用于分子缀合物和缀合的差异表征的材料和方法与流程

用于分子缀合物和缀合的差异表征的材料和方法
1.本技术要求2019年9月19日提交的美国临时申请62/902,958的优先权的权益，该申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
2.本技术涉及用于特别是表征分子缀合物，包括例如定量、归一化、检测和/或鉴定缀合分子的方法和试剂。如本技术中所教导，本发明可用于各种类型的分子，例如包括分子缀合物、药物缀合物，如抗体-药物缀合物(adc)等。


背景技术：

3.分子的缀合可以是有利的。例如，药物缀合物(如抗体-药物缀合物(adc))是用于治疗以下疾病的一类日益增长的疗法：癌症(polakis,药理学评论(pharmacological reviews)68,3-19(2016))和免疫性障碍(mcpherson.分子生物方法(methods in molecular biology)2078,23-36(2020))。adc的一般结构含有经由可断裂或不可断裂的接头连接到药物的单克隆抗体(mab)。例如，adc可以具有人源化/人mab，如细胞毒素、类固醇和反义寡核苷酸，该人源化/人mab经由不可切割或可切割的接头，如酸不稳定连接子、蛋白酶可断裂连接子或二硫键接头连接到生物活性有效负载。接头可以经由赖氨酸偶联、半胱氨酸烷基化或酶促反应在缀合位点处共价连接到mab。adc与其靶细胞表面抗原受体结合，这使得药物能够靶向递送到靶位点并且使对健康组织的全身毒性影响最小化，从而相对于替代性化学治疗方法或其它第一代mab导致选择性增加、功效和安全性改进(参见例如，dan等人，2018，《药物》(pharmaceuticals)(basel)11)。
4.难以实现完全的缀合。不完全的缀合过程可能导致游离或非缀合的药物、药物接头或药物相关杂质。降解产物可以随着时间的推移在制剂中以及体内发生。adc的表征和定量对于adc的安全性、功效和均匀性是重要的。


技术实现要素：

5.本技术提供了用于有效鉴定和定量分子缀合物，包括治疗缀合物(如药物缀合物)的改进的(例如更准确、可靠、敏感等)的材料和方法。本发明教导例如这种改进的表征的材料和方法。
6.本技术特别涉及通过使用串联质谱标签(tandem mass tag，tmt)来分析缀合物的方法，该缀合物包括与多肽共价连接的药物。
7.在一个方面，本技术涉及一种分析包括与多肽共价连接的药物的缀合物的方法，该方法包括：
8.(i)使包含缀合物的样品与第一串联质谱标签(tmt)接触，从而用第一tmt标记该缀合物的多肽；
9.(ii)消化用该第一tmt标记的缀合物的多肽以产生包含一种或多种未标记的肽和一种或多种用该第一tmt标记的肽的第一混合物；
10.(iii)使该第一混合物与第二串联质谱标签(tmt)接触，从而获得第二混合物，该第二混合物包含一种或多种用该第一tmt和该第二tmt中的至少一者标记的肽，其中该第一tmt和该第二tmt不具有相同的报告离子质量；
11.(iv)使该第二混合物经受液相色谱(lc)以产生lc的洗脱液；以及
12.(v)使洗脱液经受串联质谱，以获得包含该第一tmt和该第二tmt的至少一个报告离子的肽的质谱；以及
13.(vi)检测与该至少一种报告离子相关联的质荷比(m/z)，从而分析该样品中的缀合物。
14.在另一方面，将包含与多肽共价连接的药物的缀合物的样品与包含不与药物共价连接的多肽的对照样品一起分析。该方法包括：
15.(i)使包含缀合物的样品与第一串联质谱标签(tmt)接触，从而用该第一tmt标记该缀合物的多肽；
16.(ii)消化用该第一tmt标记的缀合物的多肽以产生包含一种或多种未标记的肽和一种或多种用该第一tmt标记的肽的第一混合物；
17.(iii)使该第一混合物与第二串联质谱标签(tmt)接触，从而获得第二混合物，该第二混合物包含一种或多种用该第一tmt和该第二tmt中的至少一者标记的肽，任选地一种或多种未标记的肽；
18.(iv)使包含与药物未共价连接的多肽的对照样品与第三tmt接触，从而标记与第三tmt未共价连接的多肽；
19.(v)消化用该第三tmt标记的与药物未共价连接的多肽以产生包含一种或多种未标记的肽和一种或多种用该第三tmt标记的肽的第三混合物；
20.(vi)使该第三混合物与第四串联质谱标签(tmt)接触，从而获得第四混合物，该第四混合物包含一种或多种用该第三tmt和该第四tmt中的至少一者标记的肽，任选地一种或多种未标记的肽；
21.(vii)将该第二混合物与该第四混合物组合并且使该组合经受液相色谱(lc)以产生lc的洗脱液；以及
22.(viii)使洗脱液经受串联质谱，以获得包含该第一tmt、该第二tmt、该第三tmt和该第四tmt的至少一个报告离子的肽的质谱；以及
23.(ix)检测与该至少一个报告离子相关联的质荷比，从而分析该样品中的缀合物，
24.其中该第一tmt、该第二tmt、该第三tmt和该第四tmt中没有一个具有相同的报告离子质量，该第一tmt和该第三tmt选自tmt的第一等压组，该第二tmt和该第四tmt选自tmt的第二等压组，并且该tmt的第一等压组与能够与药物形成共价键的未缀合的氨基酸残基反应，并且该tmt的第二等压组在肽的n端与赖氨酸或游离胺反应。
25.在一个方面，本技术的方法用于确定缀合物中的缀合位点的占用比。例如，缀合物的个别位点占用可以通过以下确定：1)使用本技术的方法获得用第一tmt和第二tmt两者标记的肽和用第三tmt和第四tmt两者标记的肽的质谱，其中质谱包括第一tmt的报告离子、第三tmt的报告离子、第二tmt的报告离子和第四tmt的报告离子；2)检测与质谱中的报告离子相关联的质荷比(m/z)；和3)基于质谱中的第一tmt的报告离子的强度和第二tmt的报告离子的强度，或者第二tmt的报告离子的强度和述第四tmt的报告离子的强度，确定缀合物中
的缀合位点的占用比，优选地由以下方程确定：
26.(第三tmt的报告离子的强度-第一tmt的报告离子的强度)/第三tmt的报告离子的强度，或
27.(第四tmt的报告离子的强度-第二tmt的报告离子的强度)/第四tmt的报告离子的强度。
28.在某些实施方案中，在各个时间点确定缀合物中的缀合位点的占用比，其中另外的tmt用于在不同的时间点标记多肽。
29.在另一个实施方案中，本技术的方法用于用对照样品对缀合物样品进行归一化。例如，通过包括以下的方法用对照样品对缀合物样品进行归一化：1)使用根据权利要求2所述的方法获得仅用第二tmt标记的肽和仅用第四tmt标记的肽的质谱，其中质谱包括第二tmt的报告离子和第四tmt的报告离子，但不包括第一tmt或第三tmt的报告离子；2)检测与报告离子相关联的质荷比(m/z)；和3)通过第二tmt的报告离子的强度与第四tmt的报告离子的强度的比率，用对照样品对样品进行归一化。
30.在又一个实施方案中，本技术的方法用于定位药物缀合位点，例如，药物在缀合物中与多肽共价结合的位点。例如，药物缀合位点可以通过包括以下的方法定位：1)使用本技术的方法获得仅用第二tmt标记的肽的质谱，其中质谱仅包括第二tmt的报告离子，但不包括第一tmt、第三tmt或第四tmt的报告离子；和2)在仅用第二tmt的报告离子标记的肽上触发第二串联质谱分析，从而定位药物缀合位点。在某些实施方案中，在用第二混合物消化后获得的仅用第二tmt的报告离子标记的肽与药物完全缀合，例如能够与药物缀合的肽上的所有氨基酸残基已经与药物共价连接。当肽仅含有能够与药物形成共价键的一个氨基酸残基(例如，cys或lys)时，肽可以仅与一种药物缀合。当肽含有能够与药物形成共价键的多于一个氨基酸残基(例如，cys或lys)时，肽也可以与多于一种药物缀合。
31.在某些实施方案中，定位缀合物中的药物缀合位点的方法包括：1)使用本技术的方法获得仅用第一tmt和第二tmt标记的肽的质谱，其中质谱仅包括所述第一tmt和第二tmt的报告离子，但不包括所述第三tmt或所述第四tmt的报告离子；和2)对仅用第一tmt和第二tmt标记的肽触发第二串联质谱分析，从而定位药物缀合位点。在某些实施方案中，在消化第二混合物后获得的仅用第一tmt和第二tmt标记的肽与药物不完全缀合，例如能够与药物缀合的仅一些但不是全部氨基酸残基已经与药物共价连接。
32.在本技术的一个实施方案中，缀合物是药物抗体缀合物(adc)，更优选地adc包括与单克隆抗体的一个或多个半胱氨酸(cys)或赖氨酸(lys)残基共价连接的药物。
33.如本领域普通技术人员将理解的，鉴于本公开，可以在本技术的方法中使用各种合适的串联质谱。参见例如，friese等人，mabs 10,335-345(2018)，对串联质谱法的综述，其内容全文以引用方式并入本文。在某些实施方案中，高能量碰撞诱导解离串联质谱(hcd-ms2)用于获得包含第一tmt、第二tmt、第三tmt和第四tmt的至少一个报告离子的肽的质谱。在其它实施方案中，在从来自hcd-ms2分析的肽中检测到一个或多个tmt报告离子后，触发另外的解离分析以另外表征肽，例如以定位肽中的药物缀合位点。另外的解离可以通过第二串联质谱分析进行。可用于此类方法的第二串联质谱的示例包括但不限于电子转移解离串联质谱(etd-ms2)或电子捕获解离串联质谱(ecd-ms2)。
34.在其它实施方案中，使用较高的触发强度阈值和/或窄分离窗口来改进第二串联
质谱的触发。在某些实施方案中，将具有三合一技术(tribrid technology)的同步前体选择应用于串联质谱法以改进检测和定量的特异性和准确性。
35.根据本技术中的公开内容可以使用任何合适的tmt。例如参见bachor等人，molecules 2019,24,701，对tmt的综述，其内容全文以引用方式并入本文中。在本技术的一些实施方案中，tmt的第一等压组包含对还原半胱氨酸反应的两个或更多个tmt。优选地，tmt的第一等压组包括对还原半胱氨酸反应的两个、三个、四个、五个、六个或更多个tmt。在一些实施方案中，第一等压组包含两个、三个、四个、五个、六个或更多个等压异构体(例如，相同质量和结构)，该等压异构体被碘乙酰基活化以用于共价、不可逆标记巯基(—sh)基团。在一些实施方案中，第一等压组包括可从thermofisher scientific(目录号90101)获得的iodotmtsixplex等压标记试剂组的两个、三个、四个、五个或六个等压异构体。
36.在某些实施方案中，第一tmt和第三tmt中的每一者包括彼此共价连接的质量报告子、质量归一化物和半胱氨酸反应性基团。因此，第一tmt和第三tmt中的每一者标记缀合物的多肽中的还原的半胱氨酸，并且可以用于分析含有与多肽的一个或多个半胱氨酸残基共价连接的药物的缀合物。优选地，第一tmt和第三tmt中的每一者选自iodotmtsixplex的等压组。
37.在本技术的一些实施方案中，tmt的第二等压组包括两个、三个、四个、五个、六个或更多个与赖氨酸反应的tmt或肽的n端的伯胺。在本技术的一个实施方案中，tmt的第二等压组包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个具有胺反应性nhs酯基团的等压化合物、间隔臂和质量报告子。例如，第二等压组可以包括tmt10plex
tm
(thermofisher，目录号90110)、tmtsixplex
tm
(thermofisher，目录号90061)或tmtpro
tm
16plex(thermofisher，目录号a44520)标记试剂组的两个、三个、四个、五个、六个或更多个等压异构体。
38.在某些实施方案中，第二tmt和第四tmt中的每一者包括彼此共价连接的质量报告子、质量归一化物和胺反应性基团。因此，第二tmt和第四tmt中的每一者标记缀合物的多肽的赖氨酸或n端，并且可以与第一tmt和第三tmt一起用于分析含有与多肽的一个或多个半胱氨酸残基共价连接的药物的缀合物。优选地，第二tmt和第四tmt中的每一者选自tmt6plex、tmt10plex或tmt pro16 plex的等压组。
39.在一些实施方案中，第一等压组和tmt的第二等压组各自独立地包括两个、三个、四个、五个、六个或更多个与赖氨酸反应的tmt或肽的n端处的伯胺。在某些实施方案中，第一tmt、第二tmt、第三tmt和第四tmt中的每一者包括彼此共价连接的质量报告子、质量归一化物和胺反应性基团。tmt可用于分析含有与多肽的一个或多个赖氨酸残基共价连接的药物的缀合物。
40.在一些实施方案中，一起分析包含一种或多种缀合物的多重样品。在某些实施方案中，缀合物中的药物缀合位点的特征在于包含(2n 2)报告离子的质谱条形码，并通过质谱条形码对缀合物进行归一化，该质谱条形码包括n 1报告离子，并且n是通过该方法分析的样品数。
41.本技术的其它方面涉及一种用于进行根据权利要求1至23所述的方法中的任一种的系统。
42.本技术的又一方面涉及一种组合物，该组合物包含用第一tmt和第二tmt中的至少
一者标记的肽，任选地一种或多种未标记的肽的混合物，其中该第一tmt和该第二tmt不具有相同的报告离子质量，并且肽的混合物包含至少一种与药物缀合并且用第一tmt和第二tmt中的至少一者标记的肽。
43.本发明的其它方面、特征和优点将从以下公开内容中变得显而易见，包括本发明的详细描述及其优选的实施方案和所附权利要求，如本领域普通技术人员将理解的，所附权利要求书是示例性和非限制性的。
附图说明
44.结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
45.本专利或专利申请文件包含至少一张绘制成彩色的附图。在提出请求并且支付必要的费用后，美国专利和商标局将会提供本专利或专利申请公开的带彩图副本。
46.除非另有说明，否则在本文的所有附图中，idotmt的报告离子由以下表示，tmt6的报告离子由以下表示，分析的肽由以下表示，并且药物由
■
以下表示。
47.图1a-图1d示出了可用于标记多肽中的半胱氨酸的示例性串联质谱标签(tmt)的结构：图1a-iodotmtsixplex组，图1b-tmtsixplex组，图1c-tmt10plex组，图1d-tmtpro 16plex，包括tmt的化学结构和13c和15n稳定同位素位置(*)；
48.图2显示了根据本技术的实施方案的用于样品表征的独特条形码的产生，例如以定量(例如，药物的占用)、归一化(例如，归一化模拟物对比缀合物)，并且基于从串联质谱(ms2)分析检测到的预定tmt报告子(模式)的强度和组合来检测(例如，定位药物缀合位点)样品；
49.图3a示出了使用可以定量、归一化和定位的分析方案，通过连续双tmt标记与药物(d)缀合的缀合物(如与药物缀合的抗体或其片段)，和模拟物(如未与药物缀合的抗体或其片段)经由三重融合产生ms条形码的本技术的实施方案；
50.图3b示出了根据本技术的实施方案的使用双tmt来定量药物缀合物的过程，其中一种药物(d)与通过胰蛋白酶消化获得的肽缀合；
51.图3c示出了根据本技术的实施方案的使用双tmt来定量药物缀合物的过程，其中多达两种药物(d1和d2)与通过胰蛋白酶消化获得的肽缀合；
52.图3d示出了根据本技术的实施方案的使用双tmt来定量药物缀合物，其中多达三种药物(d1、d2和d3)与通过胰蛋白酶消化获得的肽缀合；
53.图4显示了通过本发明的方法分析的几个示例性实验adc系统，所述系统包括与碘乙酰胺(iaa)和通过与生物素peo碘乙酰胺缀合形成的生物素-peo乙酰胺缀合物缀合的nist单克隆抗体(mab)半胱氨酸、含有1-3个与n-(7-二甲基氨基-4-甲基-3-香豆素基)马来酰亚胺(dacm-3)缀合的半胱氨酸的nist mab或hsa肽、以及来自sigma的adc标准msqc8(丹磺酰荧光团lc-smcc交联剂)；
54.图5a和图5b各自示出了使用双tmt通过执行hcd-ms2(尽管也可以使用其它ms2，如etd-ms2)来定量nist mab上的位点特异性adc，例如使用iodotmt(io，标记cys残基或c)或tmt(tm，标记lys残基或n端胺)报告离子强度来定量特定残基上药物的占用率，并且应用于
计算占用率％的公式的本技术的实施方案，其中adc是nist mab-生物素-peo乙酰胺；
55.图5c和图5d显示了通过hcd-ms2测序的肽的相应ms2光谱(具有所有主链产物离子)；
56.图6a和图6b示出了使用tmt通过执行hcd-ms2(尽管也可以使用其它ms2，如etd-ms2)跨具有非半胱氨酸肽的反应条件来归一化nist mab的混合比，以及使用公式中所示的归一化比率来校正含有adc(nist mab-生物素-peo乙酰胺)的样品(样品，sample)和未缀合样品(模拟物)的之间的混合或消化偏差的本技术的实施方案；
57.图7显示了使用根据本技术的实施方案的方法以及利用etd-ms2的分析含有由药物以及与生物素peo乙酰胺分子的片段化相对应的片段组成的肽的主链片段化的hcd-ms2产物离子质谱图：注意小分子缀合物易于片段化，从而产生复杂光谱，并且来自药物的片段质量对每种药物具有特异性；
58.图8a示出了用于nist三重融合工作流的tmt-130报告子触发；
59.图8b示出了使用tmt-130特征离子(条形码)触发etd-ms2以使用根据本技术的实施方案的方法和观察到的总离子色谱图(tic)定位缀合的药物；
60.图9a和图9b示出使用根据本技术的实施方案的方法经由tmt-130的质量触发环定位生物素peo乙酰胺：来自hcd-ms2的tmt-130是独特的，并且触发与adc的类型无关，并且etd-ms2在药物没有片段化的情况下定位药物；d＝生物素-peo乙酰胺
61.图9c和图9d显示了对应于在cys-23处缀合的生物素peo乙酰胺的肽的触发质量检测，其中与生物素peo乙酰胺所产生的亚铵离子相比，tmt130的丰度较低；
62.图10a和图10b显示了根据本技术的实施方案的改进触发环tmt-130的特异性的方法：肽的共分离和共片段化导致tmt-130的特异性丧失，并且较高的触发强度阈值或窄分离窗口导致改进的质量触发；
63.图11示出了样品制备站(sample prep station，sps-3)如何用于根据本技术的实施方案的等压标记实验，其中前体离子从多极离子通道(ion routing multipole，irm)转移到离子阱(ion trap，it)，并且在it中进行同步前体选择(sps)；
64.图12a-图12c显示了根据本技术的实施方案的使用同步前体选择的tmt定量的改进的特异性和准确性：图12a显示了用于同步前体离子选择(顶部5个片段)的ms2 tmt报告子；图12b显示了当干扰物共分离时，sps-ms3改进定量灵敏度和准确性；并且图12c显示了报告子定量，其中adc是sigmamab adc模拟物(msqc8)-与丹磺酰荧光团缀合的人类通用mab标准物，并且模拟物是未与药物缀合的人类通用mab标准物(msqc4,igg1 mab)；
65.图13a至图13f示出了使用根据本技术的实施方案的方法，使用双tmt来定量msqc8(mab抗体-药物缀合物模拟物)上的位点特异性adc(丹磺酰荧光团)的双tmt的实验和结果，包括用于位点特异性缀合占用率的基于ms的条形码；
66.图14a-图14c显示出使用根据本技术的实施方案的方法的msqc8宽位点adc定量与以下已知方法相关：在cys-218＝60％基于三重融合定量的msqc8轻链缀合，并与1:2的轻链slim-ims dar0/dar1比率相关，并且评估cys-266(最大)＝60％和cys-372＝15％的占用率，而所有其它半胱氨酸均显示0％缀合；
67.图15示出了使用根据本技术的实施方案的方法的msqc8中的丹磺酰荧光团的鉴定，其显示出小分子缀合物易于片段化，从而产生复杂光谱，并且来自药物的片段质量对每
种药物具有特异性；
68.图16a和图16b示出了使用根据本技术的实施方案的方法对反应时间进程进行分析的tmt；
69.图16c示出了根据本技术的实施方案以多路复用方式应用于监测多种药物(d1、d2、d3、d4和d5)的反应的三重融合工作流；
70.图16d示出了经由对每个药物分子具有特异性的单个tmt报告离子的质量触发；
71.图17a和图17b显示出来自tmt分析的结果与在高占用率下的荧光定量结果相关；
72.图18a描述了根据本技术的实施方案的在用于使用双tmt对多达4个adc样品的三重融合分析的各种组合中使用tmt的多路复用方案；
73.图18b示出了根据本技术的实施方案的具有4种不同的位点特异性adc占用率的4个adc样品的多路复用分析；使用tmt10plex试剂的tmt；
74.图19a-图19c示出了使用本发明的方法以高通量分析，例如分析4个adc的结果，所述adc实现单次运行中的四个adc样品的双tmt定量；
75.图20a显示了使用非半胱氨酸肽序列，现在在ms2-hcd上具有五个tmt
10
报告离子的条形码(一个模拟物(b)和四个缀合物样品(1)至(4))以校正在多路复用实验中的样品浓度：第i个样品的归一化因子由方程2给出，并且每个adc样本的校正占用率可由方程3得到；并且
76.图20b显示了在单次采集中针对四个样品获得的归一化占用率。
具体实施方式
77.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。
78.本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
79.应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
80.除非另行指出，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的
±
10％。例如，约50ppm或更少的量包括45ppm或更少到55ppm或更少。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
81.贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。
82.当在本文使用时，“由
……
组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或
成分。当在本文使用时，“基本上由
……
组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当本文在本技术的一个方面或实施方案的上下文中使用时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”替代以改变本公开的范围。
83.如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
84.如本文所用，“ms/ms”或“ms
2”或“ms2”是指串联质谱。串联质谱是仪器分析中的一种技术，其中两个或更多个质量分析仪使用另外的反应步骤联接在一起以增加其分析样品的能力。可以在将反应步骤在空间中分开(空间上串联)和/或将反应步骤在时间上分开(时间上串联)是情况下进行质量分析的串联使用。串联质谱法的常用用途是分析生物分子，如蛋白质、肽、有机和无机分子、脂质、代谢物和寡核苷酸。
85.如本文所用，“报告离子”或“诊断离子”是指在etd质谱中观察到的含有n端标签或标记的标记肽的特征产物离子。通常，它是质谱中最主要的产物离子，并且用于触发随后的ms/ms事件以进一步对标记肽进行测序。
86.如本文所用，“三合一技术”是指使用具有多于单一类型的质量分析仪的混合质谱仪的技术。它能够对于tmt样品多路复用以极大的灵活性执行串联质谱分析实验。三合一技术可以用于对复杂基质中包括低丰度肽的挑战性样品进行表征，确定完整蛋白质的位置和翻译后同种型、等压代谢物的分辨率和使用化学交联的蛋白质结构表征。
87.如本文所用，“轨道阱”或“ot”是指由两个外部电极和中心电极组成的离子阱质量分析仪。此设置使得轨道阱能够用作分析仪和检测器两者。进入轨道阱的离子被捕获并围绕中心电极且在两个外部电极之间振荡。不同的离子以不同频率振荡，这导致其分离。测量由外部电极上的离子引起的振荡频率，并且使用图像电流检测获取离子的质谱。
88.如本文所用，“等压”是指具有相同的标称分子量或式量。优选地，适用于本技术的本发明的等压tmt具有相同的质量和结构，并且它们也称为同位素。
89.如本文所用，“离子”是指由于一个或多个电子的损失或增益而具有净电荷的分子。离子的示例可以是a、b或y型产物离子，其是由于碰撞诱导解离(cid)沿着蛋白质主链断裂的酰胺键的结果。
90.如本文所用，“序列离子”是指对应于在给定肽键处分裂的特定肽的产物的一个离子(或多个离子)。
91.如本文所用，“亚铵离子”是指对应于肽的内部片段的一个离子(或多个离子)，该肽具有由-类型或y型断裂的组合形成的单个侧链。
92.如本文所用，“报告离子”是指通过本领域已知的方法从等压标记肽断裂的离子(例如，ms2)。
93.如本文所用，“同位素体”是指如下分子，该分子与其母体分子的不同之处在于至少一个原子具有不同数量的中子。
94.如本文所用，“多极杆”是指由金属杆构成以通过真空系统输送离子的离子导向器。
95.如本文所用，“缀合物”是指与一个或多个异源分子共价连接的蛋白质或肽。可以与一种或多种异源分子共价连接的蛋白质或肽的示例包括但不限于治疗性肽或蛋白质、抗体或其片段。可以与蛋白质或肽共价连接的异源分子的示例包括但不限于一种或多种小分子化合物、标记等。
96.如本文所用，“肽”是指基于氨基酸的聚合物，通常由二十个常见天然存在的氨基酸的一些组合构成，但也可以含有非天然氨基酸单体残基或完全由非天然氨基酸单体残基构成。它可以包括线性氨基酸聚合物构型，或可以包括环肽或支链酮，或所有三种构型的任何组合。肽还可以具有天然存在的修饰(例如，磷酸化或糖基化)或未天然存在的修饰(例如，羧酰胺甲基化)的任何组合。
[0097]“抗体”应包括但不限于(a)包含两条重链和两条轻链并且识别抗原的免疫球蛋白分子；(b)多克隆或单克隆免疫球蛋白分子；和(c)其单价或二价片段。免疫球蛋白分子可以衍生自任何通常已知类别，包括但不限于iga、分泌型iga、igg、ige和igm。igg亚类是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于人igg 1、igg 2、igg 3和igg 4。抗体可以是天然存在的和非天然存在的。此外，抗体包括多特异性抗体，如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、完全合成抗体、单链抗体及其片段。抗体可以是人或非人。抗体片段包括但不限于fab片段、fv片段和其它抗原结合片段。
[0098]
如本文所用，“串联质谱标签”或“tmt”是指可用于基于质谱(ms)的定量和分子鉴定的化学标记。可以标记具有游离硫醇或伯胺或聚糖的任何分子。例如，分子可以是蛋白质或肽。tmt标签通常含有至少三个区域，例如，质量报告子区域、质量归一化或平衡区域和反应性基团。可以递增报告子质量以产生独特的质量，而平衡质量用于补偿试剂的总质量以制备具有相同总体质量但具有不同报告子质量的一系列试剂。反应性基团促进胺、硫醇、氧鎓或其它官能团的加成反应。其可以例如是游离硫醇或还原半胱氨酸反应性的、伯胺或赖氨酸反应性的或氨基氧基反应性的。任选地，tmt还可以含有一个或多个可断裂的接头区域。
[0099]
tmt的等压组能够使用串联质谱法在不同样品中的蛋白质进行并行鉴定和多重定量。n个tmt的等压组可以含有具有n-1同位素取代的tmt和tmt。tmt的等压组内的所有标签的化学结构相同，但每个化学结构在各个位置处含有取代的同位素，使得质量报告子和质量归一化区域在每个标签中具有不同的分子质量，而tmt具有相同的总分子量(等压)和结构，使得在色谱或电泳分离期间以及在单个ms模式下，用不同标签标记的分子是不可区分的。例如，每个等压试剂可以在质量报告子区域中含有不同数量的重同位素，这导致在串联ms/ms期间用于样品鉴定和相对定量的独特报告子质量。在ms/ms模式中片段化后，从肽后骨的片段化获得序列信息，并且从标签的片段化获得定量数据，从而产生质量报告离子。等压组内的每个tmt在ms/ms质谱图上产生独特的报告子质量。
[0100]
tmt标记，例如那些市售tmt标记，可以多路复用样品(如6路、10路或更多)并且分别对半胱氨酸或胺具有反应性。在报告基团与间隔物之间移位重同位素的位置，每个标签的总质量和化学结构可以保持相同(等压)。例如，半胱氨酸反应性iodotmtsixplex试剂和胺反应性试剂各自具有六个相同的报告离子质量。然而，每个报告离子对于质荷比，或报告
子质量，也称为报告离子质量是独特的(m/z)。例如，等压tmt6设定范围内的6tmt的标称报告子质量为126-131da(道尔顿)。
[0101]“iodotmtsixplex”，也称为“cystmt”、“iodotmt”、“iodotmt6”或“iodotmt
6”的等压标记试剂组是指六个tmt的等压组，其是被碘乙酰基活化以用于共价、不可逆标记巯基(—sh)基团，并且具有图1a所示的化学结构。tmt含有通过间隔臂连接到反应性基团的含有13c和/或15n同位素(图1a-图1d中示出为*)的特征报告基团。iodotmtsixplex等压标记试剂组可从thermofisher scientific(目录号90101)商购获得。iodotmt试剂与肽和蛋白质中的还原半胱氨酸(cys)发生特异性反应。在用不同条件生长或处理的培养细胞中可以通过质谱(ms)分化iodotmt试剂，使得能够定量半胱氨酸修饰的相对丰度，如s-亚硝基化、氧化和二硫键。
[0102]“tmtsixplex”，在本文中也称为“tmt6”、“tmt
6”、“tmt6plex”的等压标记试剂组是指六个tmt的等压组，其是nhs激活以共价、不可逆标记伯胺(
–
nh2)基团并且具有图1b中所示的化学结构。tmtsixplex等压标记试剂组可从thermofisher scientific(目录号90061)商购获得。试剂标记由细胞或组织样品制备的所有肽，以在单次ms分析中分析多达六个样品。根据thermofisher scientific，tmt6试剂经过优化可与高分辨率thermo scientific ms/ms平台(如q exactive、orbitrap elite
tm
和orbitrap fusion
tm
tribrid
tm
orbitrap lumos
tm
仪器)配合使用，并且proteome discoverer
tm
1.0及以上版本完全支持数据分析。
[0103]“tmt10plex”(在本文中也称为“tmt10”、“tmt
10”或“tmt10plex”)的等压标记试剂组是指各自具有胺反应性nhs酯基团、间隔臂和质量报告子并且具有图1c所示化学结构的十个tmt的等压组。胺反应性tmt10plex可以多路复用多达10个单独的样品(10-plex)。tmt10plex等压标记试剂组可从thermofisher scientific(目录号90110)商购获得。重要的是应当注意，10-plex试剂仍具有六个标称质量(126-131da)，然而，六个报告子质量中的四个(127-130da)各自具有两个独特的报告离子质量，差异为6.32mda(毫道尔顿)，其中c
12
、n
15
原子对被c
13
、n
14
取代。高分辨率质谱法能够准确相对定量这些报告离子质量及其同位素体的基线分辨率。试剂组使得能够平行标记多达十种取自细胞或组织的不同肽样品，然后将其合并进行分析。对于每个样品，可采用高分辨率ms/ms光谱低质量区域中独特的报告子质量(即，tmt10 126-131da)测量肽段片段化和串联质谱法期间的相对蛋白表达水平。根据thermofisher scientific，tmt10试剂经过优化可与高分辨率thermo scientific ms/ms平台(如q exactive、orbitrap elite
tm
和orbitrap fusion
tm
orbitrap elite
tm
tribrid
tm
仪器)配合使用，并且由proteome discoverer
tm
1.4完全支持数据分析。
[0104]“tmtpro 16plex”(在本文中也称为“tmt16”、“tmt
16”、“tmtpro”或“tmtpro16 plex”)的等压标记试剂组是指具有图1d所示化学结构的16个胺反应性nhs酯活化试剂的等压组。16个tmt各自具有在n端与赖氨酸或伯胺反应的基团。tmtpro 16plex可从thermofisher scientific(目录号a44520)商购获得。根据thermofisher scientific，tmtpro标记试剂是下一代的串联质谱标签，其经过优化可与高分辨率thermo scientific ms/ms平台(如q exactive和orbitrap fusion tribrid仪器系列，包括orbitrap eclipse tribrid和orbitrap explororis 480质谱仪)配合使用，并且proteome discoverer 2.3完全支持数据分析。
[0105]
本发明的方法可以采用此类tmt的一组6个报告子(tmt-6plex)、一组10个报告子
(tmt-10plex)、一组11个报告子(tmt-11plex)和多达16个报告子(tmt-16plex)。根据本公开，tmt的其它示例也可以用于本发明。具体地，tmt16-plex和未来的n-plex试剂(其中n》16)将增加可用双tmt标记来标记的样品的数量。tmt可以使用本领域已知的方法制备或从如thermofisher scientific等商业来源获得。然而，当两个tmt串联使用时，它们不能具有相同的报告离子质量。例如，由于iodotmt和tmt6具有相同的一系列报告子质量，所以当使用iodotmt和tmt6的等压组进行双标记时，所选的iodotmt和tmt在用于双重标记时必须不具有相同的报告子质量。类似地，当在同一分析中采用多于两个tmt，例如用于一起分析样品和模拟物的tmt或用于一起分析多个样品的tmt时，分析中使用的tmt中的每一个必须具有独特的报告子质量，或在同一测定中使用的tmt都不能具有相同的报告子质量。
[0106]
通过药物-抗体比率(dar)确定adc效率、安全性和选择性的重要指标。色谱方法，例如尺寸排阻色谱法(sec)、疏水相互作用色谱法(hic)和反相液相色谱法(rplc)，可以用于获得dar值并表征adc。然而，这些方法具有显著缺点，例如它们通常由于分离和柱再生时间长而表现出低通量。此外，某些必需的流动相防止在线耦合到质谱(ms)。基于天然ms的方法保持非共价相互作用，并且因此可以获得有关可能的药物缀合物物种的阵列的信息。
[0107]
另一种方法是离子迁移谱法与质谱联用(ims-ms)。ims-ms在单次测定中同时获得结构和质量信息。它已经证明ims-ms与ms之间在dar表征方面的一致性。因此，ims-ms可用于研究adc的药物负载分布并表征mab。
[0108]
然而，用于定量和鉴定药物缀合物的常规方法具有随意性、灵敏度低、选择性不足和/或相对分析时间长或成本高的缺点。例如，天然ms、色谱和ims-ms方法几乎没有提供有关mab的位点特异性药物缀合以及与抗体结合的药物的占用率和位置是否改变adc的选择性或功效的信息。由于小分子和接头的大小，具有完整药物分子的肽的鉴定具有挑战性。
[0109]
可以通过用未修饰的肽对应物和缀合肽的加和强度归一化缀合肽强度来获得比率以定量缀合肽。该ad hoc比率有助于对所关注位点跨样品的缀合物水平的相对估计。也可以使用基于化学计量的方法，其中通过化学去除修饰或使用稳定同位素标记的合成肽和稳定同位素标记的细胞系来间接确定修饰的占用率(参见例如，wu等人，《自然方法》(nature methods)8,677-683(2011)；lim等人，《蛋白质组学研究杂志》(journal of proteome research)16,4217-4226(2017))。对伯胺具有特异性的等压标记已经用于研究模型nist mab的占用率以显示基于等压标记的基于化学计量的方法的效用(hill等人，sci rep 8,17680(2018))。尽管如此，基于化学计量的定量方法尚未集成到药物管道中以用于定量或adc分析，由于例如复杂且具有挑战性的样品制备、基于药物缀合等获得组成差异所需的详细分析方案(janin-bussat等人，《色谱法杂志b》(journal of chromatography.b),生物医学和生命科学中的分析技术(analytical technologies in the biomedical and life sciences)981-982,9-13(2015)；le等人，anal chem 84,7479-7486(2012))。
[0110]
tmt的等压组可以用于标记和研究一组药物多肽缀合物，如adc。使用高分辨率质谱，这些报告离子质量和同位素体的基线分辨率是可以用于准确的相对定量。在本技术的一个方面，tmt在样品，特别是药物缀合物的串联质谱(ms2)分析中用于基于样品的质谱条形码表征样品。
[0111]
质谱是使用质谱仪获取的直方图。分析的质谱通常绘制为强度(y)与m/z(质荷比)比(x)的关系图。tmt的报告离子可以通过其在质谱上的m/z比来检测。y轴表示离子的信号
强度。
[0112]
取决于仪器和软件，可以以不同方式测量和表达信号强度。例如，当使用计数检测器时，强度通常以每秒计数(cps)测量。当使用模拟检测电子器件时，强度通常以伏特测量。在傅里叶变换离子回旋共振质谱和orbitrap中，频域信号(y轴)与信号正弦波(通常降低到rms功率)的功率(大约振幅的平方)有关。一些软件计算报告面积而不是强度。如本文所用，关于质谱，术语“强度”涵盖通过任何方法测量并以任何形式表达的离子的信号强度。例如，报告离子的“强度”可以包括报告强度、报告面积或来自质谱分析的离子的信号强度的任何其它变化。
[0113]
如本文所用，样品的“质谱条形码”、“ms条形码”、“报告离子质量条形码”、“条形码”或“质量条形码”是指来自含有一组报告离子的信息的串联质谱(ms2)分析的样品的测量值，并且测量值对于样品是唯一的。样品的独特条形码可以基于从串联ms2检测到的一组tmt报告离子的强度和/或存在(图案)或不存在。可以在样品的三重融合(triple play)分析中使用一个或多个条形码。
[0114]
图2示出了使用iodotmtsixplex和tmt6以多路复用6种不同细胞裂解物，其中可以在消化之前对蛋白质进行标记或在消化每个样品后具有半胱氨酸的替代肽上进行。六个样品中的每个样品可用tmt在iodotmt组中标记、组合并一起经受lc-ms2分析以获得六个样品中的每个样品的不同条形码。条形码通过由tmt在串联质谱上产生的报告离子的m/z的强度和模式限定。具体地，标记为不可被质量区分的每个细胞系产生相同肽的等压质量。然而，在通过碰撞(hcd)解离或经由基于电子的解离(etd)之后，产生独特的报告离子。重要的是注意，hcd产生一系列带电片段，其中整个报告子被解离，而etd产生第二系列的独特报告离子质量。类似地，tmt标记也可以用于蛋白质组学中以比较任何肽的不同样品的6、10、11和16组报告子，因为每个肽具有n端，并且tmt试剂可以标记n端胺和/或赖氨酸，从而连接到所有肽。
[0115]
因此，本技术提供一种用于准确、灵敏和有效鉴定和定量药物缀合物的改进方法。在本发明的一个方面，药物多肽缀合物(如adc)用第一tmt标记，如cys反应性iodotmt和第二tmt，例如在n端与lys或伯胺反应的tmt顺序标记，并且使标记的药物缀合物经受串联质谱分析。顺序标记方案有助于查询(interrogate)药物缀合物。根据本技术的实施方案，两个平行样品制备臂可用于标记药物缀合物(缀合物样品)和未缀合模拟物(参考或对照样品)。两种标签都有利于对区分样品和模拟物或参考物的独特报告离子特征进行编码。参考样品产生参考报告离子通道，并且缀合物样品产生样品报告离子通道。通过hcd解离或通过如etd等基于电子的解离后产生独特的报告离子。报告离子区域中的通道的数量、其比率和/或执行与tmt相关联的细节的其它质谱可以用于产生独特的条形码以表征药物缀合物。例如，条形码可以包括一组不同的报告离子和/或质量条形码。
[0116]
如图3a所示，本技术的方法可用于定量缀合物中的药物的占用率，例如通过比较缀合物中含半胱氨酸肽的较低m/z区域报告离子强度的质谱与含有未与药物缀合的多肽的模拟物对照中的离子强度的质谱。该方法还可以用于归一化模拟物对照和缀合物。
[0117]
本技术的另一方面涉及一种定位多肽上的缀合位点的方法，例如通过使用一个或两个tmt报告离子来触发另外的解离步骤以进一步表征与药物共价连接的肽。在本技术的一个实施方案中，使用第一串联质谱分析(如hcd分析)产生一个或两个tmt报告离子。然后
使用报告离子来触发肽的etd扫描以获得etd光谱。etd光谱补充用于表征缀合物的hcd光谱，使得etd提供有助于残留物与药物缀合物的定位的序列离子。另选地，然后使用报告离子来触发ecd扫描以获得etd光谱以进一步分析肽。
[0118]
图3a-图3c展示出其中iodotmt6和tmt6用于标记mab及其药物缀合物的双tmt工作流。特别地，iodotmt6用于多路复用6种不同样品(例如，细胞裂解物)。在这种情况下，可以在消化之前对蛋白质进行标记或在消化每个样品后对半胱氨酸的替代肽进行标记。iodotmt6和tmt6试剂两者的报告子具有相同标称质量。由于选择质量不重叠的试剂，因此产生等压标记的肽。顺序标记首先用mab的iodotmt6进行，接着胰蛋白酶消化和标记通过用tmt6标记物的胰蛋白酶消化获得的肽来进行。来自缀合物样品和模拟物的肽以等摩尔比率混合并经受lc-ms。此处描述的顺序标记方案是查询肽的新颖方法，该方法有助于根据本技术的实施方案形成质谱条形码。
[0119]
在某些实施方案中，所示工作流具有用于药物缀合物和未缀合模拟物的两个平行样品制备臂。例如，iodotmt6和tmt6标记物两者促进对区分样品和模拟物或参考物的独特报告离子特征进行编码，例如参考样品产生参考报告离子通道和缀合物样品产生样品报告离子通道。而且，报告离子区域中的通道的数量及其比率编码可以获得的实验测量的占用率以及类型，并且每个实验测量具有一组不同的报告离子或质量条形码。
[0120]
因此，本技术的一个方面涉及一种组合物，该组合物包含用第一tmt和第二tmt中的至少一者标记的肽，任选地一种或多种未标记的肽的混合物，其中第一tmt和第二tmt不具有相同的报告离子质量，并且肽的混合物包含至少一种与药物缀合并且用第一tmt和第二tmt中的至少一者标记的肽。例如，本技术的组合物可以包含用第一tmt和第二tmt中的至少一者标记的衍生自缀合物样品的肽，任选地一种或多种未标记的肽的混合物。组合物还可以包含衍生自本文所述的缀合物样品的肽的混合物和用第三tmt和第四tmt中的至少一者标记的衍生自模拟样品的肽，任选地一种或多种未标记的肽的混合物。
[0121]
图3a示出了在替代胰蛋白酶肽中看到的单个半胱氨酸的药物缀合，其中在消化之前，在未缀合的部分上的mab的游离硫醇处发生iodotmt标记。无论缀合位点的数量如何，样品制备和lc-ms都可以保持相同。数据依赖性ms2或数据依赖性sps-ms3(同步前体选择和三级质谱)和tmt报告离子触发etd-ms可以在用于生成质谱条形码的仪器软件的完整控制下以无缝方式进行。此新型自动3步骤方法在本文中被称为“三重融合”，其中特定的报告离子组合用于定量、归一化和检测药物多肽缀合物。在本技术的一些实施方案中，用双tmt报告子进行三重融合以定量药物占用率，将多个样品中的药物缀合物归一化，并且检测或定位缀合位点(例如，通过触发另外的ms2)。优选地，药物多肽缀合物是adc。
[0122]
参考图3a-图3b，在图中描绘的工作流后，携带用iodotmt标记组标记的单个半胱氨酸缀合位点的所有肽产生四个报告离子(即，iodotmt-126和iodotmt-127和tmt-129和tmt-130)，而所有非半胱氨酸标记的肽产生两个报告离子tmt-129和tmt-130，其可以用于校正样品混合和归一化的差异。在药物缀合肽中独特地发现的单个报告子tmt-130可用于触发另外的etd-ms2扫描以进行位点定位(参见例如图3b)。tmt-130报告离子与缀合至肽的药物无关，并且不依赖于药物的片段。因此，触发的ms2可用于任何类型的药物缀合物或筛选具有独特报告离子以容易地鉴定和定位药物的药物的文库。
[0123]
与具有单个半胱氨酸的肽不同，具有多个半胱氨酸残基的肽可以具有与一个或多
个半胱氨酸残基共价连接的药物。例如，igg1和igg4 mab的两个铰链半胱氨酸具有任何单个半胱氨酸的双重占用和单次占用的可能性。igg2上的四个铰链半胱氨酸(具有igg2-a、igg2-b和igg2-a/b同种型)甚至进一步增加可能的组合缀合可能性(liu等人,mabs 4,17-23(2012)。
[0124]
根据本技术的实施方案的方法可用于研究具有与多肽(如抗体)缀合的一种或多种药物的药物缀合物。一种或多种药物可以在单个消化的肽内。药物分子可以具有相同类型或不同类型。图3b至图3d示出了对在单个消化肽上含有＝一种、两种或三种药物的药物缀合物的研究，其中d1、d2和d3可以是相同的或独特的。用于定量和归一化的条形码的数量不会改变，不管可用的缀合位点的数量以及它们是否完全或部分结合。此类实例中的占用率是所有位置同种型的总药物占用率并且归一化的条形码的数量保持为两个报告子。此外，如果单个肽内的缀合位点的数量大于2，则部分缀合产生两个报告子，例如tmt-127和tmt-130离子，并且全缀合产生单个报告子，例如tmt-130离子，用于触发用于占用率研究的etd-ms2扫描以将缀合的药物定位在正确的氨基酸残基处。如本文所用，具有与药物“完全缀合”或“与药物完全缀合”的肽是指与药物共价结合的肽，所述氨基酸残基能够与所述药物缀合。如本文所用，具有“不完全缀合”或“与药物不完全缀合”的肽是指仅一些与药物共价结合的肽，但并非所有氨基酸残基能够与所述药物缀合。与药物完全缀合的肽可以具有与其缀合的一种、两种、三种或更多种药物。
[0125]
尽管用于分析此类缀合反应的样品制备工作流保持相同，tmt触发的质谱参数需要2个报告子中的1个或2个报告子中的2个，报告子分别包含在触发设置中用于分别定位完整多个缀合物或部分多个缀合物。根据本公开，使用本技术的方法，可以使用类似的方法/方案来研究含有多于三种药物的药物缀合物。
[0126]
图4示出了通过本发明的方法分析的几个示例性实验adc系统。例如，nist mab-生物素peo乙酰胺adc具有与mab缀合的生物素peo乙酰胺和其仅含有不具有缀合药物的抗体的模拟物对照。除了抗体或其片段外，与其它多肽的药物缀合物还可以通过本技术的方法表征。人血清白蛋白(hsa)肽用作示例。与仅具有两个半胱氨酸的一个肽的nist不同，hsa肽在同一肽上具有多个半胱氨酸。其在根据本技术的实施方案的方法中进行测试，例如在荧光测定以及iodotmt标记中。
[0127]
在图4所示的代表性结构中，两种生物素peo乙酰胺与nist mab缀合，一种在nist mab的轻链中，一种在重链中。然而，nist mab-生物素peo乙酰胺adc可以具有几种不同的同种型，其中存在生物素peo乙酰胺并且连接到具有不同水平或占用的nist抗体内的不同半胱氨酸残基的不同组合。类似地，尽管图4中所示的msqc8的代表性结构仅具有与mab(msqc4)缀合的一个丹磺基荧光团，其可以具有在一个或多个其它位点处与mab缀合的丹磺酰荧光团的不同同种型。
[0128]
任何adc，包括但不限于图4中所示的adc中的任何adc，及其模拟物对照可以经受根据具有双tmt的本技术的实施方案的串联质谱分析，如cys反应性iodotmt的tmt，以及在n端对lys或伯胺具有反应性的tmt。从分析获得的质谱的示例以及来自分析的结果例如在图5a、图5b、图5c、图5d、图6a、图6b、图7、图9a-图9d等中示出。
[0129]
在另一个实施方案中，使用三种不同类型的报告条形码来计算每个半胱氨酸残基处的药物占用率。图5a显示了nist mab轻链的双tmt标记的等压肽的hcd-ms2光谱。肽具有
用iodotmt(io)标记的未占用的半胱氨酸残基和用tmt(tm)标记的n端和末端赖氨酸残基。hcd光谱(左侧面板)由一系列特征b和y型主链产物离子组成，所述骨架产物离子用对应的tmt标签定位标记位点。较低的质量范围显示四个报告离子，其在放大的右侧面板中更清楚地描绘，包括每个双tmt通道的报告离子质量，即，表示模拟通道的iodotmt-129和tmt-128对和表示缀合物样品通道的iodotmt-126和tmt-130对。占用率可以通过模拟物(a2)和缀合物(a1)或使用模拟物(b2)和缀合物(b1)的tmt强度的iodotmt强度导出。hcd光谱提供序列离子和光谱比率以鉴定在约50％的占用率下在具有生物素peo乙酰胺的轻链cys-193处的位点缀合。类似地，对于缀合物产生的给定反应条件，可获得占用率。例如，图5b示出两个附加位点的报告离子区域；具有约65％的生物素peo乙酰胺占用率的轻链cys-63和具有约100％的生物素peo乙酰胺占用率的重链cys-147，并且图5c和图5d显示通过hcd-ms2测序的肽的相应的ms2光谱(具有所有主链产物离子)。
[0130]
双tmt工作流使用缀合物和模拟样品之间的归一化因子来校正占用率估计值的偏差。例如，图6a和图6b示出了nist mab重链的双tmt标记的等压肽的hcd-ms2光谱。肽的n端和c端赖氨酸用tmt标记。hcd光谱(图6a)由定位tmt标记位点的一系列特征b和y型主链产物离子组成。较低的质量范围显示两个报告离子；并且报告离子tmt-128、tmt-130对(图6b)分别表示模拟物和缀合物样品通道。缺乏半胱氨酸残基的肽表现出两个报告离子的这种特性质量数条码，其中报告离子强度代表模拟物和缀合物样品的浓度。通常，对于完全标记的此类非半胱氨酸肽，观察到的比率为1。
[0131]
在另一个实施方案中，对应药物片段的序列离子和亚铵离子有助于确定缀合肽的占用位点(参见例如图7)。当同一肽上存在多个潜在缀合位点时，使用常规方法难以确定位点定位。通常不存在对位点具有特异性的序列离子，并且肽的定位对于确定肽序列的质荷比何时不可区分具有挑战性。因此，确定缀合位点的精确定位通常需要通过本领域已知的另外的互补解离方法获得的位点特异性序列离子。例如，etd-ms2与hcd-ms2互补。可以使用两种方法来形成序列离子，这可以使位点区分或换句话说定位修饰的残基。例如，药物缀合的半胱氨酸可以位于未缀合的半胱氨酸中。根据本技术的实施方案的方法允许人们确定缀合肽的占用位点，包括具有多个缀合位点的那些，而不使用互补解离方法。例如，可以进行解离以识别和定位有效负载。
[0132]
根据本公开，使用本领域已知的方法，本技术的方法可以进一步包括改进质量触发、定量灵敏度和准确性的步骤。例如，hcd-ms2可以在多级离子通道(ion routing multipole)中对tmt标记的肽缀合物的质量选择的前体离子进行(例如参见图8a和8b)。在其中检测到tmt报告离子的orbitrap中获取所产生的离子光谱。报告离子质量(图8a中的130.14da)可以用作相同母离子的触发质量选择并且转移到离子阱。随后，etd-ms2在离子阱中执行，并且所得产物离子在orbitrap中进行质量分析。例如，图8b展示出用于数据依赖性扫描的tic和对应质谱，所述数据依赖性扫描从ms、ms2和nist轻链cys-193生物素peo乙酰胺缀合物肽的触发ms2顺序发生。标记为1的tic是在orbitrap中收集的全ms扫描。标记为2的tic是在orbitrap中以两次连续扫描获取的质量选择的前体离子的hcd-ms2并且标记为3的tic是在orbitrap中分析的相同扫描循环和质量内获取的tmt-130触发的etd-ms2光谱。两个ms2产物离子谱的高分辨率orbitrap质量分析序列产生的时间惩罚可能不会影响药物缀合物肽的相对小子集。
[0133]
由hcd-ms2(如报告离子tmt-130)产生的电荷损耗离子可用于触发etd-ms2并产生etd光谱。图9a和图9b分别示出cys-193生物素peo乙酰胺缀合物肽的注释hcd和etd谱。重要的是注意，在光谱中容易观察到来自药物的高度选择性tmt130离子和亚铵离子。另外，在etd谱图中观察到报告子和整个标签的特征中性丢失，在图9b和图9d中用星号显示。来自etd和hcd两者的主链片段是互补的并且将生物素peo乙酰胺定位在cys-193上。尽管不是最丰富的亚铵离子，但tmt130显示为有用的亚铵离子。例如，图9c和图9d示出在cys-23处缀合的对应的生物素peo乙酰胺的肽的触发质量检测，其中与由生物素peo乙酰胺产生的亚铵离子相比，tmt130丰度较小。通过减少前体离子的质量选择窗口，还可以针对干扰肽控制产生tmt130质量触发的特异性。
[0134]
例如，肽的共分离和共片段化可能导致tmt-130的报告离子的特异性丧失，tmt-130用于触发adc-肽的etd-ms2分析以定位多肽上的缀合位点。更高的触发强度阈值或窄分离窗口(例如，0.4da)可用于改进质量触发(参见例如图10a和图10b)。各种报告离子可以影响用于触发的条形码类型，特别是在共分离发生并且共片段化由于与相同的分离窗口尺寸(例如，2da)共洗脱的肽发生的(图10b)。
[0135]
在另一个实施方案中，sps-ms3可用于进一步改进检测和定量的特异性和准确性(参见例如图11)。在离子阱中通过碰撞诱导解离(cid)解离前体离子，并且使用施加到离子阱的陷波波形对若干产物离子质量进行同步分离。分离的产物离子被转移到多级离子通道，在该多级离子通道中进行hcd-ms3片段化。由于sps，减轻由于在标准hcd期间共片段化引起的任何干扰，这导致报告离子几乎没有干扰。
[0136]
例如，同步前体选择用于使用根据本技术的实施方案的方法在具有图4所示结构的msqc8及其没有缀合药物的抗体的模拟物对照msqc4的adc上的研究的报告分析定量。如图12a-图12c所示，同步前体选择的应用允许准确的tmt报告，这改进定量灵敏度和准确性。使用具有表示msqc8的iodotmt-128、tmt-129报告离子对和表示msqc4的iodotmt-130、tmt-131报告离子对(模拟物)的n＝5离子在sps-ms3后观察到准确的报告离子比率。msqc8:msqc4的报告离子比率为1，指示半胱氨酸残基未被缀合。
[0137]
图13a、图13b和图14示出使用根据本技术的实施方案的方法对msqc8上的位点特异性adc进行定量的使用双tmt的实验和结果。如图13a和图13b所示，当adc的标记未完成，例如，缀合物仅用cys反应性tmt标记，但不用ycs反应性tmt标记时，检测到的占用率(％adc)仅略低于完整标记的占用率。有趣的是，尽管找到具有不完整标记的肽，观察到55-60％的类似位点占用率，这证明本技术的方法的稳健性。
[0138]
优选地，缀合物用tmt完全标记。标记的完成可以通过质谱上tmt的报告离子的强度来测量。图13c-图13f中所示的结果表明，在msqc8中，药物在cys-266和cys-372处与抗体缀合。还观察到，cys-218是在轻链上的丹磺酰-戊二胺-smcc的唯一缀合位点，其中位点占用率60％与通过slim-ims观察到的1的平均dar紧密一致(nagy等人，anal chem 92,5004-5012(2020))，并且msqc8的质量分析减少(数据未示出)。估计在cys-266处的占用率(最大)为60％并且在cys-372处的为15％，而所有其它半胱氨酸均显示0％的缀合(例如参见图14a至14c)。这类结果与从现有方法，例如例如，用于无损离子操作的轻链结构与离子迁移谱(slim-ims)相结合(slim-ims)一获得的1:2的dar0/dar1比率一致。此外，使用大量肽来归一化两个样品之间的混合差异(即，msqc8 adc样品和msqc4模拟物)确保每个缀合位点的占
用率估计值是准确的。
[0139]
根据本技术的实施方案的方法也可以用于表征或鉴定与多肽缀合的药物的结构。如图15所示，小分子缀合物易于片段化，从而产生复杂光谱。来自药物的片段质量对每种药物具有特异性，并且可以用于药物的鉴定。图15示出了sigmmab丹磺酰-戊二胺-smcc缀合物的一系列铵离子，其与生物素peo乙酰胺的亚铵离子显著不同。类似于图8a和图8b的结果，通过使用特定的报告离子m/z来触发etd，本发明的方法允许使用etd-ms2进行明确的位点定位，而与倾向于产生片段的小分子药物的结构无关。换句话说，tmt报告子m/z具有特异性，而来自药物的报告子取决于分子的结构改变m/z。
[0140]
根据本技术的其它实施方案，根据本发明的双tmt质谱分析还可以用于分析缀合反应的反应时间进程(例如参见图16a-图16b、图17a和图17b)。在图16a和图16b的双tmt实验方案中，单个tmt在合成肽标准物(如hsa肽)上使用，该标准物具有不同数量的半胱氨酸残基用于将tmt与荧光组合的多重反应时间进程实验。
[0141]
在本技术的其它实施方案中，根据本发明的双tmt质谱分析可以用于药物多肽缀合物的多路复用定量，以增加通量并降低成本。图18a示出了多路复用形式，其中将另外的药物缀合物样品加到原始工作流中。多路复用允许在单次分析中监测多个反应条件，这优于每个样品的单独工作流。仔细选择具有不重叠报告离子质量的tmt试剂允许甚至更高数量的样品多路复用。多路复用还改变报告离子特征的占用率，其中针对n的样品数量，条形码中的报告子的数量为(2n 2)。在图18a的示例中，加入第二样品产生总共6个报告子。此外，这些报告子来自等数量的iodotmt和tmt试剂。用于归一化的条形码中的报告离子的数量是用于占用的条形码的数目的一半，并且是(2n 2)/2。这在双tmt策略中始终是这种情况，其中仅使用胺反应性tmt报告离子进行样品的归一化。重要的是应当注意，用于肽药物缀合物的质量触发的条形码中的报告离子的数量独立于样品的数量。相反，用于质量触发的报告子的数量取决于可能的缀合位点的数量：m.通常，当m＝1时，观察到单个报告子，并且当m》1时，并且药物未在所有位点缀合，观察到两个报告离子。
[0142]
在本技术的某些实施方案中，多路复用的三重融合分析可用于分析含有具有多于一个缀合位点的缀合物的多个样品。例如，使用本技术的方法分析与荧光分子dcam-3缀合的具有1-3个半胱氨酸残基的合成肽。图16b示出了使用本技术的方法使用iodotmt6与阻断未反应的半胱氨酸的iaa的组合监测反应的时间点。在此方法中，iodotmt6未与tmt
10
一起用作双标记方法，因为在测定条件下多路复用的上限为4。目前，tmt
16
(16路)和未来n路试剂(其中n》16)的可用性将大大促进双tmt方法的样品数量。将基于荧光的定量用作标准并与基于tmt的占用率估计进行比较。图16c示出了应用于以多路复用方式进行监测多种药物d1-d5的反应的本技术的三重融合工作流程。该方案表示用iaa或iodotmt标记以实现双重标记。可以使用报告强度来估计每种药物的占用率以显示反应性d5》d3》d1的等级顺序和其中占用率为零的d2、d4的失败反应。图16d示出了经由特定于每个药物分子的单个tmt报告离子的质量触发，即d1的tmt127、d2的tmt129和d3的tmt130。
[0143]
图17a和图17b示出了来自多路复用实验的结果，其中通过混合肽-dacm-3缀合的百分比比率：0、20、40、60和80来模拟反应时间点。单独制备每种肽混合物，使得首先还原未缀合的肽对应物，并且将所有游离硫醇用iaa阻断。将缀合肽混合物和每个肽序列的未缀合对应物用于两个平行实验。首先，进行荧光测量以确保dacm缀合并且混合准确。具有1-3个
胱氨酸残基的所有肽的荧光强度示出无缀合(模拟物)到80％缀合的线性反应。接下来，缀合物比率为0、20、40、60、80的五种肽-dacm和模拟物，每个样品分别用iodotmt 126、127、128、129、130和131标记并将等摩尔量混合用于报告离子定量。hcd-ms2报告离子反映反应物随着反应进行并且达到平稳的反应的独特条形码。肽混合物相对于其模拟物的报告强度随预期的缀合增加而降低。基于tmt报告离子获得观察到的缀合水平与预期或理论缀合水平的相关性。重要的是注意tmt报告离子强度与缀合水平成反比。特别是对于低强度报告离子的tmt比率的动态压缩主要影响高药物缀合物。
[0144]
例如由savisky等人报告的算法可用于校正比率压缩(savisky等人,2013,《蛋白质组学研究杂志》(journal of proteome research)12,3586-3598)，其全部内容以引用方式并入本文。当前仪器上可用的sps-ms3例行程序也可以改进比率压缩(mcalister等人,anal chem 86,7150-7158(2014)。然而，在没有任何校正的情况下，本技术的方法可以提供对低水平缀合的准确估计，其中tmt反应是缀合的线性功能。对缀合物的低化学计量的检测是有益的，因为大多数脱靶缀合是不期望的并且可以更准确地监测。将多路复用tmt比率和/或逆tmt比率(位点占用率)与基于荧光的产率估计进行比较。与由于比率压缩引起的tmt报告子占用的动态范围相比，基于荧光的测量的线性动态范围较高。然而，具有高强度的tmt报告子也是具有低水平缀合的通道，所述低水平缀合可以以较少比率压缩效应和缺失值测量(lim等人，《he detection of low-stoichiometr》(journal of proteome research)16,4217-4226(2017))。
[0145]
在另一个实施方案中，本技术的方法包括使用机器人系统。例如，本技术的三重融合工作流可以在asaymap bravo液体处理机器人系统上实施，其中用tmt试剂双标记和样品多路复用可以增加基于tmt的定量的准确性和精确度。图18a示出了其中自动化可以特别是对于在合成点对反应的稳健监测是有益的总体方案。当需要快速优化反应条件时，同时分析多种药物缀合反应可能是有用的。另外，除了最终产物外，顺序缀合反应还需要估计中间步骤的药物产生，以优化总产率。在样品处理期间，任何自动化平台提供多路复用的速度和重现性都需要减少人为错误。
[0146]
在一个实施方案中，本技术的样品多路复用方案可以使用样品的双tmt标记(如msqc8)以两种不同的浓度一式两份地分析多达四个adc样品。图18b示出了来自tmt
10
和iodotmt6试剂的双tmt报告子的选择，使得所有质量都是独特的。tmt
10
(10-plex)试剂具有10种同位素中的6种，这些同位素的同位素体标记为tmt
10
xn或tmt
10
xc，相差6.32mda(毫道尔顿)，其中c
12
、n
15
原子对被c
13
、n
14
取代。tmt
10
xc同位素体质量是与iodotmt试剂相同的质量并且不能并行使用。一旦样品与报告离子的正确组合多路复用，高分辨率质谱法允许报告离子质量及其同位素体的基线分离。四种不同的adc样品和模拟物或未缀合的样品是如方案所示标记的双tmt，使得含有半胱氨酸肽的胰蛋白酶是5个tmt报告子和5个iodotmt报告子的等压混合物。在ms2后，条形码由10个报告离子组成。
[0147]
以两种浓度制备四种msqc8药物缀合物模拟物；原始样品，并且另一种通过用msqc4和msqc8稀释至浓度的一半。这些样品中的每一个都是双tmt标记中复制的样品。图19示出了hcd-ms2后cys-218肽的报告离子。模拟物的报告子(msqc4)用tmt
10-126和iodotmt
6-130对双标记，而四个样品用tmt
10
xn、iodtmt6x试剂标记，其中x范围为127-130。用双试剂x＝127标记msqc8的复制品1，并用双试剂x＝130标记msqc8的复制品。同样，对于msqc8和
msqc4标记的试剂的等摩尔混合物的两个重复样品，其中x＝128和129。第i个样品在cys-218处的位点占用率在方程1中给出。图20a显示了非半胱氨酸肽序列的用途，现在具有在ms2-hcd(一个模拟物和四个样品)上的五个tmt
10
报告离子的条形码以校正多路复用实验中的样品浓度。第i个样品的归一化因子由方程2给出。每个adc样品的校正占用率可以通过方程3获得。图20b显示了在单次采集中获得的四个样品的归一化占用。主要的这些多路复用实验也可用于使用触发质量来识别药物缀合物。
[0148]
在本技术的一个实施方案中，当反应经由中间步骤进行或参考材料不可用的情况下(例如参见图20a和图20b)时，可以确定任何两个反应步骤之间的相对占用率。如图16a和图16b所示，可以通过两步抗体缀合反应来评估与荧光团药物模拟物dacm-3缀合的肽的占用率。两步抗体缀合反应的示例是转谷氨酰胺酶反应，然后点击添加细胞毒性有效负载。还可例如参见huggins等人，molecules.2019年9月；24(18):3287，其内容全文以引用方式并入本文。通过两步抗体缀合反应制备的任何adc都可以通过本技术的方法进行分析。
[0149]
现在将参考以下具体的非限制性实施例更详细地描述本发明。本领域技术人员应了解，以下实施例中公开的技术表示被发明人发现的技术，所述技术在本发明的实践中很好地起作用，并且因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员应当根据本公开内容理解，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然在不脱离本发明的范围的情况下获得相似或类似的结果。
[0150]
实施例
[0151]
实施例1：未缀合的mab的双tmt标记和缀合
[0152]
将四种不同比率(1:1、1:9、9:1和1:3)的还原的和药物缀合的nist单克隆抗体((mab)，sigma aldrich，目录号8671)(样品#1)制备成非还原的和iodotmt
tm
标记的nist mab(样品#2)。nist mab通过使用碘乙酰胺(iaa)(sigma aldrich，目录号16125)或生物素peo碘乙酰胺(sigma aldrich，目录号b2059)缀合。对于样品#1，通过将10μl储备液(10mg/ml)与40μl包含8m盐酸胍(guhcl)(sigma aldrich，目录号g3272)和4mm乙二胺四乙酸(edta)(sigma aldrich，目录号03620)的溶液组合来制备100μg的nist(50μl 2mg/ml nist)的2个等分试样。然后通过加入10μl 1m dtt(sigma aldrich，目录号1019777001)减少nist等分试样，并在37℃下孵育1小时。另选地，tcep也可以用作还原剂而不是dtt。虽然dtt通常在中性碱性ph条件下具有活性，但tcep具有宽的ph范围和更强的还原剂。
[0153]
nist与1m iaa缀合。通过向eppendorf管中加入300μl三甲基碳酸铵(teab)(thermofisher，部分tmt标记试剂盒)来制备1m iaa，将其涡旋并超声处理20分钟以在使用前将tmt试剂平衡至室温。然后将24μl 1m iaa加到还原nist样品中，将其在黑暗中在室温下孵育1小时。在孵育期间，将15μl 1m dtt加到样品中以淬灭缀合反应。通过将样品与缓冲液交换溶液(8m guhcl 4m edta)组合使样品脱盐并且通过分子量截留值为7kda的zebra
tm
旋转脱盐柱(thermofisher，目录号89882)放置。
[0154]
为了将还原的nist样品与生物素peo碘乙酰胺缀合，在约7.5的ph下将样品缓冲液交换为不含巯基的pbs(磷酸盐缓冲液)。在使用前立即制备20mm生物素peo碘乙酰胺原液(将190μl pbs加到eppendorf管中的2mg生物素peo碘乙酰胺中)。将pbs中的还原的nist样品与5μl20mm生物素peo碘乙酰胺组合并混合。将反应在冰上或在室温下孵育2小时。在孵育期后，使样品脱盐。将样品置于缓冲液交换溶液(8m guhcl 4m edta)中并且通过分子量截
留值为7kda的zebra
tm
旋转脱盐柱运行。
[0155]
通过产生3个等分试样的nist(50μl 2mg/ml nist与10μl储备液(10mg/ml)合并)制备样品#2(iodotmt
tm
标记的非还原nist样品)并加到40μl溶液(8m guhcl 4mm edta)中。将每个等分试样与50μl含有8m guhcl和4mm edta的溶液组合以补偿体积。为了还原用于后续iodotmt标记的样品，将10μl dtt加到每个等分试样中，并将样品在37℃下孵育1小时。制备样品#1和样品#2的以下四个比率：1)1:9比率(10μl还原nist：90μl非还原nist)，2)1:3比率(25μl还原nist：75μl非还原nist)，3)1:1比率(50μl还原nist：50μl非还原nist)和4)9:1比率(90μl还原nist：10μl非还原nist)。每个混合样品含有100μg nist，并且将2μl的iodotmt
tm
标记的a1(将10μl甲醇加到200μgiodotmt
tm
中)加到所有样品中。然后将样品在黑暗中在37℃下孵育1小时。为了淬灭标记反应，向每个样品中加入4μl 0.5m dtt，并在黑暗中在37℃下再孵育15分钟。样品的缓冲液与teab交换，并且在37℃下用4μl胰蛋白酶(1mg/ml)消化iodotmt
tm
标记的蛋白质4小时至过夜。将胰蛋白酶用2μl 98％甲酸淬灭，并将2μl tmt标记的b1(800μg溶解于40μl无水乙腈中)加到4个样品中的每一个中。将样品在黑暗中在37℃下孵育1小时，并且通过在室温下加入8μl 5％羟胺来淬灭反应15分钟。
[0156]
除了样品#1和样品#2外，制备称为样品#3的参考或模拟样品，并用iodotmt
t
标签标记。样品#3的制备与样品#2所用的方案类似，不同之处在于生成4个样品而不是3个样品。样品#3单独胰蛋白酶化并用tmt标记的b2标记。样品#1和样品#2各自以1:1的体积比与132μl样品#3混合，这导致tmt标记的蛋白质具有形成用于质谱的四个多路复用样品的独特的等压报告离子质量。最多四种反应混合物可以与来自iodotmt
tm
和胺反应性tmt10plex
tm
试剂(thermofisher，目录号90110)的五个独特报告子质量的双标记多路复用。将双标记的四个缀合样品和单个模拟/参考对照样品以1:1:1:1:1的体积比组合，这产生用于液相色谱-质谱的单个多路复用样品。
[0157]
图13a、图13b和图14示出使用根据本技术的实施方案的方法使用双tmt对msqc8上的位点特异性adc进行定量的实验和结果。如图13a所示，当adc的标记未完成时，例如，缀合物仅用cys反应性tmt标记，例如iodotmt128和iodotmt130，但是分别不是msqc-4和msqc-8中的每一个的lys反应性tmt，例如tmt129和tmt131，在单个标记中检测到的位点占用率(例如55％-60％adc)略微小于具有双重标记的位点占用率。具有双标记的非缀合肽，例如用于msqc-4的iodotmt 128和tmt129，以及用于msqc-8的iodotmt130和tmt 131，提供60％的更精确的评估(来自两个报告子而不是一个报告子的测量评估)。通过质谱上的tmt的报告离子的强度来测量标记的完成。已知msqc8具有若干缀合位点。图13b中所示的结果表明在msqc8中，药物在cys-266和cys-372处与抗体缀合。cys-218是在轻链上的丹磺酰-戊二胺-smcc的唯一缀合位点，其中位点占用率60％与通过slim-ims观察到的平均dar为1紧密一致(例如，nagy,g.等人anal-chem-92,5004-5012(2020)，其发现与抗体两条链结合的药物)。另外，评估60％的cys-266(最大)和15％的cys-372的msqc8占用率的质量分析减少，而所有其它半胱氨酸均显示出0％的缀合(例如参见图14)。这种结果与从现有方法获得的1:2的dar0/dar1比率一致，例如用于无损离子操作的轻链结构与离子迁移谱相结合(slim-ims)。重要的是应当注意，使用大量肽来归一化两个样品之间的混合差异(即，msqc8 adc样品和msqc4模拟物)确保每个缀合位点的占用率评估值是准确的。
[0158]
实施例2：缀合mab的双tmt标记
[0159]
用双tmt标记方案标记缀合的mab。将msqc8(sigma aldrich mab抗体-药物缀合物模拟物)和msqc4(sigma aldrich mab标准物)分别用作缀合样品和参考或模拟样品。按照如针对标记nist mab所述的样品方案，用不同的iodotmt
tm
标签标记样品，并且单独胰蛋白酶化以产生肽。按照用于用tmt或iodotmt
tm
标记nist mab的相同方案，将来自msqc8和msqc4的所得肽混合物分别用不同的胺反应性tmt标签标记。在tmt双标记后，将样品以1:1的体积比混合，这产生用于质谱的多路复用单一样品。
[0160]
实施例3：assaymap bravo中tmt标记的自动化
[0161]
双tmt标记方案在assaymap bravo(agilent)机器人系统中实现，所述系统在用lc-ms分析之前使蛋白质样品制备自动化。如先前所描述进行未缀合nist mab缀合的双tmt标记。根据制造商的说明使用溶液中消化单板方案，该说明全文以引用方式并入本文(参见万维网：agilent.com/cs/library/applications/application-protease-digestion-in-solution-assaymap-5994-1682en-agilent.pdf)。将自动化样品制备编程为分配5μl的最小体积，并且使用如本领域已知的rp-w盒应用将样品用反相蛋白脱盐。使用assaymap bravo机器人系统中的重新格式化工具执行不同的样品比率(例如，1:1、1:9、9:1和1:3)。
[0162]
实施例4：缀合肽的多路复用tmt标记
[0163]
将具有1-3个半胱氨酸残基的合成mab分别与n-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆-3-基)马来酰亚胺(dacm-3；thermofisher，目录号d10251)经由用于蛋白质标记的适配制造商方案缀合。制备16.76mm dacm-3的原液。将1mg每种肽溶解于1ml溶液中，所述溶液包含100mm pbs、0.1mnacl、10mm edta(ph 8.0)和50μl 16.76mm dacm-3。用光保护盖密封肽，并在环境温度下孵育约5分钟。使用质谱确认肽完全缀合。用荧光板读数仪(spectramax m5,molecular devices)测量样品的相对荧光(相对荧光单位或rfu)和n-乙酰基-l-半胱氨酸的标准曲线(来自nist单克隆抗体的半胱氨酸肽标准物由biomatik corporation合成为99.99％纯度)(激发＝385nm，发射＝465nm，455nm截留值)。根据内部n-乙酰基-l-半胱氨酸曲线的回归分析计算每种肽的游离硫醇或缀合硫醇的相对浓度。确定n-乙酰基-l-半胱氨酸基本上与dacm-3100％反应。
[0164]
在肽的dacm-3缀合后，用tmt标记肽。将每个dacm-3缀合的肽与未标记的肽对应物混合以产生五种各种化学计量比的混合物(0、0.2、0.4、0.6和0.8)。未标记的肽用作对照物。根据本公开，用本领域已知的荧光测定评估样品以确保dacm-3标记在tmt标记之前适当起作用。如先前针对胰蛋白酶肽的tmt标记所述，对每个样品进行胺反应性6-plextmt标记。最后，将标记的五种混合物和对照物以1:1的体积比组合，并且使用本领域已知的方法使用本领域已知的方法进行分析。
[0165]
实施例5：lc-ms2(lc-ms/ms)分析
[0166]
用lc-ms2分析的样品在具有advancebio peptide mapping柱(agilent，目录号864600-911)的agilent infinity 12900uhplc上在65℃下分析。使用具有0.1％甲酸作为流动相a和乙腈作为流动相b的lc-ms级水的50分钟液相色谱(lc)梯度程序根据以下方案进行：0min，2％b；35min，30％b；40min，80％b；45min，85％b；45.5min，2％b；并且随后在2％b下再平衡5分钟。流速设置为0.2ml/min，并且进样体积为2μl。质谱仪用本领域已知的数据依赖性(dd)ms
2 hcd(ms/ms-hcd)和电子转移解离(etd)方法以正电离模式操作。使用以下界面条件：发射器电压， 2600v；气化器温度，325℃；离子传输管，325℃；套管气体，55(arb
(任意单位))：辅助气体，10(arb)；和吹扫气体，1(arb)。
[0167]
以下内部质谱仪设置用于ms扫描：rf(射频)透镜，60％；agc(自动增益控制)目标，1e6；最大注射时间，50ms；和在orbitrap(ot)质量分析仪上在70k分辨率下的分析模式中的1μscan。该方法在如本领域已知的任何ms
2 hcd事件之前依次包括一系列过滤器。包括单同位素峰选择过滤器并且针对所有方法设置为肽，并且使用1e5的强度过滤器。一些方法使用任选的电荷状态过滤器来选择前体电荷状态2-6。另外，某些方法使用任选的动态排除(de)过滤器以更有效地识别样品中具有12s或3s排除窗口的肽，并表现出以下常见参数：排除n＝1次； /-3ppm；排除同位素；和每个前体的单个电荷状态。一种方法涉及apex检测，apex检测使用以下参数：预期峰宽，6s；期望顶点窗口，30％。
[0168]
五次ddms
2 ot-hcd(数据依赖性ms/ms-orbitrap检测-更高的能量碰撞解离)扫描用以下设置进行：四极分离，1.6m/z分离窗口；检测器类型，orbitrap，自动m/z正常扫描范围，70k分辨率，100m/z第一质量；agc目标，2e5，经所有可用的可平行时间注射离子，最大注射时间为50ms；1μscan，轮廓。在ddms
2 ot-hcd后，实现目标质量触发(tmt)，其是仅在系统检测到来自用户定义列表的产物离子时才触发的扫描。靶向离子质量包括特异性tmt报告离子，以检测报告子质量列表中的有效载荷(例如，126至131da)，并且只有前10个最强质荷比内的离子用于所有质量触发。以下条件用于ddms
2 ot-etd(数据依赖性ms/ms-orbitrap检测-电子转移解离)：msn水平，2；四极分离，1.6m/z分离窗口；etd反应时间为50ms；检测器类型，orbitrap，自动m/z正常扫描范围，30k分辨率；agc目标，5e4，经所有可用的可平行时间注射离子，最大注射时间22ms；1μscan，轮廓。在ddms
2 ot-hcd和ddms
2 ot-etd之间的依赖性扫描数设置为1。
[0169]
来自各种质谱分析的数据用xcalibur
tm
数据采集和解析软件(thermofisher，目录号opton-3096 7，maxquant和perseus源蛋白质组学数据分析软件(maxplanck institute)，和r 3.6统计编程软件(用于统计计算的r foundation，vienna，奥地利)进行。通过方程1，用iodotmt报告离子峰面积估计位点占用率，其中a2是未缀合样品的区域，而a1是缀合样品的面积。通过方程2，使用tmt报告离子计算归一化因子，其中b1是缀合样品的峰面积，b2是未缀合样品的峰面积：
[0170][0171][0172]
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是为了进行示意性的说明，并且可在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施方案进行修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖符合本发明实质和范围的修改，如所附权利要求书中定义的。