细胞选择的方法与流程

1.本公开涉及用于鉴定、选择或培养包含主题核酸序列的细胞的方法和组合物。


背景技术：

2.细胞表达系统普遍用于生产重组生物制品，如治疗性生物制剂。生产线细胞的开发涉及将编码目标重组产物的核酸构建体引入宿主细胞，并选择含有这些核酸构建体的细胞。这一般涉及使细胞承受选择压力以有利于已经吸收外源核酸的细胞。早期的选择标记系统使用抗生素抗性标记，但已有远离使用此类系统的趋势。一些替代系统基于补充代谢缺陷，例如二氢叶酸还原酶(dhfr)和谷氨酰胺合成酶(gs)。然而，仍然需要新的可以用于选择用于生产重组生物制品的细胞的选择系统。进一步地，由于越来越多地使用生产宿主细胞工程策略，那些涉及引入修饰宿主细胞特性的新序列的策略将受益于选择系统，该选择系统与用于引入编码生物制品的序列的现有或未来选择系统不同。


技术实现要素：

3.本发明涉及一种基于酪氨酸营养缺陷型的选择系统和无需在培养基中包括酪氨酸的重组产物的制造。我们发现，仅基于苯丙氨酸羟化酶(pah-其催化苯丙氨酸转化为酪氨酸)的系统是无效的，并且有必要包括与酪氨酸生物合成相关的第二酶，即gtp环化水解酶1(gch1)。进一步地，我们发现与全长酶相比，使用带有去除n末端调节域的截短的pah提供了显著的优势。使用全长cho pah导致转染后在无酪氨酸培养基中没有恢复或恢复时间慢得多，而分子的截短(tpah)形式能够实现良好的恢复。pah和gch1的组合让细胞在与不表达这些酶的类似细胞相比酪氨酸水平较低(例如，在不存在酪氨酸的情况下)的条件下生长。
4.因此，在第一方面中，本发明提供了一种包含一种或多种核酸载体的载体系统，该核酸载体包含：
5.a)第一核酸序列，包含编码缺乏功能性n末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(pah)的序列并可操作地连接到使该pah能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；
6.b)第二核酸序列，包含编码gtp环化水解酶1(gch1)的序列并可操作地连接到使该gch1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和
7.c)多克隆位点，用于插入一个或多个编码目标产物的序列并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列。
8.在相关方面，本发明还提供了一种包含一种或多种核酸载体的载体系统，该核酸载体包含：
9.a)第一核酸序列，包含编码缺乏功能性n末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(pah)的序列并可操作地连接到使该pah能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；
10.b)第二核酸序列，包含编码gtp环化水解酶1(gch1)的序列并可操作地连接到使该gch1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和
11.c)第三核酸序列，包含编码目标产物的序列并可操作地连接到使该产物能够在宿
主细胞中表达的第三控制序列。
12.此类载体可以被引入宿主细胞和那些含有在不让非转化细胞高效生长的酪氨酸限制条件下所选择的载体的细胞。因此，在第二方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含：
13.a)第一外源性核酸，包含编码苯丙氨酸羟化酶(pah)的序列并可操作地连接到使该pah能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；和
14.b)第二外源性核酸，其编码gtp环化水解酶1(gch1)并可操作地连接到使该gch1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和
15.c)第三外源性核酸，其编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列。
16.在一个实施例中，第一、第二和第三核酸分子被整合到宿主细胞的基因组中。
17.在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
18.在本发明的各个方面，pah中缺乏功能性n末端调节域，例如可能是由于缺失而形成截短的pah。基于人和cho pah氨基酸序列，这通常是约前116个氨基酸的缺失。
19.在一个实施例中，pah是cho pah或人pah。
20.在一个实施例中，第一和/或第二控制序列包含sv40启动子。
21.本发明的载体系统通常用于选择已成功地用编码目标产物，如重组多肽的核酸转化的细胞。因此，在第三方面，本发明提供了一种选择包含编码产物的核酸序列的细胞的方法，该方法包含：
22.a)在允许细胞摄取载体系统的条件下，使在不存在酪氨酸的情况下不能存活或生长的细胞群与本发明的载体系统接触；
23.b)在酪氨酸水平低于不表达由载体系统编码的pah和gch1酶的细胞存活或生长所需水平的条件下培养细胞；和
24.c)选择能够在此类条件下生长的一种或多种细胞以获得一种或多种含有编码产物的核酸序列的细胞。
25.选定酪氨酸的水平以确保严格的选择并且任选地补充苯丙氨酸。在一个实施例中，培养基不包括添加的酪氨酸。
26.在相关方面，本发明提供了一种本发明的载体系统用于从细胞群中选择一种或多种细胞的用途，该一种或多种细胞包含已被引入细胞中的核酸序列。
27.通过本发明的选择方法获得的所选择的宿主细胞构成本发明的另一方面。因此，在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含：
28.a)第一外源性核酸，包含编码缺乏功能性n末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(pah)的序列并可操作地连接到使该pah能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；和
29.b)第二外源性核酸，其编码gtp环化水解酶1(gch1)并可操作地连接到使该gch1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和
30.c)第三外源性核酸，其编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列。
31.本发明的宿主细胞可以被遗传修饰以抑制或消除任何内源性pah和/或gch1活性。在一个实施例中，这可以通过编码和/或调节内源性pah和/或gch1表达的基因组序列中的突变(插入、缺失和/或取代)来实现。
32.包含编码目标产物的核酸序列的本发明的所选择的宿主细胞将通常用于该产物的制造。因此，在第五方面，本发明提供了一种制备产物的方法，该方法包含在适合于表达该产物的条件下培养包含编码该产物的核酸序列的本发明的宿主细胞，以及回收该产物并且任选地对所回收的产物执行一个或多个处理或纯化步骤。
33.当使用本发明的宿主细胞和选择过程开发的细胞系用于大规模制造时，通过在培养步骤期间省略酪氨酸来施加选择压力可能不再是必要的。然而，被认为是必需氨基酸的酪氨酸在任何氨基酸中的水中低溶解度仅次于半胱氨酸。酪氨酸的低溶解度对于产生足够浓度的进料溶液以支持例如在生物反应器中例如在进料分批生物过程中在生物制造条件下培养细胞可能是一个挑战。
34.本发明的宿主细胞可以在较低水平的(包括不存在酪氨酸的情况)酪氨酸中高效生长，从而减少对高浓度酪氨酸进料溶液的需要。因为细胞消耗苯丙氨酸以产生酪氨酸，因此在一个实施例中，培养基补充有苯丙氨酸。
35.本发明还提供了一种培养基，如进料，其包含多种氨基酸，如至少3或4种氨基酸，其中在水溶液中有少于0.01g/l的酪氨酸，如少于50μm、20μm或10μm的酪氨酸(例如，无酪氨酸)和至少2mm，优选地至少3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm的苯丙氨酸。通常，培养基包含少于10mm的苯丙氨酸。本发明还提供了一种基本上干燥形式的培养基混合物(例如，包含少于5％、4％、3％、2％或1％的水，例如，不明显包含水)，包含多种氨基酸，如至少3或4种氨基酸，其酪氨酸和苯丙氨酸的水平使得通过添加适当体积的水来制备上述培养基。
36.本发明进一步提供了培养基和培养基混合物在选择和/或生长用本发明的载体系统转化的细胞中的用途，如在表达由载体系统编码的目标产物中的用途。
37.本发明还提供了一种包含本发明的宿主细胞和本发明的培养基的混合物。
38.在另一方面，本发明的特征在于一种包含本发明的宿主细胞群的生物反应器。在另一方面，本发明的特征在于一种包含本发明的培养基和生产细胞群的生物反应器。
附图说明
39.图1示出了pah酶的域结构的示意图。
40.图2示出了(a)使用流式细胞术获得的相同cho细胞池转染和恢复3周后细胞群平均荧光的直方图和(b)荧光数据表。
41.图3示出了通过qrt-pcr测定的相对于对照的pah mrna量的图。
42.图4示出了(a)18天内各种细胞池的活细胞浓度的细胞生长的图，一些细胞池在不存在酪氨酸或谷氨酰胺情况下过表达截短的pah并任选地补充有苯丙氨酸；(b)相同条件下相同细胞池的培养存活率的图。
43.图5示出了补充有不同苯丙氨酸的酪氨酸原养型细胞池的生长特性。
44.图6示出了不含酪氨酸但含6mm苯丙氨酸的cd cho中酪氨酸原养型细胞池的生长特性的图。(a)不含酪氨酸并任选地补充有苯丙氨酸的各种细胞池的活细胞浓度和(b)相同池的培养存活率的图。
45.图7示出了在细胞生长评估之前已补充有苯丙氨酸的预适应酪氨酸原养型细胞池的生长特性的图。(a)细胞池的活细胞浓度和(b)相同条件下相同细胞池的培养存活率的图。
46.图8示出了各种细胞池中相对于对照细胞的pah mrna量的图(顶部)和各种细胞池中相对于对照细胞的gch1 mrna量的图(底部)。
47.图9示出了共表达酪氨酸和谷氨酰胺营养缺陷型细胞池的生长特性的图。(a)活细胞浓度、(b)存活率和(c)细胞直径。
具体实施方式
48.定义
49.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。标题、副标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等，仅为便于阅读而呈现。本文件中标题、编号或字母元素的使用不要求按照字母顺序执行步骤或元素，也不要求步骤或元素之间必须相互独立。本发明的其他特征、目标和优点将根据说明书和附图以及权利要求书变得明显。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。
50.本文使用的术语“约”或“大约”适用于一个或多个目标值，其是指与规定参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指一系列在(大于或小于)规定参考值的任一方向上5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的值，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％)。
51.如本文所用，术语“控制元件”是指适合调节(例如增加或减少)编码序列，例如，编码产物或酶分子的基因或序列的表达的核酸。控制元件可以包含启动子序列、增强子序列或启动子和增强子序列两者。控制元件可以包含连续核酸序列、不连续核酸序列(被其他编码或非编码核酸序列中断的序列)或连续核酸序列和不连续核酸序列两者。单个控制元件可以包含在单个核酸或不止一个核酸上。在实施例中，控制元件可以包含编码序列，例如重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的编码序列的序列5'或3'。在实施例中，控制元件可以包含基因，例如编码重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的基因的一个或多个内含子内的序列。在实施例中，控制元件可以部分或全部包含在编码序列，例如重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的编码序列的序列5'或3'内。在实施例中，控制元件可以部分或全部包含在编码序列，例如重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的编码序列内。在实施例中，控制元件可以部分或全部包含在基因，例如编码重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的基因的一个或多个内含子内。在实施例中，单个控制元件包含的核酸序列可以i)接近(例如，邻近或含在基因内)基因，例如编码重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的基因，或ii)远离(例如，相隔10个或更多、100个或更多、1000个或更多或10,000个或更多碱基或布置在不同且独立的核酸上)基因，例如编码重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的基因。
52.当提及如量、时间长度等可测定值时，术语“约”旨在涵盖规定值
±
5％，或在某些情况下
±
1％，或在某些情况下
±
0.1％的变化，因为这样的变化适合执行所公开的方法。
53.本文使用的术语
‘
生物反应器’是指进行生物反应或过程的装置。这些过程可以在工业、中试和实验室规模上进行，包括微尺度和纳米尺度。
54.如本文所用，术语“内源性”是指任何来自或在生物体、细胞、组织或系统内部天然产生的物质。
55.如本文所用，术语“外源性”是指任何引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的物质。因此，“外源性核酸”是指被引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的核酸。在一些实施例中，外源性核酸的序列不在引入外源性核酸的生物体、细胞、组织或系统内部天然产生也不会在其内部天然存在。在一些实施例中，外源性核酸的序列是非天然存在的序列，或编码非天然存在的产物。在一些实施例中，外源性核酸的序列也可以存在于外源性核酸引入的生物体、细胞、组织或系统中。例如，外源性核酸可以在组成型活性启动子的控制下编码酶，其中外源性核酸被引入的细胞含有编码所述酶的内源性核酸序列(例如，在内源性启动子的控制下)。
56.如本文所用，术语“酶分子”是指一种具有目标酶活性的多肽。酶分子可以与具有目标酶活性的天然存在的酶共享结构相似性(例如，序列同源性)。在一些情况下，酶分子与具有目标酶活性的天然存在的酶具有至少80％的氨基酸序列同一性(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。在一些实施例中，酶分子是天然存在的酶的变体(例如，包含相对于天然存在的酶的氨基酸序列的一个或多个氨基酸序列改变(例如，取代、缺失或插入)的变体)。在一些情况下，在与酶(例如，pah或gch1)的标识符一起使用时，术语“分子”是指一种具有所鉴定的酶的酶活性的多肽。通过举例，如本文所用的术语“pah分子”或“pah酶分子”是指一种具有pah酶活性的多肽。通过进一步举例，如本文所用的术语“gch1分子”或“gch1酶分子”是指一种具有gch1酶活性的多肽。在一些实施例中，酶分子是或包含单一多肽链。在一些实施例中，酶分子是或包含多多肽复合物，例如低聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、八聚体、十聚体或十二聚体)。
57.如本文所用，术语“酶活性片段”是指具有酶或酶分子的目标酶活性的酶或酶分子的一部分。在一些实施例中，酶活性片段是酶或酶分子的变体，该变体包含相对于酶或酶分子的缺失(例如，截短)。在一些实施例中，酶活性片段的目标酶活性相对于衍生酶活性片段的酶或酶分子降低不超过50％、40％、30％、20％或10％。
58.如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可互换使用，并指脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)或其dna或rna的组合和其单链或双链形式的聚合体。术语“核酸”包括但不限于基因、cdna或rna序列(例如，mrna)。在一些实施例中，核酸分子是合成(例如，化学合成或人工)或重组的。除非具体限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物或衍生物的分子，这些天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然或非天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个(或所有)所选择的密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基(batzer等人，《核酸研究(nucleic acid res.)》19:5081(1991)；ohtsuka等人，《生物化学杂志(j.biol.chem.)》260:2605-2608(1985)；和rossolini等人，《分子和细胞探针(mol.cell.probes)》8:91-98(1994))取代的序列来实现。如本文所用，所谓“主题核酸”是指任何目标核酸，例如，包含编码如本文所述的产物的序列或编码如本文所述的生产因子(例如，脂质代谢调节剂(lmm)，如scd1和/或srebf-1)的
序列，其被期望地引入或存在于如本文所述的细胞内。
59.如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并指由通过肽键或通过肽键以外的方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。在一个实施例中，蛋白可以包含多于一种，例如，两种、三种、四种、五种或更多种多肽，其中每种多肽通过共价键或非共价键/相互作用与另一种多肽相结合。多肽包括任何肽或蛋白，其包含两种或更多种通过肽键或通过肽键以外的方式彼此连接的氨基酸。如本文所用，该术语既指短链，其在本领域中也通常称为例如肽、低聚肽和低聚体，也指长链，其在本领域中通常称为蛋白，其有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、低聚肽、同型二聚体、异质二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。
60.如本文所用，术语“多个”是指该文中语法对象中的不止一个(例如，两个或更多个)语法对象。通过举例，“多个细胞”可以指两个细胞或不止两个细胞。
61.如本文所用的术语“产物”是指实体，例如化合物(例如多肽(如糖蛋白)、核酸、脂质、糖类、多糖类或其任何杂合体)、囊泡、外来体或病毒，其由细胞，例如已被修饰或工程化以产生产物的细胞(例如生产细胞)产生(例如表达)。在一些实施例中，该产物是蛋白或多肽产物。在一些实施例中，该产物包含天然存在的产物。在一些实施例中，该产物包含非天然存在的产物。在一些实施例中，该产物的一部分是天然存在的，而该产物的另一部分是非天然存在的。在一些实施例中，该产物是多肽，例如重组多肽。在一些实施例中，该产物适用于诊断或临床前使用。在一些实施例中，该产物适用于治疗用途，例如，用于治疗疾病。在一些实施例中，产物是本文所述的重组蛋白或治疗性蛋白，例如，在下文标题为
‘
多肽’的部分中。在一些实施例中，病毒包括天然存在的病毒、重组病毒、重组病毒颗粒、病毒样颗粒(vlp)、病毒载体、灭活(例如，死亡或不能感染)病毒、多种病毒蛋白、病毒衣壳或其任何片段、组分子集或其变体。
62.如本文所用，“生产细胞”是指能够产生产物，例如重组多肽的细胞。在一些实施例中，生产细胞包含编码产物(例如，重组多肽)的外源性核酸，例如，其可操作地连接到调节生产细胞中产物表达的控制元件。当例如在生物反应器和合适的培养基中在合适的条件，例如本文公开的条件下培养时，生产细胞例如产生以及分泌产物。
63.如本文所用，“生产因子”是指影响生产细胞关于重组产物表达的特性的多肽或核酸。例如，生产因子可以提高数量(例如每细胞单位生产率或产物效价)或产物质量(例如正确折叠和组装、溶解度等)。生产因子可以是例如参与脂质代谢(例如，脂质代谢调节剂，如scd1和/或srebf-1)、蛋白合成、蛋白折叠、转译后修饰、蛋白转运和/或蛋白分泌的蛋白。它也可以是抑制内源性蛋白的表达或活性的多肽或核酸。例如，生产因子可以抑制高表达和分泌的非必需内源性蛋白的表达，以提高细胞的生产能力。
64.如本文所用，术语“启动子”是指例如，来自天然存在的或工程化的启动子的具有足够序列的序列，使得将编码序列可操作地连接到启动子导致编码序列的表达。例如，巨细胞病毒(cmv)启动子包含cmv启动子的全部或一个活性片段，例如任选地包括内含子a和/或utr序列的cmv启动子的全部或一个活性片段。在实施例中，cmv启动子与天然存在的或工程化的变体cmv启动子差异不超过5、10、20、30、50或100个核苷酸。在实施例中，cmv启动子与天然存在的或工程化的cmv启动子的差异不超过其核苷酸的1％、5％、10％或50％。如本文
所用的启动子可以是组成型的、调节的、可抑制的、可诱导的、强的、弱的或启动子所包含的启动子序列的其他特性。在实施例中，启动子可以包含编码序列(例如重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的编码序列)的序列5'或3'。在实施例中，启动子可以包含基因(例如编码重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的基因)的一个或多个内含子内的序列。在实施例中，启动子可以部分或全部包含在编码序列，例如重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的编码序列的序列5'或3'内。在实施例中，启动子可以部分或全部包含在编码序列，例如重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的编码序列内。在实施例中，启动子可以部分或全部包含在基因(例如编码重组多肽、治疗性多肽或阻遏多肽的基因)的一个或多个内含子内。
65.如本文所用，术语“可操作地连接”是指编码产物(例如多肽)或酶分子的核酸序列和控制元件之间的关系，其中如果编码产物或酶分子的序列和控制元件以适合控制元件调节编码产物或酶分子的序列的表达的方式布置，则它们可操作地连接。因此，对于不同的控制元件，可操作地连接将构成编码产物或酶分子的序列相对于控制元件的不同布置。例如，如果启动子元件和编码产物(例如，多肽)的序列彼此靠近且位于同一核酸上布置，则编码产物(例如，多肽)的序列可以可操作地连接到包含启动子元件的控制元件。在另一实例中，如果增强子序列和编码产物(例如，多肽)的序列在同一核酸上，或甚至在不同和独立的核酸上以适当数量的碱基分开布置，则编码产物(例如，多肽)的序列可以可操作地连接到包含在远端操作的增强子序列的控制元件。
66.如本文所用，选择标记是指一种或多种核酸序列，其赋予可用于选择包含一种或多种核酸序列的细胞的表型。在一些实施例中，该一种或多种核酸序列包含编码多肽的序列(例如，和用于表达所述多肽的合适的控制元件)。例如，选择标记可以包含编码赋予抗生素抗性表型的蛋白的基因。这种选择标记可以称为抗生素选择标记。在一些实施例中，选择标记包含一个或多个核酸序列，该核酸序列传达在没有选择标记的情况下在必需营养物的水平降低(例如，不存在必需营养物)(例如，不足以使细胞存活的水平)的条件下存活(例如，存活期间生长并分裂)的能力。例如，选择标记可以包含编码pah酶分子的第一核酸和编码gch1酶分子的第二核酸，其中选择标记传达在培养基中酪氨酸水平降低(例如，缺乏酪氨酸)的情况下存活的能力。这种选择标记可以称为营养缺陷型标记或营养缺陷型选择标记。在营养缺陷型标记或营养缺陷型选择标记后附加化合物名称(例如氨基酸名称)指定营养物，选择标记传达在其水平降低或不存在的情况下存活的能力。
67.载体和载体系统
68.本发明使用编码组分的载体，这些组分使转化的宿主细胞能够表达目标产物，如重组多肽，并能够在低水平和不存在酪氨酸的情况下生长，否则酪氨酸将是细胞的必需氨基酸，其不存在将导致细胞死亡和/或生长不良。
69.载体包含三种组分。编码通常缺乏功能性n末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(pah)酶分子的第一核酸序列；和编码gtp环化水解酶1(gch1)酶分子的第二核酸序列。这些序列可操作地连接到使酶能够在合适的宿主细胞中表达的控制序列。在一个实施例中，控制序列包括cmv启动子或sv40启动子，例如编码人pah序列的序列可以可操作地连接到包含sv40启动子的控制序列和/或编码gch1的序列可以可操作地连接到包含sv40启动子的控制序列。
70.第三序列包含编码目标产物的核酸序列可以克隆到其中的插入位点，例如多克隆位点。该位点被定位并可操作地连接到控制序列，以便当期望的序列已被引入时，其可以在
合适的宿主细胞中表达。在一个实施例中，可被视为表达盒的三个序列存在于同一载体中。在另一实施例中，第一和第二核酸序列可以在独立的载体上，条件是第三核酸序列与它们中的一者在同一载体上以确保目标序列的选择与选择标记的存在相关联。
71.载体可以包含用于目标产物的额外的表达盒，即载体系统可以包含第四、任选的第五和任选的第六核酸序列等，每个核酸序列包含编码目标产物的核酸序列可以克隆到其中的插入位点，例如多克隆站点。至于第三核酸序列，这些位点被定位并可操作地连接到控制序列，以便当期望的序列已被引入时，其可以在合适的宿主细胞中表达。双特异性抗体例如至少有三条不同的链，通常至少有四条不同的链。这些准备插入目标序列的表达盒可以以多种方式构造。如果pah和gch1序列位于不同的载体上，那么每个载体可能含有一个或多个具有多克隆位点的表达盒，例如，每个载体可以含有两个这样的表达盒。在一些实施例中，每个具有多克隆位点的表达盒可存在于仅具有选择标记中的一个选择标记的单个载体中。因此，一个载体可以具有三个或四个表达盒，每个表达盒具有多克隆位点，用于引入目标序列，如用于产生双特异性抗体的重链或轻链。
72.在一个实施例中，为了充分利用在同一步骤中引入多个序列的能力，可以将所有载体系统组分同时引入宿主细胞。
73.在另一实施例中，合适的宿主细胞可能已被工程化为包含第一或第二核酸序列中的一个核酸序列。因此，本发明进一步提供了一种选择系统，包含：
74.a)第一核酸，包含编码缺乏功能性n末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(pah)的序列并可操作地连接到使该pah能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；
75.b)第二核酸，其编码gtp环化水解酶1(gch1)并可操作地连接到使该gch1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和
76.c)(i)多克隆位点，用于插入编码目标产物的序列并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列或(ii)第三核酸，其编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列；和
77.d)宿主细胞，
78.其中(a)和(c)存在于载体中并且(b)存在于宿主细胞中(通常整合到宿主细胞基因组中)；或(b)和(c)存在于载体中并且(a)存在于宿主细胞中(通常整合到宿主细胞基因组中)。
79.编码重组产物和pah酶、gch1酶的核酸序列可以克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定目标载体包括表达载体和复制载体。在实施例中，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的并且例如描述在sambrook等人2012年的《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》第1卷-第4卷，纽约的冷泉港出版社(cold spring harbor press)和其他病毒学和分子生物学手册中。可作为载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点(因此载体可以是自我复制的)、包含启动子元件和任选的增强子元件的控制元件、方便到达的限制性内切核酸酶位点和一种或更多种选择标记(例如，wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。衍生自病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其
在子细胞中的繁殖。
80.载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(bgh)基因)、允许游离型复制和在原核生物中复制的元件(例如sv40起点和cole1或其他本领域已知的元件)和/或允许选择的元件，例如选择标记或报告基因。
81.所构想的载体可以包含适合插入编码多肽，例如外源性治疗性多肽的序列的插入位点。插入位点可以包含限制性内切酶位点。
82.使用本领域公知的克隆技术可以将编码目标产物(如以下标题为重组产品的部分所述)序列引入在此所述的载体系统中。那么，除了第一和第二核酸序列之外，所得载体系统还将至少包含第三核酸序列，该第三核酸序列包含编码目标产物的序列并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列，该第三序列存在于与第一核酸序列和/或第二核酸序列相同的载体中(以确保选择标记选择包括第三核酸序列的细胞的功能)。
83.如上文所讨论的，本发明的载体系统可用于表达多个目标序列，例如具有多个包括抗体(标准和双特异性抗体)的亚基的蛋白的序列。载体因而可以包含用于目标产物的额外的表达盒，并且可以将多个目标序列引入多克隆位点以产生准备引入宿主细胞的载体，这些宿主细胞可以表达多个目标产物。因此，在引入目标序列后，除了包含编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的序列的第三核酸序列之外，载体系统还可以包含第四、任选地第五和任选地第六核酸序列等，每一个序列都包含编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的控制序列的序列。这些序列将存在于与第一和/或第二核酸序列相同的载体中(以确保它们由于与选择标记相关联而被选择)。
84.同样如上文所讨论的，这些表达盒可以以多种方式构造。如果pah和gch1序列位于不同的载体上，那么每个载体可能含有一个或多个表达盒，每个表达盒编码目标产物，例如每个载体可以含有两个这样的表达盒。在一些实施例中，表达盒可以存在于仅具有选择标记中的一个选择标记的单个载体中。因此，一个载体可以具有三个或四个表达盒，每个表达盒具有编码目标产物的序列，如用于产生双特异性抗体的重链或轻链。
85.载体还可以含有用以协助随机或以位点特异性方式(如使用位于载体两端的反向末端重复序列(itr)的piggybac
tm
系统)整合到宿主细胞基因组中的序列。在转染过程中包括的序列特异性转座酶、位点特异性整合方法和序列也描述在wo2013/190032和wo2018/150269中。
86.在一些实施例中，包含编码产物的核酸序列的载体包含进一步的选择标记，如下文所述，如谷氨酰胺合成酶。通常，载体系统包括单独的载体，该载体包含如下所述的进一步的选择标记和用于插入一个或多个编码一种或多种目标产物的序列的多克隆位点，该一个或多个序列可操作地连接到使产物能够在宿主细胞中表达的控制序列。一旦目标序列已被克隆到多克隆位点中，那么载体将包含如下所述的进一步的选择标记和核酸序列，该核酸序列包含编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的序列。这种载体一般不包括pah或gch1序列。
87.一种或多种载体可以作为试剂盒提供，该试剂盒包括使用说明和任选的转染试剂等。
88.本文还提供了核酸，例如编码本文所述产物(例如重组多肽)的主题核酸。编码所
期望的重组多肽的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过使用标准技术从表达所期望的核酸序列(例如基因)的细胞中筛选文库，通过从已知包括核酸序列的载体中衍生核酸序列或通过直接从含有核酸序列的细胞和组织中分离。可替代地，编码重组多肽的核酸可以合成而不是克隆产生。重组dna技术(techniques/technology)在本领域中是极为先进和成熟的。因此，了解本文所述的重组多肽的氨基酸序列的普通技术人员可以容易地设想或产生将编码重组多肽的核酸序列。
89.gch1酶分子
90.天然存在的gch1酶催化gtp转化为7,8-二氢新蝶呤3'-三磷酸(消耗两个水分子并产生乙酸)，这是生产bh4的第一步。在一些实施例中，gch1酶分子具有与天然存在的gch1酶相同或相似的活性。在一些实施例中，gch1酶分子的活性相对于天然存在的gch1酶有所增强或降低。
91.在一些实施例中，gch1酶分子是天然存在的gch1酶。在一些实施例中，gch1酶分子包含全长(例如，非截短)gch1酶。在一些实施例中，gch1分子与哺乳动物gch1酶具有至少50％的氨基酸序列同一性(例如，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。
92.在一些实施例中，gch1酶分子是天然存在的gch1酶或非天然存在的(例如，合成的)gch1酶的变体(例如，包含一个或多个相对于天然存在或非天然存在的酶的氨基酸序列的氨基酸序列改变(例如，取代、缺失或插入)的变体)。在一些实施例中，相对于天然存在的gch1酶，gch1酶分子是或包含缺失突变，例如截短，例如n末端区域的截短。在一些实施例中，gch1酶分子是或包含至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的天然存在的gch1酶的氨基酸序列(和任选地，高达100％、99％、95％、90％、85％、80％、79％、78％、77％、76％或75％的氨基酸序列)。在一些实施例中，gch1酶分子包含不超过99％、95％、90％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％或75％的天然存在的gch1酶的氨基酸序列。
93.在一些实施例中，gch1酶分子是单体，例如，是作为单体的活性酶。在一些实施例中，gch1酶分子形成多聚体(例如，在酶促活性的适当条件下，例如细胞或生理条件下，例如在生物制造过程中)，例如，是作为多聚体的活性酶。在一些实施例中，gch1酶分子多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体，例如，十聚体。
94.用于本公开的gch1酶分子的序列可取自任何已知的gch1酶序列。在一些实施例中，gch1酶分子包含人gch1酶、其变体或其酶活性片段。在一些实施例中，gch1酶分子包含cho gch1酶、其变体或其酶活性片段。
95.在一些实施例中，gch1酶分子包含由seq id no:1编码的氨基酸序列，例如，seq id no:2的氨基酸序列。在一些实施例中，gch1酶分子包含由ncbi参考序列：nm_001024024(例如，截至2019年10月6日)编码的氨基酸序列。在一些实施例中，gch1酶分子包含与由seq id no:1编码的氨基酸序列，例如与seq id no:2的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，编码gch1酶分子的外源性核酸包含与seq id no:1的核酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸
序列。
96.ncbi参考序列：nm_001024024
97.acgcgtatggagaagggccctgtgcgggcaccggcggagaagccgcggggcgccaggtgcagcaatgggttccccgagcgggatccgccgcggcccgggcccagcaggccggcggagaagcccccgcggcccgaggccaagagcgcgcagcccgcggacggctggaagggcgagcggccccgcagcgaggaggataacgagctgaacctccctaacctggcagccgcctactcgtccatcctgagctcgctgggcgagaacccccagcggcaagggctgctcaagacgccctggagggcggcctcggccatgcagttcttcaccaagggctaccaggagaccatctcagatgtcctaaacgatgctatatttgatgaagatcatgatgagatggtgattgtgaaggacatagacatgttttccatgtgtgagcatcacttggttccatttgttggaaaggtccatattggttatcttcctaacaagcaagtccttggcctcagcaaacttgcgaggattgtagaaatctatagtagaagactacaagttcaggagcgccttacaaaacaaattgctgtagcaatcacggaagccttgcggcctgctggagtcggggtagtggttgaagcaacacacatgtgtatggtaatgcgaggtgtacagaaaatgaacagcaaaactgtgaccagcacaatgttgggtgtgttccgggaggatccaaagactcgggaagagttcctgactctcattaggagctgacgtacgaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcgtcgac(seq id no:1)
98.mekgpvrapaekprgarcsngfperdpprpgpsrpaekpprpeaksaqpadgwkgerprseednelnlpnlaaayssilsslgenpqrqgllktpwraasamqfftkgyqetisdvlndaifdedhdemvivkdidmfsmcehhlvpfvgkvhigylpnkqvlglsklariveiysrrlqvqerltkqiavaitealrpagvgvvveathmcmvmrgvqkmnsktvtstmlgvfredpktreefltlirs(seq id no:2)
99.pah酶分子
100.天然存在的pah酶使用分子氧和四氢生物蝶呤(bh4)催化苯丙氨酸转化为酪氨酸。在一些实施例中，pah酶分子的活性与天然存在的pah酶相同或相似。在一些实施例中，pah酶分子的活性相对于天然存在pah酶有所增强或下降。
101.在一些实施例中，pah酶分子是天然存在的pah酶。在一些实施例中，pah酶分子包含全长(例如，未截短的)pah酶。
102.在一些实施例中，pah酶分子是天然存在的pah酶或非天然存在的(例如，合成的)pah酶的变体(例如，包含一个或多个相对于天然存在或非天然存在的酶的氨基酸序列的氨基酸序列改变(例如，取代、缺失或插入)的变体)。在一些实施例中，相对于天然存在的pah酶，pah酶分子是或包含缺失突变，例如截短，例如n末端区域的截短。在一些实施例中，pah酶分子是或包含天然存在的pah酶的至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的氨基酸序列(和任选地，高达100％、99％、95％、90％、85％、80％、79％、78％、77％、76％或75％的氨基酸序列)。在一些实施例中，pah酶分子包含不超过99％、95％、90％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％或75％的天然存在的pah酶的氨基酸序列。在一些实施例中，pah酶分子是或包含天然存在的pah酶分子的至少200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、335或336个氨基酸(并且任选地，不超过450、400、390、380、370、360、350、340或336个氨基酸)。在一些实施例中，pah酶分子是或包含天然存在的pah酶分子的小于或等于450、400、390、380、370、360、350、340或336个氨基酸(并且任选地，至少200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、335或336个氨基酸)。例如，pah酶分子可以包含前1-14和37位及以后的氨基酸，包含氨基酸15-37的缺失。作为进一
步的实例，pah酶分子可以包含氨基酸1-116的缺失。作为进一步的实例，pah酶分子可以包含氨基酸1-10和30-40的缺失。作为进一步的实例，pah酶分子可以包含天然存在的pah酶的335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349或350个c末端氨基酸，例如，343个c末端氨基酸。
103.在优选的实施例中，pah酶分子缺乏天然存在的pah酶的一些或全部调节域，例如，使得pah酶分子相对于天然存在的pah酶具有组成型活性。不希望受理论束缚，pah酶被理解为包含n末端区域，该n末端区域包含一个或多个例如通过调节对酶活性位点的接近来调节pah的酶活性的调节域。调节区域可以包含已知允许代谢酶的变构调节的act域和/或可有条件阻断接近酶活性位点的活性位点盖。我们认为，缺乏部分或全部调节域的pah酶分子在生产细胞，例如本文所述的选择标记中是有用的，因为这样的pah酶分子可能比包含全长pah酶的pah酶分子(例如进行调节域变构调节的pah酶分子)更具活性(例如组成活性)。在一些实施例中，pah酶分子缺乏活性位点盖。在一些实施例中，pah酶分子缺乏act域。在一些实施例中，pah酶分子包含使n末端调节区域(例如，活性位点盖和/或act域)的调节(例如，抑制)功能消除的改变(例如，取代、缺失或插入)。在一些实施例中，pah酶分子不会被苯丙氨酸的存在明显抑制(例如，不被抑制)。在一些实施例中，pah酶分子包含氨基酸1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110或1-116(例如1-116)的缺失，或对应于人pah的氨基酸1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110或1-116(例如1-116)的残基的缺失。在一些实施例中，pah酶分子缺乏天然存在的pah酶(例如，天然存在的人pah酶)的n末端116个氨基酸或不同的天然存在的pah酶的相应氨基酸。参见daubner等人1997年的《生物化学和生物物理学档案(arch.biochem.biophys)》348(2):295，其描述了缺乏调节域(前116个氨基酸)的截短的pah。这种在大肠杆菌中表达的截短的pah更稳定，更易溶解，不需要与苯丙氨酸预孵育即可变得有活性，并且对底物具有更高的亲和力。在一些实施例中，pah酶分子包含天然存在的pah酶的c末端区域，例如pah酶的催化和多聚化部分。
104.在一些实施例中，pah酶分子是单体，例如，是作为单体的活性酶。在一些实施例中，pah酶分子形成多聚体(例如，在适合酶活性的条件下，例如细胞或生理条件下，例如在生物制造过程中)，例如，是作为多聚体的活性酶。在一些实施例中，pah酶分子多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体，例如四聚体。
105.用于本公开的pah酶分子的序列可取自任何已知的pah酶序列。在一些实施例中，pah酶分子包含人pah酶、其变体或其酶活性片段。在一些实施例中，pah分子与人pah酶具有至少50％的氨基酸序列同一性(例如，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。在一些实施例中，pah酶分子包含cho pah酶、其变体或其酶活性片段。在一些情况下，pah分子与cho pah酶具有至少50％的氨基酸序列同一性(例如，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。
106.在一些实施例中，pah酶分子包含由seq id no:3或4中的任何一者编码的氨基酸序列，例如，seq id no:5或6中的任何一者的氨基酸序列。在一些实施例中，pah酶分子包含与由seq id no:3或4中任何一者编码的氨基酸序列，例如与seq id no:5或6中的任何一者的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，编码pah酶分子的外源性核酸包含与seq id nos:3或4中任何一者的核酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
107.示例性cho pah核酸序列(ncbi参考序列：xm_027434726.1)
108.atggtgccctggttcccaaggaccattcaagagctggacagatttgccaatcagattctcagttatggagcagaactggatgcagaccacccgggctttaaagatcctgtgtaccgggcgaggcgaaagcagtttgctgacattgcctacaactaccgccatgggcagcccatccctcgggtggaatacacagaagaagagaagaagacctggggaacagtgttcaagacactgaaggccttgtataaaacgcatgcctgctatgaacacaaccacattttcccacttctggaaaagtactgcgggttccgtgaagacaacattccccagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgacctgttgctggcttactgtcctctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccactgcacacaatacatcaggcatgggtctaagcccatgtacacacctgaaccagacatttgtcatgaactgttgggacatgtgcccttgttttcagatcgcagctttgcccagttttcccaggaaatcggacttgcttctctgggtgcacctgacgaatacatcgagaaattggccacaatttactggtttactgtggagtttgggctctgcaaggaaggagattccatcaaggcatatggtgctgggcttctgtcatcctttggtgaattacagtactgtttatcagacaagccgaagctcctgcccctggacctagagaagacagcctcacaggagtacaatgtcacagagttccagcccctgtactacgtggcagagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgagggcctttgctgccacaatcccccggcccttctcggttcgctatgatccctacactcaaagggttgaggtcctggacaacactcagcagttgaagattttggctgactccatcaacagtgaggttggaatcctttgcagtgccctgcataaaataaagtcatga(seq id no:3)
109.示例性cho pah核酸序列
110.mvpwfprtiqeldrfanqilsygaeldadhpgfkdpvyrarrkqfadiaynyrhgqpiprveyteeekktwgtvfktlkalykthacyehnhifpllekycgfrednipqledvsqflqtctgfrlrpvagllssrdflgglafrvfhctqyirhgskpmytpepdichellghvplfsdrsfaqfsqeiglaslgapdeyieklatiywftvefglckegdsikaygagllssfgelqyclsdkpkllpldlektasqeynvtefqplyyvaesfndakekvrafaatiprpfsvrydpytqrvevldntqqlkiladsinsevgilcsalhkiks(seq id no:5)
111.示例性人pah核酸序列(基因库：k03020.1)
112.gctagcatggtgccctggttcccaagaaccattcaagagctggacagatttgccaatcagattctcagctatggagcggaactggatgctgaccaccctggttttaaagatcctgtgtaccgtgcaagacggaagcagtttgctgacattgcctacaactaccgccatgggcagcccatccctcgagtggaatacatggaggaagaaaagaaaacatggggcacagtgttcaagactctgaagtccttgtataaaacccatgcttgctatgagtacaatcacatttttccacttcttgaaaagtactgtggcttccatgaagataacattccccagctggaagacgtttctcaattcctgcagacttgcactggtttccgcctccgacctgtggctggcctgctttcctctcgggatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccactgcacacagtacatcagacatggatccaagcccatgtatacccccgaacctgacatctgccatgagctgttgggacatgtgcccttgttttcagatcgcagctttgcccagttttcccaggaaattggccttgcctctctgggtgcacctgatgaatacattgaaaagctcgccacaatttactggtttactgtggagtttgggctctgcaaacaaggagactccataaaggcatatggtgctgggctcctgtcatcctttggtgaattacagtactgcttatcagagaagccaaagcttctccccctggagctggagaagacagccatccaaaattacactgtcacggagttccagcccctgtattacgtggcagagagttttaatgatgccaaggagaaagtaaggaactttgctgccacaatacctcggcccttctcagttcgctacgacccatacacccaaaggattgaggtcttggacaatacccagcagcttaagattttggctgattccattaacagtgaaat
tggaatcctttgcagtgccctccagaaaataaagtaaagatct(seq id no:4)
113.示例性人pah核酸序列
114.mvpwfprtiqeldrfanqilsygaeldadhpgfkdpvyrarrkqfadiaynyrhgqpiprveymeeekktwgtvfktlkslykthacyeynhifpllekycgfhednipqledvsqflqtctgfrlrpvagllssrdflgglafrvfhctqyirhgskpmytpepdichellghvplfsdrsfaqfsqeiglaslgapdeyieklatiywftvefglckqgdsikaygagllssfgelqyclsekpkllplelektaiqnytvtefqplyyvaesfndakekvrnfaatiprpfsvrydpytqrievldntqqlkiladsinseigilcsalqkik(seq id no:6)
115.宿主细胞
116.本公开部分涉及宿主细胞，其包含酪氨酸营养缺陷型选择标记，例如编码苯丙氨酸羟化酶(pah)酶分子的第一核酸；和编码gtp环化水解酶1(gch1)酶分子的第二核酸。这些序列中的至少一种序列对于宿主细胞是外源的，即不是天然存在的。两种序列对于宿主细胞都可能是外源的。
117.如上文关于载体的部分所述，由于核酸序列可以存在于相同或不同的载体中，因此它们可以以相同或不同的核酸分子/载体存在于宿主细胞中。这些载体可能是自我复制的载体，尤其是在染色体外维持时。在一些实施例中，第一和/或第二核酸被整合到生产细胞的基因组中。
118.引入载体系统后的宿主细胞通常还将包含编码目标产物的第三外源性核酸序列，这些细胞在本文中也称为
‘
生产细胞’。该产物，例如一种生物治疗性蛋白通常不天然存在于未修饰的宿主细胞中。第三核酸序列存在于与第一核酸序列和/或第二核酸序列相同的核酸中，这取决于有多少用于产生细胞的载体。在一些实施例中，第三外源性核酸整合到宿主细胞的基因组中。也可以存在使用本发明的载体系统引入的额外的外源性核酸。
119.第一外源性核酸、第二外源性核酸和/或第三外源性核酸等均可以包含一个或多个控制元件。控制元件，例如，启动子和/或增强子可以可操作地连接到编码pah酶分子的序列、编码gch1分子的序列或编码产物的序列。在一些实施例中，第一和第二外源性核酸包含一个或多个足以在生产细胞中表达pah酶分子和gch1酶分子的控制元件。在一些实施例中，第三外源性核酸包含一个或多个足以在生产细胞中表达产物(例如多肽产物)的控制元件。适用于本发明的控制元件是本领域技术人员已知的，并且本文也描述了其实例。
120.宿主细胞类型
121.在一个方面，本公开的宿主细胞可以是本文所述的任何细胞类型、菌株或细胞系，由本文所述的任何细胞类型、菌株或细胞系制成或衍生自本文所述的任何细胞类型、菌株或细胞系。一般而言，本文所述的方法可用于产生宿主细胞，例如包含核酸构建体(例如，整合到基因组中的载体或异源核酸)的细胞或细胞系，该核酸构建体包含(i)编码目标产物的主题核酸序列和(ii)一种或多种外源性核酸序列，该外源性核酸序列编码一种或多种参与氨基酸生物合成途径的酶分子，其中细胞或细胞系不内源性表达该酶分子。
122.宿主细胞可以是任何可以被遗传操作和生长的合适的细胞。通常，该细胞适合于大规模培养以产生目标产物。
123.在引入本发明的载体系统之前的宿主细胞不能产生足够水平的酪氨酸来支持在不存在酪氨酸的情况下的细胞生长。这可能是因为它天然不能将酪氨酸生物合成所必需的酶中的一种或多种酶表达到足够的水平，或其已被工程化敲除相关基因。因此，在一个实施
方例中，本发明的宿主细胞已被遗传修饰以抑制或消除任何内源pah和/或gch1活性。这可以例如通过编码和/或调节内源性pah和/或gch1表达的基因组序列中的突变(插入、缺失和/或取代)来实现。
124.在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
125.在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可以衍生宿主细胞的示例性物种包括人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴子、猿、狗、马、雪貂和猫。
126.在实施例中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一个实施例中，宿主细胞是cho-k1细胞、细胞、dg44 cho细胞、duxb11 cho细胞、cho-s细胞、cho-gs敲除细胞(谷胱甘肽合成酶(gs)基因的所有内源性拷贝均已失活的cho细胞)、fut8敲除细胞、chozn细胞或cho衍生细胞。cho gs敲除细胞(例如，gs-ko细胞)是例如gs敲除细胞(如gs细胞-chok1sv龙沙生物制剂公司(lonza biologics,inc.))。cho fut8敲除细胞是例如fut8敲除细胞(龙沙生物制剂公司)。
127.在实施例中，宿主细胞是hela细胞、mdck细胞、sf9细胞、sf21细胞、tn5细胞、ht1080细胞、nb324k细胞、flyrd18细胞、hek293细胞、hek293t细胞、ht1080细胞、h9细胞、hepg2细胞、mcf7细胞、jurkat细胞、nih3t3细胞、pc12细胞、per.c6细胞、bhk(小仓鼠肾)细胞、vero细胞、sp2/0细胞、ns0细胞、yb2/0细胞、y0细胞、eb66细胞、c127细胞、l细胞、cos细胞(例如cos1细胞和cos7细胞)、qc1-3细胞、chok1细胞、chok1sv细胞、(chok1sv fut8-ko细胞)、cho gs敲除细胞、gs xceed
tm
(chok1sv gs-ko细胞)、chos细胞、cho dg44细胞、cho dxb11细胞或chozn细胞或任何自其衍生的细胞。
128.在其他实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞以外的细胞，如禽类细胞、鱼类细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或酵母细胞。
129.在一些实施例中，宿主细胞或宿主细胞的细胞系通过包含多个细胞融合(例如，相同类型(例如，两个cho细胞)或不同类型(例如，不同物种)的两个细胞的融合)的过程形成。通过包含融合多个细胞的过程形成的宿主细胞或细胞系的实例包括但不限于杂交瘤、三源杂交瘤和四源杂交瘤。
130.在一些实施例中，自其衍生的细胞包括但不限于本文所述的细胞，其进一步包括如突变(例如，取代、缺失或插入)或核酸(例如，载体)的添加等改变(例如，基因的敲入、基因的敲除或基因的多重性)。在一些实施例中，自其衍生的细胞包括本文所述的经受定向进化的细胞。在一些实施例中，自其衍生的细胞包括本文所述的这些示例性修饰的组合。
131.真核细胞包括干细胞。干细胞可以是例如多能干细胞，包括胚胎干细胞(esc)、成体干细胞、诱导多能干细胞(ipsc)、组织特异性干细胞(例如造血干细胞)和间充质干细胞(msc)。
132.在实施例中，宿主细胞是本文所述的细胞中的任何一种细胞的分化形式。在一个实施例中，宿主细胞是一种衍生自培养中的任何原代细胞的细胞
133.在实施例中，宿主细胞是肝细胞，如人肝细胞、动物肝细胞或非实质细胞。例如，宿主细胞可以是可涂布的代谢合格的人肝细胞、可涂布的诱导合格的人肝细胞、可涂布的
qualyst transporter certified
tm
人肝细胞、悬浮合格的人肝细胞(包括10个供体和20个供体汇集的肝细胞)、人肝k
ü
pffer细胞、人肝星状细胞、狗肝细胞(包括单个和汇集的beagle肝细胞)、小鼠肝细胞(包括cd-1和c57bi/6肝细胞)、大鼠肝细胞(包括sprague-dawley、wistar han和wistar肝细胞)、猴肝细胞(包括食蟹猴或恒河猴肝细胞)、猫肝细胞(包括家养短毛猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性肝细胞可商购自三角研究实验室有限责任公司(triangle research labs,llc)，美国北卡罗来纳州研究三角公园戴维斯大道6号(6davis drive research triangle park,north carolina,usa)邮编：27709。
134.在一些实施例中，宿主细胞包含谷氨酰胺合成酶(gs)的敲除。在实施例中，宿主细胞不包含功能性gs基因。在实施例中，宿主细胞不包含gs基因。在实施例中，宿主细胞中的gs基因包含使基因不能编码功能性gs蛋白的突变。
135.在实施例中，该真核细胞是低等真核细胞，如例如酵母细胞(例如毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、克鲁维毕赤酵母和安格斯毕赤酵母)、驹形氏酵母属(例如巴斯德驹形氏酵母、假巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母)、酵母菌属(例如酿酒酵母、酿酒酵母(cerevisiae)、克鲁维酵母、葡萄汁酵母)、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母)、假丝酵母属(例如产朊假丝酵母、可可假丝酵母、博伊丁假丝酵母)、地霉属(例如发酵地霉)、多形汉逊酵母、解脂耶氏酵母或粟酒裂殖酵母。在一些实施例中，该真核细胞属于毕赤酵母菌种。毕赤酵母菌株的实例包括但不限于x33、gs115、km71、km71h和cbs7435。
136.在实施例中，该真核细胞是真菌细胞(例如曲霉属(如黑曲霉、烟曲霉、米曲霉、构巢曲霉)、支顶孢属(如嗜热支顶孢)、毛壳菌属(如嗜热毛壳菌)、金孢子菌属(如嗜热金孢子菌)、虫草属(如蛹虫草)、棒囊壳属、栉霉属、镰刀菌属(如尖孢镰刀菌)、小丛壳属(如禾生小丛壳)、肉座菌属(如红褐肉座菌)、稻瘟病菌属(如稻瘟病菌)、毁丝菌属(如嗜热毁丝菌)、丛赤壳菌属(如鞭毛藻丛赤壳菌)、脉孢菌属(如粗糙脉孢菌)、青霉菌属、侧孢霉属(如嗜热侧孢霉)、梭孢壳属(如太瑞斯梭孢壳霉、异宗梭孢壳霉)、木霉属(如里氏木霉)或轮枝菌属(如大丽轮枝菌)。
137.在实施例中，该真核细胞是昆虫细胞(例如，sf9、mimic
tm sf9、sf21、high five
tm
(bt1-tn-5b1-4)或bt1-ea88细胞)、藻类细胞(例如，属于双眉藻属、硅藻属、杜氏藻属、小球藻属、衣藻属、蓝藻门属(蓝藻细菌)、微拟球藻属、螺旋藻属或棕鞭藻属或植物细胞(例如，来自单子叶植物类(例如，玉米、水稻、小麦或狗尾草属)或来自双子叶植物类(例如，木薯、马铃薯、大豆、番茄、烟草、紫花苜蓿、小立碗藓或拟南芥属的细胞)。
138.在实施例中，该宿主细胞是原核细胞，如细菌细胞。
139.在实施例中，该原核细胞是革兰氏阳性细胞，如芽孢杆菌属、链霉菌属、链球菌属、葡萄球菌属或乳杆菌属。可以使用的芽孢杆菌属是，例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。在实施例中，该细胞是枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌3na和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌属可以从例如芽孢杆菌基因保藏中心(bacillus genetic stock center)，生物科学(biological sciences)556，俄亥俄州哥伦布西12大道484号43210-1214(484west 12th avenue,columbus oh 43210-1214)获得。
140.在实施例中，该原核细胞是革兰氏阴性细胞，如沙门氏菌属或大肠杆菌，如tg1、
tg2、w3110、dh1、dhb4、dh5a、hms 174、hms174(de3)、nm533、c600、hb101、jm109、mc4100、xl1-blue和origami以及那些衍生自大肠杆菌b菌株的细胞，如例如bl-21或bl21(de3)或bl21(de3)plyss，所有这些细胞都是可商购的。
141.在一些实施例中，该原核细胞是蓝藻细胞。在一些实施例中，该蓝藻细胞是蓝绿藻，例如集胞藻细胞。
142.合适的宿主细胞是例如可商购自菌种保藏中心，如德国微生物菌种保藏中心dsmz(deutsche sammlung von mikroorganismen and zellkulturen gmbh，德国不伦瑞克(braunschweig,germany))或美国菌种保藏中心(american type culture collection,atcc)。
143.额外的选择标记
144.在一些实施例中，除了酪氨酸营养缺陷行选择标记之外，宿主细胞还包含一种或多种选择标记。在一些实施例中，第二选择标记是不同的营养缺陷型选择标记，如不同的氨基酸营养缺陷型选择标记。在一个实施例中，该氨基酸是脯氨酸或谷氨酰胺。这种选择标记所需的核酸序列的实例是编码谷氨酰胺合成酶(用于谷氨酰胺)和吡咯啉-5-羧酸合酶(p5cs)(用于脯氨酸)的序列。
145.另一种选择标记是二氢叶酸还原酶(dhfr)，例如，编码dhfr酶分子的外源性核酸，例如，其赋予对甲氨蝶呤(mtx)的抗性。在一些实施例中，dhfr选择标记也是胸苷营养缺陷型选择标记和/或次黄嘌呤营养缺陷型选择标记。在一些实施例中，宿主细胞不包含内源性功能性dhfr基因，例如，包含使内源性dhfr基因不能编码功能性dhfr酶的突变。
146.另一种选择标记包含次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)选择标记，例如编码hprt酶分子的外源性核酸。在一些实施例中，在没有hprt(例如由外源性核酸编码的补充的hprt)和补充的嘌呤(例如次黄嘌呤)的情况下，生产细胞不能在存在氨基蝶呤的情况下生长和/或分裂。在一些实施例中，hprt选择标记也是嘌呤(例如，次黄嘌呤或鸟嘌呤)营养缺陷型选择标记。在一些实施例中，生产细胞不包含内源性功能性hprt基因，例如，包含使内源性hprt基因不能编码功能性hprt酶的突变。
147.在一个实施例中，选择标记与selexis选择系统(例如，suretechnology platform
tm
和selexis genetic elements
tm
，可从selexis sa商购)或catalent选择系统兼容。
148.一种用于生产细胞的选择标记可以与主题核酸相关联。如本文所用的关于选择标记和主题核酸之间的关系，与
……
相关联是指生产细胞中选择标记的存在与主题核酸的存在相关的关系。选择标记与主题核酸相关联，使得选择(例如，需要)在生产细胞中存在选择标记则选择存在主题核酸。在一些实施例中，选择标记(例如，选择标记的至少一个组分)位于与主题核酸相同的核酸分子上，例如位于与主题核酸相同的载体上。例如，包含酪氨酸营养缺陷型选择标记(该酪氨酸营养缺陷型选择标记包含编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸)的生产细胞可以包含位于与第一外源性核酸或第二外源性核酸相同载体上的主题核酸。在包含不止一种选择标记的生产细胞中，每种选择标记可以与不同的主题核酸相关联。在一些实施例中，生产细胞包含与第一主题核酸相关联的第一选择标记(例如，编码产物)和与第二主题核酸相关联的第二选择标记(例如，编码生产因子，例如脂质代谢调节剂(lmm)，如wo2017/191165和wo2019/152876中所述的scd1和/
或srebf-1，通过引用并入本文)。因此，进一步的选择标记用于维持已引入宿主细胞的外源性生产因子(包括在先前的场合产生稳定的细胞系)。在一些实施例中，生产细胞包含与第一主题核酸相关联的第一选择标记(例如，编码第一产物)和与第二主题核酸相关联的第二选择标记(例如，编码第二产物)。在一些实施例中，生产细胞包含与第一主题核酸相关联的第一选择标记(例如，编码多多肽产物的第一多肽)和与第二主题核酸相关联的第二选择标记(例如，编码多多肽产物的第二多肽)。应当理解，可以包括可以与不同标记或相同标记相关联的额外的主题核酸。
149.抑制剂
150.宿主细胞和/或包含宿主细胞的培养物可以包含一种或多种酶分子抑制剂(在本文中也称为抑制剂)。酶分子抑制剂可用于通过降低或阻断内源性酶分子活性来增加本文所述选择过程的严格性，例如，使得不吸收编码酶分子的外源性核酸的细胞(例如，并且包含主题核酸序列)表现出水平降低或检测不到的内源性酶分子活性。在不存在合成需要酶活性的氨基酸(例如，脯氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺)的外部供应的情况下，表现出内源性酶分子活性水平降低或检测不到的细胞可能不能生长和/或存活。在一些实施例中，该抑制剂结合到酶分子，例如，其结合到并抑制酶分子。在实施例中，该抑制剂是酶分子的变构抑制剂。在实施例中，该抑制剂是酶分子的竞争性抑制剂。
151.在一些实施例中，本文所述的生产细胞可以进一步包含酶分子的抑制剂，该酶分子由引入细胞的外源性核酸(例如pah或gch1)表达。在一些实施例中，细胞中的抑制剂水平足以将内源性酶分子活性降低至低于在缺乏抑制剂的细胞中观察到的约0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％或10％。在一些实施例中，根据在缺乏氨基酸的培养基中生长而选择的少于约0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％或10％的细胞不包含主题核酸。在一些实施例中，在细胞中的酶分子和抑制剂分子的比约为1:1000、1:500、1:250、1:200、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、250:1、500:1或1000:1。
152.该抑制剂可以是例如氨基酸或其类似物、多肽、核酸或小分子。在一些实施例中，该抑制剂是由酶分子参与的生物合成途径产生的氨基酸的类似物。在一些实施例中，该抑制剂是酶分子底物的类似物。在一些实施例中，该抑制剂是抗体分子(例如，抗体或抗体片段，例如，如本文所述)、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、报告蛋白、治疗性肽、适体或其中任何一者的结构和/或功能片段或杂合体。在一些实施例中，该抑制剂是反义rna、sirna、trna、核糖体rna、微小rna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、rna适体或长链非编码rna。
153.在一些实施例中，该抑制剂抑制脯氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺生物合成途径中的酶分子。在一个实施例中，该抑制剂抑制pah(例如苯丙氨酸类似物)或gch1的活性。在实施例中，该抑制剂是一种四氢生物蝶呤(bh4)类似物。在一些实施例中，该抑制剂是gtp类似物。在一个实施例中，该抑制剂选自α-甲基酪氨酸(例如，在50-100μm下)、α-甲基苯丙氨酸和2,4-氨基-6-羟基嘧啶。
154.在实施例中，在使用的情况下，该抑制剂抑制酶的活性，该酶构成额外的选择标记中的一种选择标记的主要组分，如吡咯啉-5-羧酸合酶(p5cs)分子。在实施例中，该抑制剂
抑制p5cs的活性。在实施例中，该抑制剂是脯氨酸类似物。在实施例中，该抑制剂是l-氮杂环丁烷-2-羧酸、3,4-脱氢-l-脯氨酸或l-4-噻唑烷羧酸。在一些实施例中，该抑制剂抑制dhfr的活性，例如该抑制剂是甲氨蝶呤。在一些实施例中，该抑制剂抑制谷氨酰胺合成酶，例如谷氨酰胺类似物、蛋氨酸亚氨基代砜(msx)或其类似物(例如α-甲基或α-乙基msx)。在一些实施例中，生产细胞包含不止一种选择标记，并且包含用于每种选择标记的酶分子抑制剂。
155.核酸引入宿主细胞和选择步骤
156.本领域已知许多合适的用于将外源性核酸引入宿主细胞的方法，包括例如将核酸(例如载体)转染、转导(例如，病毒转导)或电穿孔到细胞中。用于将核酸(例如本文所述的异源性核酸或载体)引入宿主细胞的物理方法的实例包括但不限于磷酸钙沉淀、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于生产包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如sambrook等人2012年的《分子克隆：实验室手册》第1卷-第4卷，纽约的冷泉港出版社)。用于将核酸(例如本文所述的异源性核酸或载体)引入宿主细胞的化学方法的实例包括但不限于脂质转染、胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。其他最先进的核酸靶向递送方法是可用的，如用靶向纳米粒子或其他合适的亚微米尺寸递送系统递送多核苷酸。
157.宿主细胞可以用核酸瞬时转染或稳定转染。
158.基于本发明的酪氨酸营养缺陷型选择系统(和可能包括的任何其他额外的选择标记)，通过在严格的选择条件下培养细胞可以实现对含有引入的核酸的宿主细胞的选择，这些严格的选择条件允许含有引入的核酸的细胞生长，同时限制非转化细胞的生长能力。
159.转染/转化的细胞群在酪氨酸的水平很容易允许选择含有引入的核酸的细胞的条件下培养。因此，细胞在酪氨酸水平低于细胞存活或生长所需水平的情况下培养。通常，这将涉及使用缺乏酪氨酸的培养基，以便在细胞不存在酪氨酸的情况下培养。尽管如此，只要选择条件足够严格，如培养基包含少于0.01g/l酪氨酸或少于50μm、20μm或10μm酪氨酸，就可以允许低水平的酪氨酸。本领域技术人员将能够容易地确定所期望的酪氨酸水平以获得令人满意的选择严格性。
160.因为一种或多种外源性核酸供给的酶分子提供将苯丙氨酸转化为酪氨酸的活性，因此可能期望用额外的苯丙氨酸补充培养基，以便满足宿主细胞对苯丙氨酸的正常需求，以及为酪氨酸产生提供前体。因此，细胞群可以在苯丙氨酸水平高于生产细胞存活或生长所需水平的情况下培养，该生产细胞在存活或生长所需的酪氨酸水平下培养。因此，在一些实施例中，苯丙氨酸以至少0.035g/l的水平提供(例如，作为培养的一部分和/或作为培养基的组分)。细胞因而可以在水平至少为2mm、3mm或4mm的苯丙氨酸的情况下培养。因为高水平的苯丙氨酸可抑制细胞生长，因此通常苯丙氨酸的水平低于10mm，如低于9mm、8mm、7mm或6mm。
161.在cho pah酶的情况下，在一个实施例中，优选培养基中的苯丙氨酸水平为2mm至9mm，如2mm或3mm至6mm或7mm苯丙氨酸，而在人pah酶的情况下，在一个实施例中，优选范围是4mm至9mm苯丙氨酸。
162.可以对细胞执行适应步骤，以便它们可以适应更高水平的苯丙氨酸。本步骤可能
涉及在细胞培养基中以一种或多种越来越高的苯丙氨酸浓度(如3mm)传代细胞一代或两代，然后以最终所期望的浓度(例如6mm)传代细胞。这可以在转染之前或转染之后执行，例如，当细胞在生长期之前恢复时。
163.在一些实施例中，使用自动调节系统建立和/或维持苯丙氨酸水平，该系统检测和/或监测培养物中苯丙氨酸的水平，以及响应检测到的小于阈值的水平，提供苯丙氨酸(例如，直到检测到的水平大于或等于阈值)。在一些实施例中，这种自动调节系统利用光谱法(例如，拉曼光谱法)来检测和/或监测苯丙氨酸的水平。类似的考虑适用于使用额外的选择标记的情况。
164.在使用两种选择标记，例如本发明的选择系统和gs选择系统的情况下，可同时引入相关载体，并配制细胞培养基，即，例如如上所述的缺乏酪氨酸和谷氨酰胺并任选地补充有苯丙氨酸的培养基，以对两种类型的标记提供严格的选择。可替代地，选择可以是两步过程，由此一个载体系统被引入并在针对第一标记的严格条件下选择，然后导致在针对第二标记并任选地针对第一标记的严格条件(例如缺乏酪氨酸和谷氨酰胺并任选地补充有苯丙氨酸的培养基)下选择转染/转化的细胞。可替代地，当随后为第二标记选择严格条件时，可以对第一标记使用不太严格的条件。上述培养条件经必要的修改后适用于这两个选择标记程序(如果使用了额外的标记)。
165.含有导入的核酸序列的生产细胞的功能特性
166.在一些实施例中，宿主细胞包含酪氨酸营养缺陷型选择标记(例如，编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸)，并且能够在包含水平降低的酪氨酸(例如，不存在酪氨酸)的培养基中生长和/或分裂。此类细胞在本文中也称为生产细胞。生长和/或分裂的能力可以通过本领域技术人员已知并在本文中描述的方法来评估。在一些实施例中，宿主细胞能够在含有小于0.01g/l酪氨酸或小于50μm、20μm或10μm酪氨酸(例如，不存在酪氨酸)的培养基中生长和/或分裂。在一些实施例中，宿主细胞能够在缺乏酪氨酸的培养基中生长和/或分裂。
167.在一些实施例中，宿主细胞包含与选择标记(例如，酪氨酸营养缺陷型选择标记，例如，包含编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸)相关联的主题核酸。在一些实施例中，宿主细胞包含至少阈值拷贝数的主题核酸(例如，足以高效产生产物的拷贝数)，例如，至少1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500份拷贝的主题核酸。
168.在一些实施例中，宿主细胞包含编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸。在一些实施例中，宿主细胞包含至少阈值拷贝数的第一外源性核酸(例如，足以让宿主细胞在降低的酪氨酸水平(例如，不存在酪氨酸)下生长和/或分裂的拷贝数)，例如，至少1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500份拷贝的第一外源性核酸。在一些实施例中，宿主细胞包含至少阈值拷贝数的第二外源性核酸(例如，足以让宿主细胞在降低的酪氨酸水平(例如，不存在酪氨酸)下生长和/或分裂的拷贝数)，例如，至少1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或10,000份拷贝的第二外源性核酸。
169.在一些实施例中，该主题核酸，例如，由于其与选择标记(例如，包含编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸的酪氨酸营养缺陷型标记)的关
联在指定间隔内持续存在于宿主细胞(例如，或其子细胞或后代)中。在一些实施例中，该第一外源性核酸在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或群体倍增的细胞)中持续存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月(以及任选地无限期持续存在)。在一些实施例中，该第一外源性核酸在宿主细胞(例如，或其子细胞或后代细胞)中持续存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300次细胞分裂(以及任选地无限期持续存在)。在一些实施例中，该第一外源性核酸在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或群体倍增的细胞)中持续存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300个例如本文所述的生物反应器的宿主循环、群体倍增数或若干世代(以及任选地无限期持续存在)。在一些实施例中，该第二外源性核酸在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或群体倍增的细胞)中持续存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月(以及任选地无限期持续存在)。在一些实施例中，该第二外源性核酸在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或群体倍增的细胞)中持续存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300次细胞分裂(以及任选地无限期持续存在)。在一些实施例中，该第二外源性核酸在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或种群体倍增的细胞)中持续存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个例如本文所述的生物反应器的宿主循环、群体倍增数或若干世代(以及任选地无限期持续存在)。在一些实施例中，只要宿主细胞保持在包含水平降低的酪氨酸(例如，不包含酪氨酸)的培养基中，第一外源性核酸就会在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或群体增倍的细胞)中持续存在。在一些实施例中，只要宿主细胞保持在包含水平降低的酪氨酸(例如，不包含酪氨酸)的培养基中，第二外源性核酸就会在宿主细胞(例如，或其子细胞、后代细胞、世代细胞或群体增倍的细胞)中持续存在。在一些实施例中，第一、第二或第一和第二外源性核酸在宿主细胞中的持续存在性，例如通过宿主细胞是否在包含水平降低的酪氨酸(例如，不包含酪氨酸)的培养基中生长并产生产物来从功能上进行评价。在一些实施例中，第一、第二或第一和第二外源性核酸在宿主细胞中的持续存在性通过使用rt-pcr来进行评价(例如，确认)。
170.在一些实施例中，包含酪氨酸营养缺陷型选择标记(例如，编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸)的宿主细胞在包含酪氨酸水平降低(例如，不存在酪氨酸)的培养基中比其他不包含酪氨酸营养缺陷型选择标记的类似细胞生长和/或分裂更快。在一些实施例中，宿主细胞的生长和/或分裂速度在包含水平降低的酪氨酸(例如，不存在酪氨酸)的培养基中比不包含酪氨酸营养缺陷型选择标记的类似细胞快至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或快10倍、102倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
171.在一些实施例中，与缺乏外源性核酸和/或主题核酸的细胞相比，包含选择标记的宿主细胞(该选择标记包含编码酶分子的外源性核酸)(例如，编码pah酶分子的第一外源性核酸和编码gch1酶分子的第二外源性核酸)(和任选地与所述外源性核酸相关联的主题核
酸)表现出升高的酶分子活性。在一些实施例中，相对于在缺乏编码酶分子和/或相关联的主题核酸的外源性核酸的细胞中可检测到的酶分子活性，该酶分子活性水平增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在一些实施例中，活性升高的细胞可以比缺乏编码酶分子和/或相关联的主题核酸的外源性核酸的细胞生长更快。在一些实施例中，相对于在缺乏编码酶分子和/或相关联的主题核酸的外源性核酸的类似培养基条件下的类似细胞，该细胞生长和/或分裂的速率增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在一些实施例中，宿主细胞在缺乏氨基酸的培养基上的生长速度比缺乏主题核酸和/或编码酶分子的外源性核酸的类似细胞快至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、5000或10000倍。
172.使用宿主(生产)细胞制备重组产物的方法
173.也可称为生产细胞的本发明的宿主细胞可以用于表达由引入的核酸编码的产物。这些生产细胞通常用第一、第二和/或第三外源性核酸(和任选地如本文所述的进一步的外源性核酸，其中将产生不止一种目标产物，包括多个亚基产物)稳定转染到细胞中以制备生产细胞。在替代实施例中，宿主细胞可以用第一、第二和/或第三外源性核酸瞬时转染到合适的细胞中。
174.考虑到下文描述的方法，重组产物可以通过根据本领域已知的任何适于产生产物的方法培养本发明的生产细胞来表达。在一些实施例中，培养基缺乏酪氨酸或包含水平低于或等于0.01g/l或低于或等于50μm、20μm或10μm的酪氨酸(例如，酪氨酸水平不足以培养不包含一种或多种编码一个或多个酶分子的外源性核酸和/或主题核酸的类似细胞)。在一些实施例中，培养包含在酪氨酸水平低于不包含一种或多种外源性核酸的细胞(例如，与生产细胞类似的细胞)存活或生长所需水平的情况下(例如，在不存在酪氨酸的情况下)培养生产细胞。因为在重组产物表达期间可能不需要对生产细胞系施加选择压力，因此培养基在生长期和生产期的不同阶段可能含有酪氨酸。然而，因为酪氨酸由于溶解度低而更难在细胞培养基中处理，因此从细胞培养基中完全省略酪氨酸可能是有利的。
175.另一方面，因为在不存在(或低水平的酪氨酸)酪氨酸的情况下，细胞会消耗更多的苯丙氨酸，因此所使用的各种培养基，如进料溶液，可以补充有苯丙氨酸。例如，苯丙氨酸的水平可以至少为0.035g/l。因此，在一些实施例中，苯丙氨酸以至少0.035g/l的水平提供(例如，作为培养的一部分和/或作为培养基的组分)。细胞因而可以在苯丙氨酸水平至少为2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm或9mm的情况下培养。因为高水平的苯丙氨酸可抑制细胞生长，因此通常苯丙氨酸的水平低于10mm，如低于9mm、8mm、7mm或6mm。
176.在cho pah酶的情况下，在一个实施例中，优选培养基中的苯丙氨酸水平为2mm至9mm，如2mm或3mm至6mm或7mm苯丙氨酸，而在人pah酶的情况下，在一个实施例中，优选范围是4mm至9mm苯丙氨酸。我们的研究结果表明，当细胞培养基中补充有苯丙氨酸时，截短的人pah酶可提供出色的细胞性能。
177.可以对细胞执行适应步骤，以便它们可以适应更高水平的苯丙氨酸。在一个实施例中，细胞已在选择阶段适应在苯丙氨酸补充的培养基中生长。可替代地，这可以发生在例如n-1生物反应器的生产或预生产阶段，该生物反应器为n生物反应器产生接种物。同样，随
着苯丙氨酸浓度的增加，适应可能会再进行一段时间，或可以将细胞接种到已处于最终补充水平的细胞培养基中。
178.在一些实施例中，使用自动调节系统建立和/或维持苯丙氨酸水平，该系统检测和/或监测培养物中苯丙氨酸的水平，以及响应检测到的小于阈值的水平，提供苯丙氨酸(例如，直到检测到的水平大于或等于阈值)。在一些实施例中，这种自动调节系统利用光谱法(例如，拉曼光谱法)来检测和/或监测苯丙氨酸的水平。类似的考虑适用于使用额外的选择标记的情况。
179.在实施例中，细胞培养以分批培养、进料分批培养、减弱分批进料过度生长(afog)、吸取和填充培养、连续培养或半连续培养，包括灌注培养的形式进行。在一些实施例中，生物反应器能够或被配置为连续或半连续操作。在实施例中，该细胞培养物是悬浮培养物。在一个实施例中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模型生物体或人体受试者中。在一些实施例中，细胞培养利用固体微载体(例如，在固体微载体表面上生长)、多孔微载体(例如，在微载体上和/或内生长)或支持基质(例如，在基质上和/或内生长)。在一些实施例中，该细胞培养物是灌注培养物。在一些实施例中，振荡该细胞培养物。在一些实施例中，该细胞培养物是微流体培养物。
180.在一个实施例中，培养基无血清。无血清、无蛋白质和化学限定的无动物组分(cdacf)培养基是可商购的，例如商购自龙沙生物科学(lonza bioscience)。
181.在一些实施例中，可以将脂质添加剂(例如，包含胆固醇、油酸、亚油酸或其组合)添加到培养基中。
182.适用于哺乳动物细胞系的培养基和培养方法在本领域是众所周知的，例如，如美国专利第5,633,162号中描述的培养基和培养方法。用于实验室烧瓶或低密度细胞培养并适应特定细胞类型需要的标准细胞培养基的实例是例如：罗斯维尔公园纪念学院(roswell park memorial institute，rpmi)1640培养基(morre,g.的《美国医学会杂志(the journal of the american medical association)》199，第519页和下一页，1967年)，l-15培养基(leibovitz,a.等人的《美国卫生杂志(amer.j.of hygiene)》78，1第173页之后的页数，1963年)，达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem)，伊格尔氏最低限度必需培养基(mem)，哈姆氏f12培养基(ham,r.等人的《美国科学院院刊(proc.natl.acad.sc.)》53，第288页之后的页数，1965年)或缺乏白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的iscoves改良dmem(iscoves等人的《实验医学杂志(j.exp.med.)》1，第923页之后的页数，1978年)。例如，哈姆氏f10或f12培养基专门为cho细胞培养而设计。其他特别适合cho细胞培养的培养基描述在ep481 791中。众所周知，这种培养基可以补充有胎牛血清(fbs，也称为胎牛血清fcs)，后者提供大量的激素和生长因子的天然源。哺乳动物细胞的细胞培养当今是科学教材和手册中详细描述的常规操作，其例如在r.ian fresney的《动物细胞培养手册(culture of animal cells,a manual)》第4版本，wiley-liss出版商/纽约，2000年中进行详细介绍。本文所述的细胞培养基中的任何一种培养基可以配制为缺乏特定氨基酸，例如，如果细胞已吸收了主题核酸(如酪氨酸)，则可以挽救其生物合成的氨基酸。
183.其他合适的培养方法是本领域技术人员已知的并且可能取决于重组多肽产物和所使用的宿主细胞。确定或优化适合表达和产生待由细胞表达的重组或治疗性多肽的条件在普通技术人员的技能范围内。
184.在一个方面，本公开涉及一种制备或制造多肽产物的方法，其中该方法包含收获该多肽产物。在一些实施例中，收获包含例如通过本文所述或本领域已知的方法从生产细胞和/或培养基分离该多肽产物。
185.培养可以包含不同的培养步骤。因此，在一些实施例中，培养步骤包含在第一培养基中然后在第二培养基(即，使用例如可能具有不同水平的酪氨酸和/或苯丙氨酸的不同培养基)中培养生产细胞。
186.生产细胞可以在任何合适的容器中以各种规模培养。对于工业生产，可以使用生物反应器，如具有至少10升，如至少50升、50升至800升或800升至200,000升体积的生物反应器。生物反应器可以是一次性使用的生物反应器。在实施例中，该生物反应器包含生物处理容器、外壳、至少一个搅拌器、至少一个起泡器、至少一个用于起泡器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个填充口、至少一个收获口、至少一个样品口和至少一个探针。生物反应器还可以包含用于监测和维持一个或多个参数(例如ph、溶解氧张力(dot)、苯丙氨酸水平和/或温度)的过程和探针。该生物反应器可以可操作地连接到收获容器。下面的
‘
应用’部分提供了进一步的细节和实施例。
187.一旦生产细胞对产物的生物合成进展到令人满意的程度，就可以收获产物，例如取出培养基并将上清液与细胞和细胞碎片分离。可以对该产物进行一个或多个如亲和层析、离子交换层析、过滤和/或病毒灭活等纯化/处理步骤以获得纯化产物。该产物还可以与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合以产生组合物，如含有缓冲剂、表面活性剂、稳定剂(如海藻糖、蔗糖、甘油)、氨基酸(如甘氨酸、组氨酸、精氨酸)、金属离子/螯合剂、盐和/或防腐剂中的一者或多者的配制药物组合物。
188.重组产物
189.本文提供了用于鉴定、选择或培养能够产生高产量产物，例如多肽(例如治疗性多肽)的生产细胞或细胞系的组合物和方法以及用于产生所述产物的方法。本发明所涵盖的产物包括但不限于分子、核酸(例如非编码核酸，例如非编码rna分子，例如反义rna、sirna、trna、核糖体rna、微小rna、pirna、snrna、snrna、exrna、scarna或长非编码rna，例如xist或hotair)、多肽(例如，重组和/或治疗性多肽)或其杂合体，其可由细胞产生，例如在细胞中表达。在一些实施例中，对细胞进行工程化或修饰以产生该产物。此类修饰包括引入控制或导致产物产生的分子。例如，细胞通过引入编码多肽(例如重组多肽)的外源性核酸来修饰，并且该细胞在适合多肽(例如重组多肽)的产生(例如表达和分泌)的条件下培养。在另一个实例中，细胞通过引入外源性核酸来修饰，该外源性核酸控制(例如，增加)由细胞内源性表达的多肽的表达，使得该细胞产生比例如在未修饰细胞中内源性产生的水平或数量更高水平或数量的多肽。在实施例中，通过本文所述的方法鉴定、选择或产生的细胞或细胞系产生产物，例如重组多肽，其可用于治疗医学病状、病症或疾病。
190.多肽
191.在一些实施例中，该目标产物包含一种或多种多肽，例如重组多肽，其通常是异源性多肽，即不是由细胞天然表达的产物。该产物可以是例如可用于药物筛选的治疗性蛋白或诊断性蛋白。治疗性或诊断性蛋白可以是抗体分子，例如抗体或抗体片段、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、报告蛋白、治疗性肽、适体或其中任何一者的结构和/或功能片段或杂合体。在一个实施例中，该产物包含多条多肽链，例如包含重链和
轻链的抗体或抗体片段。
192.在一些实施例中，该产物是抗体分子。本文涵盖的产物是可用于成像技术的诊断性抗体分子，例如单克隆抗体或其抗体片段，和适用于施用于受试者的治疗性抗体分子，例如，其用于治疗疾病或病症。抗体分子是衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列。在实施例中，该抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然源或重组源。抗体可以是免疫球蛋白分子的多聚体，例如免疫球蛋白分子的四聚体。在实施例中，该抗体是单克隆抗体。该抗体可以是人抗体或人源化抗体。在一个实施例中，该抗体是iga、igg、igd、igm或ige抗体。在一个实施例中，该抗体是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。在一些实施例中，该抗体分子是或包含多特异性抗体，例如双特异性、三特异性或四特异性抗体，例如bite。
[0193]“抗体片段”指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并指抗原结合域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足以使抗体片段识别并特异性结合到靶标，如抗原。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、scfv抗体片段、线性抗体、单域抗体(如sdab(vl或vh)、骆驼vhh域和由抗体片段(如包含两个由铰链区处的二硫键连接的fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体，以及抗体的分离cdr或其他表位结合片段。抗原结合片段还可以合并到单域抗体、巨型抗体、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、v-nar和双-scfv(参见，例如，hollinger和hudson的《自然生物技术(nature biotechnology)》23:1126-1136，2005年)。抗原结合片段也可以移植到基于多肽，如iii型纤连蛋白(fn3)的支架中(参见美国专利第6,703,199号，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)
[0194]
目标多肽的实例包括但不限于那些以下所列的内容：
[0195]
激素：促红细胞生成素、epoein-α、达比波廷-α、生长激素(gh)、促生长素、人促卵泡激素(fsh)、人体绒毛膜促性腺激素、促黄体激素-α、胰高血糖素、生长激素释放激素(ghrh)、胰岛素。
[0196]
凝血(blood clotting/coagulation)因子：因子viia、因子viii、因子ix、抗凝血酶iii(at-iii)、蛋白c浓缩物
[0197]
细胞因子/生长因子：i型α-干扰素、干扰素-αn3(ifnαn3)、干扰素-β1a(rifn-β)、干扰素-β1b(rifn-β)、干扰素-γ1b阿地白介素(白细胞介素2(il2)、表皮胸腺细胞活化因子；etaf、帕利夫明(角质形成细胞生长因子；kgf)、贝卡普明(血小板衍生生长因子；pdgf)、阿那白滞素(重组il1拮抗剂)。
[0198]
抗体：贝伐单抗(vegfa mab)、西妥昔单抗(egfr mab)、帕尼单抗(egfr mab)、阿仑单抗(cd52 mab)、利妥昔单抗(cd20 chimeric ab)、曲妥珠单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗、托西莫单抗、阿西莫单抗、雷珠单抗、阿昔单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、那它珠单抗、达克珠单抗、巴利昔单抗、依库珠单抗。
[0199]
疫苗抗原：乙型肝炎表面抗原(hbsag)、hpv抗原、hiv抗原、流感抗原。
[0200]
其他：白蛋白、抗恒河猴(rh)免疫球蛋白g、恩夫韦肽、蜘蛛丝蛋白，例如纤维蛋白、a型肉毒杆菌毒素、阿糖苷酶、伊米苷酶、重组人透明质酸酶、帕利夫明、阿那白滞素、阿法链道酶、合成的猪肠促胰液素。
[0201]
该目标重组多肽可以是多特异性蛋白，例如双特异性抗体，其有多种形式可用，如bsigg(三功能抗体)、bite、dart、tandb。
[0202]
在一些实施例中，多肽(例如，由细胞产生和/或根据本文所述的方法产生)是由癌细胞表达的抗原。在一些实施例中，重组或治疗性多肽是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施例中，重组或治疗性多肽选自her2、cd20、9-o-乙酰基-gd3、βhcg、a33抗原、ca19-9标记、ca-125标记、钙网蛋白、碳酸酐酶ix(mn/ca ix)、ccr5、ccr8、cd19、cd22、cd25、cd27、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd63、cd70、cc123、cd138、癌胚抗原(cea；cd66e)、桥粒芯蛋白4、e-钙粘蛋白新表位、内皮唾酸蛋白、肝配蛋白a2(epha2)、表皮生长因子受体(egfr)、上皮细胞粘附分子(epcam)、erbb2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞活化抗原(fap)、岩藻糖基gm1、gd2、gd3、gm2、神经节苷脂gd3、globo h、糖蛋白100、her2/neu、her3、her4、胰岛素样生长因子受体1、lewis-y、lg、ly-6、黑色素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(mcscp)、间皮素、mucl、muc2、muc3、muc4、muc5
ac
、muc5b、muc7、muc16、ii型穆勒氏抑制物质(mis)受体、浆细胞抗原、poly sa、psca、psma、音猬因子(shh)、sas、steap、stn抗原、tnf-α前体和其组合。
[0203]
在一些实施例中，多肽(例如，由细胞产生和/或根据本文所述的方法产生)是活化受体并选自2b4(cd244)、α4β1整合素、β2整合素、cd2、cd16、cd27、cd38、cd96、cdloo、cd160、cd137、ceacaml(cd66)、crtam、cs1(cd319)、dnam-1(cd226)、gitr(tnfrsf18)、kir的活化形式、nkg2c、nkg2d、nkg2e、一种或多种天然细胞毒性受体、ntb-a、pen-5和其组合，任选地，其中β2整合素包含cd11a-cd 18、cd11b-cd 18或cd11c-cd 18，任选地，其中kir的活化形式包含klr2dsl、kir2ds4或kir-s，并且任选地，其中天然细胞毒性受体包含nkp30、nkp44、nkp46或nkp80。
[0204]
在一些实施例中，多肽(例如，由细胞产生和/或根据本文所述的方法产生)是抑制性受体并选自kir、ilt2/lir-l/cd85j、kir的抑制形式、klrg1、lair-1、nkg2a、nkr-p1a、siglec-3、siglec-7、siglec-9和其组合，任选地，其中kir的抑制形式包含kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir3dl1、kir3dl2或kir-l。
[0205]
在一些实施例中，多肽(例如，由细胞产生和/或根据本文所述的方法产生)是活化受体并选自cd3、cd2(lfa2、ox34)、cd5、cd27(tnfrsf7)、cd28、cd30(tnfrsf8)、cd40l、cd84(slamf5)、cd137(4-1bb)、cd226、cd229(ly9、slamf3)、cd244(2b4、slamf4)、cd319(cracc、blame)、cd352(lyl08、ntba、slamf6)、crtam(cd355)、dr3(tnfrsf25)、gitr(cd357)、hvem(cd270)、icos、light、ltβr(tnfrsf3)、ox40(cd134)、nkg2d、slam(cd150、slamf1)、tcrα、tcrβ、tcrδγ、tim1(havcr、kim1)和其组合。
[0206]
在一些实施例中，多肽(例如，由细胞产生和/或根据本文所述的方法产生)是抑制性受体并选自pd-1(cd279)、2b4(cd244、slamf4)、b71(cd80)、b7hl(cd274、pd-l1)、btla(cd272)、cd160(by55、nk28)、cd352(ly108、ntba、slamf6)、cd358(dr6)、ctla-4(cd152)、lag3、lair1、pd-1h(vista)、tigit(vsig9、vstm3)、tim2(timd2)、tim3(havcr2、kim3)和其组合。
[0207]
其他重组蛋白产物(例如，由细胞产生和/或根据本文所述方法产生)包括非抗体支架或替代蛋白支架，如但不限于：darpin、亲和体和adnectin。此类非抗体支架或替代蛋白支架可以经工程化以识别或结合到一种或两种或更多种，例如1、2、3、4或5种或更多种不同的靶标或抗原。
[0208]
应用
[0209]
本公开的特征尤其在于生产细胞、使用生产细胞制备或制造多肽产物的方法、鉴
定、选择和/或培养细胞(例如，生产细胞)的方法和制备或生产生产细胞的方法。本文公开的鉴定、选择和/或培养细胞的方法可以用于产生可用于产生多种产物的细胞，例如生产细胞，评价各种细胞系或评价各种细胞系的生产，各种细胞系用于生物反应器或加工容器或槽中或更普遍地与任何进料源一起使用。本文所述的组合物和方法适用于培养任何所期望的细胞系，包括例如原核细胞系和/或真核细胞系。进一步地，在实施例中，本文所述的组合物和方法适用于培养悬浮细胞或贴壁依赖性(粘附)细胞并适用于为生产医药和生物医药产品(如多肽产品、核酸产品(例如dna或rna)、外质体、囊泡或细胞和/或病毒，如那些用于细胞和/或病毒疗法或作为疫苗的细胞和/或病毒)而配置的生产操作。
[0210]
在实施例中，细胞(例如生产细胞)表达或产生产物，如重组治疗性或诊断性产物。如下文更详细描述的，由细胞产生的产物的实例包括但不限于抗体分子(例如单克隆抗体、双特异性抗体)、抗体模拟物(与抗原特异性结合但在结构上与抗原(如例如darpin、亲和体、adnectin或ignar)无关的多肽分子)、融合蛋白(例如fc融合蛋白、嵌合细胞因子)、其他重组蛋白(例如糖基化蛋白、酶、激素)、病毒治疗剂(例如用于基因疗法和病毒免疫疗法的抗癌溶瘤病毒、病毒载体)、细胞治疗剂(例如，多能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包裹的颗粒(例如，外泌体、病毒样颗粒)、rna(如例如sirna)或dna(如例如质粒dna)、抗生素或氨基酸。在实施例中，本文所述的组合物和方法可用于生产生物仿制药。
[0211]
如前面提到的，在实施例中，本文所述的组合物和方法允许生产真核细胞，例如哺乳动物细胞或如例如酵母细胞或丝状真菌细胞等低等真核细胞，或如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞等原核细胞和/或真核或原核细胞的产物，例如，由真核细胞大规模合成的蛋白、肽、抗生素、氨基酸、核酸(如dna或rna)。除非本文另有说明，否则本文所述的组合物和方法可以包括任何所期望的体积或生产能力，包括但不限于实验室规模、中试规模和全生产规模能力。
[0212]
此外，除非本文另有说明，否则本文所述的组合物和方法可与任何合适的反应器一起使用，包括但不限于搅拌槽式生物反应器、气升式生物反应器、纤维生物反应器、微纤维生物反应器、中空纤维生物反应器、陶瓷基质生物反应器、流化床生物反应器、固定床生物反应器和/或喷动床生物反应器，其使用或不使用固体或多孔微载体或支持物。如本文所使用的，“反应器”可以包含发酵罐或发酵单元或任何其他反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可互换地使用。例如，在一些方面，生物反应器单元可以执行以下中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料、合适的气体(例如，氧气)的注入、发酵或细胞培养基的入口和出口流动、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和co2水平的维持、ph水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/灭菌。示例反应器单元，如发酵单元可以含有在单元内的多个反应器，例如所述单元可以具有在每个单元中的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个或更多个生物反应器和/或设施可以含有多个单元，该多个单元具有在设施内的单个或多个反应器。在各个实施例中，生物反应器可以适于分批、半进料分批、进料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，生物反应器的体积可在约100ml到约50,000l之间。非限制性实例包括10ml、50ml、100ml、250ml、500ml、750ml、1升、2升、10升、50升、100升、500升、1000升、2000升、5000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积或大约这些体积。在制备足够的产品用于临床或商业用途所需的工业规模制造的情况下，体积通常为至少10升。在一些实施例中，生物反应器
被构造成生长微流体培养物。另外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，如不锈钢(例如，316l或任何其他合适的不锈钢)和inconel、塑料和/或玻璃。在一些实施例中，合适的反应器可以是圆形的，例如圆柱形。在一些实施例中，合适的反应器可以是方形的，例如长方形。方形反应器在某些情况下可能比圆形反应器更具优势，如易于使用(例如，由技术人员装载和设置)、反应器内容物的更好混合和均匀性和更小的占地面积。
[0213]
在实施例中，除非本文另有说明，否则本文所述的组合物和方法可与未另行提及的任何合适的单元操作和/或设备一起使用，如用于分离、纯化和分离此类产品的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，如传统的构件式建造设施、模块化、移动和临时设施，或任何其他合适的建筑、设施和/或布局。例如，在一些实施例中，可以使用模块化洁净室。另外，除非另有说明，本文所述的组合物和方法可以在单个位置或设施中容纳和/或执行或可替代地在单独或多个位置和/或设施中容纳和/或执行。
[0214]
作为非限制性实例但不限于，美国公开号2013/0280797；2012/0077429；2011/0280797；2009/0305626；和美国专利第8,298,054号；第7,629,167号；和第5,656,491号，其以引用方式在此整体并入并描述了可能适合与本文所述的组合物和方法一起使用的示例性设施、设备和/或系统。
[0215]
本文所述的组合物和方法可以利用上文关于宿主细胞的部分所述的广泛的细胞。在优选的实施例中，哺乳动物细胞是cho细胞系。实例包括cho-k1细胞、cho-k1 sv细胞、dg44 cho细胞、duxb11 cho细胞、chos、cho gs敲除细胞、cho fut8 gs敲除细胞、chozn细胞和cho衍生细胞。该cho gs敲除细胞(例如gsko细胞)例如是gs敲除细胞。该cho fut8敲除细胞例如是细胞(龙沙生物制剂公司)。
[0216]
在一个实施例中，该真核细胞是低等真核细胞，如例如酵母细胞(例如毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、克鲁维毕赤酵母和安格斯毕赤酵母)、驹形氏酵母属(例如巴斯德驹形氏酵母、假巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母)、酵母菌属(例如酿酒酵母、克鲁维酵母、葡萄汁酵母)、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母)、假丝酵母属(例如产朊假丝酵母、可可假丝酵母、博伊丁假丝酵母)、地霉属(例如发酵地霉)、多形汉逊酵母、解脂耶氏酵母或粟酒裂殖酵母。首选的是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的实例为x33、gs115、km71、km71h；和cbs7435。
[0217]
在实施例中，培养的细胞用于生产用于治疗用途的蛋白，例如抗体，例如单克隆抗体和/或重组蛋白。在实施例中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生化中间体或代谢物。例如，在实施例中，可以产生分子量约4000道尔顿至大于约140,000道尔顿的分子。在实施例中，这些分子可以具有一系列复杂性，并且可以包括转译后修饰，包括糖基化。
[0218]
将参考以下非限制性实例进一步说明本发明。
[0219]
实例
[0220]
实例1：材料和方法
[0221]
细胞培养
[0222]
悬浮龙沙细胞维持在补充有6mm l-谷氨酰胺(sigma g8540)的cd-cho培养基(gibco 10743-029)中。这些细胞在5％co2气氛中以140rpm的转速
在37℃下孵育。将细胞以0.2
×
106个活细胞/ml在125ml erlenmeyer烧瓶中接种20ml，这些细胞每3-4天传代一次。
[0223]
逆转试验
[0224]
将lonza细胞以每孔5000个活细胞接种在96孔板的200μl培养基中，并在11天和3周后分析其副产物。没有酪氨酸的cd cho和没有酪氨酸但补充有6mm l-谷氨酰胺的lonza cm76(龙沙生物制剂公共有限公司(lonza biologics plc))用作测试培养基。7.2
×
106个活细胞在cm76无酪氨酸培养基中测试，2.4
×
106个细胞在cd cho无酪氨酸培养基中测试。完全培养基(cd-cho l-谷氨酰胺)用作阳性对照，然而没有l-谷氨酰胺的培养基(仅cd-cho)用作阴性对照。
[0225]
质粒和转染以制备稳定细胞系
[0226]
表1-载体构建体
[0227] 表达盒1 表达盒2 表达盒3 载体名称启动子选择基因启动子重组基因1启动子选择基因lmm170sv40谷氨酰胺合成酶(龙沙)mcmvegfpsv40gch1lmm172sv40截短的pah chomcmvegfpsv40gch1lmm173sv40截短的人pahmcmvegfpsv40gch1lmm182sv40截短的pah cho
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pgkgch1lmm183sv40截短的pah cho
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sv40gch1lmm184sv40截短的pah cho
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mcmvgch1lmm185sv40截短的人pah
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pgkgch1lmm186sv40截短的人pah
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sv40gch1lmm187sv40截短的人pah
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mcmvgch1
[0228]
截短的pah序列具有含有调节域的n末端116个氨基酸的缺失(daubner sc等人，1997年，出处同上)。pah的各个域示于图1中。
[0229]
质粒用pvui(neb,r3150l)线性化并使用乙醇沉淀方案纯化。在biorad genepulser xcell电穿孔仪上进行电穿孔。将含20μg线性化质粒的100μl te缓冲液和1
×
107个活lonza chok1sv gs-ko细胞/700μl cm76无酪氨酸( 6mm l-谷氨酰胺)培养基添加到电穿孔杯中。dna细胞混合物在300v和900μf下电穿孔，杯直径为0.4mm。电穿孔后立即向杯中添加1ml预温热的培养基。然后将细胞转移到t25烧瓶中的2
×
5ml cm76无酪氨酸( 6mm l-谷氨酰胺)培养基。将烧瓶在具有5％co2气体环境的静态培养箱中在37℃下孵育。24小时后，将额外的5ml cm76无酪氨酸( 6mm l-谷氨酰胺)培养基添加到t25烧瓶。转染后21天使用vicell仪器进行细胞计数以评估转染成功率。通过在显微镜(带gfp2滤光片的莱卡mzfliii，放大倍率为
×
100)下肉眼观察在t25烧瓶中生长的细胞进行egfp表达，进一步确认转染成功。
[0230]
生长曲线和培养存活率
[0231]
将细胞以0.2
×
106个细胞/ml在125ml埃伦迈尔(erlenmeyer)烧瓶中接种20ml并在5％co2环境中以140rpm的转速在37℃下振荡。使用vicell(贝克曼库尔特公司(beckman coulter))仪器每48小时记录一次实例图中所示天数的读数，其中使用含有0.8ml预温热的pbs的0.2ml样品来确定活细胞浓度和细胞直径。
[0232]
facs
[0233]1×
105个细胞在离心机中以1,000rpm的转速造粒5分钟并在350μl pbs中重悬。然后将样品装载到facscalibur
tm
(bd生物科学(bd biosciences))的探针上，并测定与细胞计数相关的荧光强度。前向散射(fsc)使用e-1放大器测定，侧向散射(ssc)设置为465，而fl1记录的细胞为473；所有设置都转换为对数刻度。
[0234]
sds-page，免疫印迹法
[0235]1×
106细胞在离心机中以1,000rpm的转速造粒5min并在100μl冰冷的裂解缓冲液中裂解，该裂解缓冲液由20mm hepes-naoh(ph 7.2)、100mm nacl、10mmβ-甘油磷酸钠、含50mm naf的0.5％nonidet-p40、1mm活化的na
3 vo4、10μg/ml亮抑酶酞、2μg/ml胃酶抑素和0.2mm pmsf组成，该裂解缓冲液在使用前添加。
[0236]
10μg还原蛋白样品或非还原上清液样品在10％sds-page丙烯酰胺凝胶上进行试验，并按照前述方法进行硝化纤维素的免疫转移(roobol、carden等人2009年的《欧洲生物化学学会联合会杂志(febs j.)》276:286-302)。抗体来自sigma(抗gch1、sab1405858-50μg、抗pah、hpa031642、抗gs g2781、抗b-肌动蛋白a5441、抗人igg(γ-链特异性)i9764)和cruk(egfp 3e1)。抗微管蛋白(woods、sherwin等人1989年的《细胞科学杂志(j.cell sci.)》93:491-500)是英国牛津大学keith gull教授的厚礼，而抗l7a针对人l7a的n末端序列产生(roobol和carden 1999年的《欧洲细胞生物学杂志(eur.j.cell biol.)》78(1):21-32)。用于细胞裂解物蛋白免疫印迹检测的二抗是抗全igg(小鼠或兔)-hrp偶联物(sigma)，然后是ecl(通用电气医疗集团(ge healthcare))检测。
[0237]
qrtpcr
[0238]
收获1
×
106个活细胞用于rna提取，并使用qiagen quantifast试剂盒和以下引物集：pah(qrtpahtotfwd catcaaggcatatggtgctg(seq id no:7)和qrtpahtotrvs gggctggaactctgtgacat((seq id no:8))、gch1(gch1fwd：cttcaccaagggctaccagg((seq id no:9)；gch1 rev：aggccaaggacttgcttgtt(seq id no:10))和β-肌动蛋白(chobactqf agctgagagggaaattgtgcg(seq id no:11)和chobactqr gcaacggaaccgctc att(seq id no:12))通过qrtpcr在eppendorf realplex循环仪上测定mrna量。
[0239]
实例2：在没有酪氨酸但补充有6mm l-谷氨酰胺的cm76或cd cho培养基中生长的gsko细胞的逆转试验
[0240]
该实例说明在生长不能在不存在酪氨酸的情况下生长的示例性细胞时观察到的低逆转率。
[0241]
chok1sv 宿主细胞接种到培养基内的96孔板中，该培养基缺乏酪氨酸但补充有6mm谷氨酰胺。阳性对照是在补充有6mm谷氨酰胺的培养基中生长的chok1sv宿主细胞而阴性对照是缺乏谷氨酰胺的培养基。结果示于下表2中。在缺乏酪氨酸的培养基中，没有观察到逆转菌落/细胞生长，并且平板看起来与阴性对照相似。这表明酪氨酸营养缺陷型标记将是生产细胞中有用的选择标记。
[0242]
表2
[0243][0244]
实例3：不存在酪氨酸的情况下示例性生产细胞的生长
[0245]
该实例说明缺乏编码pah和gch1酶分子的外源性核酸的细胞在不存在酪氨酸的情况下不生长，而观察到含有载体lmm172或lmm173(包含既编码pah又编码gch1酶分子的外源性核酸)的示例性生产细胞在不存在酪氨酸的情况下生长并表达报告分子egfp。然而，当我们最初将全长cho pah与gch1一起测试时，我们发现转染细胞在无酪氨酸培养基中恢复的非常缓慢(cd cho)，或在使用cm76培养基的情况下，根本没有恢复(数据未显示)。我们因而尝试了一种截短形式的pah，其中编码调节域的n末端116个氨基酸已被去除。
[0246]
用于生成这些池的载体含有截短形式的pah(盒1，含有前116个氨基酸缺失的tpah，序列衍生自cho细胞或人，由sv40启动子驱动)、gch1(盒3，由sv40启动子驱动)和egfp(盒2，由cmv启动子驱动)。包括两个对照，其中第1盒含有由sv40启动子驱动的谷氨酰胺合成酶(gs)基因(载体lmm170)。转染的对照在不存在酪氨酸(阴性对照)或存在酪氨酸(阳性对照)的情况下生长。
[0247]
chok1sv宿主细胞用线性化载体经由电穿孔转染，随后在不含酪氨酸但补充有6mm谷氨酰胺的培养基中培养三周(还包括酪氨酸的阳性对照除外)。
[0248]
chok1sv宿主工程化细胞显示，只有当截短的pah和gch1共表达时，在无酪氨酸培养基中成功生长。另外，当这些组分单独转染时，细胞无法在转染后存活也无法在无酪氨酸培养基中生长(数据未显示)。因此，需要包含截短的pah的pah酶分子和gch1酶分子两者来支持示例性cho生产细胞在不存在酪氨酸的情况下的生长。
[0249]
图2示出了在转染和恢复3周后使用流式细胞术获得的来自细胞群的平均荧光的直方图，并确认了在无酪氨酸培养基中生长的细胞中的egfp表达。来自包含截短的cho细胞衍生pah序列和gch1(载体lmm172)的示例性生产细胞的平均荧光与来自gs阳性对照(载体lmm170阳性)的平均荧光相似。与人截短的pah序列(lmm173)相比，含有cho截短的pah序列(lmm172)的生产细胞显示出更高的gfp表达。这是一种如果使用pah和gch1组合系统用作选择标记，重组蛋白可以替代egfp的模型。
[0250]
实例4：pah蛋白和mrna量
[0251]
本实例说明含有载体lmm173(包含编码人pah和gch1酶分子的外源性核酸)的示例性生产细胞表现出pah蛋白和mrna表达和egfp蛋白表达；该实例进一步说明含有载体lmm172(包含编码人cho pah和gch1酶分子的外源性核酸)的示例性生产细胞表现出pah mrna表达和egfp蛋白表达。
[0252]
对来自图2的细胞池的裂解物进行免疫印迹分析。对照在含有6mm谷氨酰胺和酪氨酸的培养基中生长而lmm170细胞在含有酪氨酸但不含谷氨酰胺的培养基中生长。lmm172和lmm173在补充有6mm谷氨酰胺的无酪氨酸培养基中生长。微管蛋白和l7a用作上样对照。pah抗体仅检测人截短的pah(约37和50kda的条带)而不是cho截短的pah(lmm172)(数据未显
示)。egfp被确认在细胞池中表达，其中转染的载体在盒2中含有egfp基因。
[0253]
图3示出了检测截短的cho pah表达和截短的人pah mrna表达的qrt-pcr数据。截短的cho pah mrna的表达量比截短的人pah高得多。两者均高于对照，确认了示例性生产细胞中的外源性pah mrna表达。
[0254]
实例5：在不存在酪氨酸的情况下的生长曲线和培养存活率
[0255]
本实例说明含有载体lmm172(包含编码cho pah和gch1酶分子的外源性核酸)的示范性生产细胞比不包含外源性核酸的类似细胞在不存在酪氨酸的情况下能够生长到更高的活细胞浓度，并具有更长时间的培养存活率。
[0256]
图4示出了如实例3和4所述生成的示例性生产细胞池的生长数据。细胞池在不存在酪氨酸或谷氨酰胺的情况下在125ml erlenmeyer烧瓶中培养18天。每两天对细胞进行采样一次，并使用vicell仪器评估活细胞数量和培养存活率；不再引入进料。图4示出了(a)活细胞浓度和(b)培养存活率。cho细胞截短的pah细胞池(lmm 172)比人截短的pah细胞池(lmm 173)生长到更高的细胞数量，并具有更长时间的培养存活率。
[0257]
实例6：在不存在酪氨酸但补充有额外的苯丙氨酸的情况下生长时示例性生产细胞的生长曲线和活细胞浓度
[0258]
本实例说明包含编码pah和gch1酶分子的外源性核酸的示例性生产细胞的生长和培养存活率特性。
[0259]
图5示出了示例性生产细胞池的生长数据。培养物在125ml erlenmeyer烧瓶中生长18天，并在指示的位置补充有苯丙氨酸(sigma p5482)。每两天对细胞进行一次采样并不再引入进料。分析这些细胞的细胞生长和培养存活率。当补充有6mm苯丙氨酸时，表达截短的人pah的示例性生产细胞比表达截短的cho pah的示例性生产细胞生长至更高的活细胞浓度并在更短的时间内达到这些浓度。本实验还说明，当gsko对照死亡时，细胞系是真正的原养细胞系。
[0260]
实例7：示例性生产细胞在不存在酪氨酸但补充有额外的苯丙氨酸的市售cd-cho培养基中生长时的生长曲线和活细胞浓度
[0261]
本实例评价细胞生长和培养存活率。图6示出了在缺乏酪氨酸但补充有6mm谷氨酰胺的市售cd-cho(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))培养基中转染和生长的示例性生产细胞的生长数据。转染的chok1sv gs-ko
tm
宿主细胞在转染后在cd cho培养基比在cm76培养基中恢复得更快。回收率从21天减少到18天，此时细胞准备在转染后转移到摇瓶中。另外，如在转染后使用含有截短的cho pah细胞的载体时所观察到的，用含有截短的人pah的质粒dna构建体转染的细胞在相似的时间内恢复，并恢复到相似的活细胞数。这表明cd-cho是本系统较好的转染介质。
[0262]
每两天对在cd cho培养基中评估生长的细胞采样一次并不再引入进料。分析培养物的细胞生长和培养存活率。当酪氨酸原养细胞池在cd cho培养基中生长时(图6)，截短的人pah细胞池从额外的6mm苯丙氨酸中获益最多。
[0263]
实例8：使细胞预适应补充苯丙氨酸缩短生长滞后期。
[0264]
本实例表明，在进行分批培养之前，通过将示例性生产细胞池预适应额外的补充的苯丙氨酸，可以改善生长(图7)。人截短的pah表达细胞对补充苯丙氨酸的反应比cho形式更好。在创建生长曲线之前，通过用6mm苯丙氨酸传代细胞对人截短的pah表达细胞
(lmm173)进行预适应。细胞在125ml erlenmeyer烧瓶中培养16天。这些细胞的细胞生长通过活细胞浓度和培养存活率进行分析。添加苯丙氨酸可促进细胞生长，但当细胞预适应在没有酪氨酸但补充有6mm l-谷氨酰胺和6mm苯丙氨酸(sigma p5482)的cd cho培养基中生长时，生长滞后期会进一步缩短。gs-ko宿主细胞不能在补充有或未补充有6mm苯丙氨酸的cd cho培养基中生长。
[0265]
实例9：具有重组蛋白生产的双重代谢选择标记。
[0266]
本实例评价了当在谷氨酰胺合成酶选择下与产生重组蛋白的细胞系结合时，截短的pah/gch1组合选择是如何被利用的。启动子强度因驱动gch1表达而变化以确定这是否会影响在生长曲线方面出现的后续细胞。启动子和截短的pah与gch1的不同质粒组合是实现最大生长(最高活细胞浓度)的最佳组合。用于生成这些池的载体含有cho或人pah(盒1，sv40启动子)、gch1(盒3，由pgk、sv40或mcmv启动子驱动)和egfp(盒2，由cmv启动子驱动)的截短形式)-参见表1。
[0267]
在gs选择下将它们线性化并转染到表达模型单克隆抗体cb72.3的细胞系中。转染到t25静态烧瓶中在无谷氨酰胺和酪氨酸的cd-cho培养基中进行。一旦细胞在转染和选择后恢复并生长出来，就将这些细胞转移到没有谷氨酰胺和酪氨酸的cm76培养基内的摇瓶中。
[0268]
图8示出了所得细胞池中截短的cho pah和截短的人pah mrna表达的qrt-pcr数据，并且与实例4中的发现相当。还对gch1表达进行检测，并且表达水平反映了驱动盒的启动子的强度。分析确认了截短的pah细胞池中pah的mrna过表达。如前面所观察到的，截短的cho pah的表达水平比人pah高得多。gch1 mrna表达水平与驱动基因的启动子强度相关。
[0269]
对来自上述细胞池的裂解物进行蛋白印迹法分析。所有双重选择细胞池均在没有谷氨酰胺和酪氨酸的cm76培养基中生长。chok1sv gs-ko
tm
对照样品从在完全培养基(含有谷氨酰胺和酪氨酸)中生长的细胞中收获。截短的pah、gch1和gs均在表达细胞系的双重选择标记中检测到，但cho pah除外，因为按照实例4，抗体未检测到cho pah(数据未显示)。重链抗体也用于确认重组蛋白(cb72.3)被分泌到上清液中(数据未显示)。微管蛋白、β-肌动蛋白和l7a用作上样对照。
[0270]
图9示出了示例性生产细胞池的生长数据。细胞池在没有酪氨酸和谷氨酰胺并如所示补充有额外的苯丙氨酸的125ml erlenmeyer烧瓶中培养18天。每两天对细胞进行采样一次，并使用vicell仪器评估活细胞数量和培养存活率；不再引入进料。当预适应额外的6mm苯丙氨酸补充的培养基时，用lmm186(sv40人pah，sv40 gch1)观察到最大生长(达到最高活细胞浓度)。
[0271]
细胞在没有酪氨酸或谷氨酰胺的cm76中培养，因为同时使用了两种选择标记。当补充有6mm苯丙氨酸(sv40人pah和sv40 gch1)时，从lmm186中产生了生长最好的细胞池。
[0272]
这些结果说明可以组合两种不同的基于氨基酸的选择系统，而不会对细胞系性能产生任何负面影响：所得细胞显示出优异的生长特性。这将为表达提供更大的灵活性，因为例如，一个选择系统可以用于制备和维持工程化的、稳定的细胞系，该细胞系具有可修饰细胞系性能的基因产物，然而另一个选择系统可以用于引入和维持编码其所需制造的产物的序列。
[0273]
这些结果还支持实例7中的发现，即使用人pah与补充苯丙氨酸一起实现了优异的
性能。
[0274]
***
[0275]
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。虽然本发明已参照特定方面进行了公开，但显然本领域的其他技术人员可以在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下设计本发明的其他方面和变化。不同部分中的特征和实施例经适当修改后可以进行组合。