。在某些实施方案中，冻干产品以小袋形式提供并密封小袋。
[0123]
在本发明的一个特定实施方案中，冻干缓冲剂不包含菊粉、半胱氨酸和核黄素，并且与冷冻前冻干培养基中的活细胞计数相比，冻干产品中的活细胞计数减少0.3log或更少(例如0.1log或更少)。
[0124]
实施例
[0125]
实施例1-利用在厌氧条件下进行的冷冻步骤冻干专性厌氧细菌
[0126]
制备来自于以登录号ncimb 42408由国际保藏机构ncimb,ltd.(ferguson building,aberdeen,ab21 9ya,scotland)于2014年12月3日保藏(在国际专利公开号wo2016/203217中有更全面描述)的多形拟杆菌菌株的细菌的第一浓缩生物质。浓缩生物质具有1x10
11
cfu/ml左右的活细胞计数。将浓缩生物质在厌氧气氛下与冻干缓冲剂混合。
[0127]
然后在厌氧条件下，在设置有一次性衬垫的隔离器中将所得混合物填充到国际专利公开号wo2019/012512中公开的类型的不透氧容器中。在填充之前，容器已经清除了氧气。一旦填充完成，就封闭填充口以提供不透氧的密封。然后将经过填充的容器从隔离器中取出并在冷藏条件下储存几个小时。
[0128]
随后，通过在液氮冷却的冷冻器中冷却至-110℃两小时，将容器(及其内容物)速冻。
[0129]
然后移除容器壁的一部分，将冷冻材料暴露于环境空气。然后将打开的容器装载到常规的冷冻干燥机中并冷冻干燥。
[0130]
制备活细胞计数为1x10
11
cfu/ml左右的第二浓缩生物质，并将其与冻干缓冲剂混合。在环境大气下，将所得混合物填充到可商购获得的透氧托盘中，装载到常规的冷冻干燥机中并在有氧条件下冷冻干燥。
[0131]
对获得的冻干物的活细胞计数进行评估。经由在厌氧条件下冷冻生物质/冻干缓冲剂的方法获得的冻干物具有2x10
10
cfu/g的活细胞计数，而经由在厌氧条件下不进行生物质/冻干缓冲剂冷冻的方法获得的冻干物具有1.3x109cfu/g的活细胞计数。
[0132]
实施例2-利用在厌氧条件下进行的冷冻步骤冻干多种专性厌氧细菌
[0133]
根据实施例1中陈述的方法，制备来自于许多专性厌氧物种(嗜黏蛋白艾克曼氏菌、人罗斯氏菌、拟杆菌属的种、狄氏副拟杆菌、粪便布劳特氏菌、马赛巨球形菌和产氢营养型布劳特氏菌)的细菌菌株的浓缩生物质用于冻干。
[0134]
对冻干产品的活细胞计数(菌落形成单位(cfu)或最大可能数(mpn))(cfu/g或mpn/g)进行评估，并与冻干前，尤其是在用浓缩生物质填充不透氧容器的步骤前的生物质的活力(cfu/ml或mpn/ml)进行比较。如在具体实施方式中所概述的，活力的实际降低(即对数损失)是相对于理论活细胞计数来计算的，理论活细胞计数将水分含量的损失计算在内并且因此将冻干过程中固有发生的细菌细胞的浓度增加计算在内。表2中提供了每种细菌菌株的结果。
[0135]
表2-冻干前后厌氧细菌的活力
[0136][0137]
本发明的冻干方法确保了大多数测试的厌氧细菌菌株的活力没有损失，并且其余测试的厌氧细菌菌株的活力仅少量损失，所得冻干物的活力仍在容许的监管限值内。因此，本发明的方法可用于成功地冻干来自于多种不同专性厌氧物种的细菌菌株，同时在冻干后保持细菌菌株的活力，并且预计适于任何厌氧细菌菌株的冻干。
[0138]
编号的实施方案
[0139]
1.一种用于制备冻干产品的方法，其包括以下步骤：
[0140]
提供包含厌氧细菌的冻干培养基
[0141]
在厌氧条件下冷冻所述冻干培养基以获得冷冻的冻干培养基，对所述冷冻的冻干培养基进行升华步骤
[0142]
收集冻干产品。
[0143]
2.根据实施方案1所述的方法，其还包括将所述冻干培养基保持在厌氧条件下直到冷冻所述冻干培养基的步骤完成的步骤。
[0144]
3.根据实施方案1或2所述的方法，其还包括在厌氧条件下将所述冻干培养基填充到容器中的步骤。
[0145]
4.根据实施方案3所述的方法，其中将所述冻干培养基填充到容器中的所述步骤在衬有一次性衬垫的隔离器中进行。
[0146]
5.根据实施方案3或4所述的方法，其中所述容器是不透氧的。
[0147]
6.根据实施方案5所述的方法，其中，在将所述冻干培养基填充到所述容器中的所述步骤之后，封闭所述容器以提供密封的不透氧的容器。
[0148]
7.根据实施方案6所述的方法，其中将所述密封的不透氧的容器装载到冻干设备中，任选地其中所述升华步骤在所述冻干设备中进行。
[0149]
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述方法包括暴露所述容器内的冷冻的冻干培养基的步骤。
[0150]
9.根据实施方案8所述的方法，其中暴露所述容器内的冷冻的冻干培养基的所述步骤在所述升华步骤之前或期间进行。
[0151]
10.根据实施方案6所述的方法，其中所述方法包括在将所述容器装载到冻干设备中之前，暴露所述容器内的所述冷冻的冻干培养基的步骤。
[0152]
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中在厌氧条件下冷冻所述冻干培养基的所述步骤和所述升华步骤在同一设备中进行。
[0153]
12.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中在厌氧条件下冷冻所述冻干培养基的所述步骤和所述升华步骤在单独的设备中进行。
[0154]
13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述厌氧细菌是专性厌氧细菌。
[0155]
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述专性厌氧细菌属于选自以下的属：艾克曼氏菌属、罗斯氏菌属、拟杆菌属、副拟杆菌属、布劳特氏菌属、巨球形菌属和/或布劳特氏菌属。
[0156]
15.根据实施方案13或14所述的方法，其中所述专性厌氧细菌属于选自以下的种：嗜黏蛋白艾克曼氏菌、人罗斯氏菌、拟杆菌属的种、多形拟杆菌、狄氏副拟杆菌、粪便布劳特氏菌、马赛巨球形菌和/或产氢营养型布劳特氏菌。
[0157]
16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中所述冻干培养基包含冻干保护剂、缓冲剂和/或填充剂。
[0158]
17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中所述冻干培养基包含冻干缓冲剂，任选地其中所述冻干缓冲剂不包含:
[0159]
(a)菊粉；
[0160]
(b)半胱氨酸；
[0161]
(c)菊粉和半胱氨酸；
[0162]
(d)菊粉和核黄素；或者
[0163]
(e)菊粉、半胱氨酸和核黄素。
[0164]
18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述冷冻的冻干培养基为粉末、块状物或丸粒形式。
[0165]
19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其还包括将所述冻干产品与一种或多种赋形剂共混的步骤。
[0166]
20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其还包括制备包含所述冻干产品的剂型的步骤。
[0167]
21.一种能够从根据实施方案1至19中任一项所述的方法获得的冻干产品或一种能够从根据实施方案20所述的方法获得的剂型。