用于评估微卫星不稳定性的系统和测定的制作方法

用于评估微卫星不稳定性的系统和测定
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2019年11月8日提交的美国临时申请第62/932,910号的优先权的权利，所述美国临时申请与本技术共同拥有，并且所述美国临时申请特此通过引用整体并入本文，如同在本文中完整阐述一样。
3.序列表
4.本技术含有序列表，所述序列表已经以ascii格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2020年11月2日的所述ascii副本命名为lt01514pct_sl.txt并且大小为8,464字节。


背景技术：

5.本公开总体上涉及dna片段分析。
6.修复dna的生物分子机制的破坏被认为是癌症的致病因素。在细胞复制期间，dna修复机制对于复制细胞的完整性至关重要。当这些机制崩溃时，错误可能在由所得细胞携带的dna中累积。存在抗癌药物可以利用这种崩溃来鉴定和破坏肿瘤。当肿瘤表现出高突变率时，所述药物最有效，所述高突变率进而与dna修复生物分子机制的高程度的故障有关。检测药物最有效的情况的一种方式是检查在dna由许多重复的子序列组成的基因座处，dna偏离正常的程度。这些子序列被称为微卫星。
7.微卫星，也被称为短串联重复序列(str)，是由短核苷酸序列组成的多态性dna基因座，通常为1-6个碱基重复序列。这些基序占人类基因组的大约3％。在dna复制期间，这些序列容易出现错误，所述错误可以导致缺失和插入。当dna mmr系统中存在缺陷时，微卫星复制错误会在基因组中累积。这种现象通常被称为微卫星不稳定性(msi)。在典型的微卫星分析中，通过聚合酶链式反应(pcr)使用荧光标记的正向引物和未标记的反向引物扩增微卫星基因座。使用电泳按大小将pcr扩增子分开。应用包含：连锁定位(linkage mapping)；动物育种；人类、动物和植物分型；病原体子分型；遗传多样性；微卫星不稳定性；杂合性丢失(loh)；简单序列重复区间(issr)；多基因座变体分析(mlva)；和癌症治疗的伴随诊断。


技术实现要素：

8.本技术总体上涉及用于检测dna样品中的微卫星不稳定性(msi)的方法、系统、组合物和试剂盒。当给定dna基因座处的微卫星数量与正常值有很大差异时，所述微卫星基因座被认为微卫星不稳定(msu)。当许多微卫星基因座表现出不稳定性时，dna样品被认为具有高微卫星不稳定性，msi高。当仅少数微卫星基因座表现出不稳定性时，dna样品被认为msi低。当没有微卫星基因座表现出不稳定性时，dna样品被认为微卫星稳定，mss。
9.一方面，提供了一种用于检测dna样品中的微卫星不稳定性(msi)的方法，所述方法包含：a)共扩增所述dna样品的多个微卫星基因座以产生包括来自每个基因座的核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)；b)测定来自每个基因座的所述经扩增片段的大小；以及c)将来自每个基因座的所述经扩增片段的大小与来自对照的对应的经扩增片段的大小进
行比较。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat 26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，样品与对照之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示dna样品中的对应基因座处存在msi。
10.另一方面，提供了一种用于分析dna样品以测定所述dna样品中的微卫星不稳定性(msi)的方法，所述方法包含：a)共扩增所述dna样品的多个微卫星基因座以产生包括来自每个基因座的核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)；b)测定来自每个基因座的所述经扩增片段的大小；c)将来自每个基因座的所述经扩增片段的大小与来自对照的对应的经扩增片段的大小进行比较，所述样品与所述对照之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示所述dna样品中存在msi；以及d)为所述dna样品分配msi程度，由此测定所述dna样品的msi状态。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat 26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。
11.另一方面，提供了一种用于诊断生物样品中癌组织的存在的方法，所述方法包含：a)共扩增dna样品的多个微卫星基因座以产生包括来自每个基因座的核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)；b)测定来自每个基因座的所述经扩增片段的大小；以及c)将来自每个基因座的所述经扩增片段的大小与来自对照的对应的经扩增片段的大小进行比较。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat 26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，样品与对照之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示在dna样品中的对应基因座处存在微卫星不稳定性(msi)，其中所述dna样品中存在msi指示所述生物样品含有癌组织。
12.在实施例中，所述方法进一步包含为dna样品分配msi程度。在实施例中，如果测定dna样品中大于约30％的基因座具有msi，则为所述dna样品分配高msi程度(微卫星不稳定性高)。在实施例中，如果测定dna样品中少于约30％但大于约1％的基因座具有msi，则为所述dna样品分配低msi程度(微卫星不稳定性低)。在实施例中，如果测定dna样品中没有基因座具有msi，则为所述dna样品分配稳定程度(微卫星稳定)。
13.另一方面，提供了一种用于诊断患有或疑似患有癌症的受试者的癌症的方法，所述方法包含：a)共扩增dna样品的多个微卫星基因座以产生包括来自每个基因座的核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)；b)测定来自每个基因座的所述经扩增片段的大小；以及c)将来自每个基因座的所述经扩增片段的大小与来自对照的对应的经扩增片段的大小进行比较，所述样品与所述对照之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示所述dna样品中的对应基因座处存在微卫星不稳定性(msi)。在实施例中，dna样品中存在msi指示受试者患有癌症。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat 26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。
14.另一方面，提供了一种用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的癌症的方法，所述方法包含：a)共扩增dna样品的多个微卫星基因座以产生包括来自每个基因座的核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)；b)测定来自每个基因座的所述经扩增片段的大小；c)将来自每个基因座的所述经扩增片段的大小与来自对照的对应的经扩增片段的大小进行比较；以及d)向所述患有癌症的受试者施用抗癌剂。在实施例中，样品之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示dna样品中存在微卫星不稳定性(msi)。在实施例中，dna样品中
存在msi指示受试者患有癌症。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat 26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。
15.另一方面，提供了一种用于分析包括核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)以测定微卫星不稳定性(msi)的方法，所述方法包含：a)提供从dna样品中的多个微卫星基因座扩增的包括核酸序列的经扩增片段(例如，dna片段)；b)测定所述经扩增片段的大小；c)将步骤b)的所述经扩增片段的大小与来自成对正常dna样品的对应的经扩增片段的大小进行比较，所述样品之间的一个或多个片段之间的大小差异指示所述dna样品中存在msi；以及d)为所述dna样品分配msi程度，由此测定所述dna样品的msi状态。在实施例中，所述经扩增片段包含修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标志物。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。
16.在实施例中，所述方法进一步包含在步骤a)中共扩增一种或多种鉴定标志物。在实施例中，所述一种或多种鉴定标志物包含pentad和/或th01。
17.在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少两个、三个、四个、五个、六个或七个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少八个、九个、十个、十一个或十二个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含以下基因座中的每个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。
18.在实施例中，所述dna样品来自肿瘤细胞、疑似癌性的细胞或其它疑似癌性的生物材料。在实施例中，所述对照是成对正常dna样品、来自非癌组织的dna样品、来自血液样品的dna、基于正常(非癌)群体的平均值或基于正常(非癌)群体的中值。
19.在实施例中，使用选自seq id no.:1-26的一个或多个引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用包含第一引物和第二引物的引物对共扩增所述微卫星基因座，其中所述第一引物和所述第二引物的多核苷酸序列包含以下对之一：seq id no.:1的多核苷酸序列和seq id no.:2的多核苷酸序列；seq id no.:3的多核苷酸序列和seq id no.:4的多核苷酸序列；seq id no.:5的多核苷酸序列和seq id no.:6的多核苷酸序列；seq id no.:7的多核苷酸序列和seq id no.:8的多核苷酸序列；seq id no.:9的多核苷酸序列和seq id no.:10的多核苷酸序列；seq id no.:11的多核苷酸序列和seq id no.:12的多核苷酸序列；seq id no.:13的多核苷酸序列和seq id no.:14的多核苷酸序列；seq id no.:15的多核苷酸序列和seq id no.:16的多核苷酸序列；seq id no.:17的多核苷酸序列和seq id no.:18的多核苷酸序列；seq id no.:19的多核苷酸序列和seq id no.:20的多核苷酸序列；seq id no.:21的多核苷酸序列和seq id no.:22的多核苷酸序列；seq id no.:23的多核苷酸序列和seq id no.:24的多核苷酸序列；seq id no.:25的多核苷酸序列和seq id no.:26的多核苷酸序列。
20.在实施例中，使用热循环扩增所述多个微卫星基因座，并且通过片段分析、桑格测序(sanger sequencing)、离子半导体测序或高分辨率熔融曲线分析对所述多个微卫星基因座进行分析。在实施例中，所述桑格测序是毛细管电泳桑格测序。在实施例中，所述dna样
品和所述成对正常dna样品来自同一个体在实施例中，所述成对正常dna样品是来自非癌组织的对照dna。在实施例中，所述dna样品和所述成对正常dna样品来自相同类型的组织。在实施例中，所述癌症是结直肠癌、胃癌、肾上腺皮质癌、宫颈癌、间皮瘤或子宫内膜癌。在实施例中，使用引物对扩增每个基因座，并且进一步地其中所述引物对中的至少一个引物包含修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标志物。
21.另一方面，提供了一种引物组，所述引物组包含一个或多个引物对，每个引物对包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物和所述第二引物的多核苷酸序列包含以下对之一：seq id no.:1的多核苷酸序列和seq id no.:2的多核苷酸序列；seq id no.:3的多核苷酸序列和seq id no.:4的多核苷酸序列；seq id no.:5的多核苷酸序列和seq id no.:6的多核苷酸序列；seq id no.:7的多核苷酸序列和seq id no.:8的多核苷酸序列；seq id no.:9的多核苷酸序列和seq id no.:10的多核苷酸序列；seq id no.:11的多核苷酸序列和seq id no.:12的多核苷酸序列；seq id no.:13的多核苷酸序列和seq id no.:14的多核苷酸序列；seq id no.:15的多核苷酸序列和seq id no.:16的多核苷酸序列；seq id no.:17的多核苷酸序列和seq id no.:18的多核苷酸序列；seq id no.:19的多核苷酸序列和seq id no.:20的多核苷酸序列；seq id no.:21的多核苷酸序列和seq id no.:22的多核苷酸序列；seq id no.:23的多核苷酸序列和seq id no.:24的多核苷酸序列；seq id no.:25的多核苷酸序列和seq id no.:26的多核苷酸序列。在实施例中，至少一个引物包含修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标记。
22.另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含先前所描述的引物组中的任一个的引物组，包含实施例。在实施例中，所述引物组包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个引物对。在实施例中，所述组合物包含13个引物对，所述引物对包含seq id no.:1-26的多核苷酸序列。在实施例中，至少一个引物被修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标记。在实施例中，所述组合物进一步包含聚合酶。在实施例中，所述组合物进一步包含多个脱氧核糖核苷酸三磷酸。在实施例中，所述组合物进一步包含dna样品。在实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种盐。
23.另一方面，提供了一种系统，所述系统包含如先前所描述的组合物，包含实施例，以及被配置成执行dna扩增的第一装置。在实施例中，所述第一装置被配置成执行桑格测序、离子半导体测序、毛细管电泳或高分辨率熔融分析。在实施例中，所述系统进一步包含被配置成比较和/或分析使用引物扩增dna产生的核酸片段的第二装置。
24.另一方面，提供了一种试剂盒，其包含缓冲液和用于微卫星基因座的扩增的至少一个引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物。在实施例中，微卫星基因座包含bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和/或abi-19。
25.在实施例中，所述至少一个引物对包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个或至少13个引物对。在实施例中，所述至少一个引物对包含具有seq id no.:1-26中任一个的多核苷酸序列的至少一个引物。在实施例中，所述至少一个引物对包含13个引物对，所述引物具有seq id no.:1-26中的每一个的多核苷酸序列。在实施例中，所述试剂盒进一步包含用于鉴定标志物的
扩增的引物对。在实施例中，所述鉴定标志物包含pentad和/或th01。
26.在实施例中，所述第一引物和所述第二引物的多核苷酸序列包含以下对之一：seq id no.:1的多核苷酸序列和seq id no.:2的多核苷酸序列；seq id no.:3的多核苷酸序列和seq id no.:4的多核苷酸序列；seq id no.:5的多核苷酸序列和seq id no.:6的多核苷酸序列；seq id no.:7的多核苷酸序列和seq id no.:8的多核苷酸序列；seq id no.:9的多核苷酸序列和seq id no.:10的多核苷酸序列；seq id no.:11的多核苷酸序列和seq id no.:12的多核苷酸序列；seq id no.:13的多核苷酸序列和seq id no.:14的多核苷酸序列；seq id no.:15的多核苷酸序列和seq id no.:16的多核苷酸序列；seq id no.:17的多核苷酸序列和seq id no.:18的多核苷酸序列；seq id no.:19的多核苷酸序列和seq id no.:20的多核苷酸序列；seq id no.:21的多核苷酸序列和seq id no.:22的多核苷酸序列；seq id no.:23的多核苷酸序列和seq id no.:24的多核苷酸序列；seq id no.:25的多核苷酸序列和seq id no.:26的多核苷酸序列。
27.在实施例中，所述引物对的所有引物都存在于同一容器中。在实施例中，所述试剂盒包含含有seq id no.:1-26中的每一个的多核苷酸序列的引物。在实施例中，所述试剂盒进一步包含聚合酶和/或多种脱氧核苷三磷酸。在实施例中，缓冲液是pcr缓冲液。在实施例中，来自引物组的至少一个引物包含修饰。在实施例中，所述修饰是可检测标记。在实施例中，所述试剂盒进一步包含用于鉴定生物样品中的微卫星不稳定性的计算机程序。
28.公开了用于检测生物样品中的微卫星不稳定性的本发明的实施例。从毛细管电泳遗传分析仪器接收信号数据，其中所述信号数据是根据通过聚合酶链式反应从所述生物样品扩增的包括核酸序列的片段的荧光测得的。核酸序列对应于多个不同的微卫星基因座。不同的基因座可以表现出不同的信号特性。在特定基因座处，可以应用分析方法的层次结构，这也可能是此基因座处信号数据的特性所特有的。例如，三级层次结构可以描述如下。实施第一处理算法以基于信号数据获得关于多个不同微卫星基因座中的一个或多个第一微卫星基因座的不稳定性的第一测定。实施第二处理算法以基于信号数据获得关于多个不同微卫星基因座中的一个或多个第二微卫星基因座的不稳定性的第二测定。然后实施第三处理算法以至少基于所述第一测定和所述第二测定来测量生物样品的微卫星不稳定性。
29.本发明的实施例描述了分析ce数据以确定给定dna基因座是否异常并确定整体遗传图谱(组合来自所有基因座的结果)可以被认为msi高、msi低还是mss的方法的集合。本文所描述的方法提供了自动进行调用的方法。所描述的方法还可以用于例如，通过报告计算结果与决策阈值的接近程度来为调用分配置信度量度，这进而可以用于将人工审查工作集中在自动化msi评估置信度低的情况上。
30.本文所公开的本发明的实施例描述了异构的分析方法，范围从简单的阈值到利用深度学习技术。其原因是，将整体遗传图谱分配给msi高、msi低或msi稳定可能涉及dna中的一个微卫星基因座直到dna中的许多微卫星基因座。分析算法的复杂性取决于所选基因座处的dna复制模式的性质。可以针对不同的癌症选择不同的基因座，因为与其它癌症类型相比，某些基因座可能对给定癌症类型更敏感，和/或与其它基因座组合，可能会产生针对msi状态的更敏感和/或特异性的测试，和/或dna可能被更可靠地扩增。
附图说明
31.图1展示了根据本发明的实施例的系统；
32.图2展示了本发明的一些实施例中使用的示例性毛细管电泳过程；
33.图3展示了本发明的一些实施例中使用的示例性遗传分析器仪器；
34.图4展示了在图3的示例性遗传分析器仪器中使用的示例性一体式筒；
35.图5展示了本发明的一些实施例中使用的用户界面显示的示例性屏幕快照；
36.图6展示了在图3的示例性遗传分析器仪器的云集成过程的流程图；
37.图7展示了根据本发明的一些实施例的方法的流程图；
38.图8展示了根据本发明的一些实施例的替代性方法的流程图；
39.图9展示了可以实施本发明的实施例的一个或多个方面的分布式计算机系统的框图；以及
40.图10展示了可以实施本发明的实施例的一个或多个方面的电子装置的框图。
41.图11示出了对来自结直肠癌(左)或正常组织(右)的dna样品进行的15重测定的代表性电泳图，其中标志物在通道上间隔开。顶行示出来自bat25、nr24和nr21基因座扩增的结果。第二行示出来自th01、bat40和cat25基因座扩增的结果。第三行示出来自nr22、nr27、abi19和abi20b基因座扩增的结果。第四行示出来自pentad基因座扩增的结果。底行示出来自abi17、abi16、bat26和abi20a基因座扩增的结果。基因座由每个迹线上的灰色条表示，每个迹线之间的划分由x轴上的红色三角形指示。
42.图12a是比较在子宫内膜癌样品上运行时如本文所描述的msi测定与竞争者(promega)msi测定的结果的表。
43.图12b示出了示出跨不同类型标志物的明显偏移的迹线轮廓：20bp(abi-20a和abi-20b)对40bp(bat-40)均聚物。
44.图13示出了揭示检测复杂性的合成构建体。
45.图14是在5bpd处具有》98％特异性和》90％敏感性的仅肿瘤分析的图表。
46.图15是在≥3bdp处具有》95％特异性和敏感性的肿瘤-正常分析的图表。
47.图16是在bat-25、nr-24和nr-21(顶部)和所有15个基因座(底部)处比较正常与肿瘤结肠样品的自动调用和报告的abi msi软件图解。
48.虽然参考以上图式描述本发明，但所述图式旨在为说明性的，并且其它实施例与本发明的精神一致，且在本发明的范围内。
具体实施方式
49.在阅读本说明书之后，对于本领域的技术人员而言，如何在各个替代性实施例和替代性应用中实施本公开将变得显而易见。然而，本文中将不描述本发明的所有各个实施例。将理解的是，此处所呈现的实施例仅通过举例而非限制的方式进行呈现。如此，各个替代性实施例的这种详细描述不应被解释为限制如本文所阐述的本公开的范围或广度。
50.在公开和描述本发明技术之前，应当理解，以下描述的方面并不限于具体组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因而这些方面当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在是限制性的。
51.详细描述仅出于读者的方便而被分成各个部分，并且在任何部分中发现的公开内
容可以与在另一个部分中的公开内容组合。为了方便读者，可以在说明书中使用标题或子标题，其并不旨在影响本公开的范围。
52.定义
53.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本说明书和以下权利要求书中，将参考多个术语，所述多个术语应被定义为具有以下含义：
54.本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在进行限制。除非上下文另外清楚地说明，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在包含复数形式。
[0055]“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”是指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包含事件或情况发生的实例以及事件或情况不发生的实例。
[0056]
当在包含范围的数值指定例如温度、时间、量、浓度以及此类其它之前使用时，术语“约”指示可以变化( )或(-)10％、5％、1％或在其之间的任何子范围或子值的近似值。优选地，当关于剂量使用时，术语“约”意指剂量可以变化 /-10％。
[0057]“包括(comprising)”或“包括(comprises)”旨在意味着组合物和方法包含所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”应当意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除对所要求保护的发明的基本和新颖特性不具有实质影响的其它材料或步骤。“由
……
组成(consisting of)”应当意味着排除大于痕量要素的其它成分和大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本公开的范围内。
[0058]
如本文所使用的，术语“癌症”是指在哺乳动物(例如，人)中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包含白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包含脑癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、头部癌症、霍奇金氏病(hodgkin's disease)和非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphomas)。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包含甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌和子宫癌。另外的实例包含甲状腺癌、胆管癌、胰腺癌、皮肤恶性黑色素瘤、结肠腺癌、直肠腺癌、胃腺癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、浸润性乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、恶性胰腺岛瘤、恶性类癌、尿膀胱癌、癌变前皮肤损伤、睾丸癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)、黑色素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌或前列腺癌。
[0059]
术语“白血病”广义上是指血液形成器官的渐进性恶性疾病，并且通常特征在于白细胞及其前体在血液和骨髓中的增殖和发育畸变。白血病通常在临床上基于以下进行分类：(1)急性病或慢性病的持续时间和特性；(2)所涉及的细胞的类型；髓样(骨髓性的)、淋
巴样(淋巴性的)或单核细胞的；以及(3)异常细胞在血液中的数量的增加或非增加-白血病性或非白血病性(亚白血病性)。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性白血病包含例如急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人t细胞白血病、非白血性白血病(aleukemic leukemia)、白血病性白血病(a leukocythemic leukemia)、嗜碱细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗氏白血病(gross'leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、微成髓细胞性白血病(micromyeloblastic leukemia)、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、内格利氏白血病(naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、里德尔氏细胞白血病(rieder cell leukemia)、希林氏白血病(schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞白血病。
[0060]
如本文所使用的，术语“淋巴瘤”是指影响造血组织和淋巴组织的一组癌症。其在淋巴细胞(主要在淋巴结、脾脏、胸腺和骨髓中发现的血细胞)中开始。淋巴瘤的两种主要类型是非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏病。霍奇金氏病占所有诊断出的淋巴瘤的大约15％。这是与里德-斯泰伯格氏(reed-sternberg)恶性b淋巴细胞相关的癌症。非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)可以基于癌症的生长速率和所涉及的细胞类型进行分类。存在侵略性(高等级)和惰性(低等级)类型的nhl。基于所涉及的细胞类型，存在b细胞和t细胞nhl。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性b细胞淋巴瘤包含但不限于小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴结外(malt)淋巴瘤、结节性(单核细胞样b细胞)淋巴瘤、脾脏淋巴瘤、弥漫性大细胞b淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(burkitt's lymphoma)、淋巴母细胞淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤或前体b淋巴母细胞淋巴瘤。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性t细胞淋巴瘤包含但不限于原发性皮肤t细胞淋巴瘤(cunateous t-cell lymphoma)、外周t细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、蕈样真菌病和前体t淋巴母细胞淋巴瘤。
[0061]
术语“肉瘤”通常是指由类似于胚胎结缔组织的物质组成并且通常由包埋在纤丝状或均质物质中的紧密压积细胞构成的肿瘤。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的肉瘤包含软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西氏肉瘤(abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯氏肿瘤肉瘤(wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、b细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、t细胞的免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯氏肉瘤(rous sarcoma)、浆液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤。
[0062]
术语“黑色素瘤”意指由皮肤和其它器官的黑色素细胞体系引起的肿瘤。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的黑色素瘤包含例如肢端雀斑样痣黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤(cloudman's melanoma)、s91黑色素瘤、哈丁-帕西黑色素瘤(harding-passey melanoma)、少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
[0063]
术语“癌”是指由上皮细胞组成的恶性新生长，所述上皮细胞倾向于浸润周围组织并且引起转移。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性癌包含例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺性囊性癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞瘤、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮(carcinoma cutaneum)、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌(carcinoma ex ulcere)、纤维癌、胶状癌(gelatiniforni carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌、许特尔氏细胞癌(hurthle cell carcinoma)、玻质状癌(hyaline carcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(krompecher's carcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液质癌(carcinoma mucosum)、粘液样癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨样癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌(carcinoma spongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、块状癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌或绒毛状癌。
[0064]
如本文所使用的，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可以可互换地使用，并且指代增殖性疾病或病症(例如，癌症)从一个器官向另一个不相邻的器官或身体部分的扩散。“转移性癌症”也被称为“iv期癌症”。癌症出现在起始部位(例如乳房)，这一部位被称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发性肿瘤或起始部位的一些癌细胞获得了穿透和渗透局部区域周围正常组织的能力和/或穿透通过系统循环到体内的其它部位和组织的淋巴系统或血管系统壁的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二种临床可检测肿瘤被称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原发性肿瘤相似。因此，如果肺癌转移到乳腺，则乳腺部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而非异常的乳腺细胞组成。乳房中的继发性肿瘤是指转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者患有或曾经患有原发性肿瘤并患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的个体是指其中个体患有原发性肿瘤但不患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，
转移性肺癌是指患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤史并且在第二个位置或多个位置(例如，在乳房中)含有一种或多种继发性肿瘤的个体中的疾病。
[0065]
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指成功治疗或改善损伤、疾病、病理或病状的任何指标，包含任何客观或主观参数，如减轻；缓解；减轻症状或使得损伤、病理或病状对患者而言更易忍受；减缓退化或衰退的速度；或使退化的最终点较少衰退；改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包含身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。术语“治疗”及其缀合可以包含预防损伤、病理、病状或疾病。在实施例中，治疗是预防。在实施例中，治疗不包含预防。
[0066]
如本文中所使用的(并且在本领域中被充分理解的)“治疗”或“治疗”还广泛地包含用于在受试者的病状中获得有益的或期望结果(包含临床结果)的任何方法。有益的或期望的临床结果可以包含但不限于：减轻或改善一种或多种症状或病状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、预防疾病传播或扩散、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、减少疾病复发以及缓解，无论是部分的还是全部的，以及无论是可检测的还是不可检测的。换句话说，如本文所使用的“治疗”包含对疾病的任何治愈、改善或预防。治疗可以预防疾病发生；抑制疾病的扩散；缓解疾病的症状，完全或部分去除疾病的根本原因，缩短疾病的持续时间或这些事物的组合。
[0067]“患者”或“有需要的受试者”是指患有或易于患有可以通过施用如本文所提供的药物组合物治疗的疾病或病状的活生物体。非限制性实例包含人、其它哺乳动物、牛科动物、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿和其它非哺乳动物。在一些实施例中，患者是人。
[0068]“有效量”是相对于不存在化合物，足以使化合物实现所陈述目的的量(例如，实现其所施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、降低信号传导路径或降低疾病或病状的一种或多种症状)。“有效量”的实例是足以促成治疗、预防或减少疾病的一种或多种症状的量，所述量也可以被称为“治疗有效量”。一种或多种症状(和此短语的语法等同物)的“减少”意指降低一种或多种症状的严重程度或频率，或消除一种或多种症状。药物的“预防有效量”是当向受试者施用时，将具有预期的预防效果的药物的量，例如预防或延迟损伤、疾病、病理或病状的发作(或复发)或降低损伤、疾病、病理或病状或其症状发作(或复发)的可能性。完全预防效果不一定通过施用一次剂量发生，并且可以在仅施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以以一次或多次施用形式来施用。如本文所使用的，“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂的情况，降低酶的活性所需的拮抗剂的量。如本文所使用的，“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂的情况，破坏酶或蛋白质的功能所需的拮抗剂的量。精确量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如，lieberman,《医药剂型(pharmaceutical dosage forms)》(第1-3卷,1992)；lloyd,《医药学配混的艺术、科学和技术(the art,science and technology of pharmaceutical compounding)》(1999)；pickar,《剂量计算(dosage calculations)》(1999)；以及《雷明顿：医药科学和实践(remington:the science and practice of pharmacy)》,第20版,2003,gennaro编辑,利平科特
·
威廉斯
·
威尔金斯出版公司(lippincott,williams&wilkins))。
[0069]
如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指如上文所描述的足以改善病症的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将显示增加或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。治疗功效也可以表示为“倍数”增加或减
少。例如，相对于对照，治疗有效量可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的效果。
[0070]
剂量可以根据患者和正在使用的化合物的要求而变化。在本公开的背景中，向患者施用的剂量应足以随时间推移而在患者体内产生有益治疗应答。剂量的大小也将通过任何不良副作用的存在、性质和程度确定。针对特定情形的适当剂量的确定在执业医师的技术之内。通常，以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，以小的增量来增加剂量，直到在多个情况下达到最佳效果。可以单独调整给药的量和间隔，以提供所施用化合物的对所治疗的特定临床适应症有效的水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。
[0071]
如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者口服施用、以栓剂形式施用、局部接触、静脉内、肠胃外、腹膜内、肌肉内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或植入缓慢释放装置(例如，微型渗透泵)。通过任何途径进行施用，包含肠胃外和经粘膜(例如，颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外施用包含例如静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。其它递送模式包含但不限于使用脂质体调配物、静脉内输注、经皮贴剂等。在实施例中，施用不包含施用除了所叙述的活性剂之外的任何活性剂。
[0072]
如本文可以使用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸低聚物”、“寡核苷酸”、“核酸序列”、“核酸片段”和“多核苷酸”可互换地使用，并且旨包含但不限于共价地连接在一起的可以具有各种长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物、衍生物或修饰。不同的多核苷酸可以具有不同的三维结构，并且可以执行各种已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包含基因、基因片段、外显子、内含子、基因间dna(包含但不限于异色dna)、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、序列的分离的dna、序列的分离的rna、核酸探针和引物。可用于本公开的方法的多核苷酸可以包括天然核酸序列和其变体、人工核酸序列或此类序列的组合。
[0073]
多核苷酸通常由四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；和胸腺嘧啶(t)(当多核苷酸为rna时胸腺嘧啶(t)的尿嘧啶(u))。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；可替代地，所述术语可以应用于多核苷酸分子本身。此字母表示可以输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并且用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。多核苷酸可以任选地包含一种或多种非标准核苷酸、一种或多种核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。
[0074]
如本文所使用的，术语“经扩增dna片段”或“包括核酸序列的经扩增片段”是指通过体外扩增方法，例如聚合酶链式反应(pcr)、等温扩增、链置换扩增或任何其它dna扩增方法产生的多核苷酸序列。
[0075]
术语“微卫星基因座(microsatellite locus/microsatellite loci)”是指含有微卫星的生物体基因组中的基因座。“微卫星”是一段重复dna，其中某些dna基序(通常为一到六个或更多个碱基对)重复，通常重复5-50次。微卫星在生物体的基因组中的数千个位置处发生。
[0076]
如本文所使用的，术语“鉴定标志物”是指可以用于鉴定dna样品的基因座。鉴定标志物可以是在群体中具有等位基因变异性的任何基因座，使得等位基因变异性可以通过使用的扩增来区分。通常，此类鉴定标志物是短串联重复序列(str)多态性，并且这些多态性
可以基于str的长度来区分。例如，鉴定标志物可以是法医dna谱、亲子关系测定或类似方法中使用的任何基因座。此类鉴定标志物包含不限于釉原蛋白、csf1po、d13s317、d16s539、d18s51、d21s11、d3s1358、d5s818、d7s820、d8s1179、fga、pentad、pentae、th01、tpox和vwa。在实施例中，所述鉴定标志物是单核苷酸多态性(snp)。在实施例中，包括从鉴定标志物扩增的核酸序列的片段的长度在表现出msi的癌症中不改变或示出较小程度的改变。
[0077]
msi检测
[0078]
临床研究人员越来越多地将msi评价用于多种目的，包含：1)评估肿瘤免疫治疗选项的有效性；2)为诊断被称为林奇综合征(lynch syndrome)的肿瘤性遗传综合征提供信息(vaksman和garner,2015)。用户指示目前的市场解决方案不足以测试多种癌症类型，分析慢并且数据报告繁琐。提出的微卫星不稳定性测定旨在通过开发对多种癌症类型敏感的产品来解决这些问题，并且通过自动化基因分型简化数据分析。
[0079]
msi状态被用作癌症免疫疗法的预测性生物标志物。由于错配修复基因的遗传性种系突变或这些基因的表观遗传失活，微卫星不稳定性在许多癌症类型中以不同的频率被发现。具有最高比率msi的肿瘤包含子宫体子宫内膜癌、结直肠腺癌和胃腺癌(cortes-ciriano等人,2017)。
[0080]
林奇综合征是最常见的遗传性结直肠癌(crc)易感综合征。其占crc的新诊断病因的大约3％-5％并且占子宫内膜癌的2％-3％。美国临床肿瘤学会(american society of clinical oncology)建议对被诊断患有结直肠癌的所有人进行针对林奇综合征的肿瘤测试。最近的指南建议同样地对所有子宫内膜癌进行肿瘤测试。可以对肿瘤组织进行筛查测试以确定是否可能出现林奇综合征。一种测试方式是分析msi。msi测试的结果可以指示是否应该考虑更具体的基因测试。最近的结果指示，被测定为msi-h(msi-高)的所有癌症中有16％与林奇综合征相关联，无论肿瘤类型或家族史如何，都需要更广泛地测试msi(latham等人,2019)。
[0081]
片段分析已经常用于评估msi状态。片段分析应用是使用为特定询问任务设计的染料标记的引物通过pcr产生dna荧光片段的那些应用。然后使用毛细管电泳分离这些片段，并且通过与大小标准比较来确定大小。通过片段分析的msi分析遵循此相同范例；使用荧光标记的引物对所关注微卫星基因座进行pcr扩增。然后通过毛细管电泳(ce)或电泳分析标记的pcr产物，以按大小分离等位基因。
[0082]
当具有与正常分子不同的微卫星的dna比例较低时，很难检测到异常dna分子的存在。需要更准确的方式来分析ce数据以解决不确定性足以在给定dna基因座处可靠地区分msi高与msi稳定，并且确定整体遗传图谱是否可以被认为是msi高还是msi低。
[0083]
存在针对使用ce片段分析的可能的替代方案。在一简单实例中，测序技术可以用于对所关注dna基因座进行测序，并且通过序列分析(例如，计算序列中微卫星的数量)来分配msi状态。然而，使用除ce片段分析之外的测序技术或类似方法可能是不利的。例如，dna序列分析对多路数据的能力有限。另外，dna序列分析过程耗时较长，并且分析可能更容易出错。
[0084]
一方面，提供了一种用于检测dna样品中的微卫星不稳定性(msi)的方法。另一方面，提供了一种用于分析dna样品以测定所述dna样品中的微卫星不稳定性(msi)的方法。另一方面，提供了一种用于诊断生物样品中癌组织的存在的方法。另一方面，提供了一种用于
治疗患有或疑似患有癌症的受试者的癌症的方法。另一方面，提供了一种用于诊断患有或疑似患有癌症的受试者的癌症的方法。
[0085]
在实施例中，所述方法包含：a)共扩增dna样品的多个微卫星基因座以产生包括来自每个基因座的核酸序列的经扩增片段；b)测定来自每个基因座的所述经扩增片段的大小；以及c)将来自每个基因座的所述经扩增片段的大小与来自对照的对应的经扩增片段的大小进行比较。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少一个基因座：bat25、bat 26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，样品与对照之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示dna样品或生物样品中的对应基因座处存在msi。
[0086]
另一方面，提供了一种用于分析包括核酸序列的经扩增片段以测定微卫星不稳定性(msi)的方法，所述方法包含：a)提供从dna样品或生物样品中的多个微卫星基因座扩增的经扩增片段；b)测定所述经扩增片段的大小；c)将步骤b)的所述经扩增片段的大小与来自成对正常dna样品或成对正常生物样品的对应的经扩增片段的大小进行比较，所述样品之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示所述dna样品中存在msi；以及d)为所述dna样品分配msi程度，由此测定所述dna样品的msi状态。
[0087]
在实施例中，样品与对照之间的一个或多个经扩增片段之间的大小差异指示dna样品中的对应基因座处存在微卫星不稳定性(msi)。在实施例中，dna样品中存在msi指示所述dna样品所源自的生物样品含有癌组织。
[0088]
在实施例中，所述方法进一步包含为dna样品分配msi程度。在实施例中，如果测定dna样品中大于约30％的基因座具有msi，则为所述dna样品分配高msi程度(微卫星不稳定性高)。在实施例中，如果测定dna样品中少于约30％但大于约1％的基因座具有msi，则为所述dna样品分配低msi程度(微卫星不稳定性低)。在实施例中，如果测定dna样品中没有基因座具有msi，则为所述dna样品分配稳定程度(微卫星稳定)。例如，当共扩增13个基因座时，其中测定至少4个(或至少3个)基因座具有msi的dna样品被分配高msi程度(即，msi-高)；其中测定至少1个但少于4个(或少于3个)基因座具有msi的dna样品被分配低msi程度(即，msi-低)；其中测定0个基因座具有msi的dna样品被分配稳定msi程度(即，为msi-稳定)。
[0089]
在实施例中，dna样品中存在msi指示受试者患有癌症。在实施例中，所述方法包含向所述患有癌症的受试者施用抗癌剂。
[0090]
在实施例中，用于扩增基因座的引物包含修饰。在实施例中，使用引物对扩增每个基因座，并且所述引物对中的至少一个引物包含修饰。在实施例中，所述修饰可以是迁移修饰剂，如聚乙二醇(peg)、锁核酸(lna)、3'-小沟结合剂，或者将非特异性核酸添加到引物序列的一端。在实施例中，所述经扩增片段包含修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标志物。可检测标志物包含但不限于荧光标志物/染料和放射性标志物。荧光标记/染料在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于荧光素、fam(羧基荧光素)(例如，5-fam、6-fam)、tet、vic(2'-氯-7'苯基-1,4-二氯-6-羧基-荧光素)、hex、ned、pet、joe、tet、cal fluor orange560、tamra、570、cal fluor red、rox
tm
、texasquasar 670、lc red 640、lc red 705、sid、taz、yy、罗丹明(或衍生物)、香豆素(或衍生物)以及青色素(或衍生物，例如cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7)或这些分子中任何分子的衍生物。
[0091]
在实施例中，所述方法进一步包含在步骤a)中共扩增一种或多种鉴定标志物。在
实施例中，所述一种或多种鉴定标志物包含釉原蛋白、csf1po、d13s317、d16s539、d18s51、d21s11、d3s1358、d5s818、d7s820、d8s1179、fga、pentad、pentae、th01、tpox和/或vwa。在实施例中，所述一种或多种鉴定标志物包含pentad。在实施例中，所述一种或多种鉴定标志物包含th01。在实施例中，所述一种或多种鉴定标志物包含pentad和th01。
[0092]
在实施例中，术语“比较大小”是指比较核酸片段的大小或大小分布。可以通过任何方法进行比较，如凝胶电泳、毛细管电泳、dna测序、显微可视化(例如，吸附网格电子显微镜可视化或克莱因施密特电子显微镜可视化(kleinschmidt electron microscopic visualization))等。可以例如通过片段大小的可视化和/或通过计算机实施的程序来执行比较。
[0093]
在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少2个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少3个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少4个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少5个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少6个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少7个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少8个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少9个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少10个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少11个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含选自以下的至少12个基因座：bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。在实施例中，多个基因座包含bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和abi-19。
[0094]
在实施例中，多个基因座包含bat25。在实施例中，多个基因座包含bat26。在实施例中，多个基因座包含bat40。在实施例中，多个基因座包含cat25。在实施例中，多个基因座包含nr21。在实施例中，多个基因座包含nr22。在实施例中，多个基因座包含nr24。在实施例中，多个基因座包含nr27。在实施例中，多个基因座包含abi-20a。在实施例中，多个基因座包含abi-17。在实施例中，多个基因座包含abi-16。在实施例中，多个基因座包含abi-20b。在实施例中，多个基因座包含abi-19。
[0095]
在实施例中，dna样品来自生物样品。在实施例中，所述生物样品包含肿瘤细胞、疑似癌性的细胞或其它疑似癌性的或来自癌细胞的生物材料。
[0096]
在实施例中，所述对照是成对正常dna样品、来自非癌组织的dna样品、来自血液样
品的dna、基于正常群体的平均值或基于正常群体的中值。在实施例中，术语“正常”是指来自非癌组织的dna样品。在实施例中，术语“正常”是指来自与癌组织相邻的非癌组织的dna样品。
[0097]
在实施例中，使用选自seq id no.:1-26的一个或多个引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:1的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:2的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:3的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:4的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:5的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:6的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:7的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:8的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:9的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:10的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:11的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:12的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:13的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:14的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:15的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:16的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:17的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:18的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:19的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:20的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:21的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:22的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:23的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:24的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:25的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。在实施例中，使用含有seq id no.:26的核苷酸序列的引物共扩增微卫星基因座。
[0098]
在实施例中，使用包含第一引物和第二引物的引物对共扩增微卫星基因座。在实施例中，所述第一引物和所述第二引物的多核苷酸序列(分别)包含以下对之一：seq id no.:1的多核苷酸序列和seq id no.:2的多核苷酸序列；seq id no.:3的多核苷酸序列和seq id no.:4的多核苷酸序列；seq id no.:5的多核苷酸序列和seq id no.:6的多核苷酸序列；seq id no.:7的多核苷酸序列和seq id no.:8的多核苷酸序列；seq id no.:9的多核苷酸序列和seq id no.:10的多核苷酸序列；seq id no.:11的多核苷酸序列和seq id no.:12的多核苷酸序列；seq id no.:13的多核苷酸序列和seq id no.:14的多核苷酸序列；seq id no.:15的多核苷酸序列和seq id no.:16的多核苷酸序列；seq id no.:17的多核苷酸序列和seq id no.:18的多核苷酸序列；seq id no.:19的多核苷酸序列和seq id no.:20的多核苷酸序列；seq id no.:21的多核苷酸序列和seq id no.:22的多核苷酸序列；seq id no.:23的多核苷酸序列和seq id no.:24的多核苷酸序列；seq id no.:25的多
核苷酸序列和seq id no.:26的多核苷酸序列。
[0099]
在实施例中，使用选自seq id no.:27-31的一个或多个引物共扩增鉴定标志物。在实施例中，使用含有seq id no.:27的核苷酸序列的引物共扩增鉴定标志物。在实施例中，使用含有seq id no.:28的核苷酸序列的引物共扩增鉴定标志物。在实施例中，使用含有seq id no.:29的核苷酸序列的引物共扩增鉴定标志物。在实施例中，使用含有seq id no.:30的核苷酸序列的引物共扩增鉴定标志物。在实施例中，使用含有seq id no.:31的核苷酸序列的引物共扩增鉴定标志物。
[0100]
在实施例中，使用热循环扩增多个微卫星基因座。在实施例中，通过片段分析、桑格测序、离子半导体测序或高分辨率熔融曲线分析对所得核酸片段进行分析。在实施例中，所述桑格测序是毛细管电泳桑格测序。
[0101]
在实施例中，所述dna样品和所述成对正常dna样品来自同一个体在实施例中，所述成对正常dna样品是来自非癌组织的对照dna。在实施例中，所述dna样品和所述成对正常dna样品来自相同类型的组织。
[0102]
癌症可以是任何类型的癌症。特别地，癌症可以是与msi相关联的任何癌症。在实施例中，所述癌症是结直肠癌、胃癌、肾上腺皮质癌、宫颈癌、间皮瘤或子宫内膜癌。
[0103]
在给定微卫星基因座处，毛细管电泳(ce)可以用于通过使用片段分析来测量微卫星的数量。与如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等其它方法相比，自动化ce使用荧光染料并且以更高的分辨率和更高的精度进行分离。
[0104]
为了在ce系统上运行片段分析，可以将探针和引物设计为侧接所关注区域。这可以通过将荧光染料附接到与聚合酶链式反应(pcr)一起使用的引物或探针上来完成，以在电泳之前扩增所关注dna基因座并且将扩增子提交给ce。还存在设定大小标准品，即使用与测试片段的颜色不同的颜色标记的一组已知大小的片段。然后将标记的pcr产物和所述设定大小标准品电动地注入到毛细管中。在电泳期间，当在电极之间施加高压时，带负电荷的dna片段从阴极穿过填充聚合物的毛细管朝带正电荷的阳极移动。
[0105]
使用ce进行的dna片段分析可以进行多路复用，这意味着反应孔中有多个片段穿过同一毛细管。较小的片段通常运行得更快，并且较大的片段运行得更慢。在到达阳极之前不久，按大小分离的荧光标记的dna片段移动通过激光束的路径。所述激光束使片段上的染料以不同的发射波长发出荧光。ccd相机检测荧光，并且荧光强度被数字化、颜色编码并且在电泳图中显示为峰。相对于较短的片段，较长的片段将在稍后的数据中出现。
[0106]
试剂和试剂盒
[0107]
另一方面，提供了一种引物组。所述引物组可以包含一个或多个引物对，每个引物对包含第一引物和第二引物(例如，正向和反向引物)。在实施例中，所述第一引物和所述第二引物的多核苷酸序列包含以下对之一：seq id no.:1的多核苷酸序列和seq id no.:2的多核苷酸序列；seq id no.:3的多核苷酸序列和seq id no.:4的多核苷酸序列；seq id no.:5的多核苷酸序列和seq id no.:6的多核苷酸序列；seq id no.:7的多核苷酸序列和seq id no.:8的多核苷酸序列；seq id no.:9的多核苷酸序列和seq id no.:10的多核苷酸序列；seq id no.:11的多核苷酸序列和seq id no.:12的多核苷酸序列；seq id no.:13的多核苷酸序列和seq id no.:14的多核苷酸序列；seq id no.:15的多核苷酸序列和seq id no.:16的多核苷酸序列；seq id no.:17的多核苷酸序列和seq id no.:18的多核苷酸
序列；seq id no.:19的多核苷酸序列和seq id no.:20的多核苷酸序列；seq id no.:21的多核苷酸序列和seq id no.:22的多核苷酸序列；seq id no.:23的多核苷酸序列和seq id no.:24的多核苷酸序列；seq id no.:25的多核苷酸序列和seq id no.:26的多核苷酸序列。
[0108]
在实施例中，至少一个引物包含修饰。在实施例中，每个引物对中的至少一个引物包括修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标记。
[0109]
另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含先前所描述的引物组中的任一个的引物组，包含实施例。在实施例中，引物组包含至少2个引物对。在实施例中，引物组包含至少3个引物对。在实施例中，引物组包含至少4个引物对。在实施例中，引物组包含至少5个引物对。在实施例中，引物组包含至少6个引物对。在实施例中，引物组包含至少7个引物对。在实施例中，引物组包含至少8个引物对。在实施例中，引物组包含至少9个引物对。在实施例中，引物组包含至少10个引物对。在实施例中，引物组包含至少11个引物对。在实施例中，引物组包含至少12个引物对。在实施例中，组合物包含至少13个引物对。
[0110]
在实施例中，引物对包含seq id no.:1-26中的一个或多个的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:1的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:2的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:3的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:4的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:5的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:6的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:7的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:8的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:9的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:10的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:11的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:12的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:13的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:14的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:15的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:16的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:17的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:18的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:19的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:20的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:21的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:22的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:23的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:24的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:25的多核苷酸序列。在实施例中，引物对包含seq id no.:26的多核苷酸序列。
[0111]
在实施例中，引物组进一步包含用于鉴定标志物的扩增的引物对。在实施例中，所述鉴定标志物包含pentad和/或th01。在实施例中，所述鉴定标志物包含th01。在实施例中，所述鉴定标志物包含pentad和th01。在实施例中，用于pentad的扩增的引物对包括包含seq id no.:27-29中的一个或多个的多核苷酸序列的引物。在实施例中，用于th01的扩增的引物对包括包含seq id no.:30-31中的一个或多个的多核苷酸序列的引物。在实施例中，引物包含含有seq id no.:27的核苷酸序列的引物。在实施例中，引物包含含有seq id no.:28的核苷酸序列的引物。在实施例中，引物包含含有seq id no.:29的核苷酸序列的引物。在实施例中，引物包含含有seq id no.:30的核苷酸序列的引物。在实施例中，引物包含使
用含有seq id no.:31的核苷酸序列的引物。
[0112]
在实施例中，至少一个引物被修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标记。在实施例中，所述组合物进一步包含聚合酶。在实施例中，所述组合物进一步包含多个脱氧核糖核苷酸三磷酸。在实施例中，所述组合物进一步包含dna样品。在实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种盐。
[0113]
另一方面，提供了一种试剂盒，其包含缓冲液和包含用于微卫星基因座的扩增的至少一个引物对的引物组，所述引物对包含第一引物和第二引物。在实施例中，微卫星基因座包含bat25、bat26、bat40、cat25、nr21、nr22、nr24、nr27、abi-20a、abi-17、abi-16、abi-20b和/或abi-19。
[0114]
在实施例中，引物组包含至少2个引物对。在实施例中，引物组包含至少3个引物对。在实施例中，引物组包含至少4个引物对。在实施例中，引物组包含至少5个引物对。在实施例中，引物组包含至少6个引物对。在实施例中，引物组包含至少7个引物对。在实施例中，引物组包含至少8个引物对。在实施例中，引物组包含至少9个引物对。在实施例中，引物组包含至少10个引物对。在实施例中，引物组包含至少11个引物对。在实施例中，引物组包含至少12个引物对。在实施例中，引物组包含至少13个引物对。在实施例中，引物组包含至少14个引物对。在实施例中，引物组包含至少14个引物对。在实施例中，引物组包含具有seq id no.:1-26中的任一个的多核苷酸序列的至少一个引物。在实施例中，引物组包含13个引物对，所述引物具有seq id no.:1-26中的每一个的多核苷酸序列。在实施例中，引物组是如上文所描述的引物组。
[0115]
在实施例中，引物组进一步包含用于鉴定标志物的扩增的引物对。在实施例中，所述鉴定标志物包含pentad。在实施例中，所述鉴定标志物包含th01。在实施例中，所述鉴定标志物包含pentad和th01。在实施例中，引物组包含具有seq id no.:27-31中的任何一个或多个的多核苷酸序列的引物。
[0116]
在实施例中，所述第一引物和所述第二引物的多核苷酸序列包含以下对之一：seq id no.:1的多核苷酸序列和seq id no.:2的多核苷酸序列；seq id no.:3的多核苷酸序列和seq id no.:4的多核苷酸序列；seq id no.:5的多核苷酸序列和seq id no.:6的多核苷酸序列；seq id no.:7的多核苷酸序列和seq id no.:8的多核苷酸序列；seq id no.:9的多核苷酸序列和seq id no.:10的多核苷酸序列；seq id no.:11的多核苷酸序列和seq id no.:12的多核苷酸序列；seq id no.:13的多核苷酸序列和seq id no.:14的多核苷酸序列；seq id no.:15的多核苷酸序列和seq id no.:16的多核苷酸序列；seq id no.:17的多核苷酸序列和seq id no.:18的多核苷酸序列；seq id no.:19的多核苷酸序列和seq id no.:20的多核苷酸序列；seq id no.:21的多核苷酸序列和seq id no.:22的多核苷酸序列；seq id no.:23的多核苷酸序列和seq id no.:24的多核苷酸序列；seq id no.:25的多核苷酸序列和seq id no.:26的多核苷酸序列。
[0117]
在实施例中，引物组中的一个或多个引物被修饰。在实施例中，引物组的每个引物对中的至少一个引物被修饰。在实施例中，所述修饰包含可检测标记。
[0118]
在实施例中，引物组的所有引物都存在于同一容器中。在实施例中，试剂盒进一步包含聚合酶。在实施例中，试剂盒进一步包含多种脱氧核苷三磷酸。在实施例中，缓冲液是pcr缓冲液。在实施例中，所述试剂盒进一步包含用于鉴定生物样品中的微卫星不稳定性的
计算机程序。
[0119]
系统和分析方法
[0120]
另一方面，提供了一种系统，所述系统包含如先前所描述的组合物，包含实施例，以及被配置成执行dna扩增的第一装置。在实施例中，所述第一装置被配置成执行桑格测序、离子半导体测序、毛细管电泳或高分辨率熔融分析。在实施例中，所述系统进一步包含被配置成比较和/或分析使用引物扩增dna产生的核酸片段的第二装置。
[0121]
另一方面，通过了一种系统，所述系统包含如先前所描述的组合物，包含实施例，以及被配置成比较和/或分析使用引物扩增dna产生的核酸片段的装置。
[0122]
涉及手动检查ce片段分析数据以进行msi状态调用的现有技术解决方案倾向于相当耗时并且对于有限的手动检查时间使用效率低下。本文所讨论的本发明的实施例提供了在许多情况下自动进行msi状态调用的覆盖范围非常广泛的合理方法。所描述的方法还可以用于例如，通过报告计算结果与决策阈值的接近程度来为调用分配置信度量度，这进而可以用于将人工审查工作集中在自动化msi评估置信度低的情况上。
[0123]
现将参看附图在下文更充分描述各种实施例，所述附图形成本发明的一部分且作为说明展示实践实施例的具体实例。然而，本说明书可以许多不同的形式得到实施，并且不应被解释为限于本文中阐述的实施例；更确切些，提供这些实施例是为了使本说明书将是透彻且完整的，并且这些实施例将把本发明的范围完整地传达给本领域技术人员。此外，本说明书可以体现为方法或装置。因此，本文中的各种实施例中的任一个可采取完全硬件实施例、完全软件实施例或组合软件和硬件方面的实施例的形式。因此，以下说明书不应被视为具有限制意义。
[0124]
图1展示了根据本发明的示例性实施例的系统1000。本发明的实施例中阐述的dna片段分析过程开始于从组织样品中提取dna。可以在扩增仪器112(如热循环仪)中进行的pcr反应中扩增正在研究的一个或多个核酸样品111中的多个所关注微卫星dna基因座。本发明的一些实施例中使用的示例性热循环仪器包含应用生物系统proflex pcr系统、simpliamp热循环仪和由赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)制造的其它热循环仪系统。使用湿化学试剂盒110进行pcr反应，所述湿化学试剂盒含有专门设计的荧光标记的引物以侧接所关注微卫星基因座，如本文所描述的那些微卫星基因座。系统1000包括基于毛细管电泳的遗传分析器仪器(例如测序仪)101、一台或多台计算机103和用户装置108。在本发明的一些实施例中使用的示例性遗传分析器仪器包含赛默飞世尔科技公司的应用生物系统seqstudio遗传分析器、models 3500、3720和3130以及由赛默飞世尔科技公司和其它公司制造的类似的基于毛细管电泳的遗传分析器。
[0125]
如图2所示的示例性过程中示出的，毛细管电泳(ce)是用于按大小分离离子片段的过程200。在本发明的一些实施例中使用的赛默飞世尔科技公司ce仪器中，电动注射用于将dna片段从溶液中注射到包括一个或多个毛细管的毛细管阵列201的每个毛细管中。在毛细管电泳期间，pcr反应的延伸产物(以及任何其它带负电荷的分子，如盐或未掺入的引物和核苷酸)由于电动注射而进入毛细管。施加到样品上的高压电荷迫使带负电荷的片段进入到毛细管中。延伸产物根据其总电荷按大小分离。样品的电泳迁移率可能受到以下运行条件的影响：缓冲液类型、浓度和ph；运行温度；施加的电压的量；以及使用的聚合物的类型。
[0126]
在到达阳极之前不久，按大小分离的荧光标记的dna片段移动穿过激光束202的路径。所述激光束使附接到片段的染料发出荧光。染料信号由衍射系统203分离，并且ccd相机检测荧光，如204中所示。因为每种染料在被激光激发时都会发出不同波长的光，可以在一次毛细管注射中检测和区分所有颜色并且因此检测和区分基因座。荧光信号被转换成数字数据，然后所述数据以与分析软件应用程序兼容的文件格式存储。
[0127]
通常，来自ce仪器的数据是一系列荧光峰，而不是给定数量的微卫星所期望的扩增子精确大小处的单个峰。这是由所关注dna的扩增的细微差别引起的；所涉及的生物分子机制的“断断续续(stutter)”可能导致产生其中微卫星数量比微卫星的真实数量多一点或少一点的扩增子。由于这种“断断续续”，在测定微卫星的数量和/或在测定微卫星的数量是否与正常非癌组织中预期的数量不同时可能存在一些不确定性。
[0128]
除了从ce仪器接收到的信号的复杂性之外，单一染料可以与若干种不同的pcr引物一起使用，所述引物针对不同的dna基因座。这样做是因为仪器对可以使用的不同染料的数量施加了限制，并且所关注dna基因座的数量可能会超过可以使用的最大染料数量。如果在其相应的pcr引物上使用相同染料的一组基因座之间扩增子大小有很大差异，则与所述基因座中的每个基因座相关联的荧光峰将在由ce仪器生成的数据中被很好地分离。
[0129]
用于实施图1中示出的ce数据分析算法102的指令驻留在存储在存储装置105中的计算机程序产品104中，并且这些指令可由处理器106执行。当处理器106正在执行计算机程序产品104的指令时，所述指令或其一部分通常被加载到工作存储器109中，处理器106可以容易地从所述工作存储器访问所述指令。在所展示的实施例中，计算机程序产品104被存储在存储装置105或其它非暂时性计算机可读介质中(其可以包含跨不同装置和不同位置上的介质分布)。在替代性实施例中，存储介质是暂时性的。
[0130]
在一个实施例中，处理器106实际上包括多个处理器，所述多个处理器可以包括另外的工作存储器(另外的处理器和存储器未单独展示)，包含图形处理单元(gpu)，所述gpu包括支持大规模并行计算的至少数千个算术逻辑单元。gpu通常用于深度学习应用程序，因为gpu可以比典型的通用处理器(cpu)更有效地执行相关处理任务。其它实施例包括一个或多个专用处理单元，所述专用处理单元包含脉动阵列和/或支持高效并行处理的其它硬件布置。在一些实施例中，此类专用硬件与cpu和/或gpu一起工作以执行本文所描述的各种处理。在一些实施例中，此类专用硬件包括专用集成电路等(其可以指特定于应用程序的集成电路的一部分)、现场可编程门阵列等和其组合。然而，在一些实施例中，如处理器106等处理器可以实施为一个或多个通用处理器(优选地具有多个核)，而不必背离本发明的精神和范围。
[0131]
图3示出了可以在图1的系统中使用的示例性遗传分析器仪器系统300。在本发明的一些实施例中，示例性遗传分析器仪器系统300包括由赛默飞世尔科技公司制造的applied biosystems
tm
seqstudio
tm
遗传分析器仪器系统，尽管可以使用类似地能够执行毛细管电泳的其它遗传分析器仪器系统。
[0132]
系统300包括遗传分析器仪器310、一体式筒320和阴极缓冲液330。内置在遗传分析器仪器310中的是触摸屏显示器340和usb端口350。本发明的一些实施例中使用的遗传分析器系统300允许在同一板上运行多次片段分析和/或测序。遗传分析器系统300易于与基于集成筒的系统320一起使用，并且允许研究人员访问和监测实验运行以及在集成触摸屏
显示器340上或远程查看数据。完全连接的遗传分析器以及简单的筒设计，可以由实验室或设施中的多个研究人员轻松共享。
[0133]
在本发明的一些实施例中，仪器的易于使用的功能核心包含有助于最大化效率和便利性的筒设计。例如，上文提到的seqstudio遗传分析器使用图4中更详细示出的一体式筒320，所述一体式筒含有毛细管阵列440、聚合物储液器410、聚合物递送系统420和阳极缓冲液430。在筒320的一些实施例中也可以提供激光检测窗口。筒320是可移除的，并且可以在仪器上存放至多四个月。在本发明的一些实施例中，每个筒都含有对seqstudio系统而言独特的新聚合物，所述seqstudio系统允许在不重新配置的情况下执行桑格测序和片段分析。在本发明的一个实施例中，筒具有四个毛细管，并且可以处理来自标准96孔板或8孔带管的样品。在本发明的一些实施例中，筒和阴极缓冲液容器包含射频识别(rfid)标签，所述rfid标签跟踪注射(筒)数量和在仪器(阴极缓冲液容器)上的时间长度。这允许科学家使用相同的仪器来维护其自己的筒。
[0134]
遗传分析器仪器系统300允许实时监控seqstudio遗传分析器上的运行。如图5中示出的，仪器300实时显示每个毛细管的结果510。一旦注射完成，计算若干个质量检查并且将其显示在示例性屏幕显示520中。如果注射产生较差的痕量或较差的qc值，则可以重新注射这些样品，并且改变注射参数(如果需要的话)。来自非现场计算机监测的示例性屏幕快照530示出了运行的进度。在本发明的一些实施例中使用的示例性屏幕快照540中，在platemanager用户界面中设置的运行可以直接上传到仪器。platemanager允许研究人员在同一个板上分配多个测序和片段分析运行，利用筒中的通用聚合物并且仅在需要时使用所述通用聚合物，从而提供另一个级别的灵活性。如图5的用户界面屏幕快照510-540中示出的，在本发明的一些实施例中使用的seqstudio遗传分析器的维护对于用户来说是简单和直接的，并且可以通过利用成像和算法工具的进步来自动处理本文所述的本发明的示例性实施例中使用的遗传分析器仪器中使用的仪器校准。
[0135]
如图6中示出的，通过将无线连接集成到图3中示出的示例性遗传分析器仪器中，可以增加另一个级别的便利性。图6示出了seqstudio遗传分析器仪器可以如何以若干种不同方式可由用户访问：通过机载界面、远程计算机或移动装置app。在本发明的一些实施例中，可以使用机载计算机或通过使用platemanager(在thermo fisher connect内或在单独的计算机上运行的独立软件)设置测定或实验运行，如610中示出的。通过使用基于网页浏览器的软件，可以从任何可以访问互联网的地方立即访问运行设置、板图、运行条件和分析设置。注射条件、再注射和注射重新排序都可以在如620中示出的运行期间进行监测和修改，从而最大化从每个板收集质量数据的能力。在数据收集之后，基于网络浏览器的应用程序套件，包含用于测量微卫星不稳定性的应用程序，允许在本发明的一些实施例中进行可访问的分析。在运行完成后，在分析步骤630中，dna序列变体、比对和片段分析的测定均立即可用。最后，云连接650使得不同位置的协作者能够在共享和协作步骤640中的后运行的任何时间监测、访问、共享数据信息并快速分析相同的数据集。
[0136]
seqstudio遗传分析器通过仪器本身或通过智能手机、平板计算机或其它用户装置提供触摸屏可用性，从而允许研究人员在远程以及在现场以同样的效率协作和分析数据。如在本发明的一些实施例中使用的本文所讨论的示例性遗传分析器系统是为需要简单且负担得起的桑格测序和片段分析的新用户和有经验的用户设计的，而不影响性能或质
量。
[0137]
图7示出了在本发明的一些实施例中用于测定生物样品的msi状态的方法700的流程图。在步骤710中，选择生物样品的一个或多个dna基因座以研究表现出高突变率并因此表现出高微卫星不稳定性的肿瘤。
[0138]
微卫星不稳定性(msi)是由于dna复制过程中保真度降低而导致的一种形式的基因组不稳定性；这被认为是由dna修复机制的缺陷引起的。通过检查dna中存在重复多次的单个核苷酸(四种可能的核苷酸之一)(均聚物)的位置，最容易观察到这种生物分子机制中的缺陷；例如，gggggggggg(seq id no:32)是鸟嘌呤的11个碱基重复序列。扩展此实例，在肿瘤细胞中经常出现受损的dna修复机制的情况下，具有鸟嘌呤的11个碱基重复序列的dna部分可以被复制为例如10个碱基或5个碱基或13个碱基，而不是正常的11个碱基。微卫星不稳定性分析涉及旨在检查dna中存在均聚物的若干个不同区域的化学物质。这些化学物质选择并扩增包含所关注均聚物中每个所关注均聚物的dna部分(特定dna基因座处的dna经扩增片段)。因此，再次以11个碱基鸟嘌呤实例为基础，通常此基因座处扩增dna的片段大小将为例如20个碱基(由化学物质选出的某些数量大于11)。然而，如果dna复制修复机制受损，则复制的dna可能例如仅有10个而不是通常的11个鸟嘌呤，因此经扩增片段的大小将为19而不是20。有两种方式可以使用作为本公开的主题的技术来检测此情况：1)分析来自同一个人的肿瘤组织和正常组织的dna并比较这两种dna，或2)分析来自肿瘤组织的dna，并在dna修复机制没有损伤的情况下与每个所关注dna基因座处通常预期的dna进行比较。注意，这些概念以及本公开中所描述的本发明也适用于由简单重复的核苷酸序列组成的dna的非均聚物部分，例如，acacacac或tatgtatgtatgtagt(seq id no:33)等。
[0139]
因此，在步骤710中，针对与其它癌症类型相比所述基因座对正在研究的癌症类型的敏感性，可以选择特定dna基因座。针对在所述特定基因座处dna扩增的可靠性，还可以选择特定dna基因座(也被称为标志物)。
[0140]
在步骤720中，检查每个dna基因座并且可以针对每个基因座选择一个或多个算法以测定给定基因座为微卫星不稳定msu还是微卫星稳定mss。本发明的实施例利用多种算法来测定给定dna基因座为msu还是mss，包含下文的算法1到11。在步骤730中，对每个所选dna基因座执行所选算法。在步骤740中，通过组合每个所选dna基因座的msi结果来测定生物样品的整体msi状态。
[0141]
图8示出了用于评估生物样品的微卫星不稳定性的方法的另一个实施例，所述方法首先在上文和图7中进行了描述。图8中示出的实施例提供了详细说明图7中示出的微卫星不稳定性评估方法的实施例的另外细节和替代性数据分析途径。从图8的步骤810处开始，获得跨生物样品的所有dna基因座的ce片段分析数据。如步骤805中示出的，可以单独分析每个dna基因座或标志物。可替代地，如图8的步骤815中示出的，可以一起分析标志物。如果要在步骤805中单独分析标志物，则可以在步骤820中针对每个标志物提取一个或多个信号特征，并且在步骤830中可以将一个或多个分类函数，如下文所描述的示例性分类函数应用于所提取的信号特征以测定每个标志物的msi状态。
[0142]
1.简单大小阈值：出现低于片段大小阈值(或高于片段大小阈值，取决于mss情况的位置)的任何荧光峰都被认为是msu。如果给定染料仅覆盖一个dna基因座，并且核苷酸数量在msu与mss dna分子情况之间显著不同，则这是适当的。
[0143]
2.片段大小区间：如果在给定的片段大小区间(数据的dna片段大小轴线上的区间)内出现任何荧光峰，则认为dna基因座是msu。这假定使用相同染料覆盖所有dna基因座的大小区间之间没有重叠，并且与msu和mss情况相关联的荧光峰也被很好地分离。
[0144]
3.给定大小区间内的峰值计数：如果显著荧光峰值的数量(显着性由峰大小确定)高于阈值，则认为基因座是msu。这假定使用相同染料覆盖所有dna基因座的大小区间之间没有重叠。
[0145]
4.给定大小区间内的相关峰值计数：如果显著荧光峰值的数量(显着性由峰大小确定)显着偏离mss的预期，则基因座被认为是msu。这假定使用相同染料覆盖所有dna基因座的大小区间之间没有重叠。
[0146]
5.给定大小区间内的峰值包络峰值：如果包络峰值的数量为两个或更多个，则认为基因座为msi-高。这假定使用相同染料覆盖所有dna基因座的大小区间之间没有重叠。
[0147]
6.给定大小区间内的峰值包络分离：如果两个最大包络峰之间的分离显著偏离msi-稳定样品的分离，则认为基因座为msi-高。这假定使用相同染料覆盖所有dna基因座的大小区间之间没有重叠。
[0148]
7.峰值模式：峰值模式可以由以下中的两个或更多个值组成：峰值幅度和/或沿片段大小轴线的位置；峰值幅度和/或相对于最大峰值的位置；峰值包络峰值幅度、位置和/或宽度；相对于峰值包络度量的峰值度量；
[0149]
8.峰值模式偏离正常值：上述(7)相对于来自正常组织样品的这些模式的峰值模式；
[0150]
9.峰值模式偏离正常(非癌症)群体峰值模式：上述(7)相对于来自这些模式的标称值的峰值模式，如未患癌症的人群的平均值、中位数、z评分等。
[0151]
10.相对于群体偏离峰值模式偏离正常值：上述(8)和(9)的组合，其中(8)的度量与未患癌症人群的这些模式的标称值进行比较。
[0152]
11.差异信号模式：在来自给定人的数据可从正常组织和肿瘤组织中获得的情况下，可以根据来自肿瘤和正常组织的标准化数据之间的差异来计算上文所描述的信号模式。另外，来源于差异信号的其它度量可以用于表征每个基因座处的差异信号。例如，差异信号的不对称性可以通过与负峰值相比差异信号的正峰值的质心之间的差异来表征。其它实例包含差异信号最大值和最小值的相对位置、正峰值与负峰值相比的均方根(rms)值、差异信号的整体rms值等。
[0153]
对于第(7)到(11)项，用于测定dna基因座为mss还是msu的算法将由可以处理多维向量的合适分类函数组成。例如，判别函数、多层人工神经网络、向量机等都是可以应用的典型机器学习方法的实例。可替代地，代替第(7)到(10)项中概述的预先指定信号特征，可以应用深度学习方法，通过使用定位到所关注片段大小区间的大量ce片段分析数据样本来自动学习最佳信号特征以区分msu和mss。
[0154]
为了在图7的步骤740中或从图8的步骤810开始对msi状态进行总体评估，在步骤840中，每个dna基因座的msi结果可以在正在研究的核酸样品中的所有标志物上组合，以分配整体msi状态调用。以下是使用两个或更多个dna基因座时用于进行此操作的示例性方法：
[0155]
12.固定百分比水平：如果为msu的dna基因座的百分比高于所选阈值，则总体分配
为msi-高(或者如果为msu的dna基因座的百分比低于第一所选阈值但高于第二预定阈值，则为msi-低)，并且如果为msu的dna基因座的百分比低于这两个阈值，则为mss。
[0156]
13.加权和：在本发明的一个实施例中，可以在为msu基因座分配示例性值1和为mss基因座分配示例性值0之后计算跨dna基因座的加权和；如果跨基因座的加权和超过阈值，则可以为整体评估分配msi-高。线性判别函数是确定权重的示例性方式。
[0157]
14.非线性分类：如图8中在步骤820和830处所示出的，跨dna基因座的msi结果可以可替代地以非线性方式组合以确定步骤840中msi状态的总体评估。用于确定非线性分类函数的示例性方式是训练多层人工神经网络以进行分配。
[0158]
已经发现用本领域已知的常规反向传播技术训练以最小化交叉熵的标准3层人工神经网络在区分msu和mss情况下提供足够的准确度。
[0159]
15.指向整体评估：代替如在步骤805中预先评估每个dna基因座的msi状态，标志物可以在步骤815中一起分析，并且第(7)到(11)项中表达的信号特征可以跨dna基因座组合，如步骤860中示出的，并且用于生成直接分配整体msi状态的一个或多个分类函数，如图8的步骤870中示出的。例如，假设标志物a使用3个信号特征来确定其为msu还是mss，并且标志物b为此使用4个特征。在本发明的一个实施例中，可以将来自两个标志物的特征组合成7维特征向量以馈送到人工智能生成的分类器，如经过训练以将此向量映射到整体msi状态调用的人工神经网络中。代替显式算法来组合跨标志物的信息，所述信息的组合在此人工神经网络分类器的训练中成为固有的。可替代地，人工智能生成的分类器可以通过深度学习方法来实施，除了在步骤805中单独分析标记之后或如在步骤815中示出的与所述步骤一起将跨dna基因座的数据组合在分析中之外，所述深度学习方法可以如上文所描述来使用。信号特征被直接馈送到深度学习神经网络中，用于直接映射到msi状态调用中，如图8的步骤850中示出的。例如，在步骤880处，可以将来自每个基因座的信号连接成一个大信号向量并馈送到深度学习网络中，以将其映射到整体msi状态调用中。
[0160]
本发明的一些实施例包括用于使用一种或多种抗肿瘤药物治疗肿瘤患者的方法。在特定实施例中，本文所公开的一种或多种方法、计算机程序产品、系统或试剂盒用于测定从患者获得的生物样品中肿瘤细胞的微卫星不稳定性。然后，如果测定微卫星不稳定性高，则向所述患者施用一种或多种抗肿瘤药物以治疗所述肿瘤。
[0161]
可以使用有形体现在信息载体(例如，非暂时性机器可读存储装置)中的计算机程序产品来实施本文所述的系统、设备和方法，以供可编程处理器执行；并且可以使用由此类处理器执行的一个或多个计算机程序实施本文所述的方法步骤，包含图6、图7和图8以及替代性实施例中的方法的步骤中的一者或多者。计算机程序是可以在计算机中直接或间接使用的以执行某种活动或产生某种结果的一组计算机程序指令。计算机程序可以以包含编译语言或解释性语言的任何形式的编程语言编写，并且所述计算机程序可以以任何形式部署，所述形式包含作为单独的程序或作为适合于在计算环境中使用的模块、部件、子例程或其它单元。
[0162]
图9展示了可以实践本发明的环境900的一个实施例的组件。实践本发明可能不需要所有组件，并且可以在不背离本发明的精神或范围的情况下对组件的布置和类型进行变化。如图所示，系统900包含一个或多个局域网(“lan”)/广域网(“wan”)912、一个或多个无线网络910、一个或多个有线或无线客户端装置906、移动或其它无线客户端装置902-906、
服务器907-909，并且可以包含一个或多个数据存储或数据库或与所述一个或多个数据存储或数据库通信。各个客户端装置902-906可以包含例如台式计算机、膝上型计算机、机顶盒、平板计算机、显示器、手机、智能电话、用于与遗传分析相关系统或实体交互或查看与所述遗传分析相关系统或实体相关的仪表板或分析的装置。服务器907-909可以包含例如一个或多个应用程序服务器、内容服务器、搜索服务器、数据库服务器、数据库管理或sql服务器、与遗传分析相关系统相关的其它服务器等。
[0163]
图10展示了根据本发明实施例的可以实施遗传分析相关系统和方法的一个或多个方面的电子装置1100的框图。电子装置1100的实例可以包含服务器，例如，服务器907-909，以及客户端装置，例如，客户端装置902-906。
[0164]
图11示出了计算机系统1100的实例，所述计算机系统中的一个或多个计算机系统可以提供图1的计算机103的部件或替代物中的一个或多个组件或替代物。计算机系统1100执行包含在计算机程序产品1122中的指令代码，所述计算机程序产品包括遗传分析器程序1123(例如，所述计算机程序产品可以包括图1的实施例的计算机程序产品102的ce数据分析器程序104)。计算机程序产品1122包括电子可读介质中的可执行代码，所述电子可读介质可以指示一个或多个计算机(如计算机系统1100)执行完成通过本文所提及的实施例执行的示例性方法步骤的处理。所述电子可读介质可以是以电子方式存储信息的任何非暂时性介质并且可以例如通过网络连接本地或远程访问。在替代性实施例中，所述介质可以是暂时性的。介质可以包含多个在地理上分散的介质，所述介质各自被配置成在不同的位置和/或在不同的时间存储可执行代码的不同部分。电子可读介质中的可执行指令代码指示所展示的计算机系统1100执行本文所述的各种示例性任务。通常将在软件中实现用于指示执行本文所述的任务的可执行代码。然而，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下，计算机或其它电子装置可以利用硬件中实现的代码来执行许多或全部识别的任务。本领域技术人员将理解，可以找到可执行代码的实施本发明的精神和范围内的示例性方法的许多变型。
[0165]
计算机程序产品1100中含有的代码或代码的副本可以驻留在通信地耦接到系统1100的一个或多个永久性存储介质(未单独示出)中，以供在永久性存储装置中加载和存储。通常，电子装置1100可以包含处理器/cpu 1102、存储器1130、电源1106和输入/输出(i/o)组件/装置1140，例如，麦克风、扬声器、显示器、触摸屏、键盘、鼠标、小键盘、显微镜、gps组件等，其可以是可操作的例如用于提供图形用户界面、仪表板等。
[0166]
用户可以通过电子装置1100的触摸屏提供输入。触摸屏可以通过例如确定用户是否正在用所述用户的身体的一部分(如他的或她的手指)触摸所述触摸屏来确定所述用户是否正在提供输入。电子装置1100还可以包含连接电子装置1100的上述元件的通信总线1104。网络接口1114可以包含接收器和发射器(或收发器)，以及用于无线通信的一个或多个天线。
[0167]
处理器1102可以包含任何类型的处理装置中的一种或多种处理装置，例如，中央处理单元(cpu)和图形处理单元(gpu)。同样例如，处理器可以是中央处理逻辑或其它逻辑，可以包含硬件、固件、软件或其组合，以执行一个或多个功能或动作，或从一个或多个其它组件引起一个或多个功能或动作。同样，基于期望的应用或需要，中央处理逻辑或其它逻辑可以包含例如，软件控制的微处理器、离散逻辑，例如专用集成电路(asic)、可编程/编程逻
辑装置、含有指令等的存储器装置，或体现在硬件中的组合逻辑。此外，逻辑也可以完全体现为软件。
[0168]
可以包含随机存取存储器(ram)1112和只读存储器(rom)1132的存储器1130可以由任何类型的存储器装置中的一个或多个存储器装置，例如，初级(由cpu直接访问的)或次级(由cpu间接访问的)存储装置(例如，闪速存储器、磁盘、光盘等)来启用。rom 1132还可以包含电子装置的基本输入/输出系统(bios)1120。
[0169]
ram可以包含操作系统1121、可以包含一个或多个数据库的数据存储装置1124和程序和/或应用程序1122和遗传分析器程序1123。遗传分析器程序1123旨在广泛地包含实施或促进根据本发明的实施例的方法和系统所需的所有编程、应用程序、算法、软件和其它工具。遗传分析器程序1123程序的元件可以存在于单个服务器计算机上或分布在多个计算机、服务器、装置或实体或位点之间。此外，本领域技术人员将理解，除了存储用于实行本文中所述的处理的计算机程序产品1122之外，存储器1130可以被配置成存储本文所提及和所展示的各种数据元素。
[0170]
电源1106含有一个或多个电力组件并且促进电子装置1100的电力供应和管理。
[0171]
包含输入/输出(i/o)接口1140的输入/输出组件可以包含例如用于促进促进电子装置1100的任何组件、外部装置的组件(例如，网络或系统1100的其它装置的组件)与最终用户之间的通信的接口。例如，此类组件可以包含可以是接收器、发射器、收发器和一个或多个输入/输出接口的集成的网卡。网卡例如可以促进与网络的其它装置的有线或无线通信。在无线通信的情况下，天线可以促进此类通信。同样，输入/输出接口1140和总线1104中的一些可以促进电子装置1100的组件之间的通信，并且在一实例中可以简化由处理器1102执行的处理。
[0172]
在电子装置1100为服务器的情况下，所述电子装置可以包含计算装置，所述计算装置可以能够例如通过有线或无线网络发送或接收信号，或者可以能够例如在存储器中处理或存储信号作为物理存储器状态。服务器可以是包含用于提供一个或多个应用程序的配置的应用程序服务器。
[0173]
能够通过有线和/或无线网络发送、接收和处理数据的任何计算装置都可以充当服务器，如在促进根据本发明的实施例的遗传分析器相关系统和方法的实施方面。充当服务器的装置可以包含如专用机架式服务器、台式计算机、膝上型计算机、机顶盒、组合前述装置中的一个或多个的集成装置等装置。
[0174]
服务器可能在配置和功能方面差异很大，但其通常包含一个或多个中央处理单元、存储器、大量数据存储装置、电源、有线或无线网络接口、输入/输出接口和操作系统，如windows server、mac os x、unix、linux、freebsd等。
[0175]
服务器可以包含例如被配置成或包含配置以通过一个或多个网络向另一个装置提供数据或内容的装置，如在促进根据本发明的实施例的系统和方法的方面。一个或多个服务器可以例如用于托管本发明的实施例中使用的网站。一个或多个服务器可以托管各种站点，例如商业站点、信息站点、社交网络站点、教育站点、wiki、金融站点、政府站点、个人站点等。
[0176]
服务器还可以例如提供各种服务，如web服务、第三方服务、音频服务、视频服务、电子邮件服务、http或https服务、即时消息(im)服务、短消息服务(sms)服务、多媒体消息
服务(mms)服务、文件传输协议(ftp)服务、ip语音(voip)服务、日历服务、电话服务等，所有这些服务都可以与根据本发明的实施例的系统和方法的示例方面结合工作。内容可以包含例如文本、图像、音频、视频等。
[0177]
在根据本发明的实施例的遗传分析器系统和方法的示例方面，客户端装置可以包含例如能够通过有线和/或无线网络发送和接收数据的任何计算装置。此类客户端装置可以包含台式计算机以及便携式装置，如手机、智能电话、显示寻呼机、射频(rf)装置、红外(ir)装置、个人数字助理(pda)、手持计算机、支持gps的装置、平板计算机、显示器、配备传感器的装置、膝上型计算机、机顶盒、可穿戴计算机、组合前述装置中的一个或多个的集成装置等。
[0178]
客户端装置在功能和特征方面可能范围广泛。例如，手机、智能电话或平板计算机可以具有数字小键盘和几行单色液晶显示(lcd)显示屏，可以在所述lcd显示屏上仅显示文本。在另一个示例中，web使能客户端装置可以具有物理或虚拟键盘、数据存储装置(如闪速存储器或sd卡)、加速度计、陀螺仪、gps或其它位置感知能力，以及之上可以显示文本和图形两者的2d或3d彩色触敏屏。
[0179]
例如可以用于根据本发明的实施例的示例系统和方法的客户端装置，如客户端装置1002-1006，可以运行各种操作系统，包含个人计算机操作系统，如windows、ios或linux，以及移动操作系统，如ios、安卓、windows mobile等。客户端装置可以用于运行一个或多个应用程序，所述应用程序被配置成从另一个计算装置发送或接收数据。客户端应用程序可以提供和接收文本内容、多媒体信息等。客户端应用程序可以执行动作，如查看分析或仪表板或与所述分析或仪表板交互、与本发明的实施例中使用的遗传分析器仪器、方法或系统交互、浏览网页、使用网络搜索引擎、与存储在智能电话上的各种app交互、通过电子邮件、sms或mms发送和接收消息、玩游戏、接收广告、观看本地存储的或流式传输的视频或参与社交网络。在根据本发明的实施例的遗传分析器系统和方法的示例方面，一个或多个网络，如网络1010或1012，例如可以将服务器和客户端装置耦接到其它计算装置，包含从无线网络到客户端装置。可以使得网络能够采用任何形式的计算机可读介质用于将信息从一个电子装置传送到另一个电子装置。除了局域网(lan)、广域网(wan)、直接连接之外，网络还可以包含互联网，如通过通用串行总线(usb)端口、其它形式的计算机可读介质或其任何组合。在一组互连的lan，包含基于不同架构和协议的lan上，路由器充当lan之间的链接，使得数据能够从一个lan发送到另一个lan。
[0180]
lan内的通信链路可以包含双绞线或同轴电缆，而网络之间的通信链路可以使用模拟电话线、电缆线、光线路、完整或部分专用数字线，包含t1、t2、t3和t4、综合业务数字网络(isdn)、数字用户线路(dsl)、包含卫星链路、光纤链路的无线链路或本领域技术人员已知的其它通信链路。此外，远程计算机和其它相关电子装置可以通过调制解调器和电话链路远程连接到lan或wan。
[0181]
无线网络，如无线网络1010，如在根据本发明的实施例的示例遗传分析相关系统和方法中，可以将装置耦接到网络。无线网络可以采用独立式自组织网络、网状网络、无线lan(wlan)网络、蜂窝网络等。
[0182]
无线网络可以进一步包含通过无线电链路等连接的终端、网关、路由器等的自治系统。这些连接器可以被配置成自由且随机移动并且任意地组织自己，使得无线网络的拓
扑可以快速变化。无线网络可以进一步采用多种接入技术，包含第2代(2g)、第3代(3g)、第4代(4g)、用于蜂窝系统的长期演进(lte)无线电接入、wlan、无线路由器(wr)网格等。如2g、2.5g、3g、4g、5g和未来的接入网络等接入技术可以使得能够实现客户端装置，如具有各种移动性程度的客户端装置的广域覆盖。例如，无线网络可以通过无线电网络接入技术，如全球移动通信系统(gsm)、通用移动电信系统(umts)、通用分组无线业务(gprs)、增强数据gsm环境(edge)、3gpp长期演进(lte)、lte高级宽带码分多址存取(wcdma)、蓝牙、802.11b/g/n等实现无线电连接。无线网络实际上可以包含任何无线通信机制，信息可以通过所述无线通信机制在客户端装置与另一个计算装置、网络等之间行进。
[0183]
互联网协议(ip)可以用于通过参与数字通信网络的网络来传输数据通信分组，并且可以包含如tcp/ip、udp、decnet、netbeui、ipx、appletalk等协议。互联网协议的版本包含ipv4和ipv6。互联网包含局域网(lan)、广域网(wan)、无线网络和可以允许在局域网之间传送分组的长途公共网络。分组可以在网络中的节点之间传输到站点，所述站点中的每个站点都具有唯一的本地网络地址。数据通信分组可以从用户站点通过连接到互联网的接入节点通过互联网发送。可以通过网络节点将分组转发到连接到网络的任何目标站点，前提是所述目标站点的站点地址包含在所述分组的报头中。在互联网上传送的每个分组都可以通过由网关和服务器确定的路径进行路由，所述网关和服务器根据目标地址和网络路径的可用性来切换分组以连接到目标站点。
[0184]
分组的报头可以包含例如源端口(16位)、目的端口(16位)、序号(32位)、确认号(32位)、数据偏移(4位)、保留(6位)、校验和(16位)、紧急指针(16位)、选项(大小为8位的倍数的可变位数)、填充(可以由全零组成，并且包含一些位，使得报头结束在32位边界上)。上述每一项的位数也可以更高或更低。
[0185]
如可以在根据本发明的实施例的示例系统和方法中使用的“内容传递网络”或“内容分发网络”(cdn)通常是指分布式计算机系统，所述分布式计算机系统包括通过一个或多个网络链接的自治计算机的集合，以及被设计成促进各种服务的软件、系统、协议和技术，所述服务如代表内容提供商存储、缓存或传输内容、流媒体和应用程序。此类服务可以使用辅助技术，包含但不限于“云计算”、分布式存储、dns请求处理、供应、数据监控和报告、内容定向、个性化和商业智能。cdn还可以使得实体能够代表第三方全部或部分地操作和/或管理所述第三方的网站基础设施。
[0186]
对等(或p2p)计算机网络主要依赖于网络中参与者的计算能力和带宽，而不是将其集中在给定的一组专用服务器中。p2p网络通常用于通过大量自组织连接来连接节点。纯粹的对等网络没有客户端或服务器的概念，而仅有同时充当网络上其它节点的“客户端”和“服务器”的对等节点。
[0187]
本发明的一个实施例包含系统、方法和非暂时性计算机可读存储介质或有形地存储能够由计算机处理器执行的计算机程序逻辑的介质。
[0188]
本领域技术人员将理解，计算机系统1100仅展示了其中可以实施根据本发明的实施例的计算机程序产品的系统的一个实例。为了引用替代性实施例的仅一个实例，包含在根据本发明的实施例的计算机程序产品中的指令的执行可以分布在多个计算机上，如例如分布式计算机网络的计算机上。
[0189]
应当理解，本文所描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据其进行的
各种修改或改变将启发本领域的技术人员并且将被包含在本技术的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的特此通过引用整体并入。
[0190]
实例
[0191]
本领域技术人员应理解，对本文所描述的制备和使用颗粒的描述仅出于说明目的，并且本公开不受这种说明的限制。
[0192]
实例1.dna分离和微卫星不稳定性分析
[0193]
使用microm hm 355s旋转式切片机从福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)块中采集ffpe组织切片(10μm)。使用recoverall
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总核酸分离试剂盒从ffpe切片中分离dna，并且使用qubit
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dsdna hs测定试剂盒在英杰公司qubit 4荧光计(invitrogen qubit 4 fluorimeter)上测量浓度。所提取的ffpe dna在1
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低edta te缓冲液中稀释到1ng/μl。使用abi msi测定评估组织样品中的微卫星不稳定性。abi msi扩增混合物由4μl多重pcr mastermix、4μl 1
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低-edta te缓冲液和1ng/μl的2μl dna组成。pcr在应用生物系统proflex pcr系统中以geneamp
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pcr系统9700模拟模式在以下条件下进行：95℃进行11分钟；94℃下29个变性循环，持续20秒并且在59℃下粘接2分钟；以及在60℃下最终延伸25分钟。扩增的pcr产物在20μl反应体积中在95℃下变性3分钟，所述反应体积由17μl hi-di
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甲酰胺、1μl genescan
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600liz
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染料(大小标准v2.0)和2μl pcr产物组成。然后在abi 3500(xl)或seqstudio
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遗传分析器上通过片段分析来分析变性扩增pcr产物。
[0194]
pcr引物，包含相关联的标志物，在表1中示出。pcr引物在每组中的正向引物的5'端用指定染料标记，但abi-16除外，abi-16在反向引物的5'端标记。标记通过c3连接子附接。
[0195]
表1.用于abi-msi测定扩增的引物
[0196][0197]
实例2.结直肠癌与正常组织中msi的评估
[0198]
从结直肠癌(“肿瘤”)或正常组织(“正常”)的ffpe切片中分离dna，并且如实例1中所描述的进行pcr。正常组织通常是匹配的正常对照(来自同一患者的组织)。图11的电泳图中的信号示出了肿瘤与正常样品信号之间的明显差异。信号清晰且易于解释，并且信号强度一致。
[0199]
实例3.abi-msi与其它msi测定的比较
[0200]
众所周知，子宫内膜癌难以测定，因为标准msi测定难以解决小缺失。如实例1(“abi-msi”)中所描述的，或使用制造商提供的方案使用promega
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msi分析系统，对来自子宫内膜癌的dna样品进行扩增和分析。promega
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系统从5个基因座(nr21、bat26、bat25、nr24
和mono27)处扩增dna，并且包含两个对照(pentac和pentad)。如图12a中示出的，abi-msi测定将被promega
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系统鉴定为msi-低(msi-l)的一个样品鉴定为msi-高(msi-h)，并且将被promega
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系统鉴定为msi-稳定(mss)的五个样品鉴定为msi-低。图12b示出了正常(蓝色)和肿瘤(绿色)样品之间的若干个基因座的明显偏移。
[0201]
实例4.使用自动化数据分析的扩展微卫星不稳定性面板的开发
[0202]
2017年，食品药品监督管理局(fda)批准派姆单抗(pembrolizumab)用于任何患有携带msi或错配修复缺陷的实体瘤的患者。这导致利用msi作为免疫检查点抑制有效性的预测性生物标志物的研究增加。然而，目前检测msi的解决方案很少并且存在局限性，包含用于跨多种肿瘤类型应用的标志物不足和繁琐的数据分析。
[0203]
为了改进标准msi检测面板和标准工作流程，开发了msi测定，其具有快速、简单的工作流程、低样品输入(2ng ffpe dna)、扩展内容、自动化分析和可解释的结果以及仅肿瘤分析。所述测定从dna到回答仅需要3.5小时：15分钟的pcr样品制备、2小时的荧光pcr、15分钟的片段分析样品制备、55分钟的基于ce的片段分析和5分钟的数据分析。
[0204]
图13示出了合成构建体如何揭示检测复杂性。不稳定性的检测是缺失大小和样品中存在的突变等位基因部分之间的复杂相互作用。生成合成构建体是为了：1)了解难以评估的msi样品的峰形态，以及2)以各种等位基因频率和每个均聚物的可变缺失大小训练算法。
[0205]
图14示出了在5bpd处》98％特异性和》90％敏感性的仅肿瘤分析。对具有大缺失的癌症类型(如结肠癌和胃癌)的仅肿瘤分析将看到高敏感性。
[0206]
图15示出了在≥3bdp处》95％特异性和敏感性的肿瘤-正常分析。可调算法参数允许最大化applied biosystems
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3500和seqstudio
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遗传分析器系统的敏感性和特异性。
[0207]
图16展示了abi msi软件(顶部)和示例msi报告(底部)。此软件为简化分析和报告提供自动化基因分型解决方案，从而为客户节省当前手动分析所需的时间和精力。
[0208]
abi msi测定以低样品输入实现了对多种癌症类型中微卫星不稳定性的可靠鉴定。另外，msi分析软件分析速度快，并且可以包含敏感性和特异性自动化调用。
[0209]
参考文献
[0210]
1.vaksman,zlaman和harold r.garner.“体细胞微卫星变异性作为结直肠癌和肝癌进展的预测性标志物(somatic microsatellite variability as a predictive marker for colorectal cancer and liver cancer progression).”《癌靶标(oncotarget)》6.8(2015):5760。
[0211]
2.le,dung t.等人“肿瘤中的pd-1阻断和错配修复缺陷(pd-1blockade in tumors with mismatch-repair deficiency).”《新英格兰医学杂志(new england journal of medicine)》372.26(2015):2509-2520。
[0212]
3.cortes-ciriano,isidro等人“跨多种癌症的微卫星不稳定性的分子肖像(a molecular portrait of microsatellite instability across multiple cancers).”《自然通讯(nature communications)》8(2017):15180。
[0213]
latham等人,2019