一种评估5-FU治疗敏感性/耐药性的试剂盒

一种评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer,crc)是全球发病率排名第三的常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率与病死率均保持逐年上升的趋势。近年来，越来越多不同作用靶点的药物给大肠癌患者带来了不同的治疗选择，同时也为患者带来了更多的生存获益。
3.5-氟尿嘧啶(5-fu)是结直肠癌化疗中使用最为广泛的药物，然而，由于肿瘤细胞原发或继发的耐药性，化疗的效果差强人意，5-fu药物的总体有效性偏低，肿瘤对5-fu药物的敏感性/耐药性成为制约患者化疗及预后的主要因素之一。因此，急需寻找5-fu药物敏感获耐药的相关基因，方便临床医生制定合理的结直肠癌个性化治疗方案，具有积极的临床意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒，本发明发现，fatty acyl-coa reductase 1(far1)基因的表达量与5-fu药物敏感性/耐药性有很高的关联性，fatty acyl-coa reductase 1基因表达量高，则结直肠癌患者对5-fu药物敏感性低、耐药性高，fatty acyl-coa reductase 1基因表达量低，则对5-fu药物敏感性高、耐药性低。因此，fatty acyl-coa reductase 1基因有望成为结直肠癌诊断和用药治疗的新靶点，开发用于fatty acyl-coa reductase 1基因表达量检测的试剂盒有重要的临床意义。
5.本发明的目的是提供检测fatty acyl-coa reductase 1基因的表达量的产品在制备评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒中的应用。
6.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
7.检测fatty acyl-coa reductase 1基因的表达量的产品在制备评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒中的应用。
8.优选地，所述fatty acyl-coa reductase 1基因的表达量为fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量。
9.优选地，所述试剂盒还含有检测内参基因gapdh的mrna的表达量的试剂。
10.优选地，所示评估5-fu治疗敏感性/耐药性为评估结直肠癌5-fu治疗敏感性/耐药性。
11.优选地，所述检测fatty acyl-coa reductase 1基因的表达量的产品为fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量检测试剂盒。
12.更优选地，所述fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量检测试剂盒含有核苷酸序列如seq id no.1～2的引物和核苷酸序列如seq id no.3的探针。
13.更优选地，所述fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量检测试剂盒还含有核苷酸序列如seq id no.4～5的引物和核苷酸序列如seq id no.6的探针。
14.更优选地，所述探针的5’端标记fam、vic、hex、或cy5荧光基团中的任何一种；
15.更优选地，所述探针的3’标记有淬灭基团bhq1、bhq2的任何一种。
16.更优选地，所述fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量检测试剂盒还含有阴性质控品和/或阳性质控品。
17.更优选地，所述fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量检测试剂盒还含有far1定量参考品和/或内参基因定量参考品。
18.进一步本发明提供一种评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒，该试剂盒是基于标准曲线法的相对定量法对fatty acyl-coa reductase 1基因和内参基因gapdh的mrna的表达量进行检测。
19.具体地，其含有以下引物和探针：
20.fatty acyl-coa reductase 1基因上游引物：5
’‑
tgtgcagctacagtaaggttt-3’(seq id no.1)，
21.fatty acyl-coa reductase 1基因下游引物：5
’‑
gattcttcatttgttgtgcaagg-3’(seq id no.2)，
22.fatty acyl-coa reductase 1基因探针：5
’‑
fam-atgtgattgcaacgcgacagctt-bhq1-3’(seq id no.3)，
23.内参基因gapdh上游引物：5
’‑
aaaacctgccaaatatgatgaca-3’(seq id no.4)，
24.内参基因gapdh下游引物：5
’‑
tgaagtcagaggagaccacc-3’(seq id no.5)，
25.内参基因gapdh探针：5
’‑
vic-cagtgtagcccaggatgccctt-bhq1-3’(seq id no.6)；
26.还含有pcr buffer、逆转录酶、rna酶抑制剂、热启动taq酶、dntps、far1定量参考品(浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml的标准物)、内参基因定量参考品(浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml的标准物)、阴性质控品、阳性质控品。
27.far1定量参考品：为用已定值的fatty acyl-coa reductase 1质粒稀释成的标准物，其浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml，fatty acyl-coa reductase 1质粒是将人工构建的含fatty acyl-coa reductase 1目的基因序列的质粒，用1
×
te稀释至相应的浓度，其fatty acyl-coa reductase 1目的基因序列如seq id no.8所示；
28.内参基因定量参考品：为用已定值的内参质粒稀释成的标准物，其浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml，内参基因定量参考品是指将人工构建的含内参目的基因序列的质粒，用1
×
te稀释至相应的浓度，其内参基因目的基因序列如seq id no.7所示；
29.阴性质控品为临床样本的rna，其fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值大于或等于3；
30.阳性质控品为临床样本的rna，其fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值小于3。
31.其使用方法为：(1)试剂准备：pcr反应液18μl、酶混合液2μl，充分混匀后备用，
32.其中pcr反应液由表1中的引物(seq id no.1～2和seq id no.4～5)、探针(seq id no.3和seq id no.6)和pcr buffer组成，其中引物的扩增体系终浓度为0.2μmol/l，探针的扩增体系终浓度为0.1μmol/l，pcr buffer终浓度为1
×
；
33.酶混合液由逆转录酶、rna酶抑制剂、热启动taq酶和dntps组成，其中逆转录酶的反应终浓度为2.0u，rna酶抑制剂的反应终浓度为0.5u，热启动taq酶的反应终浓度为2.0u，dntps的反应终浓度为0.4mm。
34.(2)加样：向pcr反应管中，分别加入5μl的阴性质控品、阳性质控品，far1定量参考品、内参基因定量参考品或待测样品(结直肠癌组织rna)盖紧管盖，放入仪器样品槽，
35.其中，far1定量参考品：为用已定值的fatty acyl-coa reductase 1质粒稀释成的标准物，浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml。
36.内参基因定量参考品：为用已定值的内参质粒稀释成的标准物，浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml。
37.(3)pcr检测：将pcr反应管置于荧光定量pcr仪(abi7500)中，设置反应程序：
38.打开“setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控、阳性质控以及未知样本设置为“unknow”、far1和内参基因定量参考品设置为“standard”并“quantity”栏中填写相应的浓度，并在“sample name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：reporter dye1：fam，quencher dye1：none，reporter dye2：vic，quencher dye2：none，passive reference：none。打开instrument窗口，设置循环条件如下：
[0039][0040]
注：*表示收集荧光信号
[0041]
3、结果分析：
[0042]
反应结束后保存检测数据文件。在results下打开amplification plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定threshold：2-6e 3。双击rn坐标上数值打开graph settings窗口，将post run settings中log改为linear，ok后打开analysis preferences窗口，在analysis菜单下选择analyze自动分析结果，在report界面察看结果，记录未知样本定量值。
[0043]
4、结果判读
[0044]
阴性结果判读：同一个样本的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值大于或等于3，5-fu化疗耐药。
[0045]
阳性结果判读：同一个样本的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值小于3，5-fu化疗敏感。
[0046]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0047]
本发明公开了一种评估5-fu治疗敏感性/耐药性的试剂盒,利用本试剂盒检测结直肠癌样本中的fatty acyl-coa reductase 1基因是可行的。本发明可以帮助临床医生根据结直肠癌患者肿瘤组织中fatty acyl-coa reductase 1基因的表达情况，确定结直肠癌患者是否适用氟尿嘧啶类药物治疗，从而制定个性化治疗方案。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，且价格低廉，主要应用于fatty acyl-coa reductase 1基因的检测，可以指导临床医生用于5-fu用药指导。
附图说明
[0048]
图1为实施例1的阴性质控品扩增曲线图。
[0049]
图2为实施例1的阳性质控品扩增曲线图。
[0050]
图3为实施例1的fatty acyl-coa reductase 1基因标准品的扩增曲线图。
[0051]
图4是实施例1的内参基因标准品的扩增曲线图。
[0052]
图5是实施例1的fatty acyl-coa reductase 1基因标准曲线图。
[0053]
图6是实施例1的内参基因标准曲线图。
[0054]
图7是实施例2的阴、阳性质控品的定量值。
具体实施方式
[0055]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0056]
实施例1 一种检测的fatty acyl-coa reductase 1基因的方法
[0057]
1、引物设计
[0058]
根据genbank中登录的fatty acyl-coa reductase 1基因(far1，ncbi：nm_032228.6)和内参基因(gapdh，ncbi：nm_001256799.3)序列，应用oligodt7.0软件设计特异性的引物及探针，并通过ncbi的blast功能对其特异性进行初步鉴定，引物探针序列见表1。
[0059]
表1：
[0060]
[0061][0062]
2、fatty acyl-coa reductase 1基因的实时荧光定量pcr扩增及检测
[0063]
(1)试剂准备：pcr反应液18μl、酶混合液2μl，充分混匀后备用，
[0064]
其中pcr反应液由表1中的引物(seq id no.1～2和seq id no.4～5)、探针(seq id no.3和seq id no.6)和pcr buffer组成，其中引物的扩增体系终浓度为0.2μmol/l，探针的扩增体系终浓度为0.1μmol/l，pcr buffer终浓度为1
×
；
[0065]
酶混合液由逆转录酶、rna酶抑制剂、热启动taq酶和dntps组成，其中逆转录酶的反应终浓度为2.0u，rna酶抑制剂的反应终浓度为0.5u，热启动taq酶的反应终浓度为2.0u，dntps的反应终浓度为0.4mm。
[0066]
(2)加样：向pcr反应管中，分别加入5μl的阴性质控品、阳性质控品、far1定量参考品或内参基因定量参考品，盖紧管盖，放入仪器样品槽，
[0067]
其中，far1定量参考品：为用已定值的fatty acyl-coa reductase 1质粒稀释成的标准物，浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml；
[0068]
内参基因定量参考品：为用已定值的内参质粒稀释成的标准物，浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml；
[0069]
内参基因定量参考品是指将人工构建的含内参目的基因序列的质粒，用1
×
te稀释至相应的浓度，其内参基因目的基因序列如seq id no.7所示；
[0070]
far1定量参考品是将人工构建的含fatty acyl-coa reductase 1目的基因序列的质粒，用1
×
te稀释至相应的浓度，其fatty acyl-coa reductase 1目的基因序列如seq id no.8所示；
[0071]
阴性质控品为临床样本的rna，其fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值大于或等于3；
[0072]
阳性质控品为临床样本的rna，其其fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值小于3。
[0073]
(3)pcr检测：将pcr反应管置于荧光定量pcr仪中，设置反应程序：
[0074][0075][0076]
注：*表示收集荧光信号
[0077]
3、结果分析：
[0078]
反应结束后保存检测数据文件。在results下打开amplification plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定threshold：2-6e 3。双击rn坐标上数值打开graph settings窗口，将post run settings中log改为linear，ok后打开analysis preferences窗口，在analysis菜单下选择analyze自动分析结果，在report界面察看结果，记录未知样本定量值。
[0079]
4、实验结果
[0080]
阴、阳性性质控品的fam、vic检测通道有扩增曲线为明显s型曲线(见图1、图2)，fatty acyl-coa reductase 1基因定量参考品的fam检测通道扩增曲线成s型(见附图3)，其标准曲线的相关系数分别为0.997，斜率为-3.74(见附图4)；内参基因定量参考品的vic检测通道扩增曲线成s型(见附图5)，其标准曲线的相关系数为0.999，斜率为-3.77(见附图6)。
[0081]
该试剂盒是基于标准曲线法的相对定量法对fatty acyl-coa reductase 1基因mrna的表达量进行检测。阴性质控品的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值大于3；阳性质控品的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值小于3。
[0082]
本试剂盒中fatty acyl-coa reductase 1基因和内参基因扩增曲线的相关系数均大于0.98，且阴、阳性质控品符合要求，说明书试剂盒的质量比较可靠，定量结果比较准确。
[0083]
实施例2 一种检测的fatty acyl-coa reductase 1基因的试剂盒
[0084]
一、组成
[0085]
far1 pcr反应液1管，由引物、探针和pcr buffer组成，其中引物的扩增体系终浓度为0.2μmol/l，探针的扩增体系终浓度为0.1μmol/l，pcr buffer终浓度为1
×
，具体引物探针如下：
[0086]
fatty acyl-coa reductase 1基因上游引物：5
’‑
tgtgcagctacagtaaggttt-3’(seq id no.1)，
[0087]
fatty acyl-coa reductase 1基因下游引物：5
’‑
gattcttcatttgttgtgcaagg-3’(seq id no.2)，
[0088]
fatty acyl-coa reductase 1基因探针：5
’‑
fam-atgtgattgcaacgcgacagct t-bhq1-3’(seq id no.3)，
[0089]
内参基因上游引物：5
’‑
aaaacctgccaaatatgatgaca-3’(seq id no.4)，
[0090]
内参基因下游引物：5
’‑
tgaagtcagaggagaccacc-3’(seq id no.5)，
[0091]
内参基因探针：5
’‑
vic-cagtgtagcccaggatgccctt-bhq1-3’(seq id no.6)；
[0092]
far1酶混合液1管，由逆转录酶、rna酶抑制剂、热启动taq酶和dntps组成，其中逆转录酶的反应终浓度为2.0u，rna酶抑制剂的反应终浓度为0.5u，热启动taq酶的反应终浓度为2.0u，dntps的反应终浓度为0.4mm。
[0093]
far1定量参考品：为用已定值的fatty acyl-coa reductase 1质粒稀释成的标准物，其浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml，fatty acyl-coa reductase 1质粒是将人工构建的含fatty acyl-coa reductase 1目的
基因序列的质粒，用1
×
te稀释至相应的浓度，其fatty acyl-coa reductase 1目的基因序列如seq id no.8所示；
[0094]
内参基因定量参考品：为用已定值的内参质粒稀释成的标准物，其浓度为1
×
106copies/ml、1
×
105copies/ml、1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml，内参基因定量参考品是指将人工构建的含内参目的基因序列的质粒，用1
×
te稀释至相应的浓度，其内参基因目的基因序列如seq id no.7所示；
[0095]
阴性质控品1管：为临床样本的rna，其fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值大于或等于3；
[0096]
阳性质控品1管：为临床样本的rna，其其fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值小于3。
[0097]
二、使用方法
[0098]
(1)试剂准备：pcr反应液18μl、酶混合液2μl，充分混匀后备用，
[0099]
(2)加样：向pcr反应管中，分别加入5μl的阴性质控品、阳性质控品，far1定量参考品、内参基因定量参考品和待测样品(结直肠癌组织rna)盖紧管盖，放入仪器样品槽。
[0100]
(3)pcr检测：将pcr反应管置于荧光定量pcr仪中，设置反应程序：
[0101][0102][0103]
注：*表示收集荧光信号
[0104]
3、结果分析：
[0105]
反应结束后保存检测数据文件。在results下打开amplification plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定threshold：2-6e 3。双击rn坐标上数值打开graph settings窗口，将post run settings中log改为linear，ok后打开analysis preferences窗口，在analysis菜单下选择analyze自动分析结果，在report界面察看结果，记录未知样本定量值。
[0106]
4、结果判读
[0107]
阴性结果判读：同一个样本的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值(见图7)为3.25，5-fu化疗耐药。
[0108]
阳性结果判读：同一个样本的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值(见图7)为1.75，5-fu化疗敏感。
[0109]
实施例3 5-fu化疗耐药性样本检测
[0110]
一、实验方法
[0111]
选取临床上5-fu化疗耐药的组织样本15例，对所有样本进行核酸提取，使用实施例2的试剂盒进行检测，同时用阴、阳性质控品进行质量控制。
[0112]
二、实验结果
[0113]
阴、阳性性质控品的fam和vic检测通道有扩增曲线为明显s型曲线，其中阴性质控品的定量值/内参基因定量值为3.25，且大于3；阳性质控品的定量值/内参基因定量值为1.75，且小于3。阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。
[0114]
由15例待检标本的检测结果可知，所有5-fu化疗耐药的样本检测的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值均大于3，详细结果见表2。
[0115]
表2
[0116][0117][0118]
结果显示，15例5-fu化疗耐药标本的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值均大于3，检测结果与临床结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测特异性是可行的，具有良好的特异性。
[0119]
实施例3 5-fu化疗敏感性样本检测
[0120]
一、实验方法
[0121]
选取临床上5-fu化疗敏感的结直肠癌组织样本20例，对所有样本进行核酸提取，使用实施例2的试剂盒进行检测，同时用阴、阳性质控品进行质量控制。
[0122]
二、实验结果
[0123]
阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。20例5-fu化疗敏感性的结直肠癌阳性组织样本检测结果均小于3，其检测结果如表3。
[0124]
表3
[0125][0126][0127]
结果显示，20例5-fu化疗敏感标本的fatty acyl-coa reductase 1基因定量值/内参基因定量值均小于3，检测结果与临床结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测特异性是可行的，具有良好的特异性。
[0128]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
[0129]
seq id no.1 5
’‑
tgtgcagctacagtaaggttt-3’[0130]
seq id no.2 5
’‑
gattcttcatttgttgtgcaagg-3’[0131]
seq id no.3 5
’‑
fam-atgtgattgcaacgcgacagctt-bhq1-3’[0132]
seq id no.4 5
’‑
aaaacctgccaaatatgatgaca-3’[0133]
seq id no.5 5
’‑
tgaagtcagaggagaccacc-3’[0134]
seq id no.6 5
’‑
vic-cagtgtagcccaggatgccctt-bhq1-3’[0135]
seq id no.7所示。
[0136]
aagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctg。
[0137]
seq id no.8所示。
[0138]
accaatattatattccactgtgcagctacagtaaggtttaatgaaaatttaagagatgctgttcagttaaatgtgattgcaacgcgacagcttattctccttgcacaacaaatgaagaatctggaagtgttcatgcatgtatcaacagcatatgcctactgtaatcgcaagcatattgatgaagtagtctatccaccacctgtggatcccaagaagctgattgattctttagagtggatggatgatggcctagtaaatgatatcacgccaaaattgataggagacagacctaataca。