从面包酵母中获得β-葡聚糖的方法与流程

从面包酵母中获得
β-葡聚糖的方法
技术领域
1.本发明一般涉及用于使用碱性试剂通过溶解性从微生物(诸如，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))中获得β-葡聚糖的方法。


背景技术：

2.β-葡聚糖是高分子量的葡萄糖的线性同聚多糖，其中葡萄糖的单元通过β-(1
→
3)和/或β-(1
→
4)键连接，并且由于在线性糖苷链中形成β-(1
→
6)键而呈现分叉。β-葡聚糖存在于诸如细菌、酵母、真菌或植物的各种生物体的细胞壁中，并且，取决于生物体，β-葡聚糖具有特定的长度和分支。
3.目前，β-葡聚糖被用作食物产品的组织化剂、乳化稳定剂和增稠剂。此外，β-葡聚糖被用作膳食补充剂，其中，依据β-葡聚糖的来源，它们与各种有益的健康影响有关。特别是，已报道，食用来自谷物中的β-葡聚糖与胆固醇血浆浓度(尤其是ldl胆固醇)浓度和血糖指数的降低之间存在关联。同样，从酵母和真菌中获得的β-葡聚糖会影响免疫反应的兴奋作用。(pizarro,s.,ronco,a.,gotteland,m.(2014)“β-glucanos:tipos existen and cu
á
les are sus beneficios enthesalud？”revistachilenaofnutrici
ó
n,41,439-446)
4.鉴于β-葡聚糖所带来的巨大益处，特别是对每种生物体的巨大益处，在现有技术中发现了用于提取这样的β-葡聚糖的各种方法，包括热水提取、碱提取、微波辅助提取、用酶作为诱导物提取、以及酸提取。由于β-葡聚糖可能存在的结构变异性，提取类型因提取β-葡聚糖的生物体而改变，酵母β-葡聚糖因其作为免疫刺激剂的特性而令人非常感兴趣。(zhu,f.,du,b.,&xu,b.(2016).“a critical review on production and industrial applications of beta-glucans”food hydrocolloids,52,275
–
288)
5.例如，在文献wo1991007091中，报道了一种提取方法，包括将酵母在碱(naoh)中高压锅处理，产生残余物，然后用乙酸酸化并将从该步骤获得的残余物用有机溶剂洗涤。用这一提取方法，获得β-葡聚糖的产率为19％。
6.此外，wo1992007064公开了一种处理酵母残余物的方法，包括用食品级碱性盐(碳酸氢钠)提取酵母残余物，随后用碱性提取剂处理，随后步骤为用食品级漂白剂(过氧化氢)或氧化/还原剂漂白，以及最终步骤为用食品级酸性剂调节ph。从这个过程中，获得产品a，它基本上不含完整的酵母细胞并且具有带有未塌陷的壁的酵母壳。
7.同样，专利us6060089a揭示了一种用于生产源自面包酵母(baker's yeast)的产品的方法，该产品包含45-60％的多糖、15-20％的蛋白质、16-22％的肽和氨基酸、以及3-5％的核酸，其包括以下步骤：将酿酒酵母重悬浮于强酸(优选hcl)溶液中，分离从这第一步获得的固体组分，并将其重悬浮于25-30％的nacl溶液中，将这上一步获得的固体用碱性溶液(优选naoh)处理，用hcl中和并收集最终的固体组分。
8.另一方面，专利文献kr100485056b1描述了一种用于提取葡聚糖寡聚体的突变酵母菌株(is2)的培养，其包括在液体培养基中产生所述特定菌株，回收所产生的酵母，加入
氢氧化钠以从细胞壁中获得β-葡聚糖，然后加入分解β-葡聚糖的酶，以获得水溶性的葡聚糖的寡聚体。
9.此外，wo2008032134教导了一种用于获得β-葡聚糖的方法，包含培养面包酿酒酵母的细胞，收集和自溶所述细胞，用碱性溶液(氢氧化钠溶液)处理从自溶获得的细胞碎片，随后用热漂白剂(次氯酸钠)处理，加入酸以调节自前一步获得的固体级分的ph，以及最终步为洗涤并喷雾干燥以获得最终的粉末状产品。该文献还报告了用有机溶剂的附加纯化步骤，以从最终产品中去除较高百分比的脂肪。
10.此外，文献us2011/0045545涉及一种用于自微生物(诸如，酵母)制备葡聚糖和甘露聚糖的方法，包括步骤：用蛋白酶和甘露聚糖酶处理微生物细胞；分离酶处理后获得的混合物以获得包含甘露聚糖的轻相和包含葡聚糖的重相；用碱、随后再用酸来处理重相，以获得第二轻相和重相两个相；分离前一步中获得的相并干燥新的重相以产生百分比在60％至85％的葡聚糖。
11.同样，专利us8753668b2公开了一种加工酵母细胞的方法，该方法包括酵母细胞在一定温度下自溶以释放其细胞壁，与外源蛋白酶一起孵育，并随后用淀粉酶和/或脂肪酶处理，以最终分离出富含葡聚糖的级分和富含甘露聚糖的级分。
12.类似地，us20160333383a1描述了一种使用基于分子组装的技术来制备β-d-葡聚糖的方法，包括酵母细胞壁的酶水解物的微流化和离心，将沉淀物重悬浮在离子液体(如，1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐或1-烯丙基-3-甲基咪唑氯化物)中，加入乙醇并收集该步骤中获得的沉淀物，重悬浮于水中并随后收集上清液，将所述上清液喷雾干燥并最终获得β-葡聚糖粉末。
13.那么，可以从上述用于获得β-葡聚糖的程序中总结出，存在不同的用于提取β-葡聚糖的策略，用碱提取是最优选的。在这些使用碱提取的情况中，现有技术公开了获得富含β-葡聚糖的级分可能存在对最终产品无益的其他成分，诸如，脂肪酸，这会降低最终产品的质量；由于因酸败而形成的过氧化物影响最终产品的风味和香气，所述高含量的这些脂肪酸趋向于在β-葡聚糖的风味品质中形成不期望的化合物。
14.同样的，一些方法采用溶剂纯化和/或漂白的步骤来实现更纯的β-葡聚糖最终产品，这通过需要额外的步骤和试剂而增加了程序的时间和生产成本，并且不能保证获得具有脂肪百分比降低的产品。
15.因此，需要继续开发用于获得具有降低的脂肪百分比和减少的步骤数的β-葡聚糖的替代方法。
16.发明的基本特征
17.本发明涉及一种获得β-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
18.1.酵母培养以获得酵母膏
19.2.酵母膏的细胞自溶和细胞壁的获得
20.3.酵母细胞壁的碱处理
21.4.碱处理中获得的β-葡聚糖级分(fraction，部分)的酸处理
22.5.酸处理后的β-葡聚糖产品的收集和处置
23.在第一步中，实施酿酒酵母的面包酵母菌株(baker's strain)的培养和生长，随后将其收集，从而获得酵母膏。
24.在此之后，对构成酵母膏的细胞采取自溶步骤，其在特定温度和ph条件下发生，以获得其中发现β-葡聚糖的酵母细胞壁。
25.在上述之后，酵母细胞壁经受碱处理，其中加入强碱，并随后实施连续洗涤，在每次洗涤中允许细胞壁在碱性相中保留一段时间。
26.随后，将从前一步中获得的级分酸化并离心以收集感兴趣的级分，然后进入收集和处置步骤，其中将其洗涤、灭菌、并干燥，以获得β-葡聚糖的最终产品。
27.所述产品富含β-葡聚糖，其相比于总质量占80重量％以上，并且具有降低量的脂肪，相比于总质量不超过4重量％。
具体实施方式
28.下面对本技术所涉及的获得β-葡聚糖的方法的基本而非限制性特征、以及其优选的实施方案进行详细限定。
29.本技术中所限定的方法从酵母培养步骤开始，其包括：预培养步骤，其包括在2.5至5.0的受控ph条件和在28至35℃的温度下培养酵母细胞约20小时，以便获得初代酵母培养物；生长步骤，包括用所述预培养物接种含有常量营养素和微量营养素的发酵器，并将描述用于所述预培养物的ph和温度条件保持20至30小时；和，最终生长步骤，其包括在3.5至6.5的ph条件和28至38℃的温度下用在前一步中获得的产物接种第二发酵器，其中发酵培养基包含有利于随后细胞破裂的微量营养素以便获得游离细胞残余物用于提取β-葡聚糖。从该第一步中获得液体酵母，其包含按重量计30％的酵母细胞。
30.本技术的方法的第二步是指从培养步骤获得的液体酵母中细胞的自溶。为此，使液体酵母达到47至60℃的温度，然后对每吨液体酵母加入0.3至6升的乙酸乙酯，且然后将ph调节到3.5至7.5的值。然后将液体酵母孵育10至72小时，监测溶液中的温度和ph，以便将自溶条件保持在所需范围内。
31.在优选的实施方案中，使自溶达到49至51℃的温度。在更优选的实施方案中，使自溶达到50℃的温度。在优选的实施方案中，对每吨液体酵母加入3.3升的乙酸乙酯。在优选的实施方案中，将ph调节到4.9至5.1的值。在优选的实施方案中，自溶时间为12小时。
32.在另一优选实施方案中，使自溶达到50℃的温度，对每吨液体酵母加入3.3升的乙酸乙酯，ph调节到4.9至5.1的值，自溶时间为12小时。
33.此外，在自溶步骤中，发生酶法水解步骤。在一个实施方案中，所述水解由酵母的内源酶介导，其活性因酵母细胞发生自溶的培养基而增强。
34.在另一实施方案中，水解由加入到酵母细胞发生自溶的培养基中的酶来介导。对于所述酶法处理，将培养基调节到60至62℃的温度和6.3至6.7的ph，随后每1000l培养基加入90至95mg的蛋白酶的酶(e1)和90至95mg的蛋白酶/肽酶的酶(e5)，优选为每1000l培养基加入93.75mg酶e1和93.75mg酶e5。水解发生6至10小时的时间段，优选6小时，在此期间监测温度和ph条件以确保它们保持在所需范围内。
35.一旦酵母细胞自溶时间已过，加入硫酸以达到4.9至5.2的最终ph。接下来，实施离心分离过程，一方面获得用于制备酵母提取物的富含蛋白质的液体，而另一方面获得酵母细胞壁，收集并洗涤酵母细胞壁，并随后在热交换器中经受热过程，其中将它们加热到40至95℃的温度，优选为85至90℃，以便在执行碱处理时有助于不需要的化合物的提取过程。
36.通过自溶和随后的分离步骤，获得固体含量为12％至16％的细胞壁产物。优选地，所获得的细胞壁中的固体含量为14％。
37.本技术的方法的第三步是指所获得的细胞壁的碱处理，其中使它们经受碱性试剂的作用，优选为氢氧化钠，并随后经受一系列连续洗涤，其中该步骤的这些阶段中每个阶段具有保留时间，有助于不需要的化合物的提取过程。
38.碱处理从将细胞壁加热到40至95℃的温度开始。在优选的实施方案中，将酵母细胞壁加热到70至80℃的温度。
39.随后，将氢氧化钠以总酵母细胞壁干重的20重量％的比例加入到酵母细胞壁。此后，在一些实施方案中，加入水以便稀释不需要的化合物。
40.加入碱性试剂后，细胞壁的保留时间开始，其中在40至95℃的温度下，保留发生2至6小时。在优选的实施方案中，保留发生在85至90℃。在其他优选实施方案中，保留时间为6小时。
41.一旦保留时间已过去，将酵母细胞壁离心以去除在保留期间释放的不需要的化合物。
42.接下来，将获得的细胞壁在40至95℃的温度下经受连续洗涤的步骤。每次洗涤包括加入热水以保持所需的洗涤温度，随后的2小时的保留时间，和离心以去除含有β-葡聚糖级分的不需要的产物的水。在优选的实施方案中，在85至90℃的温度下实施洗涤。在优选的实施方案中，对酵母细胞壁执行一到三次的连续洗涤。在更优选的实施方案中，对酵母细胞壁执行两次连续洗涤。
43.本技术的方法的第四步是指在碱处理中获得的β-葡聚糖级分的酸处理，其由加入酸试剂(优选硫酸)、并对所述级分实施连续洗涤组成。
44.在碱处理的最后一次洗涤中获得的β-葡聚糖级分的酸处理在45至90℃的温度下实施。在优选的实施方案中，酸处理在85至90℃的温度下实施。
45.对于酸处理，首先，将热水加入到β-葡聚糖产物，以便保持该步骤所需的温度。然后，通过加入酸性试剂，优选为硫酸，将ph调节到1.0至5.0，并通过离心收集β-葡聚糖的不溶产物。在优选的实施方案中，将ph值调节到2.8至2.9。
46.随后，用热水对所收集的β-葡聚糖的不溶产物实施多次洗涤，将系统维持在该步骤所需的温度，并且在每步洗涤中通过离心收集不溶产物。在优选的实施方案中，对不溶产物实施一到四次的连续洗涤。在更优选的实施方案中，对不溶产物实施三次连续洗涤。
47.本技术的方法的第五步由收集和处置在前一步中获得的β-葡聚糖产物组成。为此，加入温度在85至90℃的热水，并将所述产物的ph调节到3.3至3.5的值。随后，将产物离心以便将其浓缩以获得10％至15％的固体。
48.在一些实施方案中，浓缩的β-葡聚糖产品通过在95至110℃的温度下穿过热交换器来灭菌。
49.抗氧化剂，优选抗坏血酸，加入到浓缩的β-葡聚糖产品，以达到相对于β-葡聚糖产品的体积的0.01-1.20重量％的最终浓度。在优选的实施方案中，抗坏血酸加入至相对于β-葡聚糖产物的体积为0.075重量％的最终浓度。
50.最后，β-葡聚糖产品经受用热风的干燥过程，以将产品的水分含量降低到4-6％，由此获得最终的β-葡聚糖粉末产品。
51.本发明的实施例
52.以下为本技术的获得β-葡聚糖的方法的优选实施方案的实施例，其仅用于说明目的，而并不限制本公开的范围。
53.本技术的获得β-葡聚糖的方法的所述优选实施方案，在以下条件下执行：
54.55.在上述列出的条件下实施的方法中，获得的β-葡聚糖产品的β-葡聚糖百分比大于80％，脂肪百分比小于4％，蛋白质百分比小于3.5％，灰分百分比小于3％，并且水分含量为4％至6％。
56.本文中所描述的获得β-葡聚糖的方法允许获得具有低脂肪百分比的β-葡聚糖粉末产品，而不需要额外的漂白或纯化步骤，例如，使用有机溶剂。