评价对象的评价方法、图像处理装置和评价对象的评价系统与流程

1.本发明涉及评价对象的评价方法、图像处理装置和评价对象的评价系统。


背景技术：

2.在生物安全性评价中，已知将受试物添加到测试体中，观察其变化(例如，颜色变化)。例如，在ames试验中，作为测试体，使用对氨基酸合成基因实施基因操作，以不能合成氨基酸的方式被改良过的细胞。而后，在ames试验中，对于上述细胞加入受试物后，在一定条件下培养。若因受试物导致细胞的氨基酸合成基因发生突变，则细胞能够再次合成氨基酸，因此，通过确认细胞有无增殖来评价是否发生了突变。这时，例如，如果使用颜色会随着细胞的增殖而变化的指示剂，则能够根据颜色变化评价细胞的增殖。
3.历来，在这样的安全性评价中，为了保持测试体和受试物，多使用培养皿。这种情况下，例如若想对于相同的测试体改变受试物的浓度而评价安全性，则要针对每种浓度来准备培养皿。因此，需要大量准备受试物。相对于此，近年来，为了测试体和受试物的量等的减少等，例如，已知有非专利文献1、非专利文献2和非专利文献3所公开的这种使用具有许多孔的板的ames试验。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1：fluckiger-isler s.,kamber m.,“direct comparison of the ames microplate format(mpf)test in liquid medium with the standard ames pre-incubation assay on agar plates by use of equivocal to weakly positive test compounds.”,mutation research/genetic toxicology and environmental mutagenesis747,p36-45,2012.
7.非专利文献2：sui h.,kawakami k.,sakurai n.,hara t.,nohmi t.,“improvement and evaluation of high throughput fluctuation ames test using384-well plate with salmonella typhimurium ta100 and ta98.”,genes and environment 31(2),p47-55,2009.
8.非专利文献3：kamberm.,fluckiger-isler s.,engelhardt g.,jaeckh r.,zeiger e.,“comparison of the ames ii and traditional ames test responses with respect to mutagenicity,strain specificities,need for metabolism and correlation with rodent carcinogenicity”,mutagenesis 24(4),p359-366,2009.


技术实现要素：

9.发明所要解决的问题
10.在生物安全性评价中，向测试体加入受试物导致的变化(例如测试体是细胞时，其增殖，使用指示剂时的颜色的变化等)，传统上是评估员以目视进行评价。因此，例如，使用具有许多孔的板进行安全性评价时，评估员的负担变大，因此评价的客观性和精度有可能
降低。
11.因此，本发明其目的在于，提供一种在生物安全性评价中可以进行更客观、更高精度评价的评价对象的评价方法、图像处理装置和评价对象的评价系统。
12.解决问题的手段
13.本发明的一个方面的评价对象的评价方法，具备如下工序：分别对于与在板所具备的多个孔中保持有评价对象的评价板的图像所对应的板图像内的多个评价区域，取得基于至少1个颜色特征量的统计信息的工序；使用上述统计信息，判定上述多个评价区域的颜色的工序，上述评价对象包含测试体，上述多个孔具有保持有还包含受试物的上述评价对象的受试物用孔，上述板图像包括与上述多个孔相对应的多个孔图像，上述多个评价区域分别具有与至少1个孔相对应的至少1个的孔图像。
14.在上述评价方法中，对于上述板图像中的多个评价区域，取得基于至少1个颜色特征量的统计信息。使用对于多个评价区域所取得的统计信息判定评价区域的颜色。因此，能够客观且高精度地判定评价区域的颜色。其结果是，可以基于评价区域的颜色，客观且高精度地评价受试物的安全性。
15.上述至少1个颜色特征量，可以是2个以上的颜色特征量。2个以上的颜色特征量的示例，可以是色调和饱和度。上述统计信息，可以是将上述2个以上的颜色特征量作为变量的频数分布。
16.上述至少1个颜色特征量可以是1个颜色特征量，上述统计信息，可以包括针对于上述1个颜色特征量的至少1种统计量。
17.在判定上述多个评价区域的颜色的工序中，可以基于上述统计信息的相似度，判定上述多个评价区域的颜色。
18.在判定上述多个评价区域的颜色的工序中，具备：基于上述统计信息的相似度，从多个候选色之中，一次判定出上述多个评价区域的颜色的工序；基于上述1次判定的结果，对于上述多个候选色，取得针对于上述至少1个颜色特征量的第1基准统计信息的工序；使用上述第1基准统计信息和上述统计信息的相似度，最终判定上述多个评价区域的颜色的工序，在取得上述第1基准统计信息的工序中，也可以基于针对于上述多个评价区域的上述统计信息之中，在上述1次判定的结果中被判定为各色的至少1个评价区域的统计信息，取得上述第1基准统计信息。这种情况下，因为进行了2次判定，所以能够更准确地判定评价区域的颜色。
19.上述多个评价区域是上述多个孔图像，判定上述多个评价区域的颜色的工序，具有：基于上述统计信息的相似度，从多个候选色之中，1次判定上述多个孔图像的颜色的工序；基于上述1次判定的结果，对于上述多个候选色，取得针对于上述至少1个颜色特征量的第1基准统计信息的工序；使用上述统计信息和上述第1基准统计信息的相似度，从上述多个候选色之中，2次判定上述多个孔图像的颜色的工序；基于上述2次判定的结果，对于上述多个候选色，取得针对于上述至少1个颜色特征量的第2基准统计信息的工序；使用上述第2基准统计信息，3次判定上述多个孔图像的颜色的工序，在上述板上，设定有具有上述多个孔之中至少1个孔的第1～第n(n是2以上的整数)的分区，在上述取得第2基准统计信息的工序中，在上述板图像内的上述第1～第n的分区所对应的第1～第n的分区图像之中的第i分区图像中，基于针对于上述多个孔图像的上述统计信息之中被判定为相同候选色的至少1
个孔图像的统计信息，取得相对于上述多个候选色的上述第2基准统计信息，在3次判定上述多个孔图像的颜色的工序中，基于针对上述第i分区图像所取得的上述第2基准统计信息与上述多个孔图像相对的上述统计信息之中属于上述第i分区图像的至少1个孔的统计信息的相似度，判定上述多个孔图像之中属于上述第i分区的孔图像的颜色，据此，也可以最终判定上述多个孔图像的颜色。这种情况下，因为对颜色进行了3次判定，所以能够更准确地判定评价区域的颜色。
20.在判定上述多个评价区域的颜色的工序中，也可以基于分别针对于多个候选色的基准统计信息，即上述至少1个颜色特征量的上述基准统计信息与上述统计信息的相似度，来判定上述多个评价区域的颜色。这种情况下，可以简单地判定评价区域的颜色。
21.一个实施方式的评价对象的评价方法，可以还具备基于依据上述至少1个颜色特征量的透明度变化检测用的基准统计信息与上述统计信息的相似度，检测上述多个评价区域的透明度变化的工序。例如若发生细胞死亡或受试物析出这样的变化，则评价对象的透明度发生变化。因此，上述方法例如能够评价细胞是否死亡、或者受试物是否析出。
22.上述多个孔，还包括溶剂对照用的至少1个溶剂对照孔，上述多个评价区域的其中之一，是包括与上述至少1个溶剂对照孔相对应的至少1个溶剂对照孔图像的溶剂对照区域，在检测上述多个评价区域的透明度变化的工序中，也可以将针对上述多个评价区域的上述统计信息之中的上述溶剂对照区域的统计信息作为透明度变化检测用的基准统计信息，基于上述溶剂对照区域的统计信息与针对上述多个评价区域的上述统计信息之中剩余的统计信息的相似度，检测上述多个评价区域的透明度变化。这种情况下，因为以相同的板图像中的溶剂对照区域的统计信息为基准来检测透明度变化，所以能够减小试验条件(例如培养温度条件)等的影响，可以更准确地检测透明度变化。
23.一个实施方式的评价对象的评价方法，可以还具备基于上述多个孔图像，检测保持在上述多个孔中的上述评价对象的测试体有无形状变化的工序。由此，例如作为测试体使用细胞时，可以检测细胞增殖产生的集落等。
24.一个实施方式的评价对象的评价方法，可以还具备基于上述多个孔图像，检测上述多个孔内有无异物的工序。由此，例如，作为测试体使用细胞时，可以检测细胞死亡而产生的异物等。在本说明书中，异物与由于测试体的形状变化而产生的结构物不同。因此，异物的内容物，与由于测试体的形状变化而产生的结构物的内容物不同。
25.检测上述多个孔内有无异物的工序，具有：基于上述多个孔图像各自所设定的第1亮度阈值，检测有无上述异物的工序；分别在上述多个孔图像中，基于从上述孔的深度方向看时包围上述孔的底部区域所对应的内部区域的外部区域中设定的第2亮度阈值，检测上述外部区域内有无上述异物的工序，上述第1亮度阈值和上述第2亮度阈值不同，在上述多个孔各自之中，上述底部的面积可以比上述底部相反侧的开口的面积小。上述外部区域，例如比孔的内部区域暗，因此难以检测异物。然而，在上述结构中，因为对于外部区域设定亮度阈值而进行检测，所以也可以确实地检测位于外部区域的异物。
26.上述板，也可以是通过如下板判定方法而判定为恰当的板：在应该评价的板所具有的多个评价孔中，将包含以产生上述异物的方式而选择且调整的上述测试体和上述受试物的评价试样注入上述多个评价孔之后，经过一定时间后，如果在上述多个评价孔之中至少一个评价孔保持有上述异物时，则判定为恰当的板。所谓“判定为恰当的板”，意思是板判
定方法实施且判定过的板，并且也包括应用判定方法时应该判定的板。
27.这种情况下，由上述板判定方法判定为恰当的板，是能够保持异物的板。因此，在将评价对象注入孔之后经过了一定时间后的评价板(具体来说就是评价对象)中，因为能够恰当地检测异物，所以可以对评价对象更准确地进行评价。
28.上述板，可以是未实施表面涂覆的聚苯乙烯制板、表面涂覆有poly-d-lysine的聚苯乙烯制板、表面实施过组织培养处理的环状烯烃共聚物制的板、或未实施表面涂覆的环烯烃聚合物制板。
29.上述板也可以是如下的板，具有玻璃板、和设于上述玻璃板的表面上的树脂层的板，其中，上述树脂层由环状烯烃共聚物或聚苯乙烯形成，在上述树脂层上形成有与上述多个孔相对应的多个贯通孔，在上述表面之中从上述多个贯通孔露出的区域，未实施涂覆。
30.或者，上述板也可以是如下的板，具有玻璃板、和设于上述玻璃板的表面上的树脂层的板，其中，上述树脂层，由环状烯烃共聚物或聚苯乙烯形成，在上述树脂层上形成有与上述多个孔相对应的多个贯通孔，在上述表面之中从上述多个贯通孔露出的区域，形成有涂层，上述涂层的材料是纤连蛋白、胶原或层粘蛋白。
31.这样的板，能够在上述板判定工序中判定为恰当。
32.本发明的另一方面的评价对象的评价方法，具备如下工序：分别对于在板所具有的多个孔中保持有评价对象的评价板的图像所对应的板图像内的多个评价区域，取得基于至少1个颜色特征量的统计信息的工序；基于依据上述至少1个颜色特征量的透明度变化检测用的基准统计信息与上述统计信息的相似度，检测上述多个评价区域的透明度变化的工序，上述评价对象包含测试体，上述多个孔具有保持有还包含受试物的上述评价对象的受试物用孔，上述多个评价区域，分别具有与至少1个孔相对应的至少1个孔的图像。
33.在上述评价方法中，对于上述板图像的多个评价区域，取得基于至少1个颜色特征量的统计信息。使用对于多个评价区域所取得的统计信息检测评价区域的透明度变化。因此，能够客观且高精度检测评价区域的透明度变化。其结果是，可以基于评价区域的透明度变化，客观且高精度评价受试物的安全性。
34.在一个实施方式的评价对象的评价方法中，可以还具备对上述评价板照射光的照射工序，在上述照射工序中，可以对上述评价板照射波长范围430nm～460nm和波长范围520nm～620nm的至少一个波长范围内的波长的光。
35.这种情况下，由于评价对象的状态等不同的孔间的亮度差别变大，例如，颜色的差异变得更明显。其结果是，可以对评价对象更准确地评价。
36.在上述照射工序中照射上述评价板的光，也可以是从波长范围430nm～460nm中选择的第1波长和从波长范围520nm～620nm中选择的第2波长的光。
37.在评价板中，分别可以存在如下的孔：与波长范围430nm～460nm内的波长所代表的颜色具有近似颜色的孔(具体来说就是评价对象)、和与波长范围520nm～620nm内的波长所代表的颜色具有近似色的孔(具体来说就是评价对象)。因此，光l具有上述第1波长和第2波长时，容易针对波长范围430nm～460nm侧的颜色和波长范围520nm～620nm侧的颜色双方确保孔的亮度。其结果是，颜色的差异变得更明显，可以对评价对象更准确地评价。
38.也可以还具备拍摄上述评价板的拍摄工序。
39.在上述拍摄工序中，也可以选择性地接收波长范围430nm～460nm和波长范围
520nm～620nm的至少一个波长范围内的波长的光。这种情况下，在拍摄评价板所得到的图像中，由于评价对象的状态等不同的孔间的亮度差别变大，所以，例如颜色的差异变得更加明显。其结果是，可以对评价对象更准确地评价。
40.在上述拍摄工序中，也可以从上述多个孔的底部侧拍摄上述评价板。例如，作为测试体使用细胞时，若细胞增殖而形成集落、或细胞死亡而产生异物等，则它们有沉入到孔底部的倾向。因此，通过从上述多个孔的底部侧拍摄上述评价板，可以更确实地检测出上述集落、异物等。
41.本发明的另一方面的图像处理装置，以执行上述本发明的评价方法的方式构成。
42.本发明的另一侧面的评价对象的评价系统，具备：保持在板所具有的多个孔中保持有评价对象的评价板的板保持部；拍摄上述评价板的摄像部；对基于上述摄像部的摄像结果所得到的上述评价板相对应的板图像进行评价的上述图像处理装置。
43.上述摄像部也可以配置在上述多个孔的底部侧。
44.发明效果
45.根据本发明，能够提供在生物安全性评价中可以更客观进行高精度评价的评价对象的评价方法、图像处理装置和评价对象的评价系统。
附图说明
46.图1是一个实施方式的评价对象的评价方法中使用的评价板的俯视图。
47.图2是孔的截面的示意图。
48.图3是一个实施方式的评价对象的评价系统的示意图。
49.图4是实施颜色判定处理时的运算部的功能框图。
50.图5是表示板图像创建部所创建的评价板的图像(板图像)的一例的图。
51.图6是表示hsv图像的一例的图。
52.图7是表示对于孔创建的频数分布的一例的直方图的图。
53.图8是表示为了1次判定而创建的对于紫色和黄色的相似度分布的一例的图。
54.图9是表示为了2次判定而创建的相似度分布的一例的图。
55.图10是表示各8个分区的相似度分布的一例的图。
56.图11是使用颜色判定处理的一例的评价方法的流程图的一例。
57.图12是实施颜色判定处理的另一例时的运算部的功能框图。
58.图13是表示在颜色判定处理的另一例中，为了判定颜色而创建的各8个分区的相似度分布的一例的图。
59.图14是表示创建在颜色判定处理的另一例中使用的基准频数分布时的运算部的功能框图。
60.图15是使用颜色判定处理的另一例的评价方法的流程图的一例。
61.图16是实施集落检测处理时的运算部的功能框图。
62.图17是用于说明图16所示的由运算部进行的集落检测处理的图。
63.图18是使用集落检测处理的评价方法的流程图的一例。
64.图19是实施透明度变化检测处理时的运算部的功能框图。
65.图20是表示8个分区间的分区频数分布的相似度的图表。
66.图21是使用透明度变化检测处理的评价方法的流程图的一例。
67.图22是进行异物检测处理时的运算部的功能框图。
68.图23是用于说明图22所示的由运算部进行的异物检测处理的图。
69.图24是使用异物检测处理的评价方法的流程图的一例。
70.图25是表示实验例1的试验条件的图表。
71.图26是表示实验例1的颜色判定结果的图表。
72.图27是表示实验例1的颜色判定结果的图表。
73.图28是表示实验例1的颜色判定结果的图表。
74.图29是表示实验例1的颜色判定结果的图表。
75.图30是表示实验例1的集落检测结果的图表。
76.图31是表示在实验例1中，基于从孔底部的相反侧拍摄评价板而得到的图像的集落检测结果的图表。
77.图32是表示实验例1的异物检测结果的图表。
78.图33是表示在实验例1中，基于从孔底部的相反侧拍摄评价板而得到的图像的异物检测结果的图表。
79.图34是实验例2的观察装置的示意图。
80.图35是表示基于实验例2的试样no.1的评价板的摄像结果的分区光谱分布的图。
81.图36是表示基于实验例2的试样no.2的评价板的摄像结果的分区光谱分布的图。
82.图37是表示基于实验例2的试样no.3的评价板的摄像结果的分区光谱分布的图。
83.图38是表示基于实验例2的试样no.4的评价板的摄像结果的分区光谱分布的图。
84.图39是表示基于实验例2的试样no.5的评价板的摄像结果的分区光谱分布的图。
85.图40是表示实验例2的各波长的分区间的亮度差的图。
86.图41是表示板的另一例的剖视图。
具体实施方式
87.以下，一边参照附图一边说明本发明的实施方式。对于同样的要素附加相同的符号，并省略重复的说明。附图的尺寸比率未必与说明的尺寸一致。
88.在本实施方式中，说明评价受试物的安全性的实施方式。具体来说，就是说明使用ames试验评价受试物的安全性的情况。
89.首先，说明在本实施方式中使用的ames试验的概要。在ames试验中，使用对于氨基酸合成基因实施基因操作，以使之不能合成氨基酸的方式改良过的细胞作为测试体。在ames试验中，对于上述细胞添加受试物。其后，在一定条件下培养。若因受试物导致细胞的氨基酸合成基因发生突变，则能够使细胞再次合成氨基酸。因此，通过确认突变是否发生，细胞有无增殖来评价遗传毒性。
90.此外，通常，在ames试验中，进行细胞毒性评价，即确认受试物对于细胞是否具有毒性。
91.在本实施方式中，说明可以适用于ames试验的遗传毒性评价、细胞毒性评价的评价系统、图像处理装置和评价方法。在基于以下的ames试验的实施方式的说明中，除非另行说明，否则测试体为细胞。
92.图1是一个实施方式的评价方法中使用的评价板10的俯视图。评价板10具有板(plate)11。板11具有多个孔13。在本实施方式中，板11具有二维(16
×
24)排列的384个孔13。
93.在板11上，假想设定出第1～第n的分区(n是2以上的整数)。在本实施方式中，如图1所示，说明n是8的情况，即，假想设定8个分区的情况。以下，将8个分区称为分区se1～se8。分区se1～se8是包括4
×
12个(48个)孔13(孔群)的区域。分区se1是溶剂对照分区，分区se8是阳性对照分区。溶剂对照分区作为阴性对照分区发挥功能。
94.孔(well)13是形成于板11的凹部(凹陷)。孔13保持评价对象14。区别说明保持在分别属于分区se1～se8的孔13中的评价对象14时，称为评价对象14a～14h。
95.评价对象14a～14h，具有分散(或悬浮)有细胞培养液。在全部384个孔13中，保持有等量的培养液。由孔13保持的培养液内的细胞的量在孔13间也相同。细胞的示例，是来自具有氨基酸营养缺陷型突变的微生物、生物的细胞等。具有氨基酸营养缺陷型突变的微生物，有组氨酸营养缺陷型的沙门氏菌(例如，ta1535、ta1537、ta97、ta97a、ta98、ta100、ta92、ta94、ta102、ta104、ta1538、ta7001、ta7002、ta7003、ta7004、ta7005、ta7006、各种yg株等)、色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌(例如，wp2、wp2uvra、wp2/pkm101、wp2uvra/pkm101等)、其他的微生物等。来自生物的细胞，例如，有来自哺乳动物的培养细胞、来自其他脊椎动物的细胞、来自昆虫的细胞等。评价对象14a～14h所包含的细胞，也可以是多个种类的细胞混合的细胞。培养液的示例，略含氨基酸的磷酸缓冲液。
96.评价对象14a～14h还包含指示剂。指示剂的量在评价对象14a～14h中相同(即在全部孔13中相同)。在本实施方式中，指示剂是ph指示剂。ph指示剂的示例是溴甲酚紫。在本实施方式中，ph指示剂的颜色如果是阴性结果(细胞未发生突变时)则为紫色，如果是阳性结果(细胞发生突变时)则为黄色。因此，本实施方式的候选色是紫色和黄色。在本说明书中，候选色是像使用指示剂(例如ph指示剂)时那样，所设定的例如在规定反应的前后评价对象所显示的颜色。
97.评价对象14b～14g中，除了分散有上述细胞的培养液和指示剂以外，还包含受试物溶解或均匀分散到溶剂中的液体(受试物溶液)。因此，保持评价对象14b～14g的分区se2～se7的孔13是保持受试物的孔(受试物用孔)。受试物是要评价安全性(本实施方式中为遗传毒性)的物质(例如化学物质)。作为溶剂，可列举水、二甲基亚砜(dmso)等。评价对象14b～14g除了受试物的浓度不同这一点以外，其他均相同。属于分区se2的全部孔13的评价对象14b内的受试物溶液的量相同。在分区se3～分区se7中也同样。
98.评价对象14a，除了含上述细胞的培养液和指示剂以外，还包含溶剂对照液。因此，保持评价对象14a的分区se1的孔13是溶剂对照孔。溶剂对照液是受试物溶液所使用的溶剂。不过，溶剂对照液只要是不影响细胞的液体即可。作为溶剂对照液，例如是水、dmso。在属于分区se1的全部孔13中，评价对象14a内的溶剂对照液的量相同。
99.评价对象14h，除了含上述细胞的培养液和指示剂以外，还包含阳性对照液。因此，保持评价对象14h的分区se8的孔13是阳性对照孔。阳性对照液是含阳性对照化合物和溶剂的溶液。阳性对照化合物，是对于细胞可知呈阳性的化合物即可。阳性对照化合物的示例，包括9aa(9－aminoacridine)、4-nqo(4－nitroquinoline-n-oxide)、2-aa(2－aminoanthracene)和2－nf(2－nitrofluorene)。溶剂也可以与受试物溶液所使用的溶剂
不同。作为溶剂，可列举水、dmso等。由属于作为阳性分区的分区se8的全部孔13所保持的阳性对照液的量相同。
100.在调查受试物有无代谢活化的影响时，评价对象14a～14h还包含s9mix。s9mix是在动物肝脏的提取物中加入辅酶而得到的液体。s9mix能够为在肝匀浆的9,000
×
g上清液(s9)中，添加nadph等电子传递链相关的辅助因子并经调整而成的液体。
101.参照图1和图2，进一步说明孔13的结构。图2是孔截面的示意图。图2中示意性地图示了评价对象14。在本实施方式中，孔13的俯视形状(从孔13的深度方向看的形状)是正方形。孔13的开口部的一边长度的示例是3.0mm～4.0mm。孔13深度的示例是9.0mm～15.0mm。具有这样尺寸的孔的板11，可知是微孔板。如图2所示，孔13朝向底部13a前端变细。因此，底部13a的面积小于孔13的开口13b的面积。
102.评价板10，是在板11的各孔13中注入对应的评价对象14，在实施一定的培养处理后，成为可对评价对象14进行安全性评价的状态下的板。
103.接着，说明保持于评价板10的受试物的安全性的评价方法所使用的评价系统20。图3是一个实施方式的评价系统20的示意图。评价系统20具备观察装置30和图像处理装置40。
104.[观察装置]
[0105]
观察装置30，具有载物台(板保持部)31、照明装置32、摄像部33。载物台31支承评价板10。评价板10以使评价板10的底部(孔13的底部13a侧)位于载物台31侧的方式配置在载物台31上。载物台31构成方式为，使从照明装置32输出的光l通向摄像部33。例如，载物台31的材料可以具有透光性，也可以在与评价板10的形成有384个孔13的区域对应的区域，形成开口或透射光l的窗口部。在本实施方式中，载物台31按照可以沿图3的空心箭头方向搬送的方式构成。
[0106]
照明装置32配置在评价板10上(从评价板10观看在载物台31的相反侧)。照明装置32对评价板10照射光l。照明装置32的示例是led照明，光l的示例是波长400nm～780nm的光。
[0107]
摄像部33接收透过评价板10的光l，拍摄评价板10。摄像部33取得与目视评价板10时实质上同样的彩色图像(rgb图像)。摄像部33具有摄像器33a和聚光部33b。
[0108]
摄像器33a的示例，包括二维传感器(或照相机)和线阵传感器。二维传感器的示例有ccd照相机、cmos照相机。
[0109]
聚光部33b会聚光l并入射到摄像器33a。聚光部33b包括至少1个透镜。摄像器33a本身具有聚光的光学功能时，摄像部33也可以没有聚光部33b。
[0110]
在本实施方式中，摄像部33的摄像区域小于评价板10的大小。这种情况下，摄像部33分多次拍摄评价板10。但是，摄像部33也可以具备多个摄像部33，摄像部33的摄像区域，也可以是能够一次拍摄评价板10整体的大小。
[0111]
摄像部33以有线通信或无线通信连接于图像处理装置40，将取得的图像(具体来说是图像数据)输出到图像处理装置40。图像从摄像部33向图像处理装置40的输入，例如，可以经由dvd等的存储介质等进行。
[0112]
在观察装置30中，照明装置32和摄像部33相对于评价板10的位置也可以反转。即，在图3中，也可以将摄像部33配置在评价板10上，将照明装置32配置在载物台31的下侧，以
此状态拍摄评价板10。
[0113]
说明利用上述观察装置30拍摄评价板10的方法。拍摄评价板10时，在载物台31配置评价板10。一边使载物台31沿一个方向移动，一边从照明装置32向评价板10照射光l(照射工序)。如此在将光l照射到评价板10的状态下，由摄像部33拍摄评价板10(拍摄工序)。
[0114]
在本实施方式中，因为摄像部33的摄像区域小于评价板10的大小，所以1次拍摄能够得到评价板10的部分图像。因此，在拍摄工序中，使用摄像部33，以合成上述部分图像而形成评价板10整体图像的方式，多次拍摄评价板10。
[0115]
摄像部33将取得的图像输入图像处理装置40。
[0116]
[图像处理装置]
[0117]
图像处理装置40具有输入部41、运算部42(执行部)、输出部43。图像处理装置40是计算机。图像处理装置40，通常，能够还有计算机所具备的存储部(存储器)等。图像处理装置40可以是通过运行各种程序，从而作为图像处理装置40发挥功能的个人电脑，也可以是用于评价的专用装置。图像处理装置40，作为评价评价板10的评价装置或评价支持装置发挥功能。
[0118]
输入部41是被输入由摄像部33取得的图像数据(或接收)的输入机构。
[0119]
运算部42基于输入至输入部41的图像，创建板图像p1(参照图5)。图5是表示板图像p1的一例的图。板图像p1是与评价板10对应的图像。在板图像p1中，将孔13、分区s1～se8所对应的部分，分别称为孔图像13p、分区图像se1p～se8p。运算部42通过处理板图像p1，实施孔13的颜色判定处理。运算部42也可以进一步实施孔13内的集落检测处理、孔13的透明度变化检测处理及孔13内的异物检测处理的至少1项。在本实施方式中说明的情况是，运算部42也可以实施集落检测处理、透明度变化检测处理及异物检测处理。
[0120]
在本实施方式中所谓“孔的颜色”，是保持在孔13内的评价对象14的颜色。运算部42通过判定孔图像13p的颜色，来判定孔13的颜色。在本实施方式中所谓“孔内的集落(colony)”，是保持在孔13内的作为评价对象14的细胞发生的形状变化的集落。因为集落是细胞(测试体)的形状变化，所以是轮廓和内部的边境不清楚的结构物。在本实施方式中“孔的透明度变化”，是保持在孔13内的评价对象14的透明度变化，运算部42通过判定孔图像13p的透明度变化，来判定孔13的透明度变化。在本实施方式中所谓“孔内的异物”，是保持在孔13内的评价对象14产生的异物，与集落那样的细胞(测试体)形状变化不同，是被折射率不同于异物周围的界面分隔的物质(或结构物)。因此，异物的轮廓和内部的边界清楚(至少比集落的情况清楚)。
[0121]
输入部41例如将板图像p1输出到存储部时，运算部42访问存储部而取得应该处理的数据即可。关于运算部42后述。
[0122]
输出部43为了评价者参照而对于运算部42的结果进行显示输出。输出部43，例如，可以向外部显示装置输出运算部42的结果，输出部43自身也可以具有显示功能。输出部43也可以对运算部42进行处理过程中的数据的输出显示。
[0123]
如前述，在本实施方式中，运算部42可以实施颜色判定处理、集落检测处理、透明度变化检测处理及异物检测处理。
[0124]
说明实施各处理时的运算部42。在此说明如下的情况：摄像部33的摄像区域小于评价板10的大小，为了得到评价板10整体的图像，摄像部33对评价板10的不同区域进行多
次拍摄的情况。
[0125]
[颜色判定处理]
[0126]
关于颜色判定处理，说明第1颜色判定处理和第2颜色判定处理。颜色判定中，使用基于至少1个颜色特征量的统计信息。统计信息包括至少1种统计量。在本实施方式中，说明作为2个以上的颜色特征量使用色调和饱和度，作为统计信息使用频数分布(统计量)的情况。
[0127]
[第1颜色判定处理]
[0128]
将实施第1颜色判定处理时的运算部42，称为运算部42a。图4是运算部42a的功能框图。运算部42a具有板图像创建部42a、hsv图像创建部42b、频数分布创建部(统计信息取得部)42c、第1判定部42d、第1基准创建部(第1基准取得部)42e、第2判定部42f、第2基准创建部(第2基准取得部)42g和第3判定部42h。
[0129]
板图像创建部42a，合成输入到输入部41的多个图像(各图像是评价板10的部分图像)，如图5所示，创建与评价板10对应的板图像p1。板图像p1是彩色图像(rgb图像)。
[0130]
hsv图像创建部42b，将板图像创建部42a所创建的板图像p1，转换成hsv图像p2。图6是表示hsv图像p2的一例的图。图6所示的hsv图像p2，是将图5所示的板图像p1进行了hsv转换的图像。从rgb图像向hsv图像的转换，基于公知的转换式(或基于此的公知的程序)进行即可。由于hsv图像p2是将板图像p1进行了hsv转换的图像，所以hsv图像p2的孔13、分区se1～se8所对应的部分图像，也称为孔图像13p、分区图像se1p～se8p。
[0131]
频数分布创建部42c，使用hsv图像创建部42b所创建的hsv图像p2，针对每个孔图像13p(换言之就是孔13)，创建(即，取得以色调和饱和度为变量的作为频数分布的统计信息)以色调和饱和度为变量的频数分布。因此，频数分布创建部42c，创建评价板10具有的全部孔13所对应的多个频数分布(在本实施方式中，为384个频数分布)。说明频数分布创建部42c创建的频数分布的具体方法的一例。
[0132]
频数分布创建部42c，特定hsv图像p2的各孔图像13p的区域。例如，如图6的虚线所示，在孔图像13p中设定roi(region of interest)即可。在图6中，为了例示而显示在单孔图像13p中设定roi的状态。roi可以作为评价者指定的区域进行设定，例如，可以基于预先输入的板11的数据(形状，尺寸等)、孔13中什么都没有的状态的板11的图像、hsv图像的亮度信息等，自动设定频数分布创建部42c。
[0133]
频数分布创建部42c，使用特定的孔图像13p中包括多个像素所具有的图像信息(色调，饱和度等)，创建上述频数分布。在本实施方式中，将色调和饱和度分别分成36，通过提取36
×
36＝1296个特征量(本实施方式中为像素数)，创建频数分布。
[0134]
图7是表示创建的频数分布的一例的直方图的图。图7的横轴表示色调和饱和度，纵轴表示像素数。图7是对于单孔图像13p的直方图。
[0135]
第1判定部42d，首先，计算频数分布创建部42c所创建的多个频数分布间的相似度。相似度，例如，可以使用欧几里得距离计算，或者，也可以使用相关系数计算。相似度例如也可以利用模式匹配计算。在相似度的计算中，也可以利用深度学习。
[0136]
说明计算多个频数分布间的相似度时的一例。在本实施方式中，因为以紫色或黄色判定孔图像13p的颜色(即，孔13的颜色)，所以计算各频率数分布的紫色区域(候选色区域)的相似度和各频率数分布的黄色区域(候选色区域)的相似度。紫色区域和黄色区域，为
了孔图像13p的颜色判定，能够基于色调和饱和度，例如由评价者设定。在图7的示例中，例如，将色调为20～35且饱和度为0～15设定为紫色区域，将色调为0～15且饱和度为0～25设定为黄色区域。
[0137]
将多个孔图像13p之中任意一个称为关注孔图像。这种情况下，将关注孔图像所对应的频数分布之中紫色区域的频数分布与紫色区域的频数总和达到一定值以上的全部孔图像13p的紫色区域的平均频数分布的相似度，作为该关注孔图像的紫色区域的相似度。同样，将关注孔图像中的黄色区域的频数分布与黄色区域的频数总和达到一定值以上的全部孔图像13p的黄色区域的平均频数分布的相似度，作为该关注孔图像的黄色区域的相似度。由此，能够针对每个孔图像13p得到紫色区域和黄色区域的相似度的组，因此能够取得针对于紫色和黄色的相似度分布。
[0138]
或者，也可以将关注孔图像所对应的频数分布与紫色区域的频数总和达到一定值以上的全部孔图像13p的平均频数分布的相似度，作为该关注孔图像对于紫色的相似度。同样，也可以将关注孔图像所对应的频数分布与黄色区域的频数总和达到一定值以上的全部孔图像13p的平均频数分布的相似度，作为该关注孔图像对于紫色的相似度。这种情况下，也可取得针对于紫色和黄色的相似度分布。
[0139]
图8是对于紫色和黄色的相似度分布的一例的图。具体来说，是将针对各孔图像13p计算出的紫色的相似度和黄色的相似度的组，相对于紫色的相似度和黄色的相似度映射而得到的图。图8的横轴表示紫色的相似度，表示随着数字变大而类似于紫色。纵轴表示黄色的相似度，表示随着数字变大而类似于黄色。
[0140]
第1判定部42d，基于所取得的相似度分布，将各孔图像13p的颜色1次判定为紫色或黄色。例如，使用用于区分紫色和黄色的阈值，按紫色或黄色判定孔图像13p即可。阈值例如可以将图8所示的图提示给评价者而由评价者设定，也可以根据聚类分析中的ward法等的层次聚类方法、k－means等的非层次聚类方法和线性判别法等，由第1判定部42d自动设定。
[0141]
第1基准创建部42e，在评价板10所具有的全部孔图像13p之中，基于第1判定部42d中被分别判定为紫色和黄色的多个孔图像13p的频数分布(由频数分布创建部42c创建的频数分布)，创建每个紫色和黄色的第1基准频数分布。
[0142]
在本实施方式中，基于将被判定为紫色的多个孔图像13p的频数分布平均而得到的平均频数分布，创建紫色的第1基准频数分布。同样，基于将被判定为黄色的多个孔图像13p的频数分布平均而得到的平均频数分布，创建黄色的第1基准频数分布。
[0143]
第2判定部42f，基于第1基准创建部42e所创建的每个紫色和黄色的第1基准频数分布和评价板10所具有的全部孔图像13p的频数分布，对全部孔图像13p进行2次判定紫色或黄色。
[0144]
具体来说，第2判定部42f，计算每个紫色和黄色各自的第1基准频数分布与全部孔图像13p的频数分布的相似度。因为使用每个颜色的第1基准频数分布，不用像上述频数分布创建部42c的频数分布的创建方法的一例那样分为紫色区域和黄色区域，而是以全部区域为对象计算相似度即可。因为能够针对每个孔图像13p得到相对于紫色和黄色的相似度的组，所以可取得相对于紫色和黄色的相似度分布。
[0145]
图9是由第2判定部42f取得的相似度分布的图。图9的横轴和纵轴与图8的横轴和
纵轴同样。
[0146]
第2判定部42f，基于取得的相似度分布，对各孔图像13p进行判定紫色或黄色。例如，使用用于区分紫色和黄色的阈值，将孔图像13p判定为紫色和黄色即可。阈值例如可以将图9所示的图提示给评价者由评价者设定，也可以通过聚类分析的ward法等的层次聚类手法或k－means等的非层次聚类手法、线性判别法等，由第2判定部42f自动设定。
[0147]
第2基准创建部42g，针对每个评价板10的分区se1～se8各自对应的图像即分区图像se1p～se8p，基于在第2判定部42f中分别被判定为紫色和黄色的多个孔图像13p的频数分布(由频数分布创建部42c创建的频数分布)，创建各紫色和黄色的第2基准频数分布。
[0148]
具体来说，将分区图像se1p～se8p之中任意一个称为关注分区图像的情况下，基于属于关注分区图像的多个孔图像13p(在本实施方式中，是48孔图像13p)之中将判定为紫色的多个孔图像13p的频数分布平均而得到的平均频数分布，创建紫色的第2基准频数分布。同样，基于将判定为关注分区图像内的黄色的多个孔图像13p的频数分布平均而得平均频数分布，创建黄色的第2基准频数分布。上述关注分区图像，是将设定于板11的多个分区，如前述这样表示为第1～第n的分区时，在第1～第n的分区所对应的图像即第1～第n的分区图像之中，相当于与第i的分区(i是2以上且n以下的整数)对应的第i的分区图像。
[0149]
第3判定部42h，对每个分区图像se1p～se8p，基于第2基准创建部42g所创建的每个紫色和黄色的第2基准频数分布和分别属于分区图像se1p～se8p的多个孔图像13p的频数分布，对分别属于分区图像se1p～se8p的多个孔图像13p的颜色进行3次判定。由此，评价板10的全部孔13的颜色被3次判定。在本实施方式中，来自第3判定部42h的颜色判定结果是最终判定结果。
[0150]
如前述，具体说明将分区图像se1p～se8p之中任意一个称为关注分区图像，并由第3判定部42h进行判定的方法。
[0151]
首先，使用关注分区图像的全部孔图像13p的频数分布，代替第2判定部42f的全部孔图像13p的频数分布，并且，使用第2频数分布代替第1基准频数分布，除以上点以外，均与第2判定部42f的情况同样地取得孔图像13p的相似度分布。图10是各分区图像se1p～se8p的相似度分布的图。图10内的se1p～se8p分别表示分区图像se1p～se8p。图10的横轴和纵轴与图8的横轴和纵轴同样。图10中的白圆圈与判定为黄色的孔图像13p对应，黑圆圈与判定为紫色的孔图像13p对应。
[0152]
第3判定部42h，基于取得的相似度分布，判定分区图像se1p～se8p内的全部孔图像13p的颜色。例如，使用用于区分紫色和黄色的阈值，判定孔图像13p的颜色即可。阈值例如可以将图10所示的各图提示给评价者而由评价者设定，也可以通过聚类分析的ward法等的层次聚类方法或k－means等的非层次聚类方法、线性判别法等，由第3判定部42h自动设定。如前述，第3判定部42h的判定结果是本实施方式的最终判定结果。因此，在第3判定部42h的判定中，例如，使用上述阈值时，位于阈值上或阈值附近区域的孔图像13p(或孔13)的颜色，可以判定为紫色和黄色的中间色。
[0153]
由于判定关注分区图像内的全部孔图像13p的颜色，所以判定评价板10内的全部孔13的颜色。
[0154]
第3判定部42h也可以创建表示判定结果的数据。具体来说，各孔图像13p(或孔13)，也可以制成以判定的颜色(紫色或黄色)相应的颜色表示的输出用图像数据。这种情况
下，上述中间色，例如能够表示为绿色。
[0155]
说明使用上述第1颜色判定处理的评价板10的评价方法(受试物的评价方法)的一例。图11是使用第1颜色判定处理的评价方法的流程图的一例。实施使用了第1颜色判定处理的评价方法时，运算部42作为运算部42a发挥功能。在此，说明由观察装置30的摄像部33取得的图像被输入部41接收的工序(输入工序)后的工序。
[0156]
若来自摄像部33的图像被输入部41接收，则图像处理装置40通过板图像创建部42a，合成由输入部41接收的来自摄像部33的多个图像而生成板图像p1(板图像创建工序s11)。
[0157]
在板图像创建工序s11之后，图像处理装置40，通过hsv图像创建部42b，将上述板图像p1转换hsv图像p2(hsv图像创建工序s12)。
[0158]
在hsv图像创建工序s12之后，图像处理装置40，通过频数分布创建部42c，对每个孔图像13p创建频数分布(频数分布创建工序s13)。在频数分布创建工序(统计信息取得工序)s13中，创建板图像p1内的全部孔图像13p所对应的多个频数分布。
[0159]
在频数分布创建工序s13之后，图像处理装置40，通过第1判定部42d，计算频数分布创建工序s13中所创建的多个频数分布间的相似度，1次判定上述全部孔图像13p的颜色是紫色或黄色(第1判定工序s14)。相似度的计算方法如前述。通过计算多个频数分布间的相似度，如前述这样，取得针对于紫色和黄色的相似度分布。在取得的相似度分布中，使用区分紫色和黄色的阈值，将上述全部孔图像13p的颜色判定为紫色或黄色。
[0160]
在第1判定工序s14之后，图像处理装置40，通过第1基准创建部42e，创建紫色和黄色各自的第1基准频数分布(第1基准统计信息)(第1基准创建工序s15)。第1基准频数分布的创建方法，与关于第1基准创建部42e说明的情况同样。
[0161]
第1基准创建工序(第1基准统计信息取得工序)s15之后，图像处理装置40，通过第2判定部42f，使用上述第1基准频数分布，2次判定多个孔图像13p的颜色(第2判定工序s16)。在本实施方式中，计算每个紫色和黄色的第1基准频数分布分别与全部孔图像13p的频数分布的相似度。第2判定工序s16，以第1基准频数分布中的色调和饱和度的所有区域为对象而计算相似度即可。由此，对每个孔图像13p得到针对于紫色和黄色的相似度的组，因此取得针对于紫色和黄色的相似度分布。在如此取得的相似度分布中，使用区分紫色和黄色的阈值，对上述全部孔图像13p的颜色进行2次判定紫色或黄色。第2判定工序s16中使用的阈值，如前述，可以由评价者设定，也可以由第2判定部42f自动设定。
[0162]
在第2判定工序s16之后，图像处理装置40，通过第2基准创建部42g，对每个分区图像se1p～se8p，创建紫色和黄色各自的第2基准频数分布(第2基准创建工序s17)。在本实施方式中，在各个分区图像se1p～se8p中，基于分别属于分区图像se1p～se8p的多个孔图像13p(在本实施方式中，为48孔图像13p)之中将在第2判定工序被判定为紫色的多个孔图像13p的频数分布平均而得到的平均频数分布，创建紫色的第2基准频数分布(第2基准统计信息)。同样，创建黄色的第2基准频数分布(第2基准统计信息)。
[0163]
在第2基准创建工序(第2基准统计信息取得工序)s17之后，图像处理装置40，通过第3判定部42h，对每个分区图像se1p～se8p，3次判定(最终判定)孔图像13p的颜色(第3判定工序s18)。具体说明本实施方式的第3判定工序s18。
[0164]
首先，在各个分区图像se1p～se8p中，对于分别属于分区图像se1p～se8p的多个
孔图像13p，与第2判定工序s16同样，取得相似度分布。基于取得的相似度分布，使用分为紫色和黄色的阈值，3次判定分别属于分区图像se1p～se8p的全部孔图像13p的颜色。阈值可以由评价者设定，也可以由第3判定部42h自动设定。使用上述阈值时，位于阈值上或阈值附近区域的孔图像13p的颜色，判定为紫色和黄色的中间色。
[0165]
因为针对每个分区图像se1p～se8p判定多个孔图像13p的颜色，所以判定评价板10中的全部孔13的颜色。
[0166]
在第3判定工序s18之后，图像处理装置40，通过输出部43，将第3判定工序s18的结果，以提示给评价者的方式输出即可(输出工序)。
[0167]
[第2颜色判定处理]
[0168]
将进行第2颜色判定处理时的运算部42，称为运算部42b。图12是运算部42b的功能框图。运算部42具有板图像创建部42a、hsv图像创建部42b、频数分布创建部42c和判定部42i。板图像创建部42a、hsv图像创建部42b和频数分布创建部42c，与运算部42a的情况同样，因此省略说明。
[0169]
判定部42i，使用预先存储在图像处理装置40中的分别相对于紫色和黄色的第3基准频数分布(候选色的基准统计信息)，判定孔图像13p的颜色。在本实施方式中，判定部42i所使用的第3基准频数分布，与第2基准频数分布同样，在每个分区图像se1p～se8p取得。关于上述第3基准频数分布的创建方法后述。在本实施方式中，判定部42i使用上述第3基准频数分布，代替第2基准频数分布，除这一点以外，均与运算部42的第3判定部42h的情况同样，对每个分区图像se1p～se8p判定孔图像13p的颜色。由此，可判定评价板10的全部孔13的颜色。
[0170]
图13是由判定部42i取得的各分区图像se1p～se8p的相似度分布的图。图13的横轴和纵轴与图10的横轴和纵轴同样。图13表示使用与图10的情况相同的板图像p1时的结果。图13内的se1p～se8p表示各个分区图像se1p～se8p。
[0171]
说明上述第3基准频数分布的创建方法。将创建第3基准频数分布时的运算部42称为运算部42c。图14是运算部42c的功能框图。运算部42c具有板图像创建部42a、hsv图像创建部42b、频数分布创建部42c和基准创建部(基准统计信息取得部)42j。
[0172]
在此进行说明的情况如下，为了创建第3基准频数分布，由观察装置30取得在相同条件下准备的3张评价板10的图像，经由输入部41输入到图像处理装置40，并且上述3张评价板10的来自评价者的目视判定结果一起被输入到图像处理装置40。优选上述相同条件的板中的至少是细胞、指示剂、培养液和s9mix与受试物实际评价中所使用的相同。
[0173]
板图像创建部42a，与运算部42a的板图像创建部42a的情况同样，创建3张评价板10的板图像p1。
[0174]
hsv图像创建部42b，与运算部42a的hsv图像创建部42b的情况同样，将3张板图像p1分别转换为hsv图像p2。
[0175]
频数分布创建部42c，分别对于hsv图像创建部42b所创建的3张hsv图像p2，与运算部42a的频数分布创建部42c同样，创建每个孔图像13p的频数分布。
[0176]
基准创建部42j，基于频数分布创建部42c所创建的频数分布和评价者的目视判定结果，对每个分区图像se1p～se8p创建相对于紫色和黄色的第3基准频数分布。如前述，将分区图像se1p～se8p中的任意一个称为关注分区图像而进行说明。
[0177]
基于目视判定结果，将属于3张评价板10的关注分区的全部孔13分成紫色或黄色。基准创建部42j，通过创建被分为紫色的全部孔图像13p的频数分布的平均频数分布，从而创建紫色的第3基准频数分布。同样，通过创建被分为黄色的全部孔图像13p的频数分布的平均频数分布，创建黄色的第3基准频数分布。
[0178]
在此，说明了使用3张相同条件的评价板10的情况，但评价板10的数量不受限定。评价板10的数量越多，可以越准确地判定。第3基准频数分布创建一次即可。或者，例如，也可以将第1颜色判定方法中曾经创建的第2基准频数分布，作为第2颜色判定处理中的第3基准频数分布使用。
[0179]
第3基准频数分布，与第1基准频数分布的情况同样，也可以对于整个评价板10创建。
[0180]
接下来，说明使用第2颜色判定处理的评价板10的评价方法(受试物的评价方法)的一例。图15是使用了第2颜色判定处理的评价方法的流程图的一例。在实施使用了第2颜色判定处理的评价方法时，运算部42作为运算部42b发挥功能。
[0181]
在此，说明由观察装置30的摄像部33取得的图像被输入部41接收的工序(输入工序)后的工序。说明通过图14所示的基准创建部42j，预先创建紫色和黄色各自的第3基准频数分布，并保持到图像处理装置40的情况。
[0182]
与图11所示的情况同样，实施板图像创建工序s11、hsv图像创建工序s12和频数分布创建工序s13。
[0183]
在频数分布创建工序s13之后，图像处理装置40，通过判定部42i，判定全部孔图像13p的颜色(判定工序s21)。在本实施方式中，使用预先存储在图像处理装置40中的分别相对于紫色和黄色的第3基准频数分布，判定孔图像13p的颜色。在本实施方式中，第3基准频数分布，与图11所示的第2基准创建工序s17中说明的第2基准频数分布同样，按每个分区图像se1p～se8p取得。在本实施方式中，判定工序s21中使用第3基准频数分布，代替第2基准频数分布，除这一点以外，均与图11的第3判定工序s18的情况同样，通过对每个分区图像se1p～se8p判定孔图像13p的颜色，从而判定评价板10的全部孔13的颜色。
[0184]
在判定工序s21之后，图像处理装置40通过输出部43，将判定工序s21的结果，以提示给评价者的方式输出即可(输出工序)。
[0185]
[集落检测处理]
[0186]
将实施集落检测处理时的运算部42称为运算部42d，利用图16和图17说明运算部42d。图16是运算部42d的功能框图。图17是用于说明由运算部42d进行的集落检测处理的图。运算部42具有板图像创建部42a、孔图像特定部42k、平滑化部42l、内部区域设定部42m、第1集落检测部42n、外部区域设定部42o、第2集落检测部42p、检测结果创建部42q。
[0187]
板图像创建部42a，与运算部42a的板图像创建部42a同样，基于输入到图像处理装置40的评价板10的图像，创建板图像p1。
[0188]
孔图像特定部42k，在板图像p1中，特定作为与孔13对应的区域的孔图像(评价区域)13p。具体来说，在孔图像13p中设定roi(region of interest)即可。在图17的(a)中，显示为了例示而设定了roi的单孔图像13p。
[0189]
平滑化部42l对于孔图像13p进行平滑化处理。平滑化处理以图像处理中公知的方法实施即可。图17的(b)表示图17的(a)的孔图像13p经过了平滑化处理的结果。
[0190]
内部区域设定部42m，特定孔图像13p的内部区域ia。例如，图17的(c)的点划线所示，在内部区域ia设定roi即可。图17的(c)是表示对于图17的(b)的图像，在内部区域ia设定roi的状态的图。roi的设定区域，可以由评价者指定，也可以基于评价板10所用的板11的信息(尺寸、孔13的配置状态等)和孔图像13p的亮度信息，由内部区域设定部42m自动设定。所谓孔图像13p的内部区域ia，是从评价板10的厚度方向对其观看时与孔13的底部13a对应的区域。换言之，就是孔13中底部13a的正上方的区域(参照图2)。
[0191]
第1集落检测部42n，通过特定内部区域ia内的评价对象14的形状变化(集落造成的形状变化)，来检测内部区域ia内有无集落。在本实施方式中，形成有集落时，利用集落比周围暗来检测集落。
[0192]
具体来说，就是基于亮度阈值，对于特定的内部区域ia进行二值化处理，检测出亮度值比所设定的亮度阈值小的(暗的)区域作为候选集落。亮度阈值可以根据内部区域ia的明度(亮度值)由评价者指定，也可以基于历史数据等预先设定。在本实施方式中，上述候选集落中，将进一步满足设定为集落的形状(圆形度)和尺寸的候选作为集落检测。从候选集落基于上述形状和尺寸进行的集落检测，例如，可以观看提示候选集落的图像而由评价者实施，也可以基于预先设定的形状(圆形度)和尺寸由第1集落检测部42n判断。
[0193]
在作为溶剂对照分区的分区se1，关于通过颜色判定而判定为紫色的孔13，实际上检测不到集落。因此，例如事先实施过颜色判定处理，在通过分区se1所对应的分区图像se1p(溶剂对照区域)的颜色判定而判定为紫色的孔图像13p中特定了候选集落时，尺寸也可以在分区图像se2p～se8p中，以分区图像se1p内的候选集落之中最大的候选集落的尺寸作为标准。即，在分区图像se2p～se8p中，也可以将大于分区图像se1p内的最大的候选集落且满足作为上述集落而设定的形状的候选集落作为集落进行检测。
[0194]
图17的(d)是表示内部区域ia的集落的检测结果的一例的图。
[0195]
外部区域设定部42o，特定孔图像13p的外部区域oa。例如，如图17的(e)的点划线所示，在外部区域oa设定roi即可。图17的(e)是表示在外部区域oa设定roi的状态的图。roi的设定区域可以由评价者指定，也可以基于板11的数据等由外部区域设定部42o自动设定。所谓孔图像13p的外部区域oa，是孔13壁部的区域(参照图2)。
[0196]
第2集落检测部42p，通过特定外部区域oa内的评价对象14的形状变化(集落带来的变化)，检测外部区域oa内有无集落。在本实施方式中，与第1集落检测部42n的情况同样，形成集落时，利用集落在内侧暗，其周围亮明来检测集落。
[0197]
具体来说，就是基于亮度阈值，对特定的外部区域oa进行二值化处理，将亮度值比所设定的亮度阈值小的(暗的)区域作为候选集落加以检测。亮度阈值，可以根据外部区域oa的明度(亮度值)由评价者指定，也可以基于历史数据等预先设定。因为外部区域oa比内部区域ia暗，所以在外部区域oa，用于检测集落的亮度阈值，与内部区域ia的情况不同。在本实施方式中，在上述候选集落中，与第1集落检测部42n的情况同样，将进一步满足设定为集落的形状(圆形度)和尺寸的候选作为集落检测。形状和尺寸等的条件，可以与内部区域ia的情况不同。此外，关于尺寸，与第1集落检测部42n的情况同样，可以利用作为溶剂对照分区的分区se1所对应的分区图像se1p的结果。
[0198]
图17的(f)是表示外部区域oa的集落的检测结果的一例的图。
[0199]
检测结果创建部42q，综合第1集落检测部42n和第2集落检测部42p的结果，创建表
示集落检测结果的数据。检测结果创建部42q，例如，能够创建由第1集落检测部42n和第2集落检测部42p检测到的集落区域经过增强处理(例如上色处理)的数据。
[0200]
运算部42d，将检测结果创建部42q所创建的检测结果，作为集落的最终检测结果输出到输出部43。图17的(g)是表示来自运算部42的最终检测结果的一例的图。
[0201]
接着，说明使用集落检测处理的评价板10的评价方法(受试物的评价方法)的一例。图18是使用集落检测处理的评价板10的评价方法的流程图的一例。实施使用了集落检测处理的评价板10的评价方法时，运算部42作为运算部42d发挥功能。在此，说明由观察装置30的摄像部33取得的图像被输入部41接收的工序(输入工序)后的工序。
[0202]
与图11所示的情况同样，实施板图像创建工序s11。
[0203]
在板图像创建工序s11之后，图像处理装置40，通过孔图像特定部42k，特定板图像p1中的各孔图像13p(孔图像特定工序s31)。在本实施方式中，在板图像的各孔图像13p设定roi。roi可以由评价者指定，也可以由孔图像特定部42k自动设定。
[0204]
孔图像特定工序s31之后，图像处理装置40，通过平滑化部42l使孔图像13p平滑化(平滑化工序s32)。
[0205]
平滑化工序s32之后，图像处理装置40，通过内部区域设定部42m，设定各孔图像13p的内部区域ia(内部区域设定工序s33)。在本实施方式中，在各孔图像13p的内部区域ia设定roi。roi可以由评价者指定，也可以由内部区域设定部42m自动设定。
[0206]
内部区域设定工序s33之后，图像处理装置40，通过第1集落检测部42n，检测各孔图像13p的内部区域ia中有无集落(第1集落检测工序s34)。在本实施方式中，如第1集落检测部42n相关说明，利用亮度值并且利用形状(圆形度)和尺寸检测有无集落。
[0207]
第1集落检测工序s34之后，图像处理装置40，通过外部区域设定部42o，设定各孔图像13p的外部区域oa(外部区域设定工序s35)。在本实施方式中，在各孔图像13p的外部区域oa设定roi。roi可以由评价者指定，也可以由外部区域设定部42o自动设定。
[0208]
外部区域设定工序s35之后，图像处理装置40，通过第2集落检测部42p，检测各孔图像13p的外部区域oa有无集落(第2集落检测工序s36)。在本实施方式中，如第2集落检测部42p相关说明，使用亮度值且使用形状(圆形度)和尺寸检测有无集落。
[0209]
第2集落检测工序s36之后，图像处理装置40，通过检测结果创建部42q，综合第1集落检测工序s34和第2集落检测工序s36各自的检测结果，创建集落检测的最终检测结果(检测结果创建工序s37)。
[0210]
检测结果创建工序s37之后，图像处理装置40，通过输出部43，将检测结果创建工序s37所创建的检测结果，以提示给评价者的方式输出即可(输出工序)。
[0211]
[透明度变化检测处理]
[0212]
将实施透明度变化检测处理时的运算部42称为运算部42e，说明运算部42e。图19是运算部42e的功能框图。运算部42e具有：板图像创建部42a、hsv图像创建部42b、频数分布创建部42c、分区频数分布创建部42r、透明度变化检测部42s。板图像创建部42a、hsv图像创建部42b和频数分布创建部42c，与运算部42a的情况同样，因此省略说明。
[0213]
分区频数分布创建部42r，对每个分区图像se1p～se8p，创建以色调和饱和度为变量的频数分布(以下，称为“分区频数分布”)。将分区图像se1p～se8p之中的任意一个，如前述那样称为关注分区图像时，分区频数分布创建部42r，基于属于关注分区图像的全部孔图
像13p的频数分布的平均频数分布，创建关注分区图像的分区频数分布。另外，已经实施过颜色判定处理时，也可以在属于关注分区图像的全部孔图像13p之中，例如基于只判定为紫色的孔图像13p(例如，基于第1颜色判定处理的第3判定工序s18(参照图11)中只判定为紫色的孔图像13p)的频数分布的平均频数分布，创建关注分区图像的分区频数分布。
[0214]
透明度变化检测部42s，计算与分区图像se1p～se8p对应的分区频数分布间的相似度。透明度变化检测部42s，将作为溶剂对照分区的分区se1所对应的分区图像se1p的透明度作为透明度变化检测用的基准频数分布(透明度变化检测用的基准统计信息)，检测其他分区图像se2p～se8p的透明度的变化。具体来说，就是计算分区图像se1p的分区频数分布与其他分区图像se2p～se8p的分区频数分布的相似度。该相似度对应其他分区se2～se8的透明度相对于分区se1的透明度的变化。图20是表示分区图像se1p～se8p间的分区频数分布的相似度的图表，(a)和(b)中显示不同的示例。图20的(a)表示透明度变化大时的例子，图20的(b)表示实质上未确认到透明度变化的变化程度小时的例子。图表的se1p～se8p分别表示分区图像se1p～se8p。在图20中，se1p的行和列，是相对于分区图像se1p的透明度的其他分区图像se2p～s8p以及与分区图像se1p本身的相似度(透明度变化)。
[0215]
接下来，说明使用透明度变化检测处理的评价板10的评价方法(受试物的评价方法)的一例。图21是使用透明度变化检测处理的评价方法的流程图的一例。实施使用透明度变化检测处理的评价方法时，运算部42作为运算部42e发挥功能。在此，说明由观察装置30的摄像部33取得的图像被输入部41接收的工序(输入工序)后的工序。
[0216]
与图11所示的情况同样，实施板图像创建工序s11、hsv图像创建工序s12和频数分布创建工序s13。
[0217]
频数分布创建工序s13之后，图像处理装置40，通过分区频数分布创建部42r，对每个分区图像se1p～se8p，创建分区频数分布(分区频数分布创建工序s41)。在本实施方式中，将分区图像se1p～se8p之中的任意一个，如前述这样称为关注分区图像时，在分区频数分布工序s41中，基于属于关注分区图像的全部孔13的频数分布的平均频数分布，创建关注分区图像的分区频数分布。如前述，在已经实施过颜色判定处理时，也可以基于属于关注分区图像的全部孔图像13p之中例如只判定为紫色的孔图像13p的频数分布的平均频数分布，创建关注分区图像的分区频数分布。
[0218]
分区频数分布创建工序s41之后，图像处理装置40，通过透明度变化检测部42s，检测其他分区图像se2p～se8p相对于分区图像se1p(溶剂对照区域)的透明度变化(透明度变化检测工序s42)。在本实施方式中，计算分区图像se1p的分区频数分布与其他分区图像se2p～se8p的分区频数分布的相似度。该相似度对应其他分区se2～se8的透明度相对于分区se1的透明度的变化。
[0219]
透明度变化检测工序s42之后，图像处理装置40，通过输出部43，将透明度变化检测工序s42的检测结果，以提示给评价者的方式输出即可(输出工序)。
[0220]
[异物检测处理]
[0221]
将进行异物检测处理时的运算部42称为运算部42f，说明运算部42f。图22是运算部42f的功能框图。图23是用于说明运算部42f进行的异物检测处理的图。运算部42f具有板图像创建部42a、孔图像特定部42k、平滑化部42l、第1异物检测部42t、外部区域设定部42o、第2异物检测部42u、检测结果创建部42v。板图像创建部42a、孔图像特定部42k和平滑化部
42l与运算部42d的情况同样，因此省略说明。由孔图像特定部42k特定的孔图像13p的一例显示在图23的(a)中。图23的(b)是以平滑化部42l对于图23的(a)的孔图像13p进行平滑化处理之后的图。
[0222]
第1异物检测部42t，对于由平滑化部42l进行过平滑化处理的孔图像13p，使用第1亮度值检测异物。通常，异物区域中，异物的内侧明亮(亮度高)，异物的周围暗(亮度低)。因此，内侧亮而周围暗的区域为候选异物。因此，设定异物检测用的第1亮度阈值，对于孔图像13p进行二值化处理。在经过二值化处理的图像中，被小于第1亮度阈值的亮度值包围，其内侧为第1亮度值以上的区域，作为候选异物检测。第1亮度阈值为孔图像13p的内部区域(参照图2)的亮度值即可。作为该内部区域的亮度值(第1亮度值)，由评价者基于孔图像13p指定即可。内部区域，例如可以事先由内部区域设定部42m设定。第1亮度值也可以由第1异物检测部42t自动设定。由第1异物检测部42t自动设定第1亮度值时，例如对于孔图像13p的中心，基于一定的范围内的平均亮度值而使之自动设定即可。通常，异物呈圆形，具有一定的尺寸。因此，在本实施方式中，候选异物之中，进一步满足设定为异物的形状(圆形度)和尺寸的候选作为异物检测。从候选异物中基于上述形状和尺寸的异物检测，例如，可以观看提示候选异物的图像而由评价者实施，也可以基于预先设定的形状(圆形度)和尺寸，由第1异物检测部42t判断。图23的(c)是表示来自第1异物检测部42t的异物检测结果的一例的图。
[0223]
外部区域设定部42o，与运算部42d(参照图16)的外部区域设定部42o同样，设定孔图像13p的外部区域oa。外部区域设定部42o，例如，如图23的(d)的点划线所示，在外部区域oa设定roi即可。
[0224]
第2异物检测部42u，使用第2亮度值检测异物。第2亮度值，以可以根据外部区域oa的明度检测异物的方式设定。作为第2亮度值，评价者基于外部区域oa的明度(亮度)指定即可。第2亮度值，可以由第2异物检测部42u自动设定。第2异物检测部42u自动设定第2亮度值时，例如设定对于外部区域oa的平均亮度乘以一定值的值即可。因为外部区域oa比孔图像13p的中央部附近暗(亮度低)，所以，通常第1亮度阈值与第2亮度阈值不同。
[0225]
第2异物检测部42u，使用上述第2亮度阈值对于外部区域oa进行二值化处理，在经过二值化处理的图像中，将比第2亮度值的亮度值大或小的区域作为候选异物检测。在本实施方式中，此外，第2异物检测部42u，在检测到的候选异物之中，将进一步满足设定为异物的形状(圆形度)和尺寸的候选作为异物检测。从候选异物中基于上述形状和尺寸的异物的检测，例如，可以观看提示候选异物的图像而由评价者实施，也可以基于预先设定的形状(圆形度)和尺寸由第2异物检测部42u判断。形状和尺寸，可以与第1异物检测部42t的形状和尺寸相同，也可以不同。图23的(e)是表示来自第2异物检测部42u的异物检测结果的一例的图。
[0226]
检测结果创建部42v，综合第1异物检测部42t和第2异物检测部42u的结果，创建表示异物检测结果的数据。检测结果创建部42v，例如，能够创建第1异物检测部42t和第2异物检测部42u检测到的异物区域经过增强处理(例如上色处理)的数据。
[0227]
运算部42，将异物检测结果创建部42v所创建的检测结果，作为异物的最终检测结果输出到输出部43。图23的(f)是表示来自运算部42的最终检测结果的一例的图。
[0228]
接着，说明使用异物检测处理的评价板10的评价方法(受试物的评价方法)的一例。图24是使用了异物检测处理的评价方法的流程图的一例。实施使用了异物检测处理的
评价方法时，运算部42作为运算部42f发挥功能。在此，说明由观察装置30的摄像部33取得的图像被输入部41接收的工序(输入工序)后的工序。
[0229]
与图18所示的情况(集落检测处理的情况)同样，实施板图像创建工序s11、孔图像特定工序s31和平滑化工序s32。
[0230]
平滑化工序s32之后，图像处理装置40，通过第1异物检测部42t，检测孔图像13p内有无异物(第1异物检测工序s51)。在本实施方式中，如第1异物检测部42t相关说明，基于第1亮度阈值、形状(圆形度)和尺寸来检测异物。
[0231]
第1异物检测工序s51之后，图像处理装置40，与图18所示的外部区域设定工序s35的情况同样，通过外部区域设定部42o，设定孔图像13p的外部区域oa(外部区域设定工序s52)。在本实施方式中，在外部区域oa设定roi。roi的设定区域，可以由评价者指定，也可以基于板11的数据由外部区域设定部42o自动设定。
[0232]
外部区域设定工序s52之后，图像处理装置40，通过第2异物检测部42u，检测孔图像13p内有无异物(第2异物检测工序s53)。在本实施方式中，如第2异物检测部42u相关说明，基于第2亮度阈值、形状(圆形度)和尺寸来检测异物。
[0233]
第2异物检测工序s53之后，图像处理装置40，通过检测结果创建部42v，综合第1异物检测工序s51和第2异物检测工序s53的结果，创建异物检测的最终结果(检测结果创建工序s54)。在本实施方式中，对于第1异物检测工序s51和第2异物检测工序s53所检测到的异物区域，进行上色等增强异物区域的处理。
[0234]
检测结果创建工序s54之后，图像处理装置40，通过输出部43，将检测结果创建工序s54中创建的检测结果，以提示给评价者的方式输出即可(输出工序)。
[0235]
接下来，具体说明使用板11的ames试验的一例的步骤。
[0236]
(第1a工序)
[0237]
将使用的测试体(具有氨基酸营养缺陷型突变的细菌，例如，沙门氏菌：ta100株、ta98株、ta1535株、ta1537株，大肠杆菌：wp2uvra株等)，接种于60ml的营养肉汤培养基，以37℃振荡培养9～10小时而使之增殖。
[0238]
(第2a工序)
[0239]
量取所需量的受试物(例如是想要评价毒性的化合物)。
[0240]
(第3a工序)
[0241]
使第2a工序中准备的受试物溶解或悬浊于合适的介质中，使用介质将其阶段稀释，制备受试物液的浓度系列。例如，以不同的6种浓度评价同一受试物时，制备浓度不同的6个受试物液。
[0242]
(第4a工序)
[0243]
制备已知显示预定毒性的阳性对照化合物的溶液。
[0244]
(第5a工序)
[0245]
将受试物液的制备所使用的介质、受试物液的浓度系列、阳性对照化合物的溶液(以上统称为受试物液等)各10μl，加入24孔板(具有24个孔的板)的各个孔中。
[0246]
(第6a工序)
[0247]
将0.175～0.7ml的测试体的培养液(通常高于1
×
109细胞/ml的浓度)，和6.83～6.3ml的培养基(添加有碳源且氨基酸缺乏的基本培养基)混合。将混合物称为代谢活化非
存在条件的制备菌液。
[0248]
(第7a工序)
[0249]
在加入有受试物液等10μl的24孔板中，添加第6a工序中准备的代谢活化非存在条件的制备菌液240μl。
[0250]
(第8a工序)
[0251]
将加入了第7a工序的混合液的24孔板，以37℃、250rpm振荡90分钟(预培养)。
[0252]
(第9a工序)
[0253]
在预培养完成后的24孔板的各孔(250μl)中，添加指示培养基(含ph指示剂和碳源，氨基酸缺乏的基本培养基)2.6ml。
[0254]
(第10a工序)
[0255]
将第9a工序的混合液各50μl，以对应分区se1～se8的方式，移至作为384孔板的板11的8个分区se1～se8分别具有的48孔(1个分区量)。同样对于合计3张以上的384孔板(板11)播种。
[0256]
(第11a工序)
[0257]
将384孔板(板11)在37℃下培养48小时。由此，能够得到评价板10。
[0258]
在ames试验中，在第11a工序之后，实施以下的第12a工序至第14a工序。在本实施方式中，第12a工序以后，以利用上述评价系统20说明的评价方法实施。
[0259]
(第12a工序)
[0260]
观察培养完成的板11，即评价板10的各孔13的颜色变化、有无集落、有无异物、透明度变化，对存在颜色变化、集落、异物的孔数进行计数，并且记录在有透明度变化的分区中。
[0261]
(第13a工序)
[0262]
组合有无异物和透明度变化的结果，判定有无细胞毒性。
[0263]
(第14a工序)
[0264]
组合颜色变化和有无集落的结果，判定有无遗传毒性。
[0265]
第13a工序和第14a工序的顺序没有限定。
[0266]
检测在生物体内各种酶的作用下经代谢后而显示毒性的受试物时，在第6a工序中，制备在动物肝脏的提取物中添加有辅酶的混液(s9混液)，将0.175～0.7ml的测试体培养液、5.78～5.25ml的培养基、1.05ml的s9混液进行混合。混合物称为代谢活化存在条件的制备菌液。其后，使用代谢活化存在条件的制备菌液，代替代谢活化非存在条件的制备菌液，实施第7a工序以后的工序。
[0267]
接下来，说明本实施方式中说明的评价系统20、图像处理装置40和评价方法的作用效果。
[0268]
对评价板10进行评价时，对评价板10使用观察装置30，拍摄评价板10(拍摄工序)。图像处理装置40基于拍摄工序中得到的评价板10的图像，形成板图像p1。
[0269]
图像处理装置40，使用板图像p1而进行颜色判定处理，据此判定孔图像13p的颜色。由此，可判定孔图像13p所对应的孔13的颜色。在本实施方式中，受试物对于评价对象14所包含的细胞具有遗传毒性时，作为阳性结果，指示剂的颜色从紫色变成黄色。因此，通过上述颜色判定处理，可以评价受试物的遗传毒性。
[0270]
在本实施方式所说明的颜色判定处理中，使用按每个孔图像13p创建的以色调和饱和度为变量的频数分布来判定颜色。因此，例如在通过目视观察难以判定颜色差异的情况下，也能够可靠地判定颜色。因此，能够客观且高精度地判定颜色。
[0271]
在第1颜色判定处理中，遵循图11所示的第1颜色判定处理的流程图，进行3次判定。这种情况下，如图8～图10所示，随着反复判定，能够将孔图像13p的颜色(即，孔13的颜色)更明确地判定为紫色或黄色。
[0272]
图10和图13是以前述方式对于相同的板图像p1，进行第1和第2颜色判定处理的结果。根据图10和图13，第1颜色判定处理，能够更明确地判定孔图像13p的颜色(即，孔13的颜色)为紫色或黄色。
[0273]
图像处理装置40，使用板图像p1进行集落检测处理，据此判定孔13内有无集落。在本实施方式中，受试物对于评价对象14所包含的细胞具有遗传毒性时，存在发生集落的可能性。即，检测到集落时相当于阳性结果。因此，通过上述集落检测处理，可以评价受试物的遗传毒性。
[0274]
在本实施方式中，将孔图像13p分为内部区域ia和外部区域oa，分别在各区域检测集落。因为内部区域ia和外部区域oa明度不同，所以通过在内部区域ia和外部区域oa各自的区域检测集落，可以更确实地检测集落。
[0275]
图像处理装置40，可以进行颜色判定处理，并且可以进行集落检测处理。这种情况下，如果颜色判定处理或集落检测处理任何一项呈阳性，则评价为阳性孔，从而可以更确实地评价受试物的遗传毒性。集落检测时，使用在溶剂对照分区即分区se1所对应的分区图像se1p中检测到的集落(或候选集落)，检测分区图像se2p～se8p中的集落的形态下，可以更准确地检测集落。已经实施过颜色判定处理时，在分区图像se1p中，关于由颜色判定而判定为紫色的孔图像13p，因为实际上检测不到集落，所以分区图像se1p通过颜色判定而判定为紫色的孔图像13p所检测到的集落，可视为检测误差。因此，通过检测比分区图像se1p中检测到的集落更大的集落，容易准确检测应检测的实际集落。
[0276]
使用图像处理装置40对于相同的评价板10进行颜色判定处理，并且进行集落检测处理时，后面进行的处理适宜使用先前进行的处理中使用的数据即可。例如，在集落检测处理之前进行颜色判定处理时，也可以在集落检测处理中使用颜色判定处理中创建的板图像p1。这种情况下，在图16所示的运算部42d，不需要板图像创建部42a。同样，在使用图18所示的集落检测处理的评价方法中，能够省略板图像创建工序s11。关于在颜色判定处理之前实施集落检测处理的情况也同样。颜色判定处理和集落检测处理的顺序没有限定。
[0277]
图像处理装置40，通过使用板图像p1进行透明度检测处理，检测分区图像se1p～se8p的透明度变化。由此，检测分区se1～se8的透明度变化。在本实施方式中，受试物对于评价对象14所包含的细胞具有细胞毒性时，则细胞死亡等，由此导致孔13的透明度(具体来说，就是评价对象14的透明度)发生变化。因此，通过上述透明度变化检测处理，可以评价受试物的细胞毒性。
[0278]
培养中受试物析出时，孔13的透明度(具体来说，就是评价对象14的透明度)也发生变化。因此，通过上述透明度变化检测处理，也可以评价受试物有无析出。
[0279]
在本实施方式所说明的透明度变化检测处理中，使用对每个孔图像13p创建的以色调和饱和度为变量的频数分布来判定透明度变化。因此，例如通过目视观察难以判定透
明度的差异时，也能够确实地判定透明度的变化。因此，能够客观且高精度检测透明度变化。
[0280]
在本实施方式中，基于相同板图像p1中的分区图像se1p(溶剂对照区域)相对的分区频数分布与其他分区图像se2p～se8p的分区频数分布的相似度，计算透明度变化。因此，能够减小试验条件等的影响，因此可以更准确地检测透明度。
[0281]
图像处理装置40，通过使用板图像p1进行异物检测处理，判定孔13内有无异物。在本实施方式中，受试物对于评价对象14所包含的细胞具有细胞毒性时，则细胞死亡面导致异物发生。因此，通过上述异物检测处理，可以评价受试物的细胞毒性。
[0282]
在本实施方式中，对于孔图像13p进行一次异物检测之后，设定外部区域oa，使用外部区域oa对应的亮度阈值(第2亮度阈值)再次检测外部区域oa的异物。因为外部区域oa通常较暗，所以难以检测出异物。因此，通过使用外部区域oa对应的亮度阈值(第2亮度阈值)，可以更确实地检测异物。
[0283]
图像处理装置40，可以进行透明度变化检测处理，并且可以进行异物检测处理。这种情况下，经由透明度变化检测处理而检测到透明度变化时或通过异物检测处理而检测到异物时的任何一种情况下，都评价为存在细胞毒性，从而可以更确实地评价受试物的细胞毒性。
[0284]
作为细胞毒性评价的透明度检测处理和异物检测处理，例如，在用于准确进行遗传毒性评价的受试物浓度的设定中被利用。例如，通过透明度检测处理，分区se1～se8之中阳性结果的分区的受试物的浓度，不适合遗传毒性评价。因此，至少实施一次透明度检测处理或异物检测处理，在确定细胞毒性评价结果是阴性的浓度范围后，进行遗传毒性评价即可。
[0285]
如上述，透明度检测处理或异物检测处理，例如，为了在遗传毒性评价之前评价受试物的细胞毒性而进行。因此，也存在实施透明度检测处理或异物检测处理时的评价板10与进行用于遗传毒性评价的颜色判定处理和集落检测处理的至少一方时的评价板10的条件不同的(例如，受试物的浓度设定不同)情况。
[0286]
然而，例如，若进行透明度检测处理或异物检测处理时的评价板10与进行颜色判定处理和集落检测处理的至少一方时的评价板10的条件相同，透明度检测处理或异物检测处理时创建的数据等，也可以适宜在颜色判定处理和集落检测处理中使用。
[0287]
例如，在透明度检测处理之后，进行颜色判定处理时，截至频数分布创建工序s13为止的工序都通用，因此在颜色判定处理时，使用透明度检测处理中由频数分布创建部42c(频数分布创建工序s13)创建的每个孔图像13p的频数分布，进行颜色判定处理即可。或者，在异物检测处理之后，进行集落检测处理时，因为截至孔图像特定工序s31都通用，所以在集落检测处理时，使用异物检测处理中由孔图像特定部42k(孔图像特定工序s31)特定的孔图像13p，进行集落检测处理即可。在运算部42d进行集落检测处理时的处理流程中或运算部42f进行异物检测处理时的处理流程中，运算部42d和运算部42f也可以不必具有上述这样被省略的工序相应的功能。
[0288]
例如，图1所示，在判定384个孔13的颜色时，因为评价者的负担大，评价者的判断力也容易发生降低，所以客观性和精度有下降的倾向。相对于此，使用图像处理装置40的评价方法，因为利用图像处理装置40进行颜色判定，所以，例如与评价者通过目视进行的情况
相比，能够更客观且以更良好的精度判定颜色。在有无集落的检测、透明度变化的检测和异物的检测中也同样。
[0289]
接下来，说明将本实施方式所说明的评价系统20和评价方法应用于ames试验的实验例1。以下，除非另行说明，否则对于与至此为止说明过的要素同样的要素，附加相同的符号，并省略重复说明。
[0290]
在实验例1中，作为板11，使用perkinelmer社制的view－plate－384。view－plate－384，如图1所示，具有384个孔13。在本实验例1，也与图1同样，虚拟设定分区se1～se8。
[0291]
在本实验例1中，使用含指示剂、培养液等的xenometrix公司制的ames试剂盒(“ames mpf
tm penta i microplate format mutagenicity assay”)。
[0292]
准备试验条件不同的9种评价板10。在本实验例1中使用的评价板10，是按照上述ames试剂盒的用户指南，进行细胞、受试物等向孔13内的投用、培养等，从而可以进行毒性检查的状态的评价板10。试验条件不同的9种评价板10，在本实验例1中称为评价板10＿1～10＿9。
[0293]
评价板10＿1～10＿9的试验条件如图25所示的图表显示。在图中，条件no.1～no.9表示评价板10＿1～10＿9。在“有无代谢活化”一栏中，“无”意思是评价对象14不含s9mix的情况，“有”表示评价对象14含s9mix的情况。“浓度(ng/ml)”一栏，表示分区se2～se7内的孔13所保持的评价对象14(具体来说，就是评价对象14b～14g)内的受试物的浓度。相对于no.1～no.9(评价板10＿1～10＿9)，“浓度(ng/ml)”一栏所示的6个浓度是评价对象14b～14g中所含的受试物的浓度。评价对象14b～14g的受试物的浓度，随着从评价对象14b朝向评价对象14g浓度变高。“阳性对照化合物/溶剂(浓度(ng/ml))”中的“浓度”，表示分区se8(阳性对照分区)中的阳性对照化合物的浓度。受试物溶液和阳性对照液的溶剂，如图所示，使用dmso。溶剂对照液也是dmso。
[0294]
在本实验例1中，分别准备n张评价板10＿1～10＿9。n对于评价板10＿1、10＿3、10＿4、10＿7～10＿9而言是3，对其余而言是1。
[0295]
在本实验例1中，首先，利用观察装置30进行拍摄评价板10＿1～10＿9的拍摄工序。其后，利用图像处理装置40，进行颜色判定处理、集落检测处理、透明度变化检测处理和异物检测处理。另外，也通过对评价板10＿1～10＿9的目视进行颜色判定。
[0296]
说明本实验例1的拍摄工序。在本实验例1中，进行2个拍摄工序(以下，称为“第1拍摄工序”和“第2拍摄工序”)。
[0297]
第1拍摄工序，对于所有评价板10＿1～10＿9进行。因为对于评价板10＿1～10＿9进行的第1拍摄工序相同，所以，以对于评价板10＿1的第1拍摄工序为代表进行说明。
[0298]
在第1拍摄工序中，使用图3所示的观察装置30。观察装置30具有的照明装置32使用输出可见光的led照明。摄像部33的聚光部和摄像器33a，分别使用透镜和线阵传感器(ccd照相机)。
[0299]
在本实验例1中，由于摄像器33a的拍摄范围小于评价板10＿1的大小，所以一边由载物台31将评价板10＿1朝一个方向搬送，一边使用摄像器33a(和与之对应的聚光部33b)，拍摄评价板10＿1的一半区域。其后，使评价板在与搬送方向正交的方向上错开一半后，再次一边使评价板10＿1沿一个方向移动，一边拍摄评价板10＿1的剩余区域。
[0300]
在本实验例1中，对于n张评价板10＿1进行上述第1拍摄工序。
[0301]
第2拍摄工序同样对于评价板10＿1和10＿4进行。对于评价板10＿1和10＿4的第2拍摄工序相同，因此，以对于评价板10＿1的第2拍摄工序为代表进行说明。
[0302]
在第2拍摄工序中，在图3所示的观察装置30中，使照明装置32和摄像部33对于评价板10＿1的位置反转，以此状态(即，在图3中，将摄像部33配置在板上，将照明装置32配置在载物台31的下侧的状态)，通过与第1拍摄工序同样的方式，也进行评价板10＿1的拍摄。
[0303]
在本实验例1中，对于n张评价板10＿1进行上述第2拍摄工序。
[0304]
接着，在本实验例1中，对于由拍摄工序取得的图像，使用图像处理装置40实施颜色判定处理。在颜色判定处理中，使用第1拍摄工序中取得的图像。另外，对于评价板10＿1进行异物检测处理。此外，对于评价板10＿4进行集落检测处理。集落检测处理和异物检测处理，如后述，对于第1拍摄工序中取得的图像实施，并且对于第2拍摄工序中取得的图像也实施。
[0305]
[颜色判定处理]
[0306]
颜色判定处理，对于全部评价板10＿1～10＿9进行。对于评价板10＿1～10＿9进行颜色判定的方法相同。因此，以对于评价板10＿1进行的颜色判定处理为代表进行说明。
[0307]
颜色判定处理，使用图像处理装置40，遵循图11所示的颜色判定处理(第1颜色判定处理)的流程图进行。在第1判定工序s14中，将计算出的相似度分布，作为图8所示这样的图而提供给评价者，评价者设定区分紫色和黄色的阈值。在第2判定工序s16和第3判定工序s18中也同样设定阈值。
[0308]
颜色判定处理的结果，如图26～图29所示的图表显示。图26～图29中，除了作为颜色判定结果的检测结果以外，还显示彩色照相机图像、hsv图像和目视判定结果。
[0309]
图26～图29中的no.1～no.9，对应评价板10＿1～10＿9。图26的no.1的结果是n张评价板10＿1之中的一个结果。关于图26～图29的no.2～no.9的结果也同样。
[0310]
图26～图29中的“彩色照相机图像”，是由图11所示的板图像创建工序s11创建的板图像p1。图26～图29中的“hsv图像”，是由图11所示的hsv图像创建工序s12创建的hsv图像p2。图26～图29中的“目视判定结果”，是将评价者对评价板10＿1～10＿9目视判定的结果，输入图像处理装置40，并将按照紫色和黄色手动分类的结果进行图像显示的结果。图26～图29中的“图像处理结果”，是表示图像处理装置40的颜色判定处理(第1颜色判定处理)的结果的图。
[0311]
图26～图29所示的附加在各图像周围的“a～p”和“1～24”，与图1的“a～p”和“1～24”对应。
[0312]
在目视判定结果和图像处理结果的图像中，浅色的孔图像13p表示黄色，深色的孔图像13p表示紫色。另外，其中间色的孔图像13p表示中间色。在评价板10＿1～10＿9的目视判定结果中，带有“m”的孔图像13p，表示紫色和黄色的中间色。
[0313]
由图26～图29所示的结果能够理解，通过使用了图像处理装置40的颜色判定处理，能够得到实质上与目视判定同样的结果。实际上，对于评价板10＿1、10＿2、10＿5、10＿6使用图像处理装置40的检测结果，与目视判定结果不同的比例(以下，称为“差异率”)，分别为0.0％、0.2％、0.1％和0.0％。上述评价板10＿1的差异率，是在同一条件的3个评价板10＿1的来自图像处理装置40的检测结果中，用不同于目视判定结果的孔13的数目合计除
以全部孔13的数目(384
×
n)得到的值(％)，评价板10＿2、10＿5、10＿6的差异率也是以同样的方法计算得到的值。
[0314]
[集落检测处理]
[0315]
集落检测处理对于评价板10＿4进行。如前述，对于分别由第1拍摄工序和第2拍摄工序取得的图像，实施集落检测处理。
[0316]
首先，说明使用第1拍摄工序中取得的图像的集落检测处理。
[0317]
集落检测处理，使用图像处理装置40，遵循图18所示的集落检测处理的流程图进行。在孔图像特定工序s31中，拍摄孔13中什么都没放入状态的板11作为遮罩图像，将对应的孔区域设定为roi。此外，在第1集落检测工序s34和第2集落检测工序s36中，由评价者指定各个工序中使用的亮度阈值。同样，评价者也指定用于集落检测的形状和尺寸。
[0318]
集落检测工序的结果，如图30所示的图表显示。图30中的no.1～no.7分别摘录了评价板10＿4所对应的板图像p1内的多个孔图像13p(图30中的“原图像”)的一部分，表示各自对应的集落检测结果。在检测结果中，由点划线包围的区域是被检测为集落的区域。no.2如原图像所示表示没有发生集落的孔图像13p。这种情况下，图像处理装置40进行的集落检测处理中未检测到集落。因此，省略对no.2的检测结果的表述。
[0319]
若比较图30的原图像与检测结果，则可知通过图像处理装置40的集落检测处理，恰当地检测出集落。此外还可理解到，在使用了图像处理装置40的集落检测处理中，也能够确实地检测出孔图像13p中难以判别的小集落。如上述no.2这样，在孔图像13p中不存在集落时，在图像处理装置40的集落检测处理中也未检测出集落。即，也能够理解为没有发生误判。
[0320]
接下来，说明使用第2拍摄工序中取得的图像的集落检测处理。这种情况下，使用在第2拍摄工序中取得的评价板10＿4的图像，代替第1拍摄工序中取得的，除这一点以外，均以使用第1拍摄工序中取得的图像时同样的方式，检测集落。
[0321]
集落检测工序的结果，如图31所示的图表显示。图31中的no.1～no.7分别摘录了评价板10＿4所对应的板图像p1内的多个孔图像13p(图31中的“原图像”)的一部分，表示各自对应的集落检测结果。图31的孔图像13p，是与图30的孔图像13p的情况相同的孔13对应的图像。在检测结果中，由点划线包围的区域是被检测为集落的区域。省略no.2、no.3和no.5的检测结果的理由，与图30的no.2的情况同样。即，在原图像中，因为不存在集落，所以在使用图像处理装置40的结果中也未检测出集落。
[0322]
若比较图31中的原图像与检测结果，则可知通过图像处理装置40的集落检测处理，恰当地检测出一部分集落。
[0323]
如前述，图30和图31是与相同的孔13所对应的孔图像13p相对的结果。若比较图30和图31的结果，则可理解为，通过第1拍摄工序取得10＿4的图像时(即，从孔13的底部13a侧拍摄10＿4的情况)，相比通过第2拍摄工序取得10＿4的图像时(即，从孔13的底部13a相反侧拍摄10＿4的情况)，可更明确地检测集落(例如，参照图30和图31中的no.3、5的结果)。这被认为是由于集落通常会沉到孔13的底部13a侧。
[0324]
[异物检测处理]
[0325]
异物检测处理对于评价板10＿1进行。在此，利用集落检测处理中说明的分别由第1拍摄工序和第2拍摄工序取得的图像进行异物检测。
[0326]
首先，说明使用第1拍摄工序中取得的图像的异物检测。
[0327]
在异物检测处理中，使用图像处理装置40，遵循图24所示的异物检测处理的流程图进行。在孔图像特定工序s31中，与集落检测处理的情况同样，拍摄孔13中什么都没放入状态的板11作为遮罩图像，将对应的孔区域设定为roi。在异物检测处理中，在第1异物检测工序s51和第2异物检测工序s53中，由评价者指定第1亮度阈值和第2亮度阈值。同样，评价者也指定用于异物检测的形状和尺寸。
[0328]
异物检测工序的结果，如图32所示的图表显示。图32中的no.1～no.7，分别摘录了评价板10＿1所对应的板图像p1内的多个孔图像13p(图32中的“原图像”)的一部分，表示与之对应的检测结果。在检测结果中，由点划线包围的区域是检测为异物的区域。
[0329]
若比较图32中的原图像与检测结果，则可知通过使用图像处理装置40的异物检测处理，恰当地检测异出物。此外还可理解，在使用图像处理装置40的异物检测处理中，也可以确实地检测出原图像中难以判别的小的异物。
[0330]
接着，说明使用了第2拍摄工序中取得的图像的异物检测处理。这种情况下，使用第2拍摄工序中取得的评价板10＿1的图像代替第1拍摄工序中取得的，除这一点以外，均与使用第1拍摄工序中取得的图像的情况同样地检测异物。
[0331]
异物检测工序的结果，如图33所示的图表显示。图33中的no.1～no.7，分别摘录了与评价板10＿1对应的板图像p1内的多个孔图像13p(图33中的“原图像”)的一部分，表示与之对应的检测结果。图33的孔图像13p是与图32的孔图像13p的情况相同的孔13相对的图像。在检测结果中，由点划线包围的区域是检测为异物的区域。省略no.1和no.2的检测结果的理由，与图30的no.2的情况同样。即，在原图像中，因为不存在异物，所以使用了图像处理装置40的结果也未检测到异物。
[0332]
若比较图33的原图像与检测结果，则可知通过图像处理装置40的异物检测处理，一部分异物得到恰当地异物检测。
[0333]
如前述，图32和图33是与相同的孔13所对应的孔图像13p相对的结果。若比较图32和图33的结果，则可理解为，由第1拍摄工序取得评价板10＿1的图像时(即，从孔13的底部13a侧拍摄评价板10＿1的情况)，相比由第2拍摄工序取得评价板10＿1的图像时(即，从孔13的底部13a相反侧拍摄评价板10＿1的情况)，可更明确地检测异物(例如，参照图32和图33的no.1、2的结果)。这被认为是由于异物通常沉在孔13的底部13a侧。
[0334]
接下来，说明上述实施方式的变形例。
[0335]
(变形例1)
[0336]
在变形例1中，在拍摄上述评价板10的图像时的照射工序中，对评价板将波长范围430nm～460nm和波长范围520nm～620nm的至少一个波长范围内的波长的光l照射在评价板上。
[0337]
例如，作为图3所示的照明装置32，能够采用led照明来实施上述照射工序，该led照明包括输出波长范围430nm～460nm内的波长的光的led和输出波长范围520nm～620nm波长的光的led的至少一方。或者，上述照射工序，也可以使从照明装置32输出的光，经由选择性地通过输出波长范围430nm～460nm内的波长的光的led和输出波长范围520nm～620nm内的波长的光的led的至少一方的波长滤波器，照射到评价板10上。这样的波长滤波器可以组装到照明装置32内。
[0338]
在上述照射工序中，也可以向评价板10照射光l，其具有从波长范围430nm～460nm中选择的第1波长和从波长范围520nm～620nm选择的第2波长的光，即第1波长的光和第2波长的光的混合光。作为第1波长和第2波长组合的一例，第1波长为440nm，第2波长为590nm。
[0339]
除了所照射的光l的波长具有上述条件这一点以外，均与上述实施方式同样。因此，变形例1具有与实施方式同样的作用效果。
[0340]
通过使用上述波长范围内的光l，由于评价对象14的状态等不同的孔13间(例如，分区se1～se8间)的亮度差变大，所以，例如颜色的差异更明显。其结果是，能够更准确地实施安全性评价。
[0341]
例如，孔13的颜色(评价对象14的颜色)因ph指示剂的颜色的变化等而变化时，如果在评价板10中，也有颜色接近由波长范围430nm～460nm内的波长表示的颜色的孔13，则也存在颜色接近由波长范围520nm～620nm内的波长表示的颜色的孔13。光l具有上述第1波长和第2波长时，对于波长范围430nm～460nm侧的颜色和波长范围520nm～620nm侧的颜色双方都容易确保孔13的亮度。这种情况下，评价对象14的状态等不同的孔13间(例如，分区se1～se8间)的颜色的差异更明显。其结果是，能够更准确地实施安全性评价。
[0342]
以通过向评价板照射波长范围430nm～460nm和波长范围520nm～620nm的至少一个波长范围内的波长的光l，分区se1～se8间的颜色差异变得更明显的相关内容的验证实验，作为实验例2进行说明。
[0343]
在实验例2中，作为颜色判定状态的评价板10，即上述ames试验的步骤(第1a工序至第14a工序)之中第11a工序完成而得到的评价板10的模型，按以下方式准备5个试样no.1～试样no.5的评价板。试样no.1～试样no.5，模拟实际的ames试验的评价板中会发生的色调范围。为了便于说明，实验例2中准备的试样no.1～试样no.5的评价板也称为评价板10。
[0344]
(试样no.1)
[0345]
在图1所示的板11所具有的384个的孔13中注入溴甲酚紫(ph指示剂)。溴甲酚紫是能够从ph5.2(黄色)变成ph6.8(紫色)的ph指示剂。板11的长边长度为127mm，短边长度为87mm。在分区se1～分区se8再添加不同量的盐酸，以成为模拟评价板10的颜色评价中评价结果的一例的状态(颜色状态)的方式，来调整分区se1～分区se8的孔13的颜色(ph指示剂)的颜色。试样no.1的分区se1～分区se8的盐酸添加量、ph值和目视时的颜色判定如表1所示。表1中的中间色是紫色与黄色之间的颜色。颜色的判定方式为，分区se1(阴性对照分区)的孔13的颜色视为紫色，以及分区se8(阳性对照分区)的孔13的颜色视为黄色，以分区se1的孔13的颜色和分区se8的孔13的颜色为基准进行判定。
[0346]
【表1】
[0347]
[0348]
(试样no.2～试样no.5)
[0349]
试样no.2～试样no.5，以成为模拟在评价板10的颜色评价中互不相同的评价结果的状态(颜色状态)的方式，通过添加盐酸来调整试样no.2～试样no.5各自分区se1～分区se8的孔13的颜色(ph指示剂)的颜色。试样no.2～no.5的分区se1～分区se8的盐酸添加量、ph值和目视时的颜色判定，如表2、表3、表4和表5所示。表2和表3中的中间色是紫色与黄色之间的颜色。在试样no.2～试样no.3的颜色判定中，与试样no.1的情况同样，在各试样no.2～no.3中，以分区se1的孔13的颜色和分区se8的孔13的颜色为基准。在试样no.4～试样no.5的颜色判定中，在各试样no.4～no.5中，分区se1(阴性对照分区)的孔13的颜色视为紫色，以分区se1的孔13的颜色为基准进行判定。
[0350]
【表2】
[0351][0352]
【表3】
[0353][0354]
【表4】
[0355][0356]
【表5】
[0357][0358]
其后，使用图34所示的包括照明装置321、和与照明装置321对置的摄像部331的观察装置，拍摄试样no.1的评价板10。具体来说，点亮照明装置321，一边将试样no.1的评价板10配置在照明装置321之上并搬送，一边以摄像部331拍摄评价板10。
[0359]
照明装置321是使用了led的面光源装置，是输出波长400～700nm的光l的面光源装置(kos21制的kdb－100)。摄像部331具有摄像器331a、和安装于摄像器331a的聚光部331b。摄像器331a是高光谱照相机(resonon制的pika―l)。摄像器331a的帧率是249.2hz，曝光时间为3.93ms。聚光部331b使用shneider社制的xenoplan1.4/23－0902(光圈：f5.6)。评价板10的搬送速度为22mm/s。
[0360]
图35是表示基于试样no.1的评价板10的摄像结果的分区光谱分布的图。图35中表示将摄像器331a(高光谱照相机)所得到的光谱，按各分区se1～分区se8平均的平均光谱。在图35中，横轴是波长，纵轴是亮度值。由“1”～“8”表示的浓度不同的线，表示与分区se1～分区se8对应的平均光谱的线，“1”～“8”分别与分区se1～分区se8对应。即，按分区se1、分区se2、
…
分区se8的顺序表示平均光谱的线的颜色变浅。
[0361]
除了将所拍摄的评价板10变更为试样no.2～试样no.5的评价板10这一点以外，均以试样no.1的评价板10的情况同样的方式，拍摄试样no.2～试样no.5的评价板10。
[0362]
图36是表示基于试样no.2的评价板10的摄像结果的分区光谱分布的图。图37是表示基于试样no.3的评价板10的摄像结果的分区光谱分布的图。图38是表示基于试样no.4的评价板10的摄像结果的分区光谱分布的图。图39是表示基于试样no.5的评价板10的摄像结果的分区光谱分布的图。图36～图39中的横轴、纵轴以及表示分区se1～分区se8所对应的平均光谱的线的表示方法与图35的情况一样。
[0363]
图40是表示各波长的分区间的亮度差的图。具体来说，在图35～图39各自的结果中，在各波长下，绘制分区间的亮度差之中最大值。表示图40所示的试样no.1～试样no.5结果的线的差异由深浅表示，线的颜色按试样no.4、试样no.5、试样no.2、试样no.3和试样no.1的顺序变深。
[0364]
如图40所示，波长范围430nm～460nm和波长范围520nm～620nm，分别在全部试样no.1～试样no.5中，分区间的亮度差分别变大。
[0365]
因此，通过对评价板将波长范围430nm～460nm和波长范围520nm～620nm的至少一个波长范围内的波长的光l照射于平价板，容易明确区别分区间的颜色的变化。其结果是，能够更准确地实施安全性评价。
[0366]
(变形例2)
[0367]
在拍摄变形例2的上述评价板10的图像时的照射工序中，对评价板将波长520nm以
chloride。例如，受试物也可以是浓度为62.5μg/ml以上的1-decanol，或浓度为667μg/ml以上的tert-butylhydroquinone。
[0381]
作为评价试样的具体例，可列举以下的第1评价试样～第4评价试样。
[0382]
(第1评价试样)
[0383]
是采用大肠杆菌wp2uvra株作为上述细胞，采用浓度为62.5μg/ml的1-decanol作为上述受试物的评价试样。
[0384]
(第2评价试样)
[0385]
是采用大肠杆菌wp2uvra株作为上述细胞，采用浓度为125μg/ml的1-decanol作为上述受试物的评价试样。
[0386]
(第3评价试样)
[0387]
是采用沙门氏菌ta100株作为上述细胞，采用浓度为667μg/ml的1-decanol作为上述受试物的评价试样。
[0388]
(第4评价试样)
[0389]
是采用沙门氏菌ta100株作为上述细胞，并采用浓度为2000μg/ml的1－decanol作为上述受试物的评价试样。
[0390]
在上述板判定方法中，评价试样的培养，例如以37℃进行48小时。
[0391]
在板判定方法中，为了对板恰当判定，优选注入评价试样的孔13的数目至少为12个，更优选为48个。
[0392]
说明上述板判定方法的具体步骤的一例。
[0393]
(第1b工序)
[0394]
作为使用的测试体，使用在板11的评价试样中所用的细胞，除这一点以外，实施与第2a工序同样的工序。具体来说，将评价试样用的细胞，接种于60ml的营养肉汤培养基，以37℃振荡培养9～10小时使之增殖。
[0395]
(第2b工序)
[0396]
作为使用的受试物，使用在板11的评价试样中所用的受试物，除这一点以外，实施与第1b工序同样的工序。具体来说，量取所需量的评价试样用的受试物。
[0397]
(第3b工序)
[0398]
制备受试物液，使第2b工序的受试物溶解或悬浊于合适的介质，并使受试物达到引起细胞毒性的浓度的25倍。
[0399]
(第4b工序)
[0400]
将第3b工序中得到的受试物液在24孔板的孔中各加入10μl。
[0401]
(第5b工序)
[0402]
与第6a工序同样，创建代谢活化非存在条件的制备菌液。具体来说，将0.175～0.7ml的细胞的培养液(通常高于1
×
109细胞/ml的浓度)、和6.83～6.3ml的培养基(添加有碳源且氨基酸缺乏的基本培养基)混合，创建代谢活化非存在条件的制备菌液。
[0403]
(第6b工序)
[0404]
在加入有受试物液等10μl的24孔板中，添加由第5b工序制成的代谢活化非存在条件的制备菌液240μl。
[0405]
(第7b工序)
[0406]
将加入有第6b工序中准备的混合液的24孔板，以37℃、250rpm振荡90分钟(预培养)。
[0407]
(第8b工序)
[0408]
在预培养完成后的24孔板的各孔(250μl)中，添加指示培养基(含ph指示剂和碳源，氨基酸缺乏的基本培养基)2.6ml。
[0409]
(第9b工序)
[0410]
将第8b工序中得到的混合液，移至384孔板(板11)的48孔(1个分区量)中各50μl。
[0411]
(第10b工序)
[0412]
以37℃培养384孔板(板11)48小时。
[0413]
(第11b工序)
[0414]
在培养完成的板11中，观察由第9b工序注入了混合液的48个孔13中有无异物，对存在异物的孔13的数目进行计数，确认是否存在至少1个孔13其中存在异物。
[0415]
实施上述板的判定方法，并评价为恰当的板11，可以保持异物直到经过上述一定时间后的上述计数时刻。因此，使用评价为恰当的板11，实施上述ames试验的评价方法时，通过在经过上述一定时间后的上述计数时刻对评价板10进行评价，能够准确地评价受试物对于细胞的毒性。
[0416]
接着，说明关于变形例3的实验例3～实验例8。在实验例3～实验例8中，以上述板判定方法评价以下6个板a～板h。板a～板h具有除了以下所示的材质和涂覆状态这两点以外都相同的结构，与图1所示的板11同样，具有384个孔。
[0417]
(板a)
[0418]
板a的材质是聚苯乙烯。板a对表面(包括孔13的内表面和底面)实施过tc(组织培养)处理。
[0419]
(板b)
[0420]
板b的材质是聚苯乙烯。板b未实施表面涂覆。即，板b是未实施过表面涂覆的聚苯乙烯制板。
[0421]
(板c)
[0422]
板c，具有玻璃板，在玻璃板上，接合有具有384个孔13的结构体而构成。上述结构体的材质是环状烯烃共聚物(coc)。因此，板c所具有的各孔13的底面的材质是玻璃，壁面的材质是coc。板c在孔13的底面涂有纤连蛋白。
[0423]
(板d)
[0424]
板d的材质是聚苯乙烯。板d在表面涂有poly－d－lysine。
[0425]
(板e)
[0426]
板e，具有玻璃板，在玻璃板上，接合有具有384个孔13的结构体而构成。上述结构体的材质是coc。因此，板e所具有的各孔13的底面的材质是玻璃，壁面的材质是coc。板e未实施表面涂覆。
[0427]
(板f)
[0428]
板f的材质是环烯烃聚合物。板f未实施表面涂覆。即，板f是未实施过表面涂覆的环烯烃聚合物制板。
[0429]
(板g)
[0430]
板g，具有玻璃板，在玻璃板上，接合有具有384个孔13的结构体而构成。上述结构体的材质是聚苯乙烯。因此，板g所具有的各孔13的底面的材质是玻璃，壁面的材质是聚苯乙烯。板g未实施表面涂覆。
[0431]
(板h)
[0432]
板h的材质是coc。板h对表面实施过tc(组织培养)处理。
[0433]
实验例3～实验例8中使用的细胞，可以从国家医药食品卫生研究所、独立行政法人制品评价技术基础机构生物资源中心、american type culture collection，xenometrix社制的ames试剂盒(“ames mpf
tm penta i microplate format mutagenicity assay”)等获取。实验例3～实验例8中使用的受试物，是东京化成工业制。
[0434]
(实验例3)
[0435]
在实验例3中，使用以下评价试样用的细胞和受试物，实施上述第1b工序至第8b工序。其后，在第9b工序中，将第8b工序中准备的混合液，以第9b工序中说明的方式，分别移至板a、板b和板c之后，实施第10b工序至第11b。
[0436]
《实验例3的评价试样用的细胞和受试物》
[0437]
细胞：大肠杆菌wp2uvra株
[0438]
受试物：1-decanol
[0439]
实验例3的第3b工序中使用的介质是dmso。在第5b工序中，将0.7ml的细胞混合到6.3ml的培养基中。第6b工序的浓度为62.5μg/ml。
[0440]
在实验例3中，第11b工序中目视观察各孔13有无异物，对存在异物的孔数进行计数后，以4℃保存板11，分别在1天后、2天后、3天后、4天后和5天后，目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数。实验例3的结果如表6所示。表6中的“培养刚结束后”，意思是在48小时的培养结束的时刻进行异物的目视观察。
[0441]
【表6】
[0442][0443]
(实验例4)
[0444]
在实验例4中，使用以下评价试样用的细胞和受试物，实施上述第1b工序至第8b工序。其后，在第9b工序中，将第8b工序中准备的混合液，以第9b工序中说明的方式，分别移至板a、板b和板c后，实施第10b工序至第11b工序。
[0445]
《实验例4的评价试样用的细胞和受试物》
[0446]
细胞：大肠杆菌wp2uvra株
[0447]
受试物：1-decanol
[0448]
实验例4的第3b工序中使用的介质是dmso。在第5b工序中，将0.7ml的细胞混合到6.3ml的培养基中。第6b工序中的浓度为125μg/ml。
[0449]
在实验例4中，在第11b工序目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数后，以4℃保存板11，分别在1天后、2天后、3天后、4天后和5天后目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数。实验例4的结果如表7所示。表7中的“刚培养结束后”的
意思，与表6的情况同样。
[0450]
【表7】
[0451][0452]
(实验例5)
[0453]
在实验例5中，使用如下评价试样用的细胞和受试物，实施上述第1b工序至第8b工序。其后，在第9b工序中，将第8b工序中准备的混合液，以第9b工序中说明的方式，分别移至板a、板b和板c之后，实施第10b工序至第11b工序。
[0454]
《实验例5的评价试样用的细胞和受试物》
[0455]
细胞：沙门氏菌ta100株
[0456]
受试物：1-decanol
[0457]
实验例5的第3b工序中使用的介质是dmso。在第5b工序中，将0.35ml的细胞混合在6.65ml的培养基中。第6b工序的浓度为667μg/ml。
[0458]
在实验例5中，在第11b工序中目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数后，在4℃保存板11，分别在1天后、2天后、3天后、4天后和5天后目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数。实验例5的结果如表8所示。表8的“培养刚结束后”的意思，与表6的情况同样。
[0459]
【表8】
[0460][0461]
(实验例6)
[0462]
在实验例6中，使用以下评价试样用的细胞和受试物，实施上述第1b工序至第8b工序。其后，在第9b工序中，将第8b工序中准备的混合液，以第9b工序中说明的方式，分别移至板a、板b和板c后，实施第10b工序至第11b工序。
[0463]
《实验例6的评价试样用的细胞和受试物》
[0464]
细胞：沙门氏菌ta100株
[0465]
受试物：1-decanol
[0466]
实验例6的第3b工序中使用的介质是dmso。在第5b工序中，将0.35ml的细胞混合在6.65ml的培养基中。第6b工序的浓度为2000μg/ml。
[0467]
在实验例6中，在第11b工序中目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数后，以4℃保存板11，分别在1天后、2天后、3天后、4天后和5天后目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数。实验例6的结果如表9所示。表9中的“培养刚结束后”的意思，与表6的情况同样。
[0468]
【表9】
[0469][0470]
(实验例7)
[0471]
在实验例7中，使用以下评价试样用的细胞和受试物，实施上述第1b工序至第8b工序。其后，在第9b工序中，将第8b工序中准备的混合液，以第9b工序中说明的方式，分别移至板a、板d和板e后，实施第10b工序至第11b工序。
[0472]
《实验例7的评价试样用的细胞和受试物》
[0473]
细胞：沙门氏菌ta98株
[0474]
受试物：tert-butylhydroquinone
[0475]
实验例7的第3b工序中使用的介质是dmso。此外，第3b工序的浓度为2500μg/ml。在第5b工序中，将0.7ml的细胞混合在6.3ml的培养基中。第6b工序的浓度为2500μg/ml。
[0476]
在实验例7中，在第11b工序中目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数。实验例7的结果如表10所示。在表10中，显示48个孔13中能够确认到异物的孔的数目。表10中的“培养刚结束后”的意思与表6的情况同样。
[0477]
【表10】
[0478]
板培养刚结束后板a0板d48板e42
[0479]
(实验例8)
[0480]
在实验例8中，使用以下评价试样用的细胞和受试物，实施上述第1b工序至第8b工序。其后，在第9b工序中，将第8b工序中准备的混合液，以第9b工序中说明的方式，分别移至板a、板f、板g和板h之后，实施从第10b工序至第11b工序。
[0481]
《实验例8的评价试样用的细胞和受试物》
[0482]
细胞：大肠杆菌wp2uvra株
[0483]
受试物：1-decanol
[0484]
实验例8的第3b工序中使用的介质是dmso。在第5b工序中，将0.7ml的细胞混合在6.3ml的培养基中。第6b工序的浓度为125μg/ml。
[0485]
在实验例8中，在第11b工序中目视观察各孔13中有无异物，对存在异物的孔数进行计数。实验例8的结果如表11所示。表11中，显示在48个孔13中能够确认到异物的孔数。表11中的“培养刚结束后”的意思，与表6的情况同样。
[0486]
【表11】
[0487]
板培养刚结束后板a0板f5板g18
板h48
[0488]
(实验例3～实验例8的评价)
[0489]
在实验例3～实验例8中，培养刚结束后进行计数时，在板b、板c、板d、板e、板f、板g和板h中，存在保持有异物的孔。因此可知，实验例3～实验例8中使用的细胞和受试物的组合和受试物的浓度，是使异物产生的条件，并且，板b、板c、板d、板e、板f、板g和板h，在培养刚结束后，是可以保持异物的板。另一方面，板a在实验例3～实验例8的培养刚结束后，不存在保持有异物的孔13。因此，板a是不能保持异物的板。
[0490]
因此，对于培养不久后判定有无异物的细胞毒性评价试验来说，板b～板h是恰当的板(即，是可以恰当评价有无异物的板)，另一方面，板a可以评价为不能恰当评价异物有无的板。
[0491]
根据实验例3～实验例6的1天后、2天后、3天后、4天后和5天后的计数结果，与培养后不久的情况同样，对于分别在1天后、2天后、3天后、4天后和5天后，判定异物有无的细胞毒性评价试验，板c是恰当的，即，是可以恰当评价异物有无的板。另一方面，板a和板b在1天后之后，不存在保持异物的孔13。因此，板a和板b在评价1天后以后有无异物时，可以评价为不能恰当评价异物有无的板。
[0492]
在培养后不久的结果中，实验例3～实验例8能够得到同样的结果。因此，例如，以实验例3的评价试样(实验例3中采用的细胞、受试物和受试物浓度)作为用于板评价的基准试样时，通过使用该基准试样，如实验例4～实验例8，在其他的细胞、受试物和受试物浓度组合的情况下，也能够恰当地评价板。
[0493]
将实验例4～实验例8各自的评价试样(实验例4～实验例8中采用的细胞、受试物和受试物浓度)作为用于板评价的基准试样时也同样。即，可知实验例4～实验例8各自的评价试样作为基准试样时，由基准试样而评价为恰当的板，在实验例3～实验例8之中采用基准试样的实验例以外的实验例所采用的细胞、受试物和受试物浓度组合的情况下，也能够恰当地评价板。
[0494]
因此可以证实，实验例3～实验例8中采用的评价试样，可以作为在培养后直接用于评价板的评价试样使用。
[0495]
可证实计数时刻为1天后、2天后、3天后、4天后和5天后的情况下也同样。即，实验例3～实验例6中分别采用的评价试样，分别以1天后、2天后、3天后、4天后和5天后作为计数时刻时，可以作为用于评价板的评价试样使用。
[0496]
以上，对于本发明的各种实施方式和变形例连同实验例一起进行了说明。然而，本发明不受例示的各种实施方式、变形例和实验例限定，其意图是，包括专利要求的范围所示的范围，并且包括与专利要求的范围同等意思的范围内的全部变更。
[0497]
例如，在图11所示的流程图中，重复3次颜色判定，但颜色判定实施至少1次即可。例如，图11所示的流程图中的第1判定工序的结果，也可以作为最终判定。基于图11所示的流程图中显示的由第1基准创建工序创建的分别对于紫色和黄色的第1基准统计信息(例如频数分布)与板图像的全部孔图像的统计信息(例如频数分布)的相似度，也可以最终判定全部孔图像的颜色(相当于孔的颜色)。
[0498]
颜色判定等中所使用的候选色，不限定为紫色和黄色。也可以是其他两种颜色，根据试验内容，也可以采用3种以上的颜色作为候选色。另外，即使评价板的例如孔的颜色(或
评价对象的颜色)在目视下为无色，如果摄像部取得的图像内的颜色特征量(例如色调和饱和度)变化，则本发明也可以适用。例如，通过照射可见光或可见光以外的波长，如果摄像部所取得的图像内的颜色特征量(例如色调和饱和度)发生变化，则也可以在摄像部所取得的图像内从暂时分配的假色彩中选择候选色。这种情况下，分配假色而得到的评价板所对应的图像作为板图像发挥功能。
[0499]
作为颜色判定中使用的至少1个颜色特征量，除了色调和饱和度以外，也可以单独或组合使用明度、亮度、灰度值等。另外，rgb图像中的r的灰度值、g的灰度值、b的灰度值可以分别看作不同的颜色特征量。此外，使用的颜色特征量也可以不是2个，而是从上述之中选择使用3个以上。
[0500]
颜色判定中使用的统计信息包括至少1种统计量。统计量除了频数分布以外，也可以使用评价区域全体颜色特征量的平均值、中央值等。另外，统计量也可以是评价区域的颜色特征量的最大值、最小值、偏差(例如标准偏差)等。
[0501]
例如，作为颜色特征量能够使用灰度值，作为统计信息能够采用平均值和标准偏差(2种统计量)。
[0502]
说明这种情况的颜色判定方法的一例。首先，取得多个孔图像(评价区域)分别所包含的全部像素的rgb的各灰度值的平均值与标准偏差。由此，分别对于多个孔图像，取得平均值和标准偏差的组作为统计信息。将如此取得的多个孔图像分别相对的统计信息(平均值与标准偏差的组)，代替频数分布使用，以与利用频数分布时同样的方式实施颜色判定即可。例如，计算对于多个孔图像的统计信息与黄色和紫色的基准统计信息的相似度。基于计算出的相似度判定多个孔的颜色。黄色和紫色的基准统计信息，能够以与使用上述频数分布的第2颜色判定方法相关说明的第3基准频数分布创建的情况同样的方式取得。例如，将目视下判定为黄色的全部孔所对应的全部孔图像中包含的所有像素的rgb的各灰度值的平均值和标准偏差，作为黄色的基准统计信息即可。紫色的基准统计信息也同样。在此，说明了统计信息包括2个统计量(平均值和标准偏差)的情况，但是例如，作为统计信息，也可以使用平均值和标准偏差的一方。上述说明中，采用了灰度值的平均值、标准偏差，但是例如，也可以采用色调、饱和度等其他的颜色特征量代替灰度值。
[0503]
在集落检测处理和异物检测处理中，也可以不实施平滑化工序。在集落检测处理和异物检测处理中，也可以不实施检测结果创建工序。或者，在集落检测处理中，也可以在图18所示的第2集落检测工序中，实施检测结果创建工序中进行的处理(例如，由第2集落检测部实施)。同样，在异物检测处理中，也可以在图24所示的第2异物检测工序中，实施在检测结果创建工序中进行的处理(例如，由第2异物检测部实施)。
[0504]
在异物检测处理中，也可以不实施图24所示的外部区域设定工序和第2异物检测工序。但是，如前述，通过实施外部区域设定工序和第2异物检测工序，可以更确实地检测外部区域的异物。
[0505]
在利用统计信息(例如频数分布)的颜色判定处理和透明度检测处理中，例如，以各孔所对应的孔图像作为评价区域，分别对于多个孔图像(多个评价区域)取得统计信息。然而，评价区域具有至少1孔图像即可。因此，也可以将包括多个孔图像的孔图像群作为评价区域，对于上述孔图像群取得统计信息。例如，在图1所示的各分区se1～se8，分区se1～se8各自的评价对象的条件相同。因此，也可以将各分区se1～se8所对应的分区图像se1p～
se8p作为评价区域而创建一个统计信息，使用相对于多个分区图像的统计信息间的相似度进行颜色判定处理和透明度检测处理。
[0506]
在透明度变化检测处理中，以溶剂对照分区所对应的分区图像(溶剂对照区域)的统计信息(例如分区频数分布)为基准，检测透明度变化。然而，也可以使用相对于透明度的基准的统计信息(例如频数分布)，检测透明度变化。多个孔包括至少1个溶剂对照孔时，溶剂对照区域，是包括上述至少1个溶剂对照孔的图像所对应的至少1个溶剂对照孔图像的区域。
[0507]
测试体不限定为细胞。受试物不限定于化学物质。测试体和受试物只要是两者的组合，是至少发生颜色变化(包括使用指示剂时的颜色变化)这样的组合即可。测试体的其他示例有抗体，受试物的其他示例有抗原。
[0508]
在上述实施方式中，作为评价对象的测试体的形状变化而检测集落，但评价对象因试验结果而发生形状变化时，不限定于集落。异物是与测试体的形状变化不同的结构物，例如，是最初并不包含的物质(或结构物)，例如轮廓与内部的边界清晰。例如，是由折射率不同于异物周围的界面分隔的物质(或结构物)。作为异物的示例，可列举油块、气泡等。
[0509]
至此的说明中，评价方法至少实施颜色判定处理。然而，本发明也涉及至少实施透明度变化检测处理的评价方法。在此情况下，进行透明度变化检测时，也可以使用对于透明度的基准统计信息(例如频数分布)，检测透明度变化。
[0510]
本发明可以包括具备检测多个孔内有无异物的工序的评价方法(以下，为了便于说明，称为“基于异物检测的评价方法”)。在此基于异物检测的评价方法中也可以不进行颜色判定处理。在基于上述异物检测的评价方法的上述“检测多个孔内有无异物的工序”中，可以通过目视检测异物的有无，也可以如上述实施方式中说明的，基于孔图像进行检测。
[0511]
一种基于孔图像检测多个孔内有无异物时，基于异物检测的评价方法，其中，
[0512]
具有基于孔图像检测多个孔内有无异物的工序，
[0513]
检测多个孔内有无异物的工序，具有：
[0514]
基于在多个孔图像中分别设定的第1亮度阈值，检测有无所述异物的工序；
[0515]
分别在所述多个孔图像中，基于在从所述孔的深度方向看时包围与所述孔的底部的区域对应的内部区域的外部区域中设定的第2亮度阈值，检测所述外部区域内有无所述异物的工序，
[0516]
所述第1亮度阈值与所述第2亮度阈值不同，
[0517]
在所述多个孔的各自中，所述底部的面积小于与所述底部相反侧的开口的面积。
[0518]
作为具有基于上述孔图像检测多个孔内有无异物的工序的、基于异物检测的评价方法的一个方式，可列举在上述实施方式中，对于拍摄评价板而得到的图像实施的异物检测处理和基于此处理结果对于评价对象进行评价的方式。在此基于异物检测的评价方法中，也可以不进行颜色判定处理。另外，基于孔图像来检测多个孔内有无异物时，也可以目视孔图像(拍摄评价板而得到的图像)而检测有无异物。
[0519]
板可以是孔的底面和壁面由相同材料构成的板，也可以是孔的底面与壁面由不同材料构成的板。
[0520]
基于上述异物检测的评价方法中，优选使用由变形例4中说明的板判定方法判定为恰当的板。由此，能够更准确地检测异物。
[0521]
作为由板判定方法判定为恰当的板，可列举表面涂覆有poly-d-lysine的聚苯乙烯制板、表面实施过tc(组织培养)处理的环状烯烃共聚物制的板、未实施表面涂覆的环烯烃聚合物制板等。
[0522]
由板判定方法判定为恰当的板，也可以是图41所示的板11a。板11a具有玻璃板111、和设于玻璃板111的表面111a上的树脂层112。树脂层112上，形成有与多个孔13对应的多个贯通孔113。由玻璃板111之中从贯通孔113露出的区域和贯通孔113形成孔13。树脂层112是环状烯烃共聚物或聚苯乙烯。在板11a中，至少在相当于孔13的底面的区域(玻璃板111之中从贯通孔113露出的区域)形成有涂层114。涂层114的材料是纤连蛋白。图41所示的板11a，相当于变形例4中说明的实验例所使用的板c。因此，板11a是适合基于上述异物检测的评价方法的板。涂层114的材料也可以是纤连蛋白、胶原、层粘蛋白等。图41中表示具有涂层114的板的示例。不过，板11a在玻璃板111之中由贯通孔113露出的区域，也可以不实施涂覆。
[0523]
截至目前的说明，利用ames试验进行了说明，但本发明也可适用于其他的生物安全性评价。例如，在安全性试验中，能够优选适用评价对象发生颜色(也包括透明度变化)变化或评价对象发生测试体的形状变化的情况。评价对象的颜色变化，如前述，也包括因用于拍摄评价板的照明光等影响导致来自摄像部的图像中发生变化时的颜色变化。
[0524]
例示的实施方式和变形例等，可以在不脱离本发明的宗旨的范围内适宜组合。
[0525]
符号说明
[0526]
10
…
评价板，20
…
评价系统，13
…
孔，13a
…
底部，14、14a～14h
…
评价对象，33
…
摄像部，40
…
图像处理装置，ia
…
内部区域，oa
…
外部区域，p1
…
板图像，13p
…
孔图像，se1～se8
…
分区(第1～第n的分区)，se1p
…
分区图像(溶剂对照区域)。