细胞培养监控系统的制作方法

1.本发明涉及一种用于监控液体培养基中的细胞培养的系统。


背景技术：

2.细胞疗法和基于细胞的产品的出现导致对细胞培养的准确和及时控制的需求增加。细胞培养还可用于例如抗体和疫苗的生物生产。常规培养过程的许多步骤需要人工干预，尤其是细胞计数和细胞活力测量。每次干预增加了污染的风险和治疗的最终成本。由于错误或污染而导致的治疗批次损失会对患者造成严重的后果。


技术实现要素：

3.鉴于上述内容，本发明的目的是提供一种细胞培养监控系统，其允许精确控制细胞生长并以经济的方式降低污染风险。
4.有利地，提供一种可靠的细胞培养监控系统。
5.有利地，提供一种允许以经济和无菌的方式在培养期间连续或频繁地分析细胞状态的细胞培养监控系统。对活力的连续测量将允许在早期阶段检测细胞培养疾病。
6.本发明的目的已经通过提供根据权利要求1所述的细胞培养监控系统而实现。
7.本文公开了一种细胞培养监控系统，所述细胞培养监控系统包括：监控装置，所述监控装置用于结合到内含细胞培养基的培养罐；以及流体循环系统，所述流体循环系统用于流体结合到所述细胞培养罐，所述流体循环系统包括用于通过供给和返回导管连接到细胞培养罐的介电泳盒。所述介电泳盒包括基座和电极支撑件，所述电极支撑件具有位于所述电极支撑件中或所述电极支撑件上的电极，所述电极被配置用于行波介电泳并且包括一个测量区，该测量区布置在形成于所述电极支撑件与所述基座的地板之间的测量室的上方，由此，流经所述测量室的液体培养基中的细胞受到与经过所述测量室的所述流体的流动方向正交的行波介电泳力。所述监控装置包括计算单元、连接到所述计算单元的图像捕获系统、以及用于接收所述介电泳盒的盒保持部分，使得所述图像捕获系统可以检测流经所述测量室的细胞。
8.在一个有利的实施方式中，所述介电泳盒的至少所述基座由聚合物、优选透明聚合物制成。
9.在一个有利的实施方式中，所述电极支撑件由透明聚合物或玻璃制成。
10.在一个有利的实施方式中，所述介电泳盒包括出口和入口，所述入口被配置为与形成所述供给和返回导管的柔软聚合物管相结合。
11.在一个有利的实施方式中，所述电极形成在所述电极支撑件的内表面上，所述电极支撑件成为所述测量室的边界并且具有延伸到形成在所述基座中的电极连接窗口的接触部分，以用于与所述监控装置的互补弹簧触点插接接触，所述电极连接窗口与所述测量室密封地分离。
12.在一个有利的实施方式中，所述测量室包括升高的地板和侧向导向件，界定了所
述地板和电极支撑件之间的间隙。
13.在一个有利的实施方式中，所述电极包括由一个或多个螺旋导电轨道形成的测量区。
14.在一个有利的实施方式中，所述电极由四至十个电极、优选四至八个电极组成。
15.在一个有利的实施方式中，电极镜像对称地分两组布置在测量区中。
16.在一个有利的实施方式中，所述监控装置的所述盒保持部分包括盒保持槽，所述盒保持槽配置为可滑动地将所述介电泳盒插入其中。
17.在一个有利的实施方式中，所述盒保持部分包括定位元件，该定位元件接合在所述介电泳盒中的互补定位元件中，用于将所述介电泳盒定位和固定在测量位置。
18.在一个有利的实施方式中，所述定位元件包括在所述盒保持部分或介电泳盒上的弹簧突起或或弹簧抵抗部分。
19.在一个有利的实施方式中，所述图像捕获系统包括显微镜，所述显微镜连接到所述计算单元的图像处理电路，所述图像处理电路被配置为对由图像捕获系统捕获的细胞的轨迹进行数字分析。
20.在一个有利的实施方式中，所述计算单元包括通过连接器连接到所述介电泳盒的所述电极的信号发生器，所述信号发生器被配置为在所述电极的所述测量区中产生行波介电泳信号。
21.在一个有利的实施方式中，电极和地板之间的所述测量室在10至200μm的范围内
22.在一个有利的实施方式中，所述细胞培养罐与所述监控装置分离，并且包括流体连接器，以连接到与所述介电泳盒连接的供给和返回导管。
附图说明
23.本发明的其他目标和有利的特征将从权利要求书、详细说明和附图中明显看出，其中：
24.图1是根据本发明一个实施方式的细胞培养监控系统的示意图。
25.图2a根据本发明一个实施方式的细胞培养监控系统的立体图。
26.图2b为图2a去除了盖和去除了某些内部组件的细胞培养监控系统的一部分的立体图。
27.图3a和图3b是根据本发明一个实施方式的插入在细胞培养监控系统的细胞培养罐2中的管的示意图。
28.图4是细胞培养罐的流体连接器的横截面图。
29.图5a是根据本发明一个实施方式的细胞培养系统的监控装置的盒保持部分的立体图。
30.图5b是类似于图5a的视图，根据本发明一个实施方式的细胞培养监控系统的盒插入到保持中。
31.图5d为图5b的所述盒和所述保持的局部横截面简化立体图。
32.图5c是图5b所述元件的分解视图。
33.图6a和6b是根据本发明一个实施方式的盒的立体图。
34.图6c是根据本发明一个实施方式的盒的分解立体图。
35.图6d是根据本发明一个实施方式的盒的底座的平面图。
36.图6e是根据本发明一个实施方式的贯穿盒的横截面视图。
37.图7是根据本发明一个实施方式的介电泳盒的电极的视图。
38.图8是当受到介电泳作用时细胞相对于电极的轨迹的简化示意图。
39.图9是根据一个变型的介电泳盒的示意图。
具体实施方式
40.参照附图，根据本发明的实施方式的细胞培养监控系统1包括监控装置3、细胞培养罐2和用于在细胞培养罐和监控装置之间输送包含待观察细胞的细胞培养基的流体循环系统4。
41.所述监控装置3包括图像捕获系统7、光谱仪8、计算单元9和盒保持部分28，所述盒保持部分28用于接收所述流体循环系统4的介电泳盒5。
42.所述流体循环系统4包括介电泳盒5和将介电泳盒5与细胞培养罐2互连的导管14a、14b。所述流体循环系统4进一步包括泵6，所述泵6可以安装或形成为所述监控装置3的一部分(如图所示)，或者在其他变型中所述泵6可以安装在所述细胞培养罐上并且电连接到用于控制所述泵的监控装置。在一个优选实施方式中，所述泵被安装在监控装置上，并且可以有利地为蠕动泵的形式。所述供给导管14a的至少一部分包括一个安装在所述蠕动泵中的柔性管段，用于以无菌方式泵送细胞培养基。
43.所述流体循环系统中的与介电泳盒5和细胞培养罐2连接的所述供给导管14a和返回导管14b有利地形成一个闭合回路，使得包含在细胞培养罐2中的细胞培养基15的流体能够在闭合回路循环到介电泳盒5并返回到细胞培养罐。在一个变型中，所述流体循环系统可进一步包括连接到废物通道23的出口导管，用于移除从活细胞上分离的死(即，凋亡)细胞，或用于分离不同的细胞表型，这是由于它们在介电泳盒中的轨迹不同。所述流体连接器18可以通过流体连接领域本身已知的鲁尔锁类型的连接连接到细胞培养罐，或者可以通过其它手段互连。所述流体连接器18允许柔性管、特别是罐供给管和返回管结合到所述连接器。
44.所述供给导管14a可进一步包括浸没在细胞培养基15中的穿孔管17，并且优选地延伸到细胞培养罐的底部。所述管17中的穿孔进行布置，使得朝向所述罐的底部具有较多数量的穿孔，朝向所述罐的顶部具有逐渐减少数量的穿孔，从而使得入口阻力朝向所述罐的底部减小。这样确保了抽吸压力是基本上均匀分布的，以确保贯穿细胞培养罐高度的细胞培养基被吸入供给管中，在高度上均匀取样。可以在所述穿孔管的底部提供一个重物，在所述管的顶部提供一个浮子，以确保所有孔都在液体下。不过，也可以提供其他的管保持和定位装置。此外，所述穿孔管可以包括各种形状，例如“螺旋形开瓶器”形状，以提高水平采样的均匀性。所述细胞培养容器可进一步包括混合系统，例如旋转叶片或磁棒搅拌器(未示出)，以均匀化培养基中的细胞分布。
45.可以在流体连接器18中设置一个阀门，允许在供给返回导管内的细胞培养基再循环，以在不经过培养罐的情况下在闭合回路中循环；或者改变所述阀门的设置，使得从细胞培养罐抽取的新的细胞培养基被泵入供给导管。所述阀门的运作可以取决于要执行的分析，例如，如果供给导管和返回导管连接在一起，样品培养基的多次再循环可以通过介电泳盒进行测量，例如为了提高测量的灵敏度，或者新的细胞培养基可以被泵入供给导管并返
回至细胞培养罐中，以单次通过所述介电泳盒。
46.在某些情况下(正在被测量的样品被丢弃，且不返回到所述细胞培养基)，还可以设置一个阀门，用于将返回导管切换到废物容器(未示出)。
47.根据本发明的一个有利实施方式的介电泳盒5包括基座20和电极支撑件19。所述基座20可以有利地由聚合物材料制成，在某些实施例中，该聚合物材料可以有利地是透明聚合物材料，诸如abs(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯-共聚物)。所述基座可以有利地被模制，例如注塑模制，或通过增材制造技术(如3d打印)制成。
48.所述电极支撑件19可以由聚合物材料制成，但是优选地由玻璃制成，并且包括玻璃上的导电电极，所述导电电极可以通过各种本身已知的沉积和图案化技术(诸如化学气相沉积、平版印刷、打印)和其他已知的金属层沉积技术。在有利的实施方式中，所述电极支撑件19是与所述基座分离形成并例如通过粘合剂黏合、超声波黏合或焊接被装配到基座上的部件。然而，也可以通过增材制造技术作为单个部件形成所述基座、支撑件和电极。
49.所述基座20包括流体连接器部分24和形成在基座内的微流体回路，所述流体连接器部分24包括入口24a和出口24b，该微流体回路具有将所述入口24a互连到所述出口24b的通道。所述基座进一步包括电极连接窗口22，其允许接近所述电极21的接触部分21b。
50.所述微流体回路23包括与入口24a连接并流入测量室23b的入口通道23a、从所述测量室23b流出至出口24b的返回通道23c。所述测量室23b可有利地包括升高的地板26，其限定了基座20和电极支撑件19之间的通道高度。这确保了为流经测量室的流体提供了一个非常明确的间隙，其位于测量室上方的电极21的测量区21a的下方。在电极和地板26之间的所述测量室23中的高度优选地在10至200μm的范围内。
51.流经测量室23b的液体中的细胞根据细胞的状态而受到行波介电泳力的作用。使用介电泳电极来确定细胞的状态是一个本身众所周知的概念。在常规系统中，通常液体培养基内的细胞通过介电泳而位移，这种位移表明了细胞的状态。死细胞移位较少或不受行波介电泳力的作用，因此活细胞受介电泳力作用并跨电极平移。在本发明中，所述测量室23b中的细胞经受流体流，使得细胞表现出从入口朝向出口的在通过测量室的液体流动方向lf上的分量，以及由于行波介电泳力f
twdep
而产生的横向平移运动t。细胞的运动方向由图像捕获系统7捕获并由计算单元9分析。
52.同时的流体流动和通过介电泳的平移运动的一个重要优点在于，矢量分量允许非常准确且容易地测量细胞的状态(以区分健康细胞和死细胞)以及影响介电泳力的细胞的状态。
53.电穿孔是一种用于改善细胞转移的技术。根据本发明的另一个方面，测量室中的介电泳区可用于此目的。所产生的电场(取决于振幅)增加细胞膜的渗透性，并促进载体(例如病毒)整合到细胞中。能够通过介电泳以不同的速度移动不同大小的微生物(如病毒和细胞)将放大病毒的整合，因为会发生碰撞。因此，在测量室中产生的行波介电泳力可用于在两个方向上横向移动微生物并产生多次碰撞。
54.在另一个实施方式中，如图9中示意性地所示，有可能具有两个出口通道，第一个通道对应于返回通道23c，另一个通道对应于废物通道23d，在所述废物通道23d中无活性细胞从流体流中被移除，活细胞返回到细胞培养基。
55.允许连续或半连续分析细胞活力的介电泳盒5，与从细胞培养罐到返回细胞培养
罐的闭路连接相结合，使用蠕动泵或穿梭泵(或其他不具有接触液体培养基的致动器的泵类型)，一方面确保无菌液体回路，同时允许经济地自动分析培养基中的细胞状态。此外，所述介电泳盒和细胞培养罐与监控装置3无菌地分离，它们可以经济而容易地被处置，同时无需特殊处理即可再次使用所述监控装置。
56.所述介电泳盒5可结合到形成供给和返回导管40a、40b的柔软管，并且可移除地插入监控装置3的盒保持部分28的槽中，当在所述盒保持部分28内就位时，所述介电泳盒5进行定位，使得图像捕获系统7和光谱仪8定位在测量室23b上方，能够捕获在测量室中流动的细胞的运动并检测流体的特性。所述盒设置有在测量室中至少在测量室上方形成的透明窗口。所述透明窗口可以由电极支撑件19形成，例如以玻璃层的形式，但也可以通过基座20的透明聚合物窗口可见。
57.在某些变型中，光源13可定位在相对于图像捕获系统7的盒保持部分的相对侧上。
58.光谱仪8可用于捕获流体的特性，而图像捕获系统可用于检测液体内的细胞，以捕获通过所述测量室的细胞的运动。
59.连接到光谱仪8和图像捕获系统7的计算单元9利用算法进行配置，以计数细胞并分析细胞的轨迹并由此确定细胞的活力。所述计算单元包括一个连接到电极21的信号发生器12，用于产生行波介电泳信号。阻抗计11可以进一步连接到计算单元9，所述阻抗计测量流经测量室的液体的电阻抗。所述阻抗计可包括浸没在流经盒5的培养基中的两个间隔开的电极。
60.如图7最佳所示，根据一个有利的实施方式，多个电极可以形成一对镜像螺旋。在所示实施方式中，有八个电极，每个螺旋上四个。所示实施方式中的螺旋具有大体上矩形的形式，但可以具有椭圆形或圆形形式。在有利的实施方式中，可能具有更少的电极，例如六个或四个电极。
61.然而，在一个实施方式中(未示出)，可以仅具有多个电极的单个螺旋。
62.电极的这种螺旋形测量部分有利地允许减少电极的数量，同时提供行波介电泳信号的足够大的宽度应用，从而引起活细胞的容易测量的平移。
63.电极数量的减少有利地允许要接触的电极的数量的减少，所述接触部分21b向外延伸扩展且宽度增加，以便为监控装置的盒保持部分28中的电连接器31的互补端子31a提供足够的接触表面区域。如图5d和5c最佳所示，所述连接器31包括弹簧安装触点，当介电泳盒5完全插入盒保持部分28中时，所述弹簧安装触点弹性地压靠电极接触部分21b的金属化垫。
64.盒保持部分28包括盒保持槽29，在所述盒保持槽29内，介电泳盒可完全插入到测量位置，由此定位元件30，例如以突起30a的形式接收在介电泳盒的基座20中的相应凹部30b中，以在盒保持槽29内保持和定位介电泳盒。定位元件30b可以被弹性的安装在盒保持部分28中，或者可以是刚性的，由此弹性顺应性由介电泳盒5的材料提供，并且可选地通过为介电泳盒设置与盒保持部分28上的突起啮合的弹性引导件和凹部而提供。
65.所述监控装置可以设置有手动或电动驱动的喷射器33，所述喷射器包括推动机构(仅示意性地表示)，以将所述盒从盒保持槽29弹出或辅助弹出。
66.图像捕获系统7可以包括结合到允许光学图像的数字处理的数字图像捕获系统的光学显微镜12。然而，在变型中，可以采用其他图像捕获系统，诸如：
[0067]-相差成像，使用相差显微镜作为成像系统来增加图像的对比度并提高细胞识别的质量。
[0068]-共聚焦显微镜作为成像系统以增加图像的分辨率，由此共焦成像允许重建细胞的3d模型，其提高细胞表征的质量。
[0069]-光片显微镜可用于创建通道内部的3d图像。它将提供关于细胞形态的更多信息。
[0070]
在测量室23b中，可以在测量室部分的任何一个侧面设置侧向引导件27，以便确定测量室的精确高度，即电极支撑件19和测量室的地板之间的间隙。
[0071]
电极支撑件19可以安装在基座20的凹部25内，为电极支撑件19提供保护。
[0072]
因此，介电泳盒5可以被很容易地插入盒保持槽29，并牢固而准确地定位于所述盒保持槽内，同时通过经过基座20的电极连接窗口22压靠电极接触部分21b的所述连接器31的弹簧触点31a建立接触。
[0073]
因此，介电泳盒可以连接到供给和返回管道并连接到培养罐，所述培养罐可以单独准备，然后容易地与监控装置连接，以便在培养期间(例如细胞在培养基中生长的两周期间)对细胞进行半连续或连续分析。
[0074]
流体循环系统的闭合回路配置以及与监控装置的无菌分离，允许通过连接到计算单元的图像捕获系统对细胞进行自动分析，无需人工干预，从而允许培养基中的细胞特别安全、无菌和经济的生长。
[0075]
本发明的主要应用之一是在扩增期(例如～2周)以无菌方式监控细胞培养。本发明提供了一种可连接到检测装置的无菌的一次性试剂盒，所述一次性试剂盒在首次使用后被扔掉。使用与监控装置闭环连接的一次性试试剂盒，允许系统在培养的全部时间期间对细胞培养进行连续或半连续的分析。测量的数据可以通过通信网络获得，以实时远程跟踪细胞培养的状态。
[0076]
监控除了扩增期之外的其它时期也可以是令人感兴趣的，例如用于生物生产，这些时期例如包括对数期、稳定期和死亡期。介电泳可检测早期凋亡状态下的细胞。因此，向死亡期的转变可以被预期。
[0077]
所述系统的操作可包括以下方面。样品从细胞培养罐中提取出并流经介电泳盒。具有放大率的图像捕获系统记录通过所述盒的透明窗口观察到的穿过测量(观察)区的细胞。在观察区，行波介电泳被用于操作细胞。可以区分不同的细胞群并对其进行分类。
[0078]
培养基的光学和阻抗谱将允许监控进一步的参数，例如代谢物含量。可分析由这些测量产生的数据，以提供关于细胞培养状态的信息。
[0079]
细胞密度可以用图像捕获系统和计算单元中的后续图像分析来测量。对应于观察区的体积是已知的。可以用光学显微镜的投影模型计算两个维度(x和y)。测量室的高度是从机械设计中已知的，并且因此可以用图像识别算法自动完成计数。
[0080]
通过用图像捕获系统分析细胞的轨迹，可以用行波介电泳测量细胞活力。根据其轨迹，可以评估每个细胞的活力。通过将此与图像分析相关联，可以确定每个细胞类型的精确活力百分比。
[0081]
可以根据介电泳力产生的轨迹来鉴别细胞表型。细胞的大小、膜和介电特性在介电泳力中发挥作用。光学性质(形状、吸收)还可以从在信号处理单元中执行的图像处理算法中提取，并增加对细胞鉴别的自信。通过应用不同的信号模式，不同的细胞类型可以沿着
电极聚集。可以运行不同的信号配置(相位、振幅、时间)，并且利用图像捕获系统的反馈和/或利用强化学习的方法，可以将相同的细胞类型重新组合在一起。也可以使用类似的方法进行分类。
[0082]
鉴别细胞的能力允许观察某些细胞群是否生长得比其它更快或是否生长到损害所需细胞。所需细胞的培养条件(营养物、温度、稀释气体、ph、代谢物含量
…
)可以通过收集的数据和它们的分析得到改善。也可以在监控期间对不想要的细胞和其它颗粒(细菌、病毒)进行分类。
[0083]
除了提供关于培养状态的信息之外，还可以使用由光谱仪和阻抗计提供的与所述系统提供的其他数据(活力、细胞群
…
)结合的数据和存储在通信网络中的来自其他装置的数据。可以用算法(例如机器学习)找到模式，并且可以对当前培养进行预测。多个监控记录的数据可以在云或在分布式设备中收集和分析。
[0084]
使用的附图标记列表
[0085]
细胞培养监控系统1
[0086]
监控装置3
[0087]
图像捕获系统7
[0088]
显微镜12
[0089]
光13
[0090]
光谱仪8
[0091]
计算单元9
[0092]
信号发生器10
[0093]
阻抗计11
[0094]
盒保持部分28
[0095]
盒保持槽29
[0096]
定位元件30
[0097]
弹簧突起30a
[0098]
连接器31
[0099]
电端子31a
[0100]
喷射器33
[0101]
流体循环系统4
[0102]
介电泳盒5
[0103]
基座20
[0104]
电极连接窗口22
[0105]
微流体回路23
[0106]
入口通道23a
[0107]
测量室23b
[0108]
升高的地板26
[0109]
侧向导向件27
[0110]
返回通道23c
[0111]
废物通道23d
[0112]
补充入口通道23e
[0113]
出口(返回)24b
[0114]
入口(供给)24a
[0115]
定位凹部30b
[0116]
支撑安装凹部25
[0117]
电极支撑件19
[0118]
电极21
[0119]
测量区21a
[0120]
触点21b
[0121]
供给导管14a
[0122]
出口/返回导管14b罐供给/返回流体连接16穿孔管17
[0123]
流体连接器18
[0124]
供给连接18a
[0125]
返回连接18b
[0126]
泵6
[0127]
细胞培养罐2细胞培养基15