egfr抗原结合片段和包含它们的组合物
1.交叉参考
2.本技术要求保护2019年6月26日提交的美国临时申请第62/866,749号和2020年6月24日提交的美国临时申请第63/043,486号的权益，这两篇申请通过引用整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有序列表，其已经以ascii格式电子提交，且特此通过引用整体并入。所述ascii副本创建于2020年6月25日，名称为32808-779_601_sl.txt，并且是2,131,102个字节大小。
5.发明背景
6.许多经批准的癌症治疗剂是杀伤正常细胞以及肿瘤细胞的细胞毒性药物。这些细胞毒性药物的治疗益处取决于肿瘤细胞比正常细胞更敏感，从而允许使用不导致无法接受的副作用的剂量来实现临床响应。但是，基本上所有这些非特异性药物都会对正常组织造成一些(如果不严重的话)损害，这经常限制治疗适合性。
7.双特异性抗体可以通过指导免疫效应细胞杀伤癌细胞来提供细胞毒性药物的不同方法。双特异性抗体将源自两种单克隆抗体的不同结合特异性的益处组合到单一组合物中，能实现用单特异性抗体不可能实现的覆盖的方法或组合。在一种实施方案中，该方法依赖于双特异性抗体的一个臂与肿瘤相关的抗原或标志物的结合，而另一个臂在结合t细胞上的cd3分子时，通过释放效应分子诸如tnf-α、ifn-γ、白介素2、4和10、穿孔蛋白和颗粒酶，触发其细胞毒性活性。抗体工程的进展已经导致用于将效应细胞重定向至肿瘤靶标的许多双特异性抗体形式和组合物的开发，包括通过在肿瘤部位募集和活化t细胞的多克隆群体而起作用的双特异性抗体，并且这样做不需要共刺激或常规mhc识别。但是，仍存在双重问题，即，某些患者经历被称作“细胞因子风暴(cytokine storm)”或“细胞因子释放综合征”的严重副作用(lee dw等人current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome.blood.2014 124(2):188-195)，其由tnf-α和ifn-γ以及其它细胞因子的释放介导，此外，事实上一些双特异性组合物具有非常短的半衰期(为了在治疗窗内维持循环浓度足以达到治疗效果的时间而需要连续输注四至八周)或具有可变的效果。因此，在开发用于癌症治疗的有效双特异性抗体的领域存在未得到满足的需求。
8.发明概述
9.本发明涉及掺入嵌合融合蛋白中的抗表皮生长因子受体(egfr)抗原结合片段及其使用方法或制备方法。在一个方面，本文公开了包含抗原结合片段(af1)的多肽，其中所述af1包含轻链互补决定区(cdr-l)、重链互补决定区(cdr-h)、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1：a.特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)；和b.包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，其中fr-h1具有seq id no:14-16中的任一个的氨基酸序列，fr-h2具有seq id no:18或seq id no:19的氨基酸序列，fr-h3具有seq id no:20或seq id no:21的氨基酸序列，并且fr-h4具有seq id no:22-24中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述af1包含与seq id no:37-51中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，af1是嵌合或
人源化抗原结合片段。在一种实施方案中，所述af1选自由fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、线性抗体和单链可变片段(scfv)组成的组。
10.在另一种实施方案中，所述af1包含与seq id no:28-32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨基酸序列。在某些实施方案中，所述af1包含与seq id no:25-27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。
11.在一些实施方案中，af1还包含cdr-h3，其中cdrh3具有seq id no:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述af1还包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在某些实施方案中，所述af1 cdr-l包含分别包含seq id no:1、2和3的氨基酸序列的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。
12.在其它实施方案中，af1还包含fr-l，其包含fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4，其中a.fr-l1表现出与seq id no:7的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；b.fr-l2表现出与seq id no:8的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；c.fr-l3表现出与seq id no:9-11的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；以及d.fr-l4表现出与seq id no:13的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同。在某些实施方案中，所述fr-l包含：a.具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l1，b.具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l2，c.具有seq id no:9的氨基酸序列的fr-l3，d.具有seq id no:13的氨基酸序列的fr-l4。在另一种实施方案中，所述fr-l包含：a.具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l1，b.具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l2，c.具有seq id no:10的氨基酸序列的fr-l3，d.具有seq id no:13的氨基酸序列的fr-l4。在又一种实施方案中，所述fr-l包含：a.具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l1，b.具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l2，c.具有seq id no:11的氨基酸序列的fr-l3，以及d.具有seq id no:13的氨基酸序列的fr-l4。
13.在一种实施方案中，所述fr-h包含：a.具有seq id no:14的氨基酸序列的fr-h1，b.具有seq id no:18的氨基酸序列的fr-h2，c.具有seq id no:20的氨基酸序列的fr-h3，以及d.具有seq id no:22或23的氨基酸序列的fr-h4。在其它实施方案中，所述fr-h包含：a.具有seq id no:15的氨基酸序列的fr-h1，b.具有seq id no:19的氨基酸序列的fr-h2，c.具有seq id no:21的氨基酸序列的fr-h3，和d.具有seq id no:24的氨基酸序列的fr-h4。在某些实施方案中，所述fr-h包含：a.具有seq id no:16的氨基酸序列的fr-h1，b.具有seq id no:19的氨基酸序列的fr-h2，c.具有seq id no:20的氨基酸序列的fr-h3，以及d.具有seq id no:22或23的氨基酸序列的fr-h4。在一些实施方案中，相对于seq id no:52的氨基酸序列，所述af1在框架区中具有对疏水性氨基酸的至少一个或至少两个氨基酸取代，其中所述疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，并且取代氨基酸选自精氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺。
14.在一种实施方案中，所述多肽还包含第一释放区段肽(rs1)和/或第一延长重组多肽(xten1)，其中所述rs1为哺乳动物蛋白酶切割的底物。在一些实施方案中，处于未切割状态的融合蛋白具有af1-rs1-xten1或xten1-rs1-af1的从n-端至c-端的结构排列。
15.在一些实施方案中，所述rs1是选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：豆荚蛋白
(legumain)、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-11、mmp-14、upa和间质蛋白酶。在其它实施方案中，所述rs1包含与选自seq id no:53-671中任一种的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述rs1包含选自以下序列的氨基酸序列：rsr-2089、rsr-2295、rsr-2298、rsr-2488、rsr-2599、rsr-2485、rsr-2486、rsr-2728、rsn-2089、rsn-2295、rsn-2298、rsn-2488、rsn-2599、rsn-2485、rsn-2486、rsn-2728、rsc-2089、rsc-2295、rsc-2298、rsc-2488、rsc-2599、rsc-2485、rsc-2486和rsc-2728，其中每个在表5中示出。
16.在一些实施方案中，本文公开的多肽还包含第一延长重组多肽(xten1)，其中xten1的特征在于，a.它具有至少约36个氨基酸；b.xten1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)；和c.它具有至少4-6种不同的选自g、a、s、t、e和p的氨基酸。在某些实施方案中，xten1包含含有seq id no:672-675的氨基酸序列中的至少三个的氨基酸序列。在另一种实施方案中，xten1包含与选自seq id no:676-734中任一个的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，xten1包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：ae144_1a、ae144_2a、ae144_2b、ae144_3a、ae144_3b、ae144_4a、ae144_4b、ae144_5a、ae144_6b、ae144_7a、ae284、ae288_1、ae288_2、ae288_3、ae292、ae293、ae300、ae576、ae584、ae864、ae864_2、ae865、ae866、ae867和ae868，其中每个在表7中示出。
17.在某些实施方案中，所述af1相对于由seq id no:52中所示的序列组成的抗原结合片段具有更高的等电点(pi)。在一种实施方案中，所述af1掺入多肽中以形成抗egfr双特异性抗体，所述多肽相对于对照双特异性抗体表现出更高的pi，其中所述多肽包含所述af1和结合t细胞受体分化簇3(cd3)的参考抗原结合片段，并且其中除所述af1被seq id no:52替代之外，所述对照双特异性抗原结合片段与所述多肽相同。在另一种实施方案中，所述af1表现出比由seq id no:52中所示的序列组成的抗原结合片段的pi高至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0ph单位的pi。在某些实施方案中，所述af1表现出在5.4和6.6之间、包括端点的pi。在其它实施方案中，所述af1表现出的pi为约5.4至约5.6、或约5.5至约5.7、或约5.6至约5.8、或约5.7至约5.9、或约5.8至约6.0、或约5.9至约6.1、或约6.0至约6.2、或约6.1至约6.3、或约6.2至约6.4、或约6.3至约6.5或约6.4至约6.6。在另一种实施方案中，af1表现出的pi为约5.4、或约5.5、或约5.6、或约5.7、或约5.8、或约5.9、或约6.0、或约6.1、或约6.2、或约6.3、或约6.4、或约6.5或约6.6。
18.在某些实施方案中，所述af1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)egfr。在其它实施方案中，所述af1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)egfr。在一些实施方案中，所述af1以在约0.1nm和约100nm之间的kd特异性地结合egfr，如在包含egfr或其表位的体外抗原结合测定中所确定的。
19.在另一种实施方案中，所述多肽还包含特异性地结合t细胞受体分化簇3(cd3)的第二抗原结合片段(af2)。在某些实施方案中，(1)af2片段选自由fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scfv)组成的组，或(2)af1和af2被构造成(fab’)2或单链双体(diabody)。
20.在一些实施方案中，所述af2通过柔性肽接头融合至af1。在某些实施方案中，所述柔性接头包含2或3类选自由甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的组的氨基酸。
21.在一些实施方案中，所述af2包含与seq id no:766或seq id no:769的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨基酸序列。在某些实施方案中，所述af2包含与seq id no:765、767、768、770或771中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。在另一种实施方案中，所述af2包含与seq id no:776-780中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。
22.在某些实施方案中，所述af2包含轻链互补决定区(cdr-l)和重链互补决定区(cdr-h)，并且其中抗原结合片段包含分别具有seq id no:742、743和744的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在一些实施方案中，所述cdr-l包含：a.具有seq id no:735或736的氨基酸序列的cdr-l1；b.具有seq id no:738或739的氨基酸序列的cdr-l2；和c.具有seq id no:740的氨基酸序列的cdr-l3。
23.在其它实施方案中，所述af2还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，其中所述af2包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:748-751中的任一个的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:755或seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在另一种实施方案中，所述抗原结合片段包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:748的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:755的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在又一种实施方案中，所述抗原结合片段包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:749的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在某些实施方案中，所述抗原结合片段包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:750的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在又一种实施方案中，所述抗原结合片段包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:751的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。
24.在一些实施方案中，所述多肽还包含第二释放区段(rs2)和/或第二延长重组多肽(xten2)，其中所述rs2是哺乳动物蛋白酶切割的底物。在一些实施方案中，rs1和rs2的序列是相同的。在另一种实施方案中，rs1和rs2的序列是不同的。
25.在一些实施方案中，所述多肽具有如下的从n-端至c-端结构排列：xten1-rs1-af1-af2-rs2-xten2、xten1-rs1-af2-af1-rs2-xten2、xten2-rs2-af2-af1-rs1-xten1、xten2-rs2-af1-af2-rs1-xten1、xten2-rs2-双体-rs1-xten1或xten1-rs1-双体-rs2-xten2，其中所述双体包含af1和af2的vl和vh，其中af2特异性地结合cd3并且af1特异性地结合egfr，并且其中xten 1和xten2具有相同或不同的氨基酸长度或序列。
26.在某些实施方案中，所述rs2是选自豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-11、mmp-14、upa和间质蛋白酶的蛋白酶的底物。在其它实施方案中，所述rs2包含与选自seq id no:53-671的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，rs1和rs2各自是用于被多于一种蛋白酶在每个释放区段序列内的一个、二个或三个切割位点处切割的底物。
27.在一些实施方案中，所述xten2的特征在于a.其具有至少约36个氨基酸；b.xten 2序列中至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)；和c.它具有至少4-6种不同的选自g、a、s、t、e和p的氨基酸。在某些实施方案中，所述xten2包含与选自seq id no:676-734的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述xten2包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：ae144_1a、ae144_2a、ae144_2b、ae144_3a、ae144_3b、ae144_4a、ae144_4b、ae144_5a、ae144_6b、ae144_7a、ae284、ae288_1、ae288_2、ae288_3、ae292、ae293、ae300、ae576、ae584、ae864、ae864_2、ae865、ae866、ae867和ae868，其中每个在表7中示出。在某些实施方案中，所述xten2包含含有seq id no:672-675的氨基酸序列中的至少三个的氨基酸序列。
28.在一些实施方案中，所述af2的tm比由seq id no:781的序列组成的抗原结合片段的tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃，如通过在体外测定中解链温度的增加所确定的。
29.在一些实施方案中，所述af2结合选自cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3α和cd3βε中任一种的cd3复合物亚基。在一种实施方案中，所述af2特异性地结合人或食蟹猴(cyno)cd3。在又一种实施方案中，所述af2特异性地结合人和食蟹猴(cyno)cd3。
30.在其它实施方案中，所述af2以约10nm和约400nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在某些实施方案中，所述af2以约10nm和约400nm之间，或约50nm和约350nm之间，或约100nm和300nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在某些实施方案中，所述af2以小于约3nm、或约10nm、或约50nm、或约100nm、或约150nm、或约200nm、或约250nm、或约300nm、或约400nm的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在其它实施方案中，所述af2以比由seq id no:781的氨基酸序列组成的抗原结合片段低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合
h3及具有seq id no:24的氨基酸序列的fr-h4。在又一种实施方案中，所述fr-h包含：具有seq id no:16的氨基酸序列的fr-h1、具有seq id no:19的氨基酸序列的fr-h2、具有seq id no:20的氨基酸序列的fr-h3及具有seq id no:22或23的氨基酸序列的fr-h4。
36.在某些实施方案中，所述fr-l1表现出与seq id no:7的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；fr-l2表现出与seq id no:8的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；fr-l3表现出与seq id no:9-11的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；并且fr-l4表现出与seq id no:13的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同。在其它实施方案中，所述fr-l包含：具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l1、具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l2、具有seq id no:9的氨基酸序列的fr-l3及具有seq id no:13的氨基酸序列的fr-l4。在又一种实施方案中，所述fr-l包含：具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l1、具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l2、具有seq id no:10的氨基酸序列的fr-l3及具有seq id no:13的氨基酸序列的fr-l4。在另一种实施方案中，所述fr-l包含：具有seq id no:7的氨基酸序列的fr-l1、具有seq id no:8的氨基酸序列的fr-l2、具有seq id no:11的氨基酸序列的fr-l3及具有seq id no:13的氨基酸序列的fr-l4。
37.在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合单元的af2包含轻链互补决定区(cdr-l)和重链互补决定区(cdr-h)，并且其中抗原结合单元包含分别具有seq id no:742、743和744的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在一些实施方案中，所述af2包含与seq id no:766或seq id no:769的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨基酸序列。在其它实施方案中，所述af2包含与seq id no:765、767、768、770或771中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。在某些实施方案中，所述af2包含与seq id no:776-780中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。
38.在其它实施方案中，所述af2的cdr-l包含：具有seq id no:735或736的氨基酸序列的cdr-l1，具有seq id no:738或739的氨基酸序列的cdr-l2，和具有seq id no:740的氨基酸序列的cdr-l3。
39.在其它实施方案中，所述af2还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中af2包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:748-751中的任一个的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:755或seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在某些实施方案中，所述af2还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中抗原结合单元包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:748的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:755的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在其它实施
方案中，所述af2还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中抗原结合单元包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:749的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在另一实施方案中，所述af2还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中抗原结合单元包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:750的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。在某些实施方案中，所述af2还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中抗原结合单元包含：a.具有seq id no:746的氨基酸序列的fr-l1；b.具有seq id no:747的氨基酸序列的fr-l2；c.具有seq id no:751的氨基酸序列的fr-l3；d.具有seq id no:754的氨基酸序列的fr-l4；e.具有seq id no:756的氨基酸序列的fr-h1；f.具有seq id no:759的氨基酸序列的fr-h2；g.具有seq id no:760的氨基酸序列的fr-h3；和h.具有seq id no:764的氨基酸序列的fr-h4。
40.在一些实施方案中，所述af2通过柔性肽接头融合至af1。在某些实施方案中，所述柔性接头包含2或3类选自由甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸组成的组。
41.在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合单元还包含第一释放区段肽(rs1)和第二释放区段肽(rs2)，其中所述rs1和所述rs2中的每一个为用于被哺乳动物蛋白酶切割的底物。在一种实施方案中，rs1和rs2是相同的。在另一种实施方案中，rs1和rs2是不同的。在某些实施方案中，rs1和rs2中的每一个是选自豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-11、mmp-14、upa和间质蛋白酶组成的组的蛋白酶的底物。在其它实施方案中，rs1和rs2中的每一个包含与选自seq id no:53-671中的任一个的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一种实施方案中，所述rs1和rs2中的每一个包含选自以下序列的氨基酸序列：rsr-2089、rsr-2295、rsr-2298、rsr-2488、rsr-2599、rsr-2485、rsr-2486、rsr-2728、rsn-2089、rsn-2295、rsn-2298、rsn-2488、rsn-2599、rsn-2485、rsn-2486、rsn-2728、rsc-2089、rsc-2295、rsc-2298、rsc-2488、rsc-2599、rsc-2485、rsc-2486和rsc-2728，其中每个在表5中示出。
42.在一些实施方案中，所述双特异性抗原结合单元还包含第一延长重组多肽(xten1)和第二延长重组多肽，其中xten1和xten2中的每一个的特征在于其具有a.至少约36个氨基酸；b.xten1或xten2序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)；和c.至少4-6种不同的选自g、a、s、t、e和p的氨基酸。在一种实施方案中，所述xten1和所述xten2是相同的。在另一种实施方案中，所述xten1和所述xten2是不同的。
43.在某些实施方案中，所述xten1和所述xten2中的每一个包含含有seq id no:672-675的氨基酸序列中的至少三个的氨基酸序列。在又一种实施方案中，所述xten1和所述xten2中的每一个包含与选自seq id no:676-734中任一个的序列具有至少约90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，xten1和xten2中的每一个包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列ae144_1a、ae144_2a、ae144_2b、ae144_3a、ae144_3b、ae144_4a、ae144_4b、ae144_5a、ae144_6b、ae144_7a、ae284、ae288_1、ae288_2、ae288_3、ae292、ae293、ae300、ae576、ae584、ae864、ae864_2、ae865、ae866、ae867和ae868，其中每个在表7中示出。
44.在一些实施方案中，所述双特异性抗原结合单元具有如下从n-端到c-端的结构排列：xten1-rs1-af1-af2-rs2-xten2、xten1-rs1-af2-af1-rs2-xten2、xten2-rs2-af2-af1-rs1-xten1、xten2-rs2-af1-af2-rs1-xten1、xten2-rs2-双体-rs1-xten1或xten1-rs1-双体-rs2-xten2，其中所述双体包含af1和af2的vl和vh。
45.在一些实施方案中，所述af1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)egfr。在其它实施方案中，所述af1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)egfr。在某些实施方案中，所述af2结合选自cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3α和cd3βε中任一种的cd3复合物亚基。在另一种实施方案中，所述af2特异性地结合人或食蟹猴(cyno)cd3。在又一种实施方案中，所述af2特异性地结合人和食蟹猴(cyno)cd3。
46.在一种实施方案中，所述af1以在约0.1nm和约100nm之间的kd特异性地结合egfr，如在包含egfr或其表位的体外抗原结合测定中所确定的。
47.在其它实施方案中，所述af1以约0.1nm和约100nm之间，或在约0.5nm和约50nm之间，或在约1.0nm和约20nm之间，或在约2.0nm和约10nm之间的解离常数(kd)特异性地结合egfr，如在体外抗原结合测定中所确定的。在一些实施方案中，所述af2以约10nm和约400nm之间，或约50nm和约350nm之间，或约100nm和300nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在某些实施方案中，所述af2以小于约3nm、或约10nm、或约50nm、或约100nm、或约150nm、或约200nm、或约250nm、或约300nm、或者约400nm的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在又一种实施方案中，所述af2以比由seq id no:781的氨基酸序列组成的抗原结合片段小至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合人或食蟹猴cd3，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(kd)所确定的。在一些实施方案中，所述af2对cd3表现出的结合亲和力相对于所述af1的结合亲和力弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或至少1000倍，如通过体外抗原结合测定中的各自解离常数(kd)所确定的。
48.在另一个方面，本公开内容提供了包含本文公开的多肽和一种或更多种药学上合适的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制成用于真皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌肉内施用。在另一种实施方案中，所述药物组合物呈液体形式或冷冻形式。在某些实施方案中，所述药物组合物是在用于单次注射的预填充注射器中。在另一种实施方案中，所述药物组合物被配制为要在施用前重构的冻干粉末。
49.在又一方面，本公开内容提供本文公开的多肽，其用于制备用于治疗有相应需要的受试者的疾病的药物。在一些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的癌症的组：未分化甲状腺癌和髓样甲状腺癌、阑尾癌、卵巢睾丸母细胞瘤、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管的癌症、类癌瘤、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、子宫内膜癌、伴有恶性腹水的
腹膜内上皮恶性肿瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、输卵管癌、滤泡癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、ge-连接癌、生殖泌尿道癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝母细胞瘤、肝癌、hr 和her2 乳腺癌、hurthle细胞癌、炎性乳腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤(骨癌)、卵巢癌、卵巢癌伴恶性腹水、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状癌、甲状旁腺癌、腹膜癌扩散(peritoneal carcinomatosis)、腹膜间皮瘤、原始性神经外胚层瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃部癌、睾丸癌、甲状腺癌、三阴性乳腺癌、尿路上皮癌、子宫癌、子宫浆液性癌、阴道癌、外阴癌、肾母细胞瘤。
50.在相关方面，本公开内容提供了治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用一个或更多个治疗有效剂量的本文中公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者选自由小鼠、大鼠、猴和人组成的组。
51.在某些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的癌症的组：未分化甲状腺癌和髓样甲状腺癌、阑尾癌、卵巢睾丸母细胞瘤、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管的癌症、类癌瘤、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、子宫内膜癌、伴有恶性腹水的腹膜内上皮恶性肿瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、输卵管癌、滤泡癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、ge-连接癌、生殖泌尿道癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝母细胞瘤、肝癌、hr 和her2 乳腺癌、hurthle细胞癌、炎性乳腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤(骨癌)、卵巢癌、卵巢癌伴恶性腹水、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状癌、甲状旁腺癌、腹膜癌扩散、腹膜间皮瘤、原始性神经外胚层瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃部癌、睾丸癌、甲状腺癌、三阴性乳腺癌、尿路上皮癌、子宫癌、子宫浆液性癌、阴道癌、外阴癌、肾母细胞瘤。在其它实施方案中，将所述药物组合物以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用的一个或更多个治疗有效剂量施用至受试者。在某些实施方案中，将所述药物组合物在至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的时间段中以一个或更多个治疗有效剂量施用至受试者。在一些实施方案中，所述剂量被真皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌肉内施用。
52.在某些方面，本公开内容提供了分离的核酸，所述核酸包含(a)编码本文中公开的多肽的多核苷酸；或(b)(a)的多核苷酸的互补序列。
53.在相关方面，本公开内容提供了表达载体，其包含本文中公开的多核苷酸序列和可操作地连接至所述多核苷酸序列的重组调节序列。
54.在又一个方面，本公开内容提供了分离的宿主细胞，其包含本文中公开的表达载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核生物。在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)或哺乳动物细胞。
55.通过引用并入
56.在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。
57.附图简述
58.在所附权利要求中具体阐述了本公开内容的各种特征。参考以下阐述示例性实施方案(其中利用了本发明的原理)的详细描述，将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，且其中附图：
59.图1描绘了双特异性抗原结合片段组合物的各种组分。图1a描绘了对靶细胞标志物具有亲和力的抗原结合片段。图1b描绘了对效应细胞具有亲和力的抗原结合片段。图1c和图1d描绘了不同长度的xten多肽。图1e描绘了可切割的释放区段。
60.图2描绘了本文描述的多肽组合物的两种不同形式。图2a在左侧描绘了与释放区段和xten融合的针对效应细胞的抗原结合片段，而箭头描绘了蛋白酶切割释放区段的作用，导致在右侧，xten从多肽的抗原结合片段释放，使得抗原结合片段恢复结合亲和力潜力(例如，其完全结合亲和力潜力)，因为它不再被xten屏蔽。图2b在左侧描绘了双特异性组合物，其具有针对效应细胞的抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段。释放区段和xten也融合至对效应细胞具有亲和力的抗原结合片段，而箭头描绘了蛋白酶切割释放区段的作用，导致在右侧xten和融合的抗原结合片段从多肽的释放，由于它们不再被xten屏蔽，因此它们然后将恢复它们的完全结合亲和力潜力。
61.图3描绘了双特异性抗原结合多肽的两种不同形式。在左侧，双特异性组合物具有针对效应细胞的抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段，其中释放区段(剪刀指示对蛋白酶切割的敏感性)和xten融合至对效应细胞具有结合亲和力的抗原结合片段，而在右侧，双特异性组合物具有针对效应细胞的抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段，其中释放区段和xten融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗原结合片段。
62.图4描绘了双特异性抗原结合多肽的三种不同形式。图4a描绘了双特异性组合物，其具有针对效应细胞的scfv抗原结合片段，该片段融合至对靶细胞标志物具有结合亲和力的scfv抗原结合片段，其中释放区段(剪刀指示对蛋白酶切割的敏感性)和xten融合至每个抗原结合片段。图4b和图4c是图4a的变体，其中抗原结合片段处于双体构型，其中释放区段(剪刀指示对蛋白酶切割的敏感性)和xten分别融合至针对效应细胞或靶细胞标志物的抗原结合片段。
63.图5显示了在肿瘤组织(在顶部)和正常组织(在底部)附近的双特异性抗原结合多肽的示意图。与在正常组织中相比，双特异性抗原结合多肽优先在肿瘤组织处被切割以释放一个或更多个xten部分。被切割的双特异性抗原结合多肽能够结合t细胞和表达肿瘤特异性标志物的肿瘤细胞。
64.图6描绘了对照释放区段rsr-1517的氨基酸序列(seq id no:53)，显示了所列蛋白酶的肽切割位点。
65.发明详述
66.尽管在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将将理解，这样的实施方案仅作为示例提供。现在本领域技术人员会想到众多变体、变化和替换而不脱离本发明。应当理解，本文描述的发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。所附权利要求意图限定本发明的范围，并且由此覆盖在这些权利要求和它们的等同方案的范围内的方法和结构。
67.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通
技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但是下面描述了适合的方法和材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，所述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的，而非意图是限制性的。现在本领域技术人员会想到众多变体、变化和替换而不脱离本发明。
68.定义
69.在本技术的上下文中，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义：
70.如贯穿说明书和权利要求书所使用的，术语“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”以它们表示“至少一个/种”、“至少第一个/种”、“一个/种或更多个/种”或“多于一个/种”所提及的组成部分或步骤的含义使用，除了其中在此后具体说明上限的情况以外。因此，如本文中使用的“释放区段”是指“至少第一释放区段”，但包括多于一个释放区段。本领域普通技术人员考虑到本公开内容将知道组合的可操作限制和参数，以及任何单一剂的量。
71.术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于表示任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，且它可以被非氨基酸间隔。该术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，诸如与标记组分缀合。
72.如应用于多肽的术语“单体”表示多肽作为单个连续氨基酸序列的状态，所述序列基本上未与具有相同或不同序列的一种或更多种额外多肽缔合。
73.本文中使用的术语“氨基酸”表示天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括、但不限于d或l光学异构体，以及氨基酸类似物和肽拟似物(peptidomimetics)。标准的单字母或三字母代码可用于指定氨基酸。
74.术语“天然的l-氨基酸”或“l-氨基酸”是指甘氨酸(g)、脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、甲硫氨酸(m)、半胱氨酸(c)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)和苏氨酸(t)的l光学异构体形式。
75.术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用并涵盖各种抗体结构，包括、但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、纳米抗体(nanobodies)、vhh抗体和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(ig)在本文中与抗体可互换使用。全长抗体可以是例如单克隆的、重组的、嵌合的、去免疫化的、人源化的和人的抗体。抗体代表了一大类分子，其包括几种类型的分子，诸如igd、igg、iga、igm和ige。术语“免疫球蛋白分子”包括例如杂交抗体或改变的抗体及其片段。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由天然存在的抗体或单克隆抗体的片段来执行。
[0076]“人源化的”抗体表示包含来自非人互补决定区(cdr)的氨基酸残基和来自人框架区(fr)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部或至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的cdr对应于非人抗体的cdr(其可以包含氨基酸取代)，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的fr(其可以包含氨基酸取代)。
[0077]
如本文中使用的术语“单克隆抗体”表示从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合同一表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量
存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法是本领域已知的或本文描述的。
[0078]
如本文中使用的“抗原结合片段”表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有与抗原特异性地结合(“免疫反应”)的抗原结合位点的分子。实例包括、但不限于：fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、f(ab
′
)2、双体、线性抗体(参见美国专利号5,641,870)、单结构域抗体、单结构域骆驼科抗体、单链可变片段(scfv)抗体分子以及由保留特异性结合抗原的能力的抗体片段形成的多特异性抗体。术语“抗原结合片段”还涵盖具有适合并识别和结合表位的特定形状的任何含多肽链的分子结构，其中一种或更多种非共价结合相互作用稳定分子结构和表位之间的复合。如果与抗原结合片段结合其它参考抗原(包括多肽或其它物质)相比抗原结合片段以更大的亲和力(affinity)或亲合性(avidity)结合，则所述抗原结合片段与抗原“特异性地结合”或“免疫反应”。
[0079]“scfv”或“单链可变片段”在本文中互换地用于表示包含抗体的重链可变区(“vh”)和轻链可变区(“vl”)或的两个拷贝的vh或vl链的抗体片段形式，它们通过短的柔性肽接头连接在一起，使scfv能够形成抗原结合所需的结构。scfv是免疫球蛋白的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的融合蛋白，并且可以在大肠杆菌或其它宿主细胞中以功能形式容易地表达。
[0080]“双体(diabody)”表示通过构建在vh和vl结构域之间具有短接头(约5-10个残基)的scfv片段而制备的小抗体片段，从而实现v结构域的链间而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体是两个“交叉(crossover)”scfv片段的异源二聚体，其中两个抗体的vh和vl结构域存在于不同的多肽链上。双体更完整地描述在例如us7635475中。
[0081]
术语“双特异性抗原结合片段”应理解为对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗原结合片段。
[0082]
术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文中互换地用于表示抗体、抗体片段或基于抗体片段的分子所结合或具有针对特异性的结构或结合决定簇。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物或其部分。抗原也是对抗原具有结合亲和力的那些抗体或抗体片段的配体。本文所述的非限制性示例性抗原包括来自人、非人类灵长类动物、鼠的cd3和egfr(及其部分)及其它同源物。
[0083]
术语“cd3抗原结合片段”表示能够以足够的亲和力结合分化簇3(cd3)或cd3复合物的成员的抗原结合片段，使得该抗原结合片段可用作靶向cd3的诊断剂和/或治疗剂。
[0084]“egfr抗原结合片段”表示能够结合表皮生长因子受体的抗原结合片段。egfr是erbb受体家族的成员，erbb受体家族是四种密切相关的受体酪氨酸激酶的亚家族：egfr(erbb-1)、her2/neu(erbb-2)、her 3(erbb-3)和her 4(erbb-4)。
[0085]“靶组织”或“靶细胞”表示携带egfr抗原的组织或细胞，egfr抗原是疾病状况(例
如但不限于癌症或相关状况)的原因或部分。患病的靶组织或细胞的来源包括身体器官、肿瘤、癌细胞、或癌细胞群、或形成基质或被发现与癌细胞群相关的细胞、骨、皮肤、产生促成疾病状况的细胞因子或因子的细胞。
[0086]
术语“表位”表示抗体、抗体片段或结合结构域所结合的抗原分子上的特定位点。表位是抗体或抗体片段的配体。
[0087]“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本文中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对它的配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。本文中使用的“更大的结合亲和力”是指更低的kd值；例如，1
×
10-9
m是比1
×
10-8
m更大的结合亲和力。结合感兴趣的抗原(例如，肿瘤相关的egfr抗原)的抗体是以足够的亲和力结合该抗原且不与其它蛋白显著地交叉反应的抗体，使得该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断剂和/或治疗剂。
[0088]“解离常数”或“k
d”可互换使用，且表示配体“l”和蛋白“p”之间的亲和力；即配体结合特定蛋白的紧密程度。它可以使用公式kd＝[l][p]/[lp]计算，其中[p]、[l]和[lp]分别代表蛋白、配体和复合物的摩尔浓度。
[0089]
术语“高变区”、“hvr”或“cdr”，当在本文中使用时，可互换地表示抗体可变结构域的序列方面高变和/或形成在结构上限定的环和/或参与抗原识别的区域。通常，抗体包含六个高变区；三个在vh中(h1、h2、h3)，并且三个在vl(l1、l2、l3)中。许多cdr描述被使用并且被包含在本文中；例如，cdr-l1表示轻链的第一高变cdr区域，cdr-h2表示重链的第二高变cdr区域，等等。kabat互补决定区(cdr)基于序列变异性并且是最常用的(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。
[0090]“等电点”或“pi”在本文中互换地用于表示特定分子不携带净电荷或在统计平均值中为电中性时的ph。表示等电点的标准命名法是ph，使得单位是ph单位；例如，具有6.3的pi的抗原结合片段在ph 6.3的溶液中将具有中性电荷。等电点可以用数学方法确定，包括许多用于估计肽和蛋白的等电点的算法；例如，使用不同pk值的henderson-hasselbalch方程式。等电点也可以通过体外测定诸如毛细管电泳聚焦进行实验确定。
[0091]“框架”或“fr”残基是抗原结合片段中除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基，并且通常位于cdr之间或侧接cdr。许多fr描述被使用中并被包含在本文中；例如，fr-l1表示轻链的第一fr区域，fr-h2表示重链的第二fr区域，等等。
[0092]
术语“释放区段(release segment)”或“rs”是指在主题组合物中的切割序列，其可以被一种或更多种蛋白酶识别和切割，从而实现抗原结合片段和xten从组合物的释放。本文中使用的“哺乳动物蛋白酶”是指通常存在于哺乳动物的体液、细胞、组织中并且可以以更高的水平见于某些靶组织或细胞中(例如，在患病的组织(例如，肿瘤)中)的蛋白酶。rs序列可工程改造为被各种哺乳动物蛋白酶或多于一种哺乳动物蛋白酶切割，所述哺乳动物蛋白酶存在于受试者的靶组织中或附近或在体外测定中引入。可以使用能够识别限定的切割位点的其它等效蛋白酶(内源性的或外源性的)。特别考虑到，rs序列可以根据所利用的蛋白酶来调整和定制并且可以掺入接头氨基酸中以与相邻多肽连接。
[0093]
术语“切割位点”表示在肽或多肽中相邻氨基酸之间的可以被酶(诸如蛋白酶)破
坏或切割(相邻氨基酸之间的肽键断裂)的位置。
[0094]
术语“在
…
内”，当提及与第二多肽连接的第一多肽时，涵盖分别将第一或第二多肽的n端连接至第二或第一多肽的c端的额外组件的连接或融合，以及第一多肽向第二多肽的序列中的插入。例如，当rs组件连接“在嵌合多肽组装体内”时，该rs可以连接至n端、c端，或者可以插入在xten多肽的任何两个氨基酸之间。
[0095]
用于本文提供的组合物的形式的“活性”表示该组合物的效应组分的作用或效果，包括、但不限于抗原结合、拮抗剂活性、激动剂活性、细胞或生理响应、细胞裂解、细胞死亡、或本领域公知的效果，无论是通过体外、离体或体内测定还是通过临床效果所测量的。
[0096]
本文使用的“效应细胞”包括能够对靶细胞赋予作用的任何真核细胞。例如，效应细胞可以诱导靶细胞的膜完整性的丧失、核固缩(pyknosis)、核碎裂(karyorrhexis)、细胞凋亡、裂解和/或死亡。在另一实例中，效应细胞可以诱导靶细胞的分裂、生长、分化或者以其它方式改变靶细胞的信号转导。效应细胞的非限制性实例包括：浆细胞、t细胞、cd4细胞、cd8细胞、b细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)、肥大细胞、树突细胞、调节性t细胞(regt细胞)、辅助性t细胞、髓样细胞、巨噬细胞和nk细胞。
[0097]“效应细胞抗原”表示由效应细胞表达的分子，包括、但不限于细胞表面分子诸如蛋白、糖蛋白或脂蛋白。示例性的效应细胞抗原包括以下蛋白：cd3复合物或t细胞受体(tcr)、cd4、cd8、cd25、cd38、cd69、cd45ro、cd57、cd95、cd107和cd154，以及效应分子，诸如与效应细胞缔合、结合的细胞因子，在效应细胞内表达的细胞因子，或由效应细胞表达和释放的细胞因子。效应细胞抗原可以充当主题嵌合多肽组装体的结合结构域的结合对应物。
[0098]
本文中使用的“cd3”或“分化簇3”是指t细胞表面抗原cd3复合物，其包括呈单独形式或独立组合形式的所有已知cd3亚基，例如cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3α和cd3β。cd3ε、γ和δ的细胞外结构域含有免疫球蛋白-样结构域，因此被认为是免疫球蛋白超家族的一部分。cd3包括例如人cd3ε蛋白(ncbi refseq no.np_000724)，其长度为207个氨基酸，以及人cd3γ蛋白(ncbi refseq no.np_000064)，其长度为182个氨基酸。
[0099]
本文中使用的术语“elisa”表示如本文所述的或本领域以其它方式已知的酶联免疫吸附测定。
[0100]“宿主细胞”包括可以是或已经是已引入外源核酸的主题载体(诸如本文描述的那些)的接受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然的、意外的或有意的突变，后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学方面或者在总dna互补序列的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。
[0101]
当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”是指已经从其天然环境的组分或从更复杂的混合物(诸如在蛋白纯化期间)鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染物组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白性的或非蛋白性的溶质。如对本领域技术人员来说明显的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不要求“分离”以使之与其天然存在的对应物区别开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段可与其天然存在的对应物相区别，因为浓度或每体积的分子数目通常大于其天然存在的对应物的值。一般而言，通过重组方法制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
[0102]“分离的核酸”是从编码多肽的核酸的天然来源中通常伴随的至少一种污染物核
酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子。例如，分离的编码多肽的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的编码多肽的核酸分子与在天然细胞中存在的特定编码多肽的核酸分子有区别。但是，分离的编码多肽的核酸分子包括在通常表达所述多肽的细胞中含有的编码多肽的核酸分子，其中例如，所述核酸分子处于不同于天然细胞的核酸分子的染色体位置或者染色体外位置。
[0103]“嵌合的”蛋白或多肽含有至少一个融合多肽，该融合多肽在序列中包含至少一个与天然存在的位置不同的位置中的区域。所述区域通常可以存在于单独的蛋白中并且在融合多肽中排列在一起；或者它们通常可以存在于同一蛋白中但在融合多肽中处于新的排列。例如，嵌合蛋白可以通过化学合成来可以，或通过产生和翻译其中肽区域以所需关系编码的多核苷酸来产生。
[0104]“融合的(fused)”和“融合(fusion)”在本文中可互换地使用，并且表示通过重组方法将两个或更多个肽或多肽序列连接在一起。“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包含与第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列，第二氨基酸序列在自然界中不与第一氨基酸序列天然连接。
[0105]“xten化的(xtenylated)”用于表示已经通过一个或更多个xten多肽(下文描述)与肽或多肽的连接或融合而修饰的肽或多肽，无论是通过重组还是化学交联方法。
[0106]“可操作地连接”是指，被连接的dna序列是在阅读相(reading phase)或框架内(in-frame)。“框架内融合”表示，以维持原始orf的正确读码框的方式连接两个或更多个开放读码框(orf)以形成连续的更长的orf。例如，如果启动子或增强子影响多肽序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至多肽的编码序列。因此，得到的重组融合蛋白是含有两个或更多个区段的单一蛋白，所述两个或更多个区段对应于原始orf编码的多肽(所述区段在自然界中通常不这样连接)。
[0107]
在多肽的上下文中，“直链序列”或“序列”是多肽中以氨基端至羧基端(n-端至c-端)方向的氨基酸顺序，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。“部分序列(partial sequence)”是已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽部分的直链序列。
[0108]“异源的”是指衍生自在基因型上不同于它所对比的实体的其余部分的实体。例如，从其天然编码序列中取出并可操作地连接到不同于该天然序列的编码序列的富含甘氨酸的序列是异源的富含甘氨酸的序列。应用于多核苷酸、多肽的术语“异源的”是指多核苷酸或多肽衍生自在基因型上不同于它所对比的实体的其余部分的实体。
[0109]
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们表示任何长度的核苷酸，包括单个核酸以及多于一个核酸，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的多于一个基因座(单个基因座)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的dna、分离的任何序列的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分间隔。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。
[0110]
术语“多核苷酸的互补序列”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和反向取向的多核苷酸分子，使得它可以完全保真地与参考序列杂交。
[0111]
应用于多核苷酸的“重组”是指，多核苷酸是重组步骤的各种组合的产物，所述重组步骤可以包括克隆、限制和/或连接步骤，以及导致重组蛋白在宿主细胞中的表达的其它程序。
[0112]
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换地使用。它们表示含有至少一个开放读码框的多核苷酸，所述开放读码框在转录和翻译后能够编码特定蛋白。基因或基因片段可以是基因组或cdna，只要多核苷酸含有至少一个开放读码框，其可以覆盖整个编码区或其片段。“融合基因”是由连接在一起的至少两个异源多核苷酸组成的基因。
[0113]
本文中使用的“编码区”或“编码序列”是多核苷酸的一部分，其由可翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(tag、tga或taa)通常不会翻译成氨基酸，但它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)不是编码区的一部分。编码区的边界通常由在5'末端的起始密码子(其编码所得多肽的氨基末端)以及在3'末端的翻译终止密码子(其编码所得多肽的羧基末端)决定。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如，在单独的(不同的)载体上。因此，单个载体可仅含有单个编码区，或包含两个或更多个编码区，例如，单个载体可分别编码如下所述的结合结构域-a和结合结构域-b。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的结合结构域的核酸融合或未融合。异源编码区包括、但不限于专门元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。
[0114]
术语“下游”表示位于参考核苷酸序列的3'端的核苷酸序列。在某些实施方案中，下游核苷酸序列表示转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录的起始位点的下游。
[0115]
术语“上游”表示位于参考核苷酸序列的5'端的核苷酸序列。在某些实施方案中，上游核苷酸序列表示位于编码区或转录起始点的5'侧的序列。例如，大多数启动子位于转录的起始位点的上游。
[0116]“同源性”或“同源的”表示两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用诸如bestfit之类的程序来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵，诸如blosum45或blosum80，以优化同一性、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严谨条件下杂交的那些，并且与那些序列相比具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％、且甚至更优选地99％序列同一性。当在相当长度的序列上最佳比对时，同源的多肽优选地具有至少70％、优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少95-99％相同的序列同一性。
[0117]
应用于多核酸的“连接”表示在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二酯键从而将它们连接在一起的过程。为了将dna片段或基因连接在一起，dna的末端必须彼此相容。在某些情况下，末端在内切核酸酶消化后将直接相容。但是，可能需要首先将内切核酸酶消化后通常产生的交错末端(staggered end)转化为平末端以使它们对连接相容。
[0118]
术语“严谨条件”或“严谨杂交条件”包括使多核苷酸与其靶序列杂交到比其它序列可检测地更大程度(例如，相对于背景至少2倍)的条件。通常，杂交的严谨性部分地参照进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严谨条件是这样的条件：其中盐浓度小于约1.5m na离子，通常约0.01至1.0m na离子浓度(或其它盐)，在ph 7.0至8.3，且温度对于短多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30℃和对于长多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃—例如，“严谨条件”可以包括在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中在37℃杂交，并且在0.1
×
ssc/1％sds中在60℃至65℃洗涤三次，每次15分钟。可替换地，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。ssc浓度可以从约0.1至2
×
ssc变化，其中sds以约0.1％存在。这样的洗涤温度通常选择为比特定序列在确定的离子强度和ph下的热解链点低约5℃至20℃。tm是使50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和ph下)。用于计算tm和核酸杂交条件的方程是众所周知的，并且可以参见sambrook,j.等人,“molecular cloning:a laboratory manual,”第3版，cold spring harbor laboratory press,2001。通常，封闭试剂用于封闭非特异性杂交。这样的封闭试剂包括，例如，约100-200μg/ml的剪切和变性的鲑鱼精dna。有机溶剂，诸如浓度为约35-50％v/v的甲酰胺，也可以在特定情况下使用，诸如用于rna:dna杂交。这些洗涤条件的有用变化对于本领域普通技术人员来说将是明显的。
[0119]
应用于多核苷酸序列的术语“同一性百分比”、“序列同一性百分比”和“％同一性”表示，使用标准化的算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。这样的算法可以以标准化的和可重复的方式在被对比的序列中插入缺口以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的对比。同一性百分比可以在整个定义的多核苷酸序列的长度上测量，或可以在更短的长度上测量，例如，在取自较大的、定义的多核苷酸序列的片段的长度上，例如，至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这样的长度仅仅是示例性的，并且应当理解，在本文中、在表格、附图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可用于描述可在其上面测量同一性百分比的长度。如下计算序列同一性百分比：在对比窗口上对比两个最佳比对的序列，确定匹配位置(在此处在两个多肽序列中出现相同的残基)的数目，将匹配位置的数目除以在对比窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。当要对比不同长度的序列时，最短的序列定义了对比窗口的长度。当计算序列同一性时不考虑保守取代。
[0120]
关于本文鉴定的多肽序列的术语“同一性百分比”、“序列同一性百分比”和“％同一性”定义为，在比对序列并在必要的情况下引入缺口以达到最大序列同一性百分比以后，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，由此产生最佳比对，在查询序列中与可比较长度的第二个参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被对比序列的全长上实现最佳比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个定义的多肽序列的长度上测量，或可以在更短的长度上测量，例如，在取自较大的、定义的多肽序列的片段的长度上，例如，至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这样的长度仅仅是示例性的，并且应当理解，在本文中、在表格、附图或序列表中所示的序列支持的任何片
段长度可用于描述可在其上面测量同一性百分比的长度。
[0121]
在多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”表示序列内部同源性的程度，诸如，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。例如，通过分析相同序列的频率，可以测量重复性。
[0122]
本文中使用的术语“表达”表示使多核苷酸产生基因产物(例如，rna或多肽)的过程。它包括、但不限于将多核苷酸转录成信使rna(mrna)、转移rna(trna)、小发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)或任何其它rna产物，以及将mrna翻译成多肽。表达产生“基因产物”。本文中使用的基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使rna，或从转录物翻译的多肽。本文描述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，多腺苷酸化或剪接)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质添加、与其它蛋白亚基的缔合或蛋白水解性切割)的多肽。
[0123]“载体”或“表达载体”可互换使用，且表示核酸分子，优选地在适当的宿主中自我复制，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语包括主要功能是将dna或rna插入细胞的载体，主要功能是复制dna或rna的复制载体，和功能是转录和/或翻译dna或rna的表达载体。还包括提供超过一种以上功能的载体。“表达载体”是多核苷酸，其当被引入适当的宿主细胞时，可以被转录和翻译成多肽。“表达系统”通常是指包含表达载体的合适宿主细胞，所述表达载体可以起作用以产生期望的表达产物。
[0124]
应用于多肽的“血清降解抗性”表示多肽在血液或其组分中耐受降解的能力，其通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。可以如下测量血清降解抗性：将蛋白与人(或小鼠、大鼠、狗、猴，在适当时)血清或血浆组合，通常持续数天(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)，通常在约37℃。可以使这些时间点的样品在蛋白质印迹测定上运行，并用抗体检测蛋白。抗体可以针对蛋白中的标签。如果蛋白在蛋白质印迹上显示单条带，其中蛋白的大小与注射的蛋白的大小相同，则没有发生降解。在该示例性的方法中，通过蛋白质印迹或等效技术判断，在50％的蛋白被降解的时间点是蛋白的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
[0125]
术语“t
1/2”、“半衰期”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可互换地使用，并且如本文所用是指计算为ln(2)/k
el
的终末半衰期。k
el
是通过对数浓度相对于时间曲线的末端线性部分的线性回归计算的末端清除速率常数。半衰期通常表示沉积在活生物体中的施用物质的量的一半通过正常生物学过程代谢或消除所需的时间。当将给定多肽的清除曲线构建为时间的函数时，该曲线通常是双相的，具有快速的α相和较长的β相。在人类中人抗体的典型β-相半衰期为21天。可以使用来自任何体液的定时样品来测量半衰期，但最通常在血浆样品中测量。
[0126]
术语“分子量”通常表示分子中组分原子的原子量的总和。在理论上，可以通过将分子中组分原子的原子质量相加来确定分子量。当应用于多肽的上下文中时，如下计算分子量：基于氨基酸组成，累加组合物中每种类型的氨基酸的分子量，或通过与sds电泳凝胶中的分子量标准进行对比来估计。分子的计算分子量可以不同于分子的“表观分子量”，后者通常表示通过一种或更多种分析技术确定的分子的分子量。“表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，且当在多肽的上下文中使用时，所述术语表示特定氨基酸或多肽序列表现出的表观分子量的相对增加或减少的量度。可以确定表观分子量，例如，使用尺寸排阻色谱法(sec)或类似的方法，通过与球状蛋白标准进行对比，如以“表观kd”单位测量的。表
观分子量因子是表观分子量与“分子量”之比；后者的计算方法是，基于如上所述的氨基酸组成相加，或通过与sds电泳凝胶中的分子量标准进行对比来估计。在美国专利号8,673,860中描述了表观分子量和表观分子量因子的确定。
[0127]“确定成分培养基”表示这样的培养基：其包含培养中细胞的存活和/或生长所必需的营养和激素需求，使得培养基的组分是已知的。传统上，已经通过添加生长和/或存活所需的营养和生长因子来配制确定成分培养基。通常，确定成分培养基提供来自一个或更多个以下类别的至少一种组分：a)所有必需氨基酸，且通常是二十种氨基酸加半胱氨酸的基本组；b)能量来源，通常以碳水化合物诸如葡萄糖的形式；c)在低浓度所需的维生素和/或其它有机化合物；d)游离脂肪酸；e)痕量元素，其中痕量元素被定义为无机化合物或天然存在的元素，其通常需要在非常低的浓度，通常在微摩尔范围内。确定成分培养基还可以任选地补充来自以下任一类别的一种或更多种组分：a)一种或更多种促有丝分裂剂；b)盐和缓冲剂，例如，钙、镁和磷酸盐；c)核苷和碱基，例如，腺苷和胸苷、次黄嘌呤；d)蛋白和组织水解物。
[0128]
术语“激动剂”以最宽的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子具体包括天然多肽、肽、小有机分子等的激动剂抗体或抗体片段、片段或氨基酸序列变体。鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或更多种生物活性的可检测变化。
[0129]
本文中使用的“治疗”或“处理”、或“缓解”或“改善”在本文中可互换地使用。这些术语表示获得有益或期望结果(包括、但不限于治疗益处和/或预防益处)的方案。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在障碍。并且，治疗益处如下实现：根除或改善一种或更多种生理学症状或改善与潜在障碍相关的一种或更多种临床参数，从而在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍受潜在障碍折磨。为了预防益处，可以将组合物施用至处于发生特定疾病的风险中的受试者，或施用至报告疾病的一种或更多种生理学症状的受试者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
[0130]
本文中使用的“治疗效果”或“治疗益处”表示生理效果，包括、但不限于在受试者中减轻、改善或预防疾病或改善与潜在障碍相关的一种或更多种临床参数，或以其它方式增强受试者的身体或精神健康，这是由于本发明的多肽的施用，而不是诱导产生针对生物活性蛋白所具有的抗原表位的抗体的能力。为了预防益处，可以将组合物施用至处于发生特定疾病、先前疾病复发、疾病的状况或症状的风险中的受试者，或施用至报告疾病的一种或更多种生理学症状的受试者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
[0131]
本文中使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”表示单独地或作为组合物的一部分的药物或生物活性蛋白的量，当以一个或重复剂量施用至受试者时，其能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益效果。这样的效果不一定是绝对有益的。治疗有效量的确定充分在本领域技术人员的能力之内，特别是根据本文中提供的详细公开内容。
[0132]
本文中使用的术语“治疗上有效且无毒的剂量”表示本文定义的组合物的耐受剂量，其足够高以造成肿瘤或癌细胞的耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定，而在受试者中没有或基本上没有重大毒性效应。这样的治疗上有效且无毒的剂量可以通过本领域中描述的剂量递增研究来确定，并且应该低于诱发严重不良副作用的剂量。
[0133]
本文中使用的术语“治疗指数”表示药物变得有毒时的血液浓度与药物有效时的浓度之比。治疗指数的一个示例性比率是ld
50
:ed
50
，其中ld
50
是在受试者群体中导致50％死亡率的剂量，且ed
50
是在受试者群体中产生有效性的剂量。
[0134]
本文中使用的术语“给药方案”表示连续施用组合物的多次剂量(即，至少两剂或更多剂)的时间表，其中以治疗有效量施用剂量以对受试者中疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数、终点或特征产生持续的有益效果。
[0135]
本文中使用的“施用”是指给受试者施用一定剂量的化合物(例如，本发明的抗-cd3抗体)或组合物(例如，包括本发明的抗-cd3抗体的药物组合物)的方法。
[0136]“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人类灵长类动物诸如猴)，兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述受试者或个体是人。
[0137]
术语“癌”和“癌性的”表示或描述哺乳动物中通常以失调的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括、但不限于：癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、t-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌的任何形式、黑素瘤、生殖泌尿道癌、卵巢癌、卵巢癌伴恶性腹水、腹膜癌扩散、子宫浆液性癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、伴有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤、子宫癌、腹膜肾癌中的间皮瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、胃部癌、小肠癌、肝脏癌、肝癌、肝母细胞瘤、脂肪肉瘤、胰腺癌、胆囊癌、胆管的癌症、唾液腺癌、甲状腺癌、上皮癌、腺癌、任何起源的肉瘤、原发性血液学恶性肿瘤包括急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓性白血病、骨髓增生性肿瘤性障碍、或骨髓增生异常障碍、重症肌无力、morbus basedow、桥本甲状腺炎或古德帕斯丘综合征。
[0138]
本文中使用的“肿瘤”表示所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)，以及所有癌前和癌变细胞和组织。本文中使用的术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性障碍”、“增殖性障碍”和“肿瘤”不是相互排斥的。
[0139]
本文中使用的“肿瘤特异性标志物”表示在癌细胞上或癌细胞中发现的抗原，与正常细胞或组织相比，所述抗原可能但不一定在癌细胞中或癌细胞上以更高的数目发现。
[0140]
i).一般技术
[0141]
除非另有说明，否则本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna的常规技术，它们是在本领域的技术范围内。参见sambrook,j.等人,“molecular cloning:a laboratory manual,”第3版,cold spring harbor laboratory press,2001；“current protocols in molecular biology”,f.m.ausubel,等人.编,1987；系列“methods in enzymology,”academic press,san diego,ca.；“pcr 2:a practical approach”,m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.taylor编,oxford university press,1995；“antibodies,a laboratory manual”harlow,e.和lane,d.编,cold spring harbor laboratory,1988；“goodman&gilman’s the pharmacological basis of therapeutics,”第11版,mcgraw-hill,2005；和freshney,r.i.,“culture of animal cells:a manual of basic technique,”第4版，john wiley&sons，somerset，nj，2000，其内容通过引用整体并入本文中。
[0142]
可以在多种培养基中培养宿主细胞。商购可得的培养基诸如ham氏f10(sigma)、最
低必需培养基(mem、sigma)、rpmi-1640(sigma)和dulbecco氏改良的伊格尔培养基(dmem、sigma)适用于培养真核细胞。此外，可以使动物细胞在缺乏血清但补充了激素、生长因子或特定细胞类型的存活和/或生长所需的任何其它因子的确定成分培养基中生长。支持细胞存活的确定成分培养基会维持细胞的生存力、形态、代谢能力和潜在的分化能力，而促进细胞生长的确定成分培养基会提供细胞增殖或繁殖所需的所有化学物质。控制哺乳动物细胞体外存活和生长的一般参数在本领域中已充分确立。可以在不同的细胞培养系统中控制的物理化学参数是例如ph、po2、温度和渗透压。细胞的营养需求通常在被开发成提供最佳环境的标准培养基制剂中提供。营养物可分为几类：氨基酸及其衍生物、碳水化合物、糖、脂肪酸、复合脂质、核酸衍生物和维生素。除了维持细胞代谢的营养物外，大多数细胞还需要来自以下至少一组的一种或更多种激素：类固醇、前列腺素、生长因子、垂体激素和肽激素，以在无血清培养基中增殖(sato,g.h.,等人.“growth of cells in hormonally defined media”,cold spring harbor press,n.y.,1982)。除了激素外，细胞可能还需要运输蛋白诸如转铁蛋白(血浆铁运输蛋白)、血浆铜蓝蛋白(一种铜运输蛋白)和高密度脂蛋白(一种脂质载体)才能在体外存活和生长。每种细胞类型的最佳激素或运输蛋白组会有所不同。这些激素或运输蛋白中的大多数外源添加，或者在极少数情况下，发现了不需要特定因子的突变细胞系。本领域技术人员无需过度实验即可了解维持细胞培养所需的其它因子。
[0143]
用于原核宿主细胞生长的生长培养基包括营养物液体培养基(液体营养培养基)或lb培养基(luria bertani)。合适的培养基包括定义的和未定义的培养基。一般而言，培养基含有碳源，诸如细菌生长所需的葡萄糖、水和盐。培养基还可以包括氨基酸和氮的来源，例如牛肉或酵母浸出物(在未定义的培养基中)或已知量的氨基酸(在定义的培养基中)。在一些实施方案中，所述生长培养基是lb液体培养基，例如lb miller液体培养基或lb lennox液体培养基。lb液体培养基包含蛋白胨(酪蛋白的酶消化产物)、酵母浸出物和氯化钠。在一些实施方案中，使用包含抗生素的选择性培养基。在这种培养基中，只有对抗生素具有抗性的期望细胞才会生长。
[0144]
ii).egfr抗原结合组合物
[0145]
在第一方面，本发明提供包含与表皮生长因子受体(egfr)或其表位结合的第一抗原结合片段(af1)的多肽。在以特定形式设计以实现对携带egfr抗原的疾病细胞或组织的细胞杀伤的组合物中，结合egfr抗原的抗原结合片段具有特定用途，用于与对效应细胞的cd3抗原(或其它抗原)具有结合亲和力的第二抗原结合片段(af2)配对。结合特异性可以由互补决定区或cdr(诸如轻链cdr或重链cdr)决定。在许多情况下，结合特异性由轻链cdr和重链cdr决定。重链cdr和轻链cdr的给定组合提供赋予对egfr比其它参考抗原更大的亲和力和/或特异性的给定结合口袋。
[0146]
本公开内容考虑的抗原结合片段的来源可以衍生自天然存在的抗体或其片段、非天然存在的抗体或其片段、人源化抗体或其片段、合成抗体或其片段、杂交抗体或其片段、或经工程改造的抗体或其片段。用于产生针对给定靶标志物的抗体的方法是本领域众所周知的。例如，单克隆抗体可以使用kohler等人,nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法(美国专利号4,816,567)来制备。抗体及其片段的结构、抗体的重链和轻链的可变区(vh和vl)、单链可变区(scfv)、互补决定区(cdr)和结构域抗体(dab)是众所周知的。用于产生具有所需egfr抗原结合片段的多肽的方法是本领域已知的。
[0147]
相对于本领域已知的egfr抗体和抗原结合片段，本公开内容的各种结合egfr的抗原结合片段已经被特定地修饰以增强它们在本文描述的多肽实施方案中的稳定性。单克隆抗体的蛋白聚集持续地是其可开发性方面的重大问题，并且仍然是抗体生产的主要关注领域。抗体聚集可以由其结构域的部分解折叠触发，导致单体-单体结合，随后是成核和聚集体生长。尽管抗体和基于抗体的蛋白的聚集倾向可以受外部实验条件影响，但它们强烈依赖于由其序列和结构决定的固有抗体特性。尽管众所周知，蛋白在其折叠状态下仅略微稳定，但通常较少意识到的是，大多数蛋白在其解折叠或部分解折叠状态下固有地易于聚集，并且所产生的聚集体可以是极其稳定的和长寿的。聚集倾向的降低也被证明伴随着表达滴度的增加，这表明减少蛋白聚集在整个开发过程中是有益的，并且可以为临床研究提供更有效的途径。对于治疗性蛋白，聚集体是在患者中产生有害免疫应答的重要风险因素，并且可以通过许多机制形成。控制聚集可以提高蛋白稳定性、可制造性、损耗率、安全性、配制、滴度、免疫原性和溶解性。蛋白的固有特性，诸如大小、疏水性、静电和电荷分布，在蛋白溶解度中起着重要作用。由表面疏水性引起的治疗性蛋白的低溶解度已被证明使制剂开发更加困难，并可能在体内导致不良的生物分布、不希望的药代动力学行为和免疫原性。降低候选单克隆抗体的整体表面疏水性还可以提供与纯化和给药方案相关的益处和成本节约。可以通过结构分析将单个氨基酸鉴定为促进抗体中的聚集潜力，并且可能位于cdr以及框架区中。具体地，可以预测在给定抗体中引起疏水性问题的高风险的残基。在一种实施方案中，本公开内容提供了具有特异性地结合egfr的能力的抗原结合片段，其中该抗原结合片段相对于亲本抗体或抗体片段在框架区中具有对疏水性氨基酸的至少一个氨基酸取代，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。在另一种实施方案中，egfr抗原结合片段在一个或更多个框架区中具有对疏水性氨基酸的至少两个氨基酸取代，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
[0148]
在主题抗原结合片段的上下文中，等电点(pi)是抗体片段不具有净电荷时的ph。如果ph低于抗体片段的pi，则抗体片段将具有净正电荷。较大的正电荷倾向于与增加的血液清除和组织保留相关，通常具有较短的半衰期。如果ph大于抗体片段的pi，抗体片段将具有负电荷。负电荷通常导致减少的组织摄取和更长的半衰期。可能通过对框架残基的突变来操纵这种电荷。这些考虑为本文描述的实施方案的抗原结合片段的各种序列的设计提供了信息，其中相对于用作起始点的亲本抗体进行了单独的氨基酸取代。多肽的等电点可以用数学方法确定或在体外测定中实验确定。等电点(pi)是蛋白净电荷为零时的ph，且可以使用蛋白序列中具体氨基酸的电荷来计算。电荷的估计值被称为酸解离常数或pka值，并用于计算pi。pi可以通过方法诸如毛细管等电聚焦(参见datta-mannan,a.,等人.the interplay of non-specific binding,target-mediated clearance and fcrn interactions on the pharmacokinetics of humanized antibodies.mabs 7:1084(2015)；li,b.,等人.framework selection can influence pharmacokinetics of a humanized therapeutic antibody through differences in molecule charge.mabs 6,1255-1264(2014))或本领域已知的其它方法在体外确定。
[0149]
在本文公开的任何实施方案的一些方面，主题多肽包含af1，所述af1包含的表1中列出的轻链互补决定区(cdr-l)和重链互补决定区(cdr-h)，其中所述af1结合egfr或其表位。另外地或可替换地，本公开内容的受试af1可包含与表1中列出的cdr-l或cdr-h中的任
一个具有至少60％同一性的cdr-l或cdr-h。在一些方面，本公开内容的受试af1可包含cdr-l或cdr-h，其可表现出与表1中列出的任何seq id no至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的序列同一性。另外，实施方案的受试af1还可包含表2中列出的轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)。在一些方面，本公开内容的受试af1可包含fr-l或fr-h，其与表2中列出的任何seq id no表现出至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的序列同一性。在一种实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的af1是嵌合的或人源化的抗原结合片段。在另一种实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的af1选自由fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、线性抗体和单链可变片段(scfv)组成的组。具有cdr-h和cdr-l的af1从n-端至c-端可以以(cdr-h)-(cdr-l)或(cdr-h)-(cdr-l)取向构造。
[0150]
在一种实施方案中，本公开内容提供了包含af1的多肽，其中所述af1包含cdr-l和cdr-h，和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1(a)特异性地结合egfr；(b)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，其中fr-h1具有seq id no:14-16中的任一个的氨基酸序列，fr-h2具有seq id no:18或seq id no:19的氨基酸序列，fr-h3具有seq id no:20或seq id no:21的氨基酸序列，并且fr-h4具有seq id no:22-24中的任一个的氨基酸序列。在另一种实施方案中，本文所述的主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-h3，其中cdr-h3具有seq id no:6的氨基酸序列。在另一种实施方案中，所述af1包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。
[0151]
在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含af1的多肽，其中相对于由seq id no:52中所示序列组成的抗原结合片段，af1具有更高的等电点(pi)，如通过体外测定所证明的。在一种实施方案中，所述af1掺入多肽中以形成抗egfr双特异性抗体，其中多肽相对于对照双特异性抗体表现出更高的pi，其中所述多肽包含所述af1和结合t细胞受体分化簇3(cd3)的参考抗原结合片段，并且其中除了af1被seq id no:52替代之外，所述对照双特异性抗原结合片段与多肽相同。在前述实施方案中，所述af1表现出比由seq id no:52所示序列组成的抗原结合片段的pi高至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5ph单位的pi。在前述实施方案中，用于测定pi的体外测定可以是毛细管等电电泳聚焦或本领域已知的其它测定。
[0152]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-l、cdr-h、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1(a)被构造成特异性地结合egfr；(b)包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；(c)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，各自表现出分别与seq id no:14-16、seq id no:18和19、seq id no:20和21、以及seq id no:22-24的氨基酸至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，并且还包含fr-l，其中所述fr-l包含：(a)表现出与seq id no:7的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同的fr-l1，(b)表现出与seq id no:8的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同的fr-l2，(c)表现出与seq id no:9的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同的fr-l3，和(d)表现
出与seq id no:13的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同的fr-l4。
[0153]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-l、cdr-h、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1：(a)被构造成特异性地结合egfr；(b)包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；(c)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，各自表现出分别与seq id no:14-16、seq id no:18和19、seq id no:20和21以及seq id no:22-24的氨基酸至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和(d)还包含fr-l，其中所述fr-l包含(i)表现出与seq id no:7的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l1，(ii)表现出与seq id no:8的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l2，(iii)表现出与seq id no:10的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l3，和(iv)表现出与seq id no:13的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l4。
[0154]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-l、cdr-h、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1：(a)被构造成特异性地结合egfr；(b)包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；(c)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，各自表现出分别与seq id no:14-16、seq id no:18和19、seq id no:20和21、以及seq id no:22-24的氨基酸至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和(d)还包含fr-l，其中fr-l包含：(i)表现出与seq id no:7的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l1，(ii)表现出与seq id no:8的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l2，(iii)表现出与seq id no:11的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l3，和(iv)表现出与seq id no:13的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的fr-l4。
[0155]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-l、cdr-h、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1：(a)被构造成特异性地结合egfr；(b)包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；(c)包含fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4，各自表现出与seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9-11、seq id no:13的氨基酸至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和(d)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，其中所述fr-h1表现出与seq id no:14的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，其中所述fr-h2表现出与seq id no:18的氨基酸序列至少86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，其中所述fr-h3表现出与seq id no:20的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，并且其中所述fr-h4表现出与seq id no:22或23的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。
[0156]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-l、cdr-h、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1(a)被构造成特异性地结合egfr；(b)包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；(c)包含fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4，各自表现出分别与seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9-11和seq id no:13的氨基酸至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同；和(d)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，其中所述fr-h1表现出与具有seq id no:15的氨基酸序列的fr-h1至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，其中所述fr-h2表现出与seq id no:19的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，其中所述fr-h3表现出与seq id no:21的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，并且其中所述fr-h4表现出与seq id no:24的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。
[0157]
在又一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含cdr-l、cdr-h、轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，并且其中所述af1(a)被构造成特异性地结合egfr；(b)包含分别具有seq id no:4、5和6的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；(c)包含fr-l1、fr-l2、fr-l3和fr-l4，各自表现出与seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9-11和seq id no:13的氨基酸至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同；和(d)包含fr-h1、fr-h2、fr-h3和fr-h4，其中所述fr-h1表现出与具有seq id no:16的氨基酸序列的fr-h1至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，其中所述fr-h2表现出与seq id no:19的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，其中所述fr-h1表现出fr-h3与seq id no:20的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同，并且其中所述fr-h4表现出与seq id no:22或23的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、93％、96％、97％、94％、96％、99％的序列同一性或与其相同。
[0158]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1被构造为特异性地结合egfr，并且af1包含与seq id no:28-32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨基酸序列。
[0159]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包括af1，其中所述af1被被构造为特异性地结合egfr，其中所述af1包含与seq id no:25-27的氨基酸序
列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。
[0160]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1包含与seq id no:28-32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨基酸序列，并包含与seq id no:25-27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。所述af1可以以vl-vh或vh-vl取向构造并通过接头肽融合。
[0161]
在又一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包括af1，其中所述af1包含与seq id no:37-51中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。
[0162]
应理解，用于本文公开的组合物实施方案的术语抗原结合片段的使用不是限制性的，并且意图包括保留结合为相应完整抗体的配体的抗原的能力的抗体的部分或片段。在这样的实施方案中，抗原结合片段可以是、但不限于，cdr和插入框架区、抗体的轻链和/或重链的可变或高变区(vl、vh)、可变片段(fv)、fab'片段、f(ab')2片段、fab片段、单链抗体(scab)、vhh骆驼科抗体、单链可变片段(scfv)、线性抗体、单结构域抗体、互补决定区(cdr)、结构域抗体(dab)、bhh或bnar类型的单结构域重链免疫球蛋白、单结构域轻链免疫球蛋白、或本领域已知的含有能够结合抗原的抗体片段的其它多肽。两个抗原结合片段的vl和vh也可以以单链双体构型配置；即，af1和af2的vl和vh配置有适当长度的接头以允许排列为双体。
[0163]
在某些实施方案中，抗原结合片段的vl和vh通过相对长的接头融合，所述接头由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个亲水性氨基酸组成，当连接时在一起，具有柔性特性。在一种实施方案中，本文描述的任何scfv实施方案的vl和vh通过选自以下序列的相对长的亲水性氨基酸接头连接：gsgegsegegggegsegegsgeggegegsg(seq id no:790)、tgsgegsegegggegsegegsgeggegegsgt(seq id no:791)、gatppetgaetespgettggsaeseppgeg(seq id no:792)或gsaaptagttpsaspapptggssaagspst(seq id no:793)。
[0164]
在又一种实施方案中，本文所述任何主题组合物实施方案的af1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)egfr。在另一实施方案中，本文所述任何主题组合物实施方案的af1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)egfr。
[0165]
在另一方面，本公开内容提供了用于掺入主题组合物中的对egfr具有特异性结合亲和力的af1，在所述主题组合物中，框架区的一个或更多个单独氨基酸被修饰以相对于亲本抗原结合片段增加af1的pi，以便增强af1掺入的双特异性多肽的稳定性。在一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1表现出约5.4、或约5.5、或约5.6、或约5.6、或约5.7、或约5.8、或约5.9、或约6.0、或约6.1、或约6.2、或约6.3、或约6.4、或约6.5、或约6.6的pi，如通过体外测定所证明的。在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1表现出5.4和6.6的之间、包括端点的pi，如通过体外试验所证明的。在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1表现出约5.4和6.6、或约5.6和约6.4、或约5.8和约6.2、或约6.0和约6.2、或约6.1和约6.3、或约6.2和约6.4、或约6.3和约6.5、或约6.4和约
6.6之间的pi，如通过计算确定或通过体外测定所证明。
[0166]
在另一方面，本公开内容提供了用于掺入主题组合物中的对egfr具有特异性结合亲和力的af1，在所述主题组合物中，对egfr抗原的结合亲和力在设定范围内。在一种实施方案中，本文所述任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1以约0.1nm和约100nm之间的kd特异性地结合egfr，如在包含egfr抗原的体外抗原结合测定中所确定的。在另一种实施方案中，af1以小于约0.1nm、或小于约0.5nm、或小于约1.0nm、或小于约10nm、或小于约50nm、或小于约100nm的结合亲和力(如通过在体外结合测定中的kd所确定的)特异性地结合egfr。在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1和af2，其中所述af1对egfr的结合亲和力比af2对cd3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。将理解的是，具有较低的kd值(例如1nm)的结合亲和力是比10nm更大的结合亲和力。使用结合测定或竞争性结合测定，诸如使用芯片结合的受体或结合蛋白的biacore测定或elisa测定(如在美国专利5,534,617中所述)、在本文实施例中描述的测定、放射-受体测定或本领域已知的其它测定，可以测定主题组合物对靶配体的结合亲和力。然后可以使用标准方法，诸如scatchard分析，如在van zoelen,等人,trends pharmacol sciences(1998)19)12):487中所述，或本领域已知的其它方法，确定结合亲和常数。
[0167]
在另一方面，本公开内容提供了用于掺入主题组合物中的对egfr具有特异性结合亲和力的af1，在所述主题组合物中，框架区的一个或更多个单独氨基酸被修饰以降低抗原结合框架相对于亲本抗原结合片段的疏水性，以便增强其掺入的双特异性多肽的稳定性。在一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af1，其中所述af1特异性地结合egfr，并且其中相对于seq id no:52的氨基酸序列，所述af1在框架区中具有对疏水性氨基酸的至少一个氨基酸取代，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，并且取代氨基酸选自精氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺。在另一种实施方案中，相对于seq id no:52的氨基酸序列，所述af1在一个或更多个框架区中具有对疏水性氨基酸的至少两个氨基酸取代，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，并且取代氨基酸选自精氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺。
[0168]
表1：egfr cdr序列
[0169][0170]
表2：egfr fr序列
[0171]
[0172][0173]
表3：egfr vl&vh序列
[0174]
[0175][0176]
表4：egfr scfv序列
[0177]
[0178]
[0179][0180]
iii).释放区段
[0181]
在另一个方面，本公开内容涉及适合包含在本文所述的主题组合物中的释放区段(rs)肽，其为一种或更多种哺乳动物蛋白酶的底物，所述蛋白酶与疾病组织或在疾病组织附近存在的细胞相关或由其产生。这样的蛋白酶可以包括、但不限于诸如金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等蛋白酶类别。rs尤其可用于给主题组合物赋予前药形式，其可以通过哺乳动物蛋白酶对rs的切割而被活化。如本文中所述的，将rs掺入本文所述的主题组合物实施方案中，将掺入的抗原结合片段连接至xten(其构型在下文更完整地描述)，使得在通过一种或更多种以rs为底物的蛋白酶的作用而切割rs后，抗原结合片段和xten从组合物中释放，并且抗原结合片段不再被xten屏蔽，增加它们的结合其各自配体的结合潜力。在一个特定特征中，rs充当发现与疾病组织或细胞(诸如但不限于肿瘤、癌细胞和炎症性组织)密切相关或共定位的蛋白酶的底物，并且在rs的切割后，否则会被主题组合物的xten屏蔽(且因此对它们各自的配体具有较低结合亲和力)的抗原结合片段从组合物中释放并恢复它们的结合靶标和/或效应细胞配体的增加的潜力。在另一种实施方案中，主题多肽组合物的rs包含作为位于靶细胞内的细胞蛋白酶的底物的氨基酸序列。在本文描述的主题组合物的另一个特定特征中，作为两类或三类蛋白酶的底物的rs被设计成具有能够在rs序列的不同位置被不同蛋白酶切割的序列，代表性实例描绘在图6中。因此，作为两类、三类或更多类蛋白酶的底物的rs在rs序列中具有两个、三个或多个不同的切割位点，但单个蛋白酶的切割仍然导致抗原结合片段和xten从包含rs的组合物的释放。
[0182]
在一种实施方案中，本公开内容提供了包含一个或更多个释放区段的可活化多肽，其中所述释放区段是一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物。在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含第一释放区段(rs1)序列的多肽，其中rs1是哺乳动物蛋白酶切割的底物，其中rs1是选自由豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-11、mmp-14、upa和间质蛋白酶组成的组的蛋白酶的底物。在其它情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含第一释放区段(rs1)序列，其中rs1是选自由以下组成的组中的一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物：meprin,肾胰岛素残基溶酶(neprilysin，cd10),psma,bmp-1,a解联蛋白和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，adam),adam8,adam9,adam10,adam12,adam15,adam17(tace),adam19,adam28(mdc-l),具有凝血酶敏感蛋白基序的adam(adam with thrombospondin motifs，adamts),adamts1,adamts4,adamts5,mmp-1(胶原酶
1),基质金属蛋白酶-1(mmp-1),基质金属蛋白酶-2(mmp-2,明胶酶a),基质金属蛋白酶-3(mmp-3,基质溶素1(stromelysin 1)),基质金属蛋白酶-7(mmp-7,基质溶解因子1(matrilysin 1)),基质金属蛋白酶-8(mmp-8,胶原酶2),基质金属蛋白酶-9(mmp-9,明胶酶b),基质金属蛋白酶-10(mmp-10,基质溶素2),基质金属蛋白酶-11(mmp-11,基质溶素3),基质金属蛋白酶-12(mmp-12,巨噬细胞弹性蛋白酶),基质金属蛋白酶-13(mmp-13,胶原酶3),基质金属蛋白酶-14(mmp-14,mt1-mmp),基质金属蛋白酶-15(mmp-15,mt2-mmp),基质金属蛋白酶-19(mmp-19),基质金属蛋白酶-23(mmp-23,ca-mmp),基质金属蛋白酶-24(mmp-24,mt5-mmp),基质金属蛋白酶-26(mmp-26,基质溶解因子2),基质金属蛋白酶-27(mmp-27,cmmp),豆荚蛋白,组织蛋白酶b,组织蛋白酶c,组织蛋白酶k,组织蛋白酶l,组织蛋白酶s,组织蛋白酶x,组织蛋白酶d,组织蛋白酶e,分泌酶,尿激酶(upa),组织-型纤溶酶原活化物(tpa),纤溶酶,凝血酶,前列腺-特异性抗原(psa,klk3),人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(hne),弹性蛋白酶,类胰蛋白酶,ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(ttsp),desc1,hepsin(hpn),间质蛋白酶,间质蛋白酶-2,tmprss2,tmprss3,tmprss4(cap2),成纤维细胞活化蛋白(fap),激肽释放酶相关的肽酶(klk家族),klk4,klk5,klk6,klk7,klk8,klk10,klk11,klk13,和klk14。
[0183]
在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含用于掺入本文描述的主题多肽组合物中的第一释放区段(rs1)序列的多肽，其中rs1是一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物，其中rs1包含与选自seq id no:53-671的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一种实施方案中，所述rs1包含选自以下序列的氨基酸序列：rsr-2089、rsr-2295、rsr-2298、rsr-2488、rsr-2599、rsr-2485、rsr-2486、rsr-2728、rsn-2089、rsn-2295、rsn-2298、rsn-2488、rsn-2599、rsn-2485、rsn-2486、rsn-2728、rsc-2089、rsc-2295、rsc-2298、rsc-2488、rsc-2599、rsc-2485、rsc-2486和rsc-2728，其中每个在表5中示出。如以下主题多肽组合物的构型和特性的描述中更充分地描述的，释放区段融合在抗原结合片段和xten多肽之间，使得在释放区段的切割后，xten从组合物中释放。
[0184]
在其它实施方案中，本公开内容提供了包含用于掺入本文描述的主题多肽组合物中的第一释放区段(rs1)序列和第二释放区段(rs2)的多肽，其中rs1和rs2是相同的。在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含用于掺入主题多肽组合物中的第一释放区段(rs1)序列和第二释放区段(rs2)的多肽，其中rs1和rs2是不同的。在前述实施方案中的某些情况下，rs1和rs2各自是选自由豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-11、mmp-14、upa和间质蛋白酶组成的组的哺乳动物蛋白酶切割的底物。在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含用于掺入本文描述的主题多肽组合物中的rs1和rs2序列的多肽，其中rs1和rs2各自是一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割的底物，其中rs1和rs2各自包含与选自seq id no:53-671的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一种实施方案中，所述rs1和rs2各自包含选自以下序列的氨基酸序列：rsr-2089、rsr-2295、rsr-2298、rsr-2488、rsr-2599、rsr-2485、rsr-2486、rsr-2728、rsn-2089、rsn-2295、rsn-2298、rsn-2488、rsn-2599、rsn-2485、rsn-2486、rsn-2728、rsc-2089、rsc-2295、rsc-2298、rsc-2488、rsc-2599、rsc-2485、rsc-2486和rsc-2728，其中每个在表5中示出。如以下与主题多肽组合物的构型和特性的描述相关的段落中
更充分地描述的，释放区段融合在抗原结合片段和xten多肽之间，使得在每个释放区段的切割后，相邻的xten从组合物中释放。
[0185]
表5：释放区段和氨基酸序列
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202][0203]
[0204]
在另一个方面，用于掺入本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽中的释放区段(rs1和/或rs2)可以被设计为选择性敏感的，以便对它们作为其底物的各种蛋白酶具有不同的切割速率和不同的切割效率。由于与健康组织或在循环中相比可在疾病组织(包括、但不限于肿瘤、血癌或炎症组织或炎症部位)中发现不同浓度的给定蛋白酶，因此本公开内容提供了具有工程改造的单个氨基酸序列的rs，以便对给定蛋白酶具有较高或较低的切割效率，以便确保与健康组织或循环中释放区段的切割率相比，当多肽接近靶细胞或组织及其共定位的蛋白酶时，优先从前药形式转化为活性形式(即，通过释放区段的切割以后抗原结合片段和xten从多肽的分离和释放)，使得与循环中得以保持的前药形式相比，释放的抗原结合片段具有更大的结合疾病组织中的配体的能力。通过这样的选择性设计，可以提高所得组合物的治疗指数，从而导致相对于未掺入这样的位点特异性活化的常规治疗剂减少的副作用。
[0205]
本文中使用的切割效率被定义为，当在进行反应的生化测定(进一步详述于实施例中)中各自经受蛋白酶时，被切割的包含释放区段的测试底物的百分比与被切割的对照底物rsr-1517(ac1611)的百分比的比率的log2值，其中初始底物浓度为6μm，将反应在37℃温育2小时，然后终止(例如，通过添加edta)，通过非还原sds-page分析的消化产物和未切割底物的量来建立切割的释放区段的百分比的比率。切割效率计算如下：
[0206][0207]
因此，-1的切割效率意味着被切割的测试底物的量与对照底物的量相比为50％，而 1的切割效率意味着被切割的测试底物的量与对照底物的量相比为200％。相对于对照，测试蛋白酶更高的切割速率将导致更高的切割效率，并且相对于对照，测试蛋白酶更慢的切割速率将导致更低的切割效率。如在实施例中详述的，当在体外生化测定中测试单独蛋白酶的切割率时，具有氨基酸序列eagrsanheplglvat(seq id no:53)的对照rs序列ac1611(rsr-1517)被确定为具有被以下蛋白酶切割的适当的基线切割效率：豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-14、upa和间质蛋白酶。通过在rs肽的单独位置处的氨基酸的选择性取代，创建了rs的文库，并针对7种蛋白酶的组进行了评价(在实施例中更完整地详述)，从而产生了用于建立适当氨基酸取代的指南的图谱(profile)，以便实现具有期望切割效率的rs。在制备具有期望切割效率的rs时，优选使用亲水性氨基酸a、e、g、p、s和t的取代，但是可以在给定位置处取代其它l-氨基酸以调整切割效率，条件是释放区段至少保留一些对蛋白酶切割的敏感性。
[0208]
iv).xten多肽
[0209]
在另一个方面，本公开内容涉及包含至少第一延长重组多肽(xten)的多肽，第一延长重组多肽(xten)掺入在本文描述的主题组合物实施方案中，由此增加构建体的质量和大小并且还用于当分子处于完整的未切割状态时大大降低抗原结合片段结合其配体的能力，如下文更充分地描述。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种多肽，其包含融合至rs的末端的单个xten，rs位于抗原结合片段和xten之间的。在其它实施方案中，本公开内容提供了包含第一和第二xten(xten1和xten2)的多肽，所述第一和第二xten分别融合至rs1和rs2的n-端和c-端，rs1和rs2位于每个抗原结合片段和xten之间。
[0210]
不受理论的约束，xten的掺入可以掺入主题组合物的设计中以赋予某些特性：1)提供具有xten的多肽组合物，当组合物处于其完整的前药形式时，所述xten屏蔽抗原结合片段并降低它们对靶细胞标志物和效应细胞抗原的结合亲和力；ii)提供具有xten的多肽组合物，在施用至受试者时所述xten提供延长的半衰期，iii)有助于完整组合物的溶解性和稳定性，从而增强主题组合物的药学特性；和iv)提供具有xten的多肽组合物，所述xten减少在正常组织和器官中的外渗(extravasation)，但允许在脉管系统中具有较大孔径的疾病组织(例如，肿瘤)中一定程度的外渗，但可通过某些哺乳动物蛋白酶的作用从组合物中释放，从而允许组合物的抗原结合片段更容易渗入疾病组织例如肿瘤，并结合效应细胞和肿瘤细胞上的靶细胞标志物并连接在一起。为了满足这些需要，本公开内容提供了包含一个或更多个xten的组合物，其中xten为所得组合物提供增加的质量和流体动力学半径。实施方案的xten多肽在主题组合物的设计中提供了某些优点，即，xten多肽不仅为组合物提供了增加的质量和流体动力学半径，而且其柔性的非结构化特征可以提供对组合物的抗原结合片段的屏蔽作用，从而降低与不表达或表达低水平的靶细胞标志物和/或效应细胞抗原的正常组织或正常组织的脉管系统中的抗原的结合。此外，xten向主题组合物中的掺入可以增强单链抗原结合片段在其表达和回收过程中的溶解度和正确折叠。
[0211]
xten是具有非天然存在的、基本上非重复的序列的多肽，其在生理条件下具有低程度二级或三级结构或者没有二级或三级结构，以及具有在以下段落中描述的一种或更多种另外的特性。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含一个或更多个xten的多肽，所述xten具有至少约36、72、96、100、144、200、288、292、293、300、576、584、800、864、867、868、900或至少约1000个或更多个氨基酸。在一种实施方案中，本公开内容提供了包含xten 1的多肽，其中所述xten 1的特征在于其具有至少约36个氨基酸残基，其中xten 1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)，并且其具有至少4-6种不同的选自g、a、s、t、e和p的氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含xten1的多肽，所述xten1具有至少约36至约1000、或至少100至约900、或至少约144至约868、或至少约288-868个氨基酸残基。在其它情况下，本公开内容提供了包含xten1的多肽，所述xten1具有至少约36至约1000、或至少100至约900、或至少约144至约868、或至少约288-868个氨基酸残基，其中90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自4-6类选自由甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)组成的组的氨基酸。在其它情况下，本公开内容提供了包含xten1的多肽，其中xten1的特征在于，它具有至少约36至约1000个氨基酸残基，xten1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自六类选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)的氨基酸。
[0212]
在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含xten1的本文描述的任何实施方案的多肽，其中xten1的特征在于，它具有至少约36至约1000、或至少约100至约900、或至少144至约868个氨基酸残基，其中xten1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自seq id no:672-675的序列中的至少三个。在一些情况下，xten1序列可以通过seq id no:672-675的12个氨基酸单元的任何组合进行组装，使得可以达到至少36个氨基酸或更长的任何长度，以12个氨基酸为增量；例如，36、48、
60、72、84、96个氨基酸等。在其它情况下，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含xten1，其中xten1的特征在于，它具有至少约36至约1000、或至少约100至约900、或至少144至约868个氨基酸残基，其中xten1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自seq id no:676-734的序列。在另一种实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的xten可以具有附加到组合物的xten的n-端或c-端的亲和标签hhhhhh(seq id no:794)、hhhhhhhh(seq id no:795)或序列epea(seq id no:796)，以促进组合物通过本领域已知的色谱法方法(例如，imac色谱法或c-tagxl色谱法)或以下实施例中描述的方法纯化到至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的纯度。
[0213]
在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含xten1的多肽，其中xten1包含与ae36(包含选自seq id no:672-675的序列中的任何三个的序列)或选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：ae144_1a、ae144_2a、ae144_2b、ae144_3a、ae144_3b、ae144_4a、ae144_4b、ae144_5a、ae144_6b、ae144_7a、ae284、ae288_1、ae288_2、ae288_3、ae292、ae293、ae576、ae584、ae864、ae864_2、ae865、ae866、ae867和ae868，其中每个在表7中示出。
[0214]
在本文公开的任何实施方案的一些方面，主题多肽包含xten1和xten2。在下文中描述了包含xten1和xten2以及其它组分的多肽的构型。在一种实施方案中，本公开内容提供了包含xten 1和xten2的多肽，其中xten2的特征在于其具有至少约36至约1000个氨基酸残基，其中xten2序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸残基选自seq id no:672-675的至少三个序列。在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含xten 1和xten2的多肽，其中所述xten 1和所述xten2各自的特征在于其具有至少约36至约1000个氨基酸残基，其中所述xten2序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自seq id no:676-734的序列。在另一种实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽可以包含xten1和xten2，其中xten1和xten2各自包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：ae144_1a、ae144_2a、ae144_2b、ae144_3a、ae144_3b、ae144_4a、ae144_4b、ae144_5a、ae144_6b、ae144_7a、ae284、ae288_1、ae288_2、ae288_3、ae292、ae293、ae576、ae584、ae864、ae864_2、ae865、ae866、ae867和ae868的序列，其中每个在表7中示出。在段落的前述实施方案的一些情况下，xten1和xten 2是相同的。在段落的前述实施方案的其它情况下，段落的前述实施方案的xten1和xten2具有不同的氨基酸序列。在一些情况下，具有2个xten的任何多肽组合物实施方案的xten1融合至多肽的c-端并且选自由ae293、ae300、ae584和ae868组成的组。在其它情况下，具有2个xten的任何多肽组合物实施方案的xten2融合至多肽的n-端并且选自由ae144_7a、ae292、ae576和ae864组成的组。在其它情况下，具有2个xten的任何多肽组合物实施方案的xten1融合至多肽的c-端并且选自由ae293、ae300、ae584和ae868组成的组，并且xten 2融合至n-端并且选自由ae144_7a、ae292、ae576和ae864组成的组。
[0215]
表6：xten序列基序
[0216]
基序名称氨基酸序列seq id no:ae1gspagsptstee672
ae2gsepatsgsetp673ae3gtsesatpesgp674ae4gtstepsegsap675
[0217]
表7：xten序列
[0218][0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229][0230]
本公开内容考虑了本文描述的任何实施方案的组合物，其包含表7中的中等长度的xten，以及长度比表7中的那些更长的xten，诸如其中将表6的12个氨基酸的基序添加到表7的xten的n-端或c-端。
[0231]
在另一种实施方案中，本公开内容考虑了本文描述的任何实施方案的多肽组合物，其包含xten1和xten2，其还可包含分别在多肽组合物的n-端处的his标签hhhhhh(seq id no:794)或hhhhhhhh(seq id no:795)和/或c-端处的序列epea(seq id no:796)，以促进组合物通过本领域已知的色谱法方法(包括、但不限于imac色谱法、c-tagxl亲和基质)和其它这样的方法(包括、但不限于以下实施例中描述的那些)纯化到至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的纯度。
[0232]
可以根据本公开内容使用的xten序列的其它实例公开在美国专利公布号2010/0239554 a1、2010/0323956 a1、2011/0046060 a1、2011/0046061 a1、2011/0077199 a1或2011/0172146 a1、或国际专利公布号wo 2010091122 a1、wo 2010144502 a2、wo 2010144508 a1、wo 2011028228 a1、wo 2011028229 a1、wo 2011028344 a2、wo 2014/011819 a2或wo 2015/023891。
[0233]
v).cd3细胞抗原结合片段
[0234]
在另一个方面，本公开内容涉及对效应细胞抗原具有特异性结合亲和力的抗原结合片段(af2)，其可掺入本文所述的任何主题组合物实施方案中。在一些情况下，效应细胞抗原在选自以下的效应细胞的表面上表达：浆细胞、t细胞、b细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)、肥大细胞、树突细胞、调节性t细胞(regt细胞)、辅助性t细胞、髓样细胞和nk细胞。
[0235]
结合效应细胞抗原的各种af2具有特定效用，用于与组合物形式中对与疾病细胞或组织相关的egfr抗原具有结合亲和力的抗原结合片段配对，以便实现对疾病细胞或组织的细胞杀伤。结合特异性可以由互补决定区或cdr(诸如轻链cdr或重链cdr)决定。在许多情况下，结合特异性由轻链cdr和重链cdr决定。重链cdr和轻链cdr的给定组合提供给定的结合口袋，与其它参考抗原相比，所述结合口袋赋予对效应细胞抗原的更大亲和力和/或特异
性。所得双特异性组合物是双特异性的，其具有通过短的柔性肽接头连接至对效应细胞抗原具有结合特异性的第二抗原结合片段(af2)的针对egfr的第一抗原结合片段(af1)，其中各抗原结合片段对其各自配体具有特异性结合亲和力。应当理解，在这样的组合物中，直接针对疾病组织egfr的af1与直接针对效应细胞标记物的af2组合使用，以便使效应细胞紧密接近疾病组织的细胞，从而实现对疾病组织细胞的细胞裂解。此外，af1和af2掺入包含可切割的释放区段和xten的专门设计的多肽中，以给组合物赋予前药特征，所述组合物在靠近疾病组织时在释放区段的切割后通过融合的af1和af2的释放而变得活化，所述疾病组织具有能够在释放区段序列中的一个或更多个位置切割释放区段的蛋白酶。
[0236]
在一种实施方案中，主题组合物的af2对t细胞表面表达的效应细胞抗原具有结合亲和力。在另一种实施方案中，主题组合物的af2对cd3具有结合亲和力。在另一种实施方案中，主题组合物的af2对cd3复合物的成员具有结合亲和力，所述成员包括处于单独形式或独立组合形式的cd3复合物的所有已知cd3亚基；例如，cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3α和cd3β。在另一种实施方案中，所述af2对cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3α或cd3β具有结合亲和力。
[0237]
本公开内容考虑的抗原结合片段的来源可以衍生自天然存在的抗体或其片段、非天然存在的抗体或其片段、人源化抗体或其片段、合成抗体或其片段、杂交抗体或其片段、或经工程改造的抗体或其片段。用于产生针对给定靶标志物的抗体的方法是本领域众所周知的。例如，单克隆抗体可以使用首先由kohler等人,nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法(美国专利号4,816,567)来制备。抗体及其片段、抗体的重链和轻链的可变区(vh和vl)、单链可变区(scfv)、互补决定区(cdr)和结构域抗体(dab)的结构是众所周知的。用于产生具有对给定抗原具有结合亲和力的期望抗原结合片段的多肽的方法是本领域已知的。
[0238]
应当理解，用于本文公开的组合物实施方案的术语抗原结合片段旨在包括保留结合作为相应完整抗体的配体的抗原的能力的抗体部分或片段。在这样的实施方案中，抗原结合片段可以是、但不限于，cdr和插入框架区、抗体的轻链和/或重链的可变或高变区(vl、vh)、可变片段(fv)、fab'片段、f(ab')2片段、fab片段、单链抗体(scab)、vhh骆驼科抗体、单链可变片段(scfv)、线性抗体、单结构域抗体、互补决定区(cdr)、结构域抗体(dab)、bhh或bnar类型的单结构域重链免疫球蛋白、单结构域轻链免疫球蛋白或本领域已知的含有能够结合抗原的抗体片段的其它多肽。从n-端至c-端可以以(cdr-h)-(cdr-l)或(cdr-h)-(cdr-l)取向构造具有cdr-h和cdr-l的抗原结合片段。两个抗原结合片段的vl和vh也可以以单链双体构型配置；即，af1和af2的vl和vh配置有适当长度的接头以允许排列为双体。
[0239]
本公开内容的各种cd3结合性af2已经被特定地修饰以增强它们在本文所述的多肽实施方案中的稳定性。抗体的蛋白聚集持续地是其可开发性方面的重大问题，并且仍然是抗体生产的主要关注领域。抗体聚集可以由其结构域的部分解折叠触发，导致单体-单体结合，随后是成核和聚集体生长。尽管抗体和基于抗体的蛋白的聚集倾向可以受外部实验条件影响，但它们强烈依赖于由其序列和结构决定的固有抗体特性。尽管众所周知，蛋白在其折叠状态下仅略微稳定，但通常较少意识到的是，大多数蛋白在其解折叠或部分解折叠状态下固有地易于聚集，并且所产生的聚集体可以是极其稳定的和长寿的。聚集倾向的降低也被证明伴随着表达滴度的增加，这表明减少蛋白聚集在整个开发过程中是有益的，并且可以为临床研究提供更有效的途径。对于治疗性蛋白，聚集体是在患者中产生有害免疫
应答的重要风险因素，并且可以通过许多机制形成。控制聚集可以提高蛋白稳定性、可制造性、损耗率、安全性、配制、滴度、免疫原性和溶解性。蛋白的固有特性，诸如大小、疏水性、静电和电荷分布，在蛋白溶解度中起着重要作用。由表面疏水性引起的治疗性蛋白的低溶解度已被证明使制剂开发更加困难，并可能在体内导致不良的生物分布、不希望的药代动力学行为和免疫原性。降低候选单克隆抗体的整体表面疏水性还可以提供与纯化和给药方案相关的益处和成本节约。可以通过结构分析将单个氨基酸鉴定为促进抗体中的聚集潜力，并且可能位于cdr以及框架区中。具体地，可以预测在给定抗体中引起疏水性问题的高风险的残基。在一种实施方案中，本公开内容提供了具有特异性结合cd3的能力的af2，其中af2相对于亲本抗体或抗体片段在框架区中具有对疏水性氨基酸的至少一个氨基酸取代，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。在另一种实施方案中，cd3 af2在一个或更多个框架区中具有对疏水性氨基酸的至少两个氨基酸取代，其中疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
[0240]
等电点(pi)是抗体或抗体片段不具有净电荷时的ph。如果ph低于抗体或抗体片段的pi，那么其将具有净正电荷。较大的正电荷倾向于与增加的血液清除和组织保留相关，通常具有较短的半衰期。如果ph大于抗体或抗体片段的pi，那么其将具有负电荷。负电荷通常导致减少的组织摄取和更长的半衰期。可能通过对框架残基的突变来操纵这种电荷。这些考虑为本文描述的实施方案的af2的序列的设计提供了信息，其中相对于用作起始点的亲本抗体进行了单独的氨基酸取代。多肽的等电点可以用数学方法(例如，通过计算)确定或在体外测定中实验确定。等电点(pi)是蛋白净电荷为零时的ph，且可以使用蛋白序列中具体氨基酸的电荷来计算。电荷的估计值被称为酸解离常数或pka值，并用于计算pi。pi可以通过方法诸如毛细管等电聚焦(参见datta-mannan,a.,等人.the interplay of non-specific binding,target-mediated clearance and fcrn interactions on the pharmacokinetics of humanized antibodies.mabs 7:1084(2015)；li,b.,等人.framework selection can influence pharmacokinetics of a humanized therapeutic antibody through differences in molecule charge.mabs 6,1255-1264(2014))或本领域已知的其它方法在体外确定。在一些实施方案中，af1和af2的等电点被设计成彼此在特定范围内，从而提高稳定性。
[0241]
在一种实施方案中，本公开内容提供了用于本文所述任何多肽实施方案的af2，其包含cdr-l和cdr-h，其中af2(a)特异性地结合t细胞受体分化簇3(cd3)；和(b)包含分别具有seq id no:742、743和744的氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在另一种实施方案中，本公开内容提供用于本文所述任何多肽实施方案的af2，其包含cdr-l和cdr-h，其中af2(a)特异性地结合t细胞受体分化簇3(cd3)；(b)包含分别具有seq id no:742、743、744氨基酸序列的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3；和(c)包含cdr-l，其中cdr-l包含具有seq id no:735或736的氨基酸序列的cdr-l1、具有seq id no:738或739的氨基酸序列的cdr-l2和具有seq id no:740的氨基酸序列的cdr-l3。在另一实施方案中，段落的前述af2实施方案还包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，其中af2包含fr-l1，其表现出与seq id no:746的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l2，其表现出与seq id no:747的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性
或与其相同；fr-l3，其表现出与seq id no:748-751中的任一个的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l4，其表现出与seq id no:754的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h1，其表现出与seq id no:755或seq id no:756的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h2，其表现出与seq id no:759的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h3，其表现出与seq id no:760的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和fr-h4，其表现出与seq id no:764的氨基酸序列至少86％，87％，88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。在另一实施方案中，用于本文所述任何多肽实施方案的af2包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，其中af2包含fr-l1，其表现出与seq id no:746的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l2，其表现出与seq id no:747的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l3，其表现出与seq id no:748的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l4，其表现出与seq id no:754的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h1，其表现出与seq id no:755的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h2，其表现出与seq id no:759的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h3，其表现出与seq id no:760的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和fr-h4，其表现出与seq id no:764的氨基酸序列至少86％，87％，88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。在另一实施方案中，用于本文所述任何多肽实施方案的af2包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，其中af2包含fr-l1，其表现出与seq id no:746的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l2，其表现出与seq id no:747的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l3，其表现出与seq id no:749的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l4，其表现出与seq id no:754的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h1，其表现出与seq id no:755的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h2，其表现出与seq id no:759的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的
序列同一性或与其相同；fr-h3，其表现出与seq id no:760的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和fr-h4，其表现出与seq id no:764的氨基酸序列至少86％，87％，88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。在另一实施方案中，本文所述主题多肽实施方案的af2包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，其中af2包含fr-l1，其表现出与seq id no:746的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l2，其表现出与seq id no:747的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l3，其表现出与seq id no:750的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l4，其表现出与seq id no:754的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h1，其表现出与seq id no:755的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h2，其表现出与seq id no:759的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h3，其表现出与seq id no:760的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和fr-h4，其表现出与seq id no:764的氨基酸序列至少86％，87％，88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。在另一实施方案中，本文所述主题多肽实施方案的af2包含轻链框架区(fr-l)和重链框架区(fr-h)，其中af2包含fr-l1，其表现出与seq id no:746的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l2，其表现出与seq id no:747的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l3，其表现出与seq id no:751的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-l4，其表现出与seq id no:754的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h1，其表现出与seq id no:756的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h2，其表现出与seq id no:759的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；fr-h3，其表现出与seq id no:760的氨基酸序列至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同；和fr-h4，其表现出与seq id no:764的氨基酸序列至少86％，87％，88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同。
[0242]
在另一种实施方案中，本公开内容提供了用于本文所述的任何多肽实施方案的af2，其中af2包含与seq id no:766或seq id no:769的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨
基酸序列。在另一种实施方案中，本公开内容提供了用于本文所述的任何多肽实施方案中的af2，其中af2包含与seq id no:765、767、768、770或771中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。在另一种实施方案中，本公开内容提供了用于本文所述的任何多肽实施方案中的af2，其中af2包含与seq id no:766或seq id no:769的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(vh)氨基酸序列，和与seq id no:765、767、768、770或771中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(vl)氨基酸序列。
[0243]
在另一种实施方案中，本公开内容提供了用于本文所述的任何多肽实施方案的af2，其中所述af2包含与seq id no:776-780中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或与其相同的氨基酸序列。
[0244]
在另一个方面，本公开内容提供了与cd3蛋白复合物结合的af2抗原结合片段，该af2抗原结合片段与本领域已知的cd3结合抗体或抗原结合片段相比具有增强的稳定性。另外，本公开内容的cd3抗原结合片段被设计成赋予它们整合入其中的嵌合双特异性抗原结合片段组合物更高程度的稳定性，导致融合蛋白的改善的表达和恢复、增加的保质期(shelf-life)和当施用于受试者时增强的稳定性。在一种方案中，与本领域已知的某些cd3结合抗体和抗原结合片段相比，本公开内容的cd3 af2被设计成具有更高程度的热稳定性。因此，用作它们整合到其中的嵌合双特异性抗原结合片段组合物的组分的cd3 af2表现出有利的药学特性，包括高热稳定性和低聚集倾向，从而导致在制造和储存过程中改善的表达和回收，以及促进长血清半衰期。生物物理特性诸如热稳定性通常受限于固有特性差异很大的抗体可变结构域。高热稳定性通常与高表达水平和其它期望的特性相关，包括不易聚集(buchanan a,等人engineering a therapeutic igg molecule to address cysteinylation,aggregation and enhance thermal stability and expression.mabs 2013；5:255)。热稳定性通过测量“解链温度”(tm)来确定，tm被定义为一半分子变性时的温度。每种异源二聚体的解链温度指示其热稳定性。确定tm的体外测定是本领域已知的，包括在以下实施例中描述的方法。异源二聚体的解链点(melting point)可以使用技术诸如示差扫描量热法(chen等人(2003)pharm res 20:1952-60；ghirlando等人(1999)immunol lett 68:47-52)测量。可替换地，异源二聚体的热稳定性可以使用圆二色性(murray等人(2002)j.chromatogr sci 40:343-9)或如下文实施例中所述测量。
[0245]
本公开内容的cd3结合片段和包含所述抗cd3结合片段的抗cd3双特异性抗体的热变性曲线及参考结合显示，本公开内容的构建体比由seq id no:781中所示的序列组成的抗原结合片段或其中所述对照双特异性抗原结合片段包含seq id no:781和结合本文所述egfr实施方案的参考抗原结合片段对热变性更有抗性。在一种实施方案中，本文所述任何主题组合物实施方案的多肽包含本文所述实施方案的抗cd3 af2，其中af2的tm比由seq id no:781序列组成的抗原结合片段的tm高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃，如通过在体外测定中解链温度的增加所确定的。
[0246]
在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af2，所述
af2以在约10nm和约400nm之间、或约50nm和约350nm之间、或约100nm和300nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在包含人或食蟹猴cd3抗原的体外抗原结合测定中所确定的。在另一种实施方案中，本文描述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af2，所述af2以小于约10nm、或约50nm、或约100nm、或约150nm、或约200nm、或约250nm、或约300nm、或约350nm、或小于约400nm的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。为了清楚起见，具有400nm的kd的抗原结合片段比具有10nm的kd的抗原结合片段更弱地结合其配体。在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含af2，所述af2以比由seq id no:781的氨基酸序列组成的抗原结合片段弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合人或食蟹猴cd3，如通过体外抗原结合测定中的各自解离常数(kd)所确定的。在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含af2的双特异性多肽，所述af2相对于掺入主题多肽的本文所述egfr1实施方案的结合亲和力，表现出弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或至少1000倍的对cd3的结合亲和力，如通过体外抗原结合测定中的各自解离常数(kd)所确定的。使用结合测定或竞争性结合测定，诸如使用芯片结合的受体或结合蛋白的biacore测定或elisa测定(如在美国专利5,534,617中所述)、在本文实施例中描述的测定、放射-受体测定或本领域已知的其它测定，可以测定主题组合物对靶配体的结合亲和力。然后可以使用标准方法，诸如scatchard分析，如由van zoelen,等人,trends pharmacol sciences(1998)19)12):487所述，或本领域已知的其它方法，确定结合亲和常数。
[0247]
在一个相关方面，本公开内容提供了结合cd3并掺入嵌合双特异性多肽组合物中的af2，所述嵌合双特异性多肽组合物被设计成具有赋予本公开内容的组合物比包含本领域已知的cd3结合抗体或抗原结合片段的相应组合物增强的稳定性的等电点(pi)。在一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包括结合cd3的af2，其中af2表现出在6.0和6.6之间、包括端点的pi。在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含结合cd3的af2，其中af2表现出比由seq id no:781中所示序列组成的参考抗原结合片段的pi低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0ph单位的pi。在另一种实施方案中，本文所述任何主题组合物实施方案的多肽包含与结合egfr抗原的af1融合的结合cd3的af2，其中af2表现出在结合egfr抗原或其表位的af1的pi的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5ph单位内的pi。在另一种实施方案中，本文所述的任何主题组合物实施方案的多肽包含与结合egfr抗原的af1融合的结合cd3的af2，其中af2表现出在af1的pi的至少约0.1至约1.5、或至少约0.3至约1.2、或至少约0.5至约1.0、或至少约0.7至约0.9ph单位内的pi。特别地意图通过这样的设计，其中两种抗原结合片段的pi是在这样的范围内，所得的融合的抗原结合片段将给它们整合到其中的嵌合双特异性抗原结合片段组合物赋予更高程度的稳定性，从而导致呈可溶性非聚集形式的融合蛋白的改善的表达和提高的回收率，配制的嵌合双特异性多肽组合物的增加的保质期，以及当将组合物施用至受试者时增强的稳定性。换句话说，使af2和af1在相对窄的pi范围内可以允许选择在其中af2和af1两者都是稳定的缓冲液或其它溶液，从而促进组合物的总体稳定性。
[0248]
在某些实施方案中，抗原结合片段的vl和vh通过相对较长的接头融合，所述接头
由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个亲水性氨基酸组成，当连接时在一起，其具有柔性特性。在一种实施方案中，本文描述的任何scfv实施方案的vl和vh通过相对较长的亲水性氨基酸接头连接，所述接头选自序列gsgegsegegggegsegegsgeggegegsg(seq id no:790)、tgsgegsegegggegsegegsgeggegegsgt(seq id no:791)、gatppetgaetespgettggsaeseppgeg(seq id no:792)或gsaaptagttpsaspapptggssaagspst(seq id no:793)。在另一种实施方案中，af1和af2通过具有3、4、5、6或7个氨基酸的亲水性氨基酸的短接头连接在一起。在一种实施方案中，所述短接头序列选自序列sggggs(seq id no:797)、ggggs(seq id no:798)、ggsggs(seq id no:799)、ggs或gsp的组。在另一种实施方案中，本公开内容提供了包含单链双体的组合物，其中在折叠后，第一个结构域(vl或vh)与最后一个结构域(vh或vl)配对形成一个scfv，并且在中间的两个结构域配对形成另一个scfv，其中第一个和第二个结构域以及第三个和最后一个结构域通过前述短接头之一融合在一起，并且第二和第三可变结构域通过前述相对较长的接头之一融合。如本领域技术人员将理解的，短接头和相对较长的接头的选择是为了防止相邻可变结构域的错误配对，从而促进包含第一抗原结合片段和第二抗原结合片段的vl和vh的单链双体构型的形成。
[0249]
表8：cd3 cdr序列
[0250][0251]
表9：cd3 fr序列
[0252][0253]
表10：vl和vh序列
[0254][0255]
表11：scfv序列
[0256]
[0257]
[0258][0259]
vi).双特异性抗原结合组合物—构型和功能特性
[0260]
在另一个方面，本公开内容涉及新颖的嵌合双特异性抗原结合组合物，其结合效应细胞(例如，t细胞)的cd3蛋白复合物的抗原或表位以及与疾病细胞或组织相关的egfr。因此，它们可以被称作t-细胞衔接物(t cell engager)。如下文更充分描述的，双特异性抗原结合组合物被配置为可活化的前药形式，其赋予优于本领域已知的双特异性t-细胞衔接物和相关化合物的优点。本公开内容的组合物具有以下特性，包括在其生产和纯化过程中增强的稳定性，当施用至受试者时在循环中增强的稳定性和增加的半衰期，在预期治疗部位而不是在正常健康组织中被活化的能力，以及当通过释放区段的蛋白水解性切割释放区段并释放融合的af1和af2而活化时，对靶细胞和效应细胞表现出至少与相应的常规双特异性igg抗体相当的结合亲和力。在效应细胞和靶细胞被融合的af1和af2结合后，形成免疫突触，其影响效应细胞的活化并促进随后通过细胞凋亡或细胞裂解对靶细胞的破坏。
[0261]
本文描述的本公开内容的各种双特异性抗原结合组合物被专门设计为前药形式，即xten组分屏蔽抗原结合片段，从而降低它们结合其配体的能力，直到通过对位于释放区段内的任何蛋白酶切割位点的蛋白酶切割而从组合物中释放。已知与疾病细胞或组织相关的蛋白酶包括、但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，包括、但不限于本文所述的特定蛋白酶。与不是前药形式的双特异性t-细胞衔接物治疗剂相比，这种双特异性抗原结合组合物的前药特性提高了组合物对疾病组织或细胞的特异性。相比之下，通过在靶细胞或疾病组织的微环境(其中egfr和能够切割释放区段的蛋白酶高度表达)中特异性地活化双特异性抗原结合组合物，构建体的双特异性抗原结合片段和xten在释放区段的切割后被释放，并且融合的af1和af2可以以高度特异性的方式将细胞毒性效应细胞与表达egfr抗原的细胞交联，从而将t细胞的细胞毒性潜力导向靶细胞。在蛋白酶切割后，af1和af2不再被屏蔽，并有效地恢复其结合带有egfr抗原的靶细胞和效应细胞(诸如通过结合形成t细胞受体复合物的一部分的cd3抗原而结合细胞毒性t细胞)的全部潜力，从而引起t细胞活化，随后介导表达特定egfr抗原的靶细胞的裂解。因此，预期双特异性抗原结合组合物表现出强的、特异性的和有效的靶细胞杀伤。在这样的情况下，细胞会被选
择性消除，从而降低毒副作用的可能性。
[0262]
具有第一和第二抗原结合片段(分别是af1和af2)的主题组合物的设计由对至少三种特性的考虑来驱动：1)具有双特异性抗原结合片段的组合物，所述双特异性抗原结合片段具有结合效应细胞和具有egfr抗原的靶细胞并将它们连接到一起从而形成免疫突触的能力；2)具有xten的组合物，所述xten i)当组合物处于完整前药形式时，屏蔽两种抗原结合片段并降低它们的结合靶标和效应细胞配体的能力，ii)当施用至受试者时提供延长的半衰期，iii)与疾病组织(例如，肿瘤)相比，减少完整组合物从正常组织和器官的循环中的外渗，并且iv)赋予与常规的双特异性细胞毒性抗体治疗剂相比增加的安全性谱；和3)当rs在疾病组织附近被一种或更多种哺乳动物蛋白酶切割时被活化，从而释放双特异性抗原结合片段，使得它们恢复其对靶配体的完全结合亲和力潜力。主题组合物的设计利用了xten和释放区段(rs)组分的特性，并且它们相对于双特异性抗原结合片段的定位实现了前述特性，如以下示例性实施例中的结果所证明的。
[0263]
在一种实施方案中，本公开内容提供了双特异性抗原结合组合物，其具有两种抗原结合片段，本文所述的任何抗原结合片段实施方案的af1和af2，其中af2通过柔性肽接头融合至af1。在一种实施方案中，所述双特异性抗原结合片段组合物包含第一抗原结合片段(af1)和第二抗原结合片段(af2)，其中所述af1特异性地结合egfr或其表位，其中af2特异性地结合t细胞受体分化簇3(cd3)，其中第二抗原结合片段的等电点(pi)与第一抗原结合片段的pi之间的差异为0至约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5ph单位，如通过计算或经由体外测定所确定。在双特异性抗原结合组合物的一种实施方案中，所述af1以约0.1nm和约100nm、或约0.5nm和约50nm、或约1nm和约20nm、或约2nm和约10nm的kd特异性地结合egfr，如通过包含egfr或其表位的体外抗原结合测定所确定的。在双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案中，所述af2以约0.1nm和约100nm之间、或约0.5nm和约50nm之间、或约1.0nm和约20nm之间、或约2.0nm和约10nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案中，所述af2以约10nm和约400nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案中，所述af2以约10nm和约400nm之间，或约50nm和约350nm之间，或约100nm和300nm之间的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案中，所述af2以小于约3nm、或约10nm、或约50nm、或约100nm、或约150nm、或约200nm、或约250nm、或约300nm、或者约400nm的解离常数(kd)特异性地结合人或食蟹猴cd3，如在体外抗原结合测定中所确定的。在双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案中，所述af2以比由seq id no:781的氨基酸序列组成的抗原结合片段小至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合人或食蟹猴cd3，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(kd)所确定的。在双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案中，所述af2对cd3表现出的结合亲和力比af1弱至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或至少1000倍，如通过在体外抗原结合测定中的各自解离常数(kd)所确定的。为了清楚起见，具有400nm的kd的抗原结合片段比具有10nm的kd的抗原结合片段更弱地结合其配体。
[0264]
在本文所述的任何主题实施方案的双特异性抗原结合组合物的另一种实施方案
中，具有两个抗原结合片段(af1和af2)、单个rs和单个xten，所述多肽在未切割状态下可以具有af2-af1-rs1-xten1、af1-af2-rs1-xten1、xten1-rs1-af2-af1、xten1-rs1-af1-af2、或双体-rs1-xten1或xten1-rs1-双体的从n-端至c-端结构排列，其中所述双体包含af1和af2的vl和vh。
[0265]
在另一方面，本文所述的任何实施方案的组合物的各种设计的特征是，当双特异性抗原结合组合物的rs在靶细胞环境中被哺乳动物蛋白酶切割并从前药形式转化成活化的或脱辅基蛋白形式时，在双特异性抗原结合片段和xten从组合物切割和释放后，融合的af1和af2结合af2靶向的效应细胞(例如携带cd3的t细胞)和携带af1靶向的靶细胞的egfr抗原的疾病细胞并将它们连接在一起，于是效应细胞被活化。在一种实施方案中，其中双特异性抗原结合组合物的rs被切割并且抗原结合片段被释放，随后效应细胞和靶细胞的同时结合导致效应细胞的至少3倍、或10倍、或30倍、或100倍、或300倍、或1000倍活化，其中通过细胞因子、细胞裂解蛋白的产生或靶细胞的裂解来评估活化，这在体外基于细胞的测定中评估。在另一实施方案中，携带cd3抗原的t细胞和携带egfr抗原的靶细胞通过释放的抗原结合片段的同时结合形成免疫突触，其中所述结合导致释放能够裂解疾病细胞的t细胞来源的效应分子。用于测量效应细胞活化和/或细胞裂解的体外测定的非限制性实例包括细胞膜完整性测定、混合细胞培养测定、基于facs的碘化丙啶测定、锥虫蓝流入测定、光度测量酶释放测定、elisa、辐射测量51cr释放测定、荧光测量铕释放测定、钙黄绿素am释放测定、光度测量mtt测定、xtt测定、wst-1测定、阿拉玛蓝测定、辐射测量3h-thd掺入测定、测量细胞分裂活性的克隆原测定、测量线粒体跨膜梯度的荧光测量罗丹明123测定、通过基于facs的磷脂酰丝氨酸暴露而监测的细胞凋亡测定、基于elisa的tunel试验测定、胱天蛋白酶活性测定、和细胞形态学测定、或本领域已知的用于测定细胞因子、细胞裂解蛋白或细胞的裂解的其它测定或在下文实施例中描述的方法。
[0266]
在其它实施方案中，本发明提供双特异性抗原结合组合物，其具有两种本文所述任何实施方案的抗原结合片段、两个本文所述任何实施方案的两个rs和两个本文所述任何实施方案的两个xten。这些组合物的设计由以下考虑驱动：通过添加第二xten进一步降低未切割的组合物对af1和af2抗体片段的相应配体的结合亲和力，以进一步减少当施用至受试者时所述组合物与健康组织或细胞的意外结合，从而与仅具有一个rs和一个xten的组合物相比进一步提高主题组合物的治疗指数。当在体外测定时，相对于具有单个rs和xten的那些组合物，第二rs和第二xten的添加导致完整的未切割的多肽与af1和af2抗体片段的相应配体的结合亲和力的惊人降低，并且当以治疗有效剂量施用时，还导致在疾病的动物模型中降低的毒性，如下面的实施例中所述。在具有两种抗原结合片段、两个rs和两个xten的组合物的实施方案中，在未切割状态下，组合物可以具有以下从n-端至c-端的结构排列：xten1-rs1-af2-af1-rs2-xten2、xten1-rs1-af1-af2-rs2-xten2、xten2-rs2-af2-af1-rs1-xten1、xten2-rs2-af1-af2-rs1-xten1、xten2-rs2-双体-rs1-xten1，其中所述双体包含af1和af2的vl和vh，或xten1-rs1-双体-rs2-xten2，其中所述双体包含af1和af2的vl和vh。
[0267]
不受限于特定理论，据信，使用如上所述的双特异性抗原结合组合物形式，在rs的切割后，释放的融合的af1和af2能够通过募集细胞毒性效应细胞来杀伤靶细胞，而无需任何预刺激和/或共刺激。此外，对效应细胞的预刺激和/或共刺激的独立性可能对由释放的、
融合的af1和af2抗原结合片段介导的异常高的细胞毒性有实质贡献。在一些实施方案中，释放的af1和af2(其中af1通过接头肽保持与af2融合)被设计成具有结合特异性，使得它具有结合紧密靠近的细胞毒性效应细胞(例如，t细胞、nk细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞))和通过af1预选的egfr抗原并将它们连接在一起的能力，所述af1对与肿瘤细胞、癌症细胞或疾病组织相关细胞相关的egfr抗原具有结合特异性，从而实现免疫突触以及释放的细胞因子和效应分子针对靶疾病或癌细胞的选择性、定向和局部作用，结果是疾病或癌细胞被损伤或破坏，从而对受试者产生治疗益处。释放的与效应细胞抗原结合的af2能够调节效应细胞的一种或更多种功能，从而导致或有助于对靶肿瘤细胞的细胞裂解作用。效应细胞抗原可以由效应细胞或其它细胞表达。在一种实施方案中，效应细胞抗原在效应细胞的细胞表面上表达。效应细胞抗原的非限制性实例是cd3、cd4、cd8、cd16、cd25、cd38、cd45ro、cd56、cd57、cd69、cd95、cd107和cd154。因此，本领域技术人员将理解，主题组合物的构型旨在选择性地或不成比例地将组合物的活性形式递送至靶肿瘤组织或癌细胞，而不是其中施用组合物的受试者的健康组织或健康细胞，并导致治疗益处。从前述明显的是，本公开内容提供了用于实现期望特性的呈设计构型的一大类多肽。
[0268]
本公开内容的一个目的是，主题双特异性抗原结合组合物的设计具有由xten对完整循环组合物赋予的屏蔽作用和伴随的降低的结合效应细胞和靶组织的潜力，导致与未连接至屏蔽部分(诸如xten)的双特异性抗原结合组合物相比，当对受试者施用时，在全身暴露期间th1 t-细胞相关的细胞因子或其它促炎介质的减少产生，使得总体副作用和安全性谱(例如，治疗指数)得到改善。作为细胞免疫的重要组成部分，il-2、tnf-α和ifn-γ的产生是th1应答的标志(romagnani s.t-cell subsets(th1 versus th2).ann allergy asthma immunol.2000.85(1):9-18)，特别是在抗-cd3刺激的t细胞中(yoon,s.h.selective addition of cxcr3 ccr4-cd4 th1 cells enhances generation of cytotoxic t cells by dendritic cells in vitro.exp mol med.2009.41(3):161-170)，并且il-4、il-6和il-10也是在双特异性抗体组合物的细胞毒性应答中很重要的促炎性细胞因子(zimmerman,z.,等人unleashing the clinical power of t cells:cd19/cd3 bi-specific t cell engagerantibody composition blinatumomab as a potential therapy.int.immunol.(2015)27(1):31-37)。在一种实施方案中，与在可比较条件(例如，等同摩尔浓度)下进行的基于体外细胞的细胞因子刺激测定中的对应蛋白酶处理过的组合物的对应的释放的af1和af2(它们在通过rs的蛋白酶解释放以后保持融合在一起)刺激的th1和/或细胞因子水平相比，当在基于体外细胞的细胞因子刺激测定中使完整的、未切割的多肽与效应细胞和靶细胞接触时，本文所述实施方案的完整的、未切割的双特异性抗原结合组合物可以表现出减少了至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少7倍、或至少8倍、或至少9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少1000倍的导致th1和/或促炎性细胞因子产生的潜力。th1和/或促炎性细胞因子的非限制性实例是il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α和ifn-γ。在前述的一种实施方案中，在体外测定中测定th1细胞因子的产生，所述体外测定包含效应细胞诸如pbmc或cd3 t细胞以及具有本文公开的egfr抗原的靶细胞。在另一种实施方案中，可以从取自其中已经施用了多肽组合物的受试者的血液、流体或组织样品评估细胞因子。在前述实施方案中，受试者可以是小鼠、大鼠、猴和人。但是，在本文描述的实施方案的主题双特异性抗原结合组合物
的优点中，已经发现，组合物的细胞裂解性能不需要细胞因子的预刺激；通过抗原结合片段结合至靶细胞的效应细胞的免疫突触的形成足以在靶细胞中实现细胞裂解或细胞凋亡。尽管如此，促炎性细胞因子的产生仍是评估主题多肽组合物的效能或作用的有用标志物；无论是通过体外测定还是在监测具有肿瘤的受试者的治疗方面。
[0269]
在受试者中使用双特异性抗原结合片段组合物的背景下，本公开内容的一个目的是，通过添加xten来设计主题双特异性抗原结合组合物，以利用肿瘤或发炎组织中的脉管系统与健康脉管系统相比的孔径差异，从而减少正常组织中完整双特异性抗原结合组合物的外渗，但在肿瘤脉管系统或其它炎症区域的渗漏环境中，完整的组装体可以外渗并被疾病细胞环境中的蛋白酶活化，从而将抗原结合片段释放到效应物和靶细胞(参见，例如，图5)。至于双特异性抗原结合组合物的rs，该设计利用了这样的情况：当双特异性抗原结合组合物靠近表达一种或更多种蛋白酶的疾病组织(例如，肿瘤)时，对由肿瘤表达的一种或更多种蛋白酶敏感的rs序列能够被蛋白酶切割(在上文更全面地描述)。蛋白酶的作用切割组合物的释放区段(rs)，使抗原结合片段与xten分开，产生分子量和流体动力学半径降低的组分，特别是释放的融合的af1和af2。如将理解的，组合物的分子量和流体动力学半径的降低还赋予了这样的特性：释放的、融合的af1和af2能够在溶液中更自由地移动，移动通过组织和肿瘤中的更小的孔空间，以及更容易从肿瘤脉管系统的较大孔外渗，且更容易渗透到肿瘤中，从而产生增加与效应细胞和肿瘤细胞附接并连接到一起的能力。这样的特性可以通过不同的测定来测量。因而，本领域技术人员将理解，在使用主题组合物治疗受试者的背景下，双特异性抗原结合组合物以前药形式存在，并且当通过与疾病组织或细胞共定位的蛋白酶作用而进入某些细胞环境时转化为更具活性的形式。在通过靶组织中蛋白酶的作用从组合物释放后，对效应细胞抗原具有结合特异性的af2和连接的对靶细胞的抗原具有结合特异性的af1恢复其结合效应细胞和靶细胞并将它们连接在一起从而形成免疫突触的全部能力。免疫突触的形成引起效应细胞变得活化，其中各种信号途径开启新的基因转录，并通过胞吐作用释放其囊泡中的效应分子内容物。根据效应细胞的类型，不同的细胞因子和淋巴因子被释放；例如，1型辅助性t细胞(th1)释放细胞因子如ifn-γ、il-2和tnf-α，而2型辅助性t细胞(th2)释放刺激b细胞的细胞因子如il-4、il-5、il-10和il-13，并且细胞毒性t淋巴细胞(ctl)释放杀伤靶标的细胞毒性分子如穿孔蛋白和颗粒酶(统称为“效应分子”)。特别考虑的是，在通过双特异性抗原结合组合物释放的双特异性抗原结合片段同时结合效应细胞和靶肿瘤细胞并将它们连接在一起后，在非常低的效应物与靶标(e:t)比率，由效应细胞释放到细胞之间的免疫突触中的效应分子作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞引起损伤、穿孔蛋白介导的裂解、颗粒酶b诱导的细胞死亡和/或细胞凋亡。因此，在另一个方面，并且不受理论束缚，设计的组合物的特征在于，当将可活化的双特异性抗原结合片段组合物施用至具有肿瘤的受试者时，前药形式保留在正常组织的循环系统中，但能够外渗到肿瘤的渗透性更强的脉管系统中，使得组装体的前药形式被与肿瘤共定位的蛋白酶活化，并且释放的抗原结合片段结合效应细胞(例如，t细胞)和表达被组合物的af1靶向的egfr抗原的肿瘤细胞并将它们连接在一起，于是效应细胞被活化并实现肿瘤细胞的裂解。换句话说，在一些情况下，肿瘤组织中渗透性更强的脉管系统可以允许双特异性抗原结合多肽外渗到组织中，在那里肿瘤相关的蛋白酶可以作用于释放区段(rs)，切割它并释放结合部分，结合部分继而可以结合效应细胞和肿瘤相关细胞并将它们连接在一起。在正常组织的情况下，外渗
可以被更紧密的脉管系统屏障阻断，或者在双特异性抗原结合多肽确实一定程度地外渗的情况下，双特异性抗原结合多肽可以主要保持“原(pro)”形式，因为在健康组织中可能没有足够的蛋白酶来释放结合部分，净效应是不会形成免疫突触。在一些情况下，与对应的完整的未切割的双特异性抗原结合组合物相比，受试者的肿瘤中结合肿瘤细胞和效应细胞两者的释放的融合的af1和af2表现出增加至少10倍、或至少30倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少300倍、或至少400倍、或至少500倍、或至少1000倍的活化效应细胞的能力。在其它情况下，与肿瘤中对应的尚未切割的完整的双特异性抗原结合组合物相比，受试者的肿瘤中结合肿瘤细胞和效应细胞两者的释放的融合的af1和af2表现出增加至少10倍、或至少30倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少300倍、或至少400倍、或至少500倍、或至少1000倍的裂解肿瘤细胞的能力。在前述实施方案中，效应细胞活化和/或细胞毒性可以通过本领域已知的常规方法测定，诸如活化的效应细胞的细胞计量测量、细胞因子测定、肿瘤大小的测量或通过组织病理学。在前述实施方案中，受试者可以是小鼠、大鼠、狗、猴和人。具体而言，特别考虑将主题组合物设计成使得在施用至患有具有af2可结合的egfr抗原的疾病的受试者后，与本领域已知的常规双特异性抗体相比，双特异性抗原结合组合物表现出增强的治疗指数和降低的副作用发生率，这通过xten对前药形式中抗原结合片段的结合亲和力的屏蔽作用和空间位阻的组合实现，但能够在产生rs为其底物的蛋白酶的靶组织(例如，肿瘤)附近或内部释放双特异性af1和af2(通过在rs中包含切割序列实现)。
[0270]
vii).双特异性抗原结合组合物的方法和用途
[0271]
在另一个方面，本公开内容提供了在医疗背景下特别有用的可活化的双特异性抗原结合组合物和包含双特异性抗原结合组合物的药物组合物；例如，用于预防、治疗和/或改善某些癌症、肿瘤或炎性疾病。为了用于治疗疾病，本发明的双特异性抗原结合组合物将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的特定障碍、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用计划和医学从业人员已知的其它因素。
[0272]
许多治疗策略已被用于设计多肽组合物，用于治疗患有癌性疾病的受试者的方法中，包括通过靶向tcr信号传递来调节t细胞应答，特别是使用在临床上广泛用于免疫抑制方案的抗-人cd3单克隆抗体的vl和vh部分。cd3-特异性的单克隆okt3是第一种被批准用于人类的此类单克隆(sgro,toxicology 105(1995),23-29)，并且在临床上广泛用作移植中的免疫抑制剂(chatenoud l:immunologic monitoring during okt3 therapy.clin transplant7:422-430,1993)。此外，抗-cd3单克隆药物可诱导部分t细胞信号传递和克隆无反应性(smith,j.exp.med.185(1997),1413-1422)。okt3与t细胞膜中的cd3复合物发生反应并阻断其功能；cd3复合物与t细胞的抗原识别结构(tcr)缔合，这对于信号转导至关重要。这些和其它这样的cd3特异性抗体能够诱导各种t细胞应答，包括细胞因子产生(von wussow,human gamma interferon production by leukocytes induced with monoclonal antibodies recognizing t cells.j.immunol.127:1197-1200(1981))，增殖和抑制性t细胞诱导。在癌症中，已经进行了利用细胞毒性t细胞来裂解癌细胞的尝试。不受理论的约束，为了实现靶细胞裂解，据信细胞毒性t细胞需要细胞与细胞的直接接触；在细胞毒性t细胞上的tcr必须识别并衔接靶细胞上的适当抗原。这产生免疫突触，进而在细胞毒性t细胞内启动信号传递级联，引起t细胞活化和许多细胞毒性的细胞因子和效应分子的
产生。穿孔蛋白和颗粒酶是高毒性分子，它们储存在预先形成的颗粒中，这些颗粒存在于活化的细胞毒性t细胞中。识别靶细胞后，衔接的细胞毒性t细胞的细胞质颗粒向细胞毒性t细胞膜迁移，最终与其融合并以定向方式将其内容物释放到免疫突触中，在靶细胞的膜内形成孔，从而破坏肿瘤细胞质膜。产生的孔作为颗粒酶的进入点；所述颗粒酶是诱导肿瘤细胞的细胞凋亡的丝氨酸蛋白酶家族。
[0273]
本文描述的主题双特异性抗原结合组合物(其中对t细胞的cd3具有特异性结合亲和力的af2与对egfr抗原具有特异性结合亲和力的af1紧密融合)是具有以下能力的t-细胞衔接物：在通过释放区段的切割从组合物的完整前药形式释放后，恢复它们的结合t细胞和靶细胞的全部潜力，从而形成免疫突触，其促进t细胞的活化并促进随后通过细胞凋亡或细胞裂解对肿瘤细胞的破坏。
[0274]
本公开内容涵盖双特异性抗原结合组合物的使用方法，该组合物被工程改造成除了靶向效应细胞之外还靶向一系列恶性细胞，诸如肿瘤，以便启动靶细胞裂解并实现有益的治疗结果，其中双特异性抗原结合组合物被设计成使得一个抗原结合片段结合并衔接cd3以活化细胞毒性t细胞，而第二抗原结合片段可设计为靶向特定恶性肿瘤特征性的egfr标志物；将它们桥接在一起以产生免疫突触。在该设计的一个特别优点中，细胞毒性效应细胞与携带egfr的细胞的物理结合消除了对抗原加工、mhci/β2-微球蛋白以及共刺激分子的需要。由于携带egfr的细胞的范围，应理解，所得组合物将具有针对许多癌症的效用，包括实体瘤和血液肿瘤。在一种实施方案中，本公开内容提供了一种治疗患有肿瘤的受试者的方法。被治疗的肿瘤可以包括源自选自由以下组成的组的细胞的肿瘤细胞：间质细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、淋巴细胞性细胞、血管细胞、平滑肌细胞、间充质细胞、乳腺组织细胞、前列腺细胞、肾细胞、脑细胞、结肠细胞、卵巢细胞、子宫细胞、膀胱细胞、皮肤细胞、胃细胞、生殖泌尿道细胞、子宫颈细胞、子宫细胞、小肠细胞、肝细胞、胰腺细胞、胆囊细胞、胆管细胞、食管细胞、唾液腺细胞、肺细胞和甲状腺细胞。在组合物的另一个优点中，由于在桥接的靶癌细胞的损伤/破坏期间细胞毒性效应细胞不被消耗，因此在引起一个靶细胞的裂解后，活化的效应细胞可以释放并通过局部组织向其它靶癌细胞移动，结合egfr抗原，并启动另外的细胞裂解。此外，预期在局部环境如实体瘤中，效应细胞分子诸如穿孔蛋白和颗粒酶的释放将导致邻近但未被双特异性结合结构域的给定分子结合的肿瘤细胞的损伤，从而导致肿瘤的生长停滞或消退。
[0275]
因此，本公开内容的效用将被理解为，在治疗有效剂量的包含本文所述的双特异性抗原结合组合物的药物组合物施用至患有具有egfr抗原的癌症或肿瘤的受试者后，与癌症或肿瘤细胞相关或共定位的蛋白酶可以作用于所述组合物，从而释放融合的af1和af2，使得可以通过带有egfr的细胞和效应细胞的连接而产生免疫突触，结果是能够裂解靶细胞的效应细胞来源的效应分子被释放到突触中，导致靶癌症或肿瘤细胞的细胞凋亡、细胞裂解或死亡。此外，本领域技术人员将理解，双特异性抗原结合组合物的使用在通过释放的结合结构域与效应细胞和靶癌细胞的结合而形成免疫突触后，可产生比“单一杀伤”更持久和更普遍的有益治疗效果。
[0276]
在一个方面，本公开内容涉及治疗受试者诸如患有癌症的受试者的疾病的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的任何实施
方案的双特异性抗原结合组合物。药物组合物的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中主题组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。预防有效量表示在实现期望预防结果所必需的时间段内需要的药物组合物的量。
[0277]
本文描述的双特异性抗原结合组合物的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起显著毒性。双特异性抗原结合组合物的毒性和治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。细胞培养测定和动物研究可用于确定ld
50
(对群体的50％致死的剂量)和ed
50
(对群体的50％治疗有效的剂量)。有毒和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可表示为比率ld
50
/ed
50
。表现出大治疗指数的双特异性抗原结合组合物是优选的。在一个方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于制定适合人类使用的剂量范围。剂量优选是在包括ed
50
在内的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。取决于多种因素，例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的状况等，剂量可以在该范围内变化。精确的制剂、施用途径和剂量可以由个体医师考虑患者的状况来选择(参见，例如，fingl等人,1975，见：the pharmacological basis of therapeutics,第1章,第1页)。熟练的技术人员容易认识到，在许多情况下，双特异性抗原结合组合物可以不提供治愈，但可以仅提供部分益处。在一些方面，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些方面，提供生理变化的双特异性抗原结合组合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是小鼠、大鼠、狗、猴或人。
[0278]
本发明的双特异性抗原结合组合物可以在治疗中与一种或更多种其它剂组合施用。例如，本文描述的任何实施方案的双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖为治疗需要这样的治疗的个体的症状或疾病而施用的任何药剂。这样的另外的治疗剂可以包含适合于所治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。在某些方面，另外的治疗剂是免疫调节剂、免疫肿瘤学抗体、细胞抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡活化剂或增加细胞对细胞凋亡诱导物的敏感性的剂。在一个特定方面，所述另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管干扰剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、dna嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂或抗血管生成剂。
[0279]
在治疗受试者疾病的方法的一种实施方案中，治疗的疾病可以是间变性和髓样甲状腺癌、阑尾癌、卵巢睾丸母细胞瘤、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管的癌症、类癌瘤、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、子宫内膜癌、伴有恶性腹水的上皮腹膜内恶性肿瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、输卵管癌、滤泡癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、ge-连接癌、生殖泌尿道癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝母细胞瘤、肝癌、hr 和her2 乳腺癌、hurthle细胞癌、炎性乳腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、脂肪肉瘤、肝脏癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤(骨癌)、卵巢癌、卵巢癌伴恶性腹水、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状癌、甲状旁腺癌、腹膜癌扩散、腹膜间皮瘤、原始性神经外胚层瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃部癌、睾丸癌、甲状腺癌、三阴性乳腺癌、尿路上皮癌、子宫癌、子宫浆液性癌、阴道癌、外阴癌、肾母细胞瘤。
[0280]
治疗有效量可以在帮助治疗(例如，治愈或降低严重程度)或预防(例如，降低复发的可能性)癌症或肿瘤方面产生有益效果。在治疗受试者的疾病的方法的另一种实施方案中，将药物组合物以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用的一个或更多个治疗有效剂量施用至受试者。在该方法的另一种实施方案中，在至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的时间段内将药物组合物以两个或更多个治疗有效剂量施用至受试者。在该方法的另一种实施方案中，将第一低先导剂量施用至受试者，随后是在至少两周、或至少一个月、或至少两个月、或至少三个月、或至少四个月、或至少五个月、或至少六个月的给药计划中的一个或更多个较高维持剂量。施用的初始先导剂量选自由以下组成的组：至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg，并且施用的一个或更多个随后维持剂量选自由以下组成的组：至少约0.02mg/kg、至少约0.05mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4.mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg、或至少约2.0mg/kg或至少5.0mg/kg。在该方法的另一种实施方案中，将药物组合物真皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌肉内施用至受试者。在该方法的另一种实施方案中，将药物组合物以一个或更多个治疗有效的团注剂量(bolus dose)或通过5分钟至96小时的输注以耐受最大安全性和效力施用至受试者。在该方法的另一种实施方案中，将药物组合物以一个或更多个治疗有效的团注剂量或通过5分钟至96小时的输注施用至受试者，其中所述剂量选自由以下组成的组：至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.12mg/kg、至少约0.14mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4.mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg、或至少约2.0mg/kg或至少约5.0mg/kg。在该方法的另一种实施方案中，将药物组合物以一个或更多个治疗上有效的团注剂量或通过在5分钟至96小时的时间段内的输注施用至受试者，其中向受试者的施用在受试者中产生维持至少约3天、至少约7天、至少约10天、至少约14天或至少约21天的至少约0.1ng/ml到至少约2μg/ml或更多的完整的未切割的双特异性抗原结合组合物的cmax血浆浓度。治疗有效剂量是至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.12mg/kg、至少约0.14mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg或至少约2.0mg/kg。在一种实施方案中，初始剂量选自由以下组成的组：至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.1mg/kg，并且后续剂量选自由以下组成的组：至少约0.1mg/kg、至少约0.12mg/kg、至少约0.14mg/kg、至少约0.16mg/kg、至少约0.18mg/kg、至少约0.20mg/kg、至少约0.22mg/
kg、至少约0.24mg/kg、至少约0.26mg/kg、至少约0.27mg/kg、至少约0.28mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg或至少约2.0mg/kg。在前述实施方案中，向受试者的施用在受试者中产生持续至少约3天、至少约7天、至少约10天、至少约14天或至少约21天的至少约0.1ng/ml到至少约2ng/ml或更多的多肽的血浆浓度。在该方法的前述实施方案中，受试者可以是小鼠、大鼠、猴或人。
[0281]
viii).核酸序列
[0282]
在一些实施方案中，本发明提供了编码本文描述的af1序列、或af2序列、或释放区段序列(rs1和rs2)、或xten序列、或任何这些组分实施方案的组合的分离的多核苷酸序列或多核苷酸序列的互补序列。在一种实施方案中，本发明提供了编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的分离的多核苷酸序列或多核苷酸序列的互补序列。在一种实施方案中，本发明提供了编码多肽或双特异性抗原结合组合物的分离的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与表12所示的多核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0283]
在另一个方面，本公开内容涉及产生编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的多核苷酸序列或与所述多核苷酸序列的互补序列(包括其同源变体)的方法，以及表达由多核苷酸序列表达的蛋白的方法。一般而言，该方法包括产生编码本文描述的任何实施方案的蛋白性多肽或双特异性抗原结合组合物的多核苷酸序列，和将编码基因掺入适合宿主细胞的表达载体中。为了产生本文描述的任何实施方案的编码的多肽或双特异性抗原结合组合物，所述方法包括用表达载体转化适当的宿主细胞，和在引起或允许本文描述的任何实施方案的所得的多肽或双特异性抗原结合组合物在转化的宿主细胞中表达的条件下培养宿主细胞，从而产生多肽或双特异性抗原结合组合物，其通过本文所述的方法或通过本领域已知的标准蛋白纯化方法回收。将分子生物学中的标准重组技术用于制备本公开内容的多核苷酸和表达载体。
[0284]
根据本公开内容，编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物(或其互补序列)的核酸序列被用于产生指导在适当宿主细胞中的表达的重组dna分子。若干克隆策略适用于实施本公开内容，其中许多用于产生包含编码本公开内容的组合物的基因或其互补序列的构建体。在一种实施方案中，将克隆策略用于产生编码包含编码多肽或双特异性抗原结合组合物的核苷酸的构建体的基因，用于转化宿主细胞以表达所述组合物。在该段落描述的上文所述的前述实施方案中，基因可以包含编码本文公开的构型中的抗原结合片段、释放区段和xten的核苷酸。
[0285]
在一种方案中，首先制备构建体，其含有编码多肽或双特异性抗原结合组合物构建体的dna序列。在实施例中描述了用于制备这样的构建体的示例性方法。然后将该构建体用于产生表达载体，该载体适合于转化宿主细胞诸如原核或真核宿主(例如哺乳动物)细胞以表达和回收多肽构建体。在需要的情况下，宿主细胞是大肠杆菌。在另一种实施方案中，宿主细胞选自bhk细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞、杂交瘤细胞、nih3t3细胞、cos、hela、cho或酵母细胞。在实施例中描述了用于产生表达载体、转化宿主细胞以及表达和回收xten的示例性方法。
[0286]
编码多肽或双特异性抗原结合组合物构建体的基因可以以一个或更多个步骤制
备，这完全合成或者通过与酶促过程(诸如限制性酶介导的克隆、pcr和重叠延伸)组合的合成，包括在实施例中更充分描述的方法。例如，本文公开的方法可用于连接编码期望长度和序列的各种组分(例如，结合结构域、接头、释放区段和xten)基因的多核苷酸序列。使用基因合成的标准技术，从寡核苷酸组装编码多肽组合物的基因。可以使用优化密码子使用和氨基酸组成的算法进行基因设计，所述密码子使用和氨基酸组成适合用于在多肽或双特异性抗原结合组合物的产生中利用的大肠杆菌或哺乳动物宿主细胞。在本公开内容的一种方法中，如上所述，创建并然后组装编码构建体的组分的多核苷酸文库。然后组装所得基因，并将所得基因用于转化宿主细胞并产生和回收多肽组合物用于评价其性能，如本文所述。
[0287]
然后可以将所得的编码多肽或双特异性抗原结合组合物序列的多核苷酸单独克隆进表达载体中。通过各种程序将核酸序列插入到载体中。一般而言，使用本领域已知的技术将dna插入适当的限制性内切核酸酶位点。载体组件通常包括、但不限于信号序列、复制起点、一个或更多个标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的一种或更多种。含有这些组件中的一种或更多种的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。这样的技术是本领域众所周知的并且在科学和专利文献中得到了较好描述。各种载体是公众可得到的。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式，其可以方便地进行重组dna程序，并且载体的选择通常取决于它要引入的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制型载体，即，作为染色体外实体存在的载体(例如，质粒)，其复制独立于染色体复制。可替换地，载体可以是这样的载体：当被引入宿主细胞时，其整合到宿主细胞基因组中并与它已经整合进的染色体一起复制。在引入合适的宿主细胞后，抗原结合片段或双特异性抗原结合组合物的表达可以使用本领域已知的任何核酸或蛋白测定来确定。例如，轻链cdr或重链cdr、抗原结合片段、或双特异性抗原结合组合物的转录mrna的存在可以通过常规杂交测定(例如rna印迹分析)、扩增程序(例如rt-pcr)、sage(美国专利号5,695,937)和基于阵列的技术(参见例如美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934)使用与抗原结合单元多核苷酸的任何区域互补的探针进行检测和/或定量。
[0288]
本公开内容提供了包含复制和控制序列的质粒表达载体的用途，所述复制和控制序列与宿主细胞相容并被宿主细胞识别，并且可操作地连接至编码多肽的基因以用于多肽的受控表达。载体通常带有复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白的序列。用于各种细菌、酵母和病毒的这样的载体序列是众所周知的。可以使用的有用表达载体包括例如染色体、非染色体和合成dna序列的区段。“表达载体”表示含有dna序列的dna构建体，所述dna序列可操作地连接至合适的控制序列，所述控制序列能够实现编码多肽的dna在合适的宿主中的表达。要求是，载体在选择的宿主细胞中是可复制和有活力的。可以根据需要使用低拷贝数或高拷贝数载体。
[0289]
合适的载体包括、但不限于sv40和pcdna的衍生物以及已知的细菌质粒诸如col ei、pcrl、pbr322、pmal-c2、pet、pgex(在smith,等人,gene 57:31-40(1988)中描述)、pmb9及其衍生物、质粒诸如rp4、噬菌体dna诸如噬菌体i的众多衍生物诸如nm98 9、以及其它噬菌体dna诸如m13和丝状单链噬菌体dna；酵母质粒诸如2微米质粒或2m质粒的衍生物、以及着丝粒和整合酵母穿梭载体；可用于真核细胞的载体诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；源自质粒和噬菌体dna的组合的载体，诸如经过修饰以使用噬菌体dna或表达控制序列的质粒；等等。也可用于本公开内容中的酵母表达系统包括、但不限于非融合pyes2载体
(invitrogen)、融合体pyeshisa、b、c(invitrogen)、prs载体等。载体的控制序列包括引起转录的启动子、控制这种转录的任选操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何dna序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。适用于原核宿主的表达载体的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[chang等人,nature,275:615(1978)；goeddel等人,nature,281:544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[goeddel,nucleic acids res.,8:4057(1980)；ep 36,776]和杂合启动子诸如tac启动子[deboer等人,proc.natl.acad.sci.usa，80:21-25((1983)]，所有启动子可操作地连接至编码xten多肽的dna。用于细菌系统的启动子还可以含有shine-dalgarno(s.d.)序列，其可操作地连接至编码多肽的dna。
[0290]
还可以通过检查表达的双特异性抗原结合组合物的抗原结合片段或组分来确定载体的表达。本领域有许多种技术可用于蛋白分析。它们包括、但不限于放射免疫测定、elisa(酶联免疫放射测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定和sds-page。
[0291]
ix).制备多肽和双特异性抗原结合组合物的方法
[0292]
在另一个方面，本公开内容提供了制备主题组合物的方法。在一种实施方案中，所述方法包括：在促进多肽或双特异性抗原结合组合物的表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文描述的任何实施方案的多肽或双特异性抗原结合组合物的核酸构建体，然后使用标准的纯化方法(例如，柱色谱法、hplc等)回收多肽或双特异性抗原结合组合物，其中回收组合物，其中表达的多肽或双特异性抗原结合组合物的结合片段的至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％或至少99％正确折叠。在制备方法的另一种实施方案中，表达的多肽或双特异性抗原结合组合物被回收，其中多肽或双特异性抗原结合组合物的至少或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％以单体、可溶形式回收。
[0293]
在另一个方面，本公开内容涉及以下方法：使用大肠杆菌或哺乳动物宿主细胞以功能蛋白的高发酵表达水平制备多肽和双特异性抗原结合组合物，以及提供编码构建体的表达载体，所述构建体可用于以高表达水平产生细胞毒性活性多肽构建体组合物的方法中。在一种实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)制备编码本文公开的任何实施方案的多肽的多核苷酸，2)将多核苷酸克隆到表达载体中，该表达载体可以是在适当转录和翻译序列的控制下的质粒或其它载体，以用于在生物系统中高水平表达蛋白，3)用表达载体转化适当的宿主细胞，以及4)在适合表达多肽组合物的条件下在常规营养培养基中培养宿主细胞。在需要的情况下，宿主细胞是大肠杆菌。通过该方法，多肽的表达导致宿主细胞的至少0.05g/l、或至少0.1g/l、或至少0.2g/l、或至少0.3g/l、或至少0.5g/l、或至少0.6g/l、或至少0.7g/l、或至少0.8g/l、或至少0.9g/l、或至少1g/l表达产物的发酵滴度，并且其中至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的表达蛋白被正确折叠。本文中使用的术语“正确折叠”是指，组合物的抗原结合片段组分具有特异性地结合其靶配体的能力。在另一种实施方案中，本公开内容提供了一种生产多肽或双特异性抗原结合组合物的方法，所述方法包括：在有效表达多肽产物的条件下，在发酵反应中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的载体，所述多肽包含多肽或双特异性抗原结合组合物，当
发酵反应物在600nm波长处达到至少130的光密度时，所述多肽产物的浓度超过约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250mg/g、或约300mg/g、或约350mg/g、或约400mg/g、或约450mg/g、或约500mg/g的所述多肽，并且其中表达的蛋白的抗原结合片段正确折叠。在另一种实施方案中，本公开内容提供了一种产生多肽或双特异性抗原结合组合物的方法，所述方法包括：在有效表达多肽产物的条件下，在发酵反应中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码该组合物的载体，当发酵反应在600nm波长处达到至少130的光密度时，所述多肽产物的浓度超过约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250mg/g、或约300mg/g、或约350mg/g、或约400mg/g、或约450mg/g、或约500mg/g的所述多肽，并且其中表达的多肽产物是可溶的。
[0294]
以下是本公开内容的组合物的组成和评价的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它的实施方案。
实施例
[0295]
实施例1：具有两个释放区段的双特异性抗原结合多肽的构建。
[0296]
为了产生可以通过限制酶切消化除去单个scfv的质粒，将pcw1700(其编码抗-epcam-抗-cd3(ucht1)双特异性串联scfv，具有rsr2486释放区段、ae866 xten和6x his标签亲和标签(seq id no:794))用sacii和bstxi消化，除去抗-epcam结合结构域的3'端、抗-epcam和抗-cd3结构域之间的接头以及抗-cd3结构域的5'端。合成了编码相同区域的dna片段，在抗-epcam结合结构域和接头之间的连接部处具有沉默点突变，以引入bsu36i位点。使用in-fusion试剂盒(new england biolabs)将合成的dna片段克隆到消化的骨架中以组装pjb0035。随后将pjb0035用nhei和bsai消化以除去bsrs1释放区段序列。合成具有与nhei和bsai突出端退火的单链尾巴的编码rsr2486的重叠单链寡核苷酸。将寡核苷酸在一起退火并连接到消化的pjb0035中，产生pcw1880，其编码抗-epcam-抗-cd3(ucht1)双特异性串联scfv、rsr2486、xten866和6x his标签亲和标签(seq id no:794)。
[0297]
为了产生具有不同cd3结合结构域变体的质粒，将pcw1880用bsu36i和nhei消化以除去ucht1抗-cd3 scfv。合成编码cd3.23的dna片段。基因片段包括在限制性位点的5’和3’的30个核苷酸以充当gibson dna组装的dna重叠。使用gibson cloning kit(sgi-dna,carlsbad,ca)将合成的dna片段克隆进消化的骨架中以组装pjb0205。
[0298]
为了产生具有n-端和c-端xten两者的双特异性抗原结合多肽，将ae292 xten使用引物从质粒pcr扩增，所述引物包括与n-端上的骨架dna和与c-端上的不可切割的释放区段(rsr3058,氨基酸序列ttgeageaagatsagatgp(seq id no:111))的17-21 bp 5’同源区域。使用引物扩增编码抗-epcam抗体4d5mocb的轻链和部分重链的第二pcr产物，所述引物包括与n-端上的rsr3058和c-端上的4d5mocb的重链的16-21 bp 5’同源区域。使用in-fusion plasmid assembly kit(takara bio)将这些pcr片段克隆进用bsiwi-sacii消化的骨架载体中，所述载体编码4d5mocb重链/抗-cd3串联scfv的其余部分、rsr3058不可切割的释放区段的第二个拷贝和具有6xhis标签(seq id no:794)的ae837 xten。最终的载体编码在phoa启动子和stii分泌前导序列的控制下的双特异性抗原结合多肽，其具有以下组件(从n-端至c-端)：ae292 xten、不可切割的rsr3058释放区段、抗-epcam-抗-cd3双特异性串联scfv，以及融合至具有6xhis亲和标签(seq id no:794)的ae867 xten的rsr3058。所得构建体为
pjb0084，其具有表12中提供的dna序列和编码的氨基酸序列。
[0299]
将pjb0084用作模板来建立双特异性抗原结合多肽构建体，其编码ae292 xten、可切割的释放区段rsr2295、抗-epcam-抗-cd3双特异性串联scfv，以及融合至ae868 xten的rsr2295。该质粒利用了两种使用pjb0084为模板的pcr产物；第一种编码6xhis亲和标签(seq id no:794)和ae292 xten，其具有与载体骨架的5’同源区域和编码第一个rsr2295的3’同源区域，第二种编码抗-epcam-抗-cd3双特异性串联scfv，其具有编码在串联scfv的5’和3’的rsr2295释放区段的5’和3’同源区域。第三种片段编码的ae868 xten具有c-标签亲和标签(氨基酸序列epea(seq id no:796))，其具有编码第二rsr2295的5’同源区域和与骨架载体的3’同源区域。使用in-fusion plasmid assembly kit将三种pcr片段克隆到已用bsiwi-noti消化的pjb0084中。最终的载体pjb0169编码在phoa启动子和stii分泌前导序列的控制下的双特异性抗原结合多肽分子，其具有以下组件(从n-端至c-端)：6xhis亲和标签(seq id no:794)、ae292 xten、rsr2295释放区段、抗-epcam-抗-cd3双特异性串联scfv、rsr2295、具有c-标签亲和标签的ae868 xten，dna序列和蛋白质序列在表12中。
[0300]
为了引入具有等电点改变和氨基酸序列中潜在聚集位点的除去的新cd3scfv，用bsai和bbvci消化pjb0244以除去her2和cd3 scfv两者。合成了编码与cd3.33配对的抗-egfr scfv变体的dna片段，其包括在5’和3’末端与消化的载体的40bp同源性，以促进gibson dna组装。质粒pjb0358-pjb0372组装有6xhis亲和标签(seq id no:794)、ae292 xten、rsr2295和单个的共15种与抗-cd3 scfv配对的抗-egfr scfv变体、rsr2295、具有c-标签亲和标签的ae868 xten的结构(dna和蛋白质序列在表12中)。
[0301]
通过最初用btsi消化pjb0368和pjb0373以除去抗-cd3 scfv而产生pah0025和pah0026。定购dna片段，其编码抗-cd3.32 scfv，该抗-cd3.32 scfv侧接与消化的骨架的40bp同源区域。通过gibson assembly将这些片段引入pjb0368和pjb0373中以产生质粒，其编码6xhis亲和标签(seq id no:794)、ae292 xten、rsr2295、抗-egfr-抗-cd3双特异性串联scfv、rsr2295、具有c-标签亲和标签的ae868 xten，其用两种不同的抗-egfr结合结构域egfr.23和egfr.2构建，以产生pah0025和pah0026构建体(dna和蛋白质序列在表12中)。将使用类似的方法制备具有egfr.13、egfr.14、egfr.15、egfr.16、egfr.17、egfr.18、egfr.19、egfr.20、egfr.21、egfr.22、egfr.24、egfr.25、egfr.26、egfr.27，cd3.30，cd3.31，和cd3.33 scfv的构建体，所述scfv具有任何组合或取向(即，n-至c-末端取向的af1-af2或af2-af1)，本文提供了所述构建体的序列。
[0302]
表12：构建体的dna和氨基酸序列.
[0303][0304]
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表13：构建体的氨基酸序列.
[0491]
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[0522]
biomart)在pbs中稀释至30ug/ml的终浓度。将链霉亲和素生物传感器(streptavidin biosensors，fortebio)在pbs中活化10分钟。为了进行测量，将链霉亲和素生物传感器应用于blitz仪器。将含有300μl pbs的试管转移到blitz仪器中，持续30秒。将含有生物素化的(30ug/ml,300μl/试管)的试管转移到blitz仪器以测量抗原向传感器的捕获，持续120秒。将含有300μl pbs的试管转移到blitz仪器持续30秒以测量基线信号。将含有测试scfv(30ug/ml,300μl/试管)的试管转移到blitz仪器以测量scfv与载有抗原的生物传感器的结合，持续120秒。将含有300μl pbs的试管转移到blitz仪器持续120秒以测量scfv从载有抗原的生物传感器的解离。对每种scfv稀释重复该方案。使用bli软件(fortebio)确定每种抗体的kd。结果列于表15。
[0533]
结果：测定结果证实，与亲本cd3.9相比，cd3序列变体都对cd3具有降低的结合亲和力。
[0534]
表15：tm和结合亲和力结果
[0535]
scfv构建体解链温度(℃)结合亲和力(nm)cd3.95775cd3.2362175cd3.2462296cd3.2557215cd3.2657221
[0536]
结论：已经鉴定出两种具有改进的热稳定性的新的抗-cd3 scfv。每种新的scfv相对于cd3.9具有8至9个突变，主要位于cdr中。与亲本cd3.9相比，这些突变已经降低了scfv对其靶标(cd3)的亲和力，但利用cd3.23的双特异性t细胞衔接物在细胞杀伤测定中以及在体内仍然是有效的。
[0537]
实施例3：包含双特异性抗原结合片段、释放区段和xten的稳定嵌合融合多肽的发酵和纯化
[0538]
以下实施例描述嵌合双特异性抗原结合片段组合物的产生。
[0539]
构建体id pjb0169是具有八个不同结构域的分子。从n-端到c-端，该分子由n-端多组氨酸标签(his6)(seq id no:794)、非结构化的292氨基酸链(xten_ae293)、蛋白酶可切割的释放区段(rs)、抗-egfr scfv(aegfr.2)、抗-cd3 scfv(acd3.9)、另一个蛋白酶可切割的释放区段(rs)、非结构化的864氨基酸链和四个c-末端残基谷氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸(c-标签)(xten_ae868)组成。
[0540]
表达：将分子pjb0169在专有的大肠杆菌ame098菌株中表达，并通过n-端分泌前导序列(mkkniafllasmfvfsiatnaya-(seq id no:940))分配到周质中，该前导序列在易位过程中被切割。将发酵培养物在37℃用无动物复合培养基生长，并在磷酸盐耗尽之前将温度转移到26℃，在磷酸盐耗尽后继续发酵12小时。在收获期间，将发酵全液体培养基离心以沉淀细胞。在收获时，记录总体积和湿细胞重量(wcw；沉淀与上清液的比率)，并收集沉淀的细胞和在冷冻于-80℃。
[0541]
澄清：将pjb0169的冷冻细胞沉淀物重新悬浮在3倍的ph 4.5的裂解缓冲液(60mm乙酸,350mm nacl)中，并将细胞通过匀浆化进行裂解。使匀浆物在ph 4.5和2-8℃絮凝(flocculate)过夜。将絮凝的匀浆物离心，并保留上清液。将上清液用水稀释约3倍，然后用
nacl调节至7
±
1ms/cm。然后将上清液调节至0.1％(m/m)硅藻土并通过叶轮(impeller)混合。将上清液过滤通过以0.22μm过滤器结尾的过滤器系列(filter train)。将滤液用磷酸氢二钠调节至ph 7.0。
[0542]
纯化：分子pjb0169最初从澄清的裂解物中捕获，并通过蛋白-l色谱法(toyopearl af-rprotein l-650f)进行纯化。随后，使用imac色谱法(ge imac sepharose 6 ff)针对n-端his6-标签(seq id no:794)进行选择，然后使用c-标签亲和色谱法(captureselect c-tagxl affinity matrix)针对c-端epea-标签(seq id no:796)进行选择。使用阴离子交换色谱法(bia cimmultus qamonolith)除去hmwc并精制至最终纯度。
[0543]
分析：通过sec-hplc监测过程中间体的聚集状态。sec-hplc方法使用phenomenex 3μm sec-4000 300 x 7.8mm(p/n 00h-4514-k0)、20分钟等度方法以1ml/min进行，同时监测在220nm的吸光度。pjb0169单体在6.2分钟从分析柱洗脱，且hmwc从4.8-6.0分钟洗脱。将sec-hplc质量测量为与从4.8-6.4分钟的总曲线下面积相比在6.2分钟的相对曲线下面积。
[0544]
结果：在每个单元操作之后构建体pjb0169的聚集总结(sec-hplc％单体)呈现在表16中。≥95％单体的回收率是最终精制后的质量阈值，作为考虑分子稳定或可加工的标准。
[0545]
表16：分析结果
[0546][0547]
结论：将构建体pjb0169通过sec-hplc纯化至目标单体质量(≥95％单体)，表明该构建体是稳定的且与回收和纯化操作两者相容。
[0548]
稳定性提高和评估：新的scfv(抗-egfr.23和抗-cd3.32)被设计为通过以下来提高稳定性：(1)减少表面疏水性，和(2)通过在选定位置取代氨基酸，减少配对的scfv分子(通过短肽接头融合)之间的等电点差异。构建体pah0025和pah0026代表对pjb0169的设计迭代，其中pah0025含有抗-cd3.32 scfv变体，并且pah0026含有抗-cd3.32 scfv变体和egfr.23 scfv变体两者。构建体pah0025和pah0026将被如上进行表达、澄清、纯化和分析；将在整个纯化过程中监测sec-hplc结果并与pjb0169或其它构建体(例如，αegfr.2-αcd3.23)进行对比以评估相对稳定性。新设计配对可能比相应的αegfr.2-αcd3.23构建体(例如从n-端到c-端由以下组成的分子：n-端多组氨酸标签(his6)(seq id no:794)、非结构化的292氨基酸链(xten_ae292)、蛋白酶可切割的释放区段(rs)、抗-egfr scfv(aegfr.2)、抗-cd3 scfv(acd3.23)、另一个蛋白酶可切割的释放区段(rs)、非结构化的864
氨基酸链和四个c-末端残基——谷氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸(c-标签)(xten_ae868))更稳定。按照下表列出的单元操作或其子集(表17)，pah0025和pah0026构建体也可以预期显示出单体含量百分比的伴随改进，如通过sec-hplc所测量。满足≥95％单体的纯度目标的任何构建体都将被认为是稳定的或可加工的。
[0549]
表17：分析结果
[0550][0551]
实施例4：抗-epcam
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽组合物的结合亲和力。
[0552]
使用流式细胞术用huep-cho 4-12b(用人epcam转染的cho细胞系)和jurkat细胞流式细胞仪测量抗-epcam
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽构建体pjb0189和pcw1645对人epcam和人cd3的结合亲和力。
[0553]
通过与荧光标记的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽的竞争结合，测量抗-epcam
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽结合表达epcam和表达cd3的细胞的结合常数。通过将alexa fluor 647c2马来酰亚胺(thermo fisher,目录号a20347)缀合至含有半胱氨酸的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽突变体(mmp-9处理的pcw1645)，制备荧光标记的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽。在4℃在总体积100μl的结合缓冲液(2％fcs、5mm edta、hbss)中在10,000个细胞上进行结合实验，持续1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中，并立即在millipore guava easycyte流式细胞仪上分析。发现荧光标记的、蛋白酶处理的pcw1645对hep-cho 4-12b细胞的结合具有1nm的表观kd值，并且对cd3 jurkat细胞的结合具有4nm的表观kd值。
[0554]
在4℃在总体积100μl的结合缓冲液(2％fcs、5mm edta、hbss)中，对10,000个hep-cho 4-12b细胞与1.5nm荧光标记的、蛋白酶处理的pcw1645进行竞争结合实验，持续1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中，并立即在millipore guava easycyte流式细胞仪上分析。用经切割的双特异性抗原结合多肽(pjb0189 hep.2-hcd3.9或ac1984 hep.2-hcd3.23)对荧光标记的、蛋白酶处理的pcw1645与hep-cho 4-12b细胞的竞争结合得到hep.2(帕尼单抗)的表观结合常数为0.5nm。
[0555]
在4℃在总体积100μl的结合缓冲液(2％fcs、5mm edta、hbss)中，对10,000个
jurkat细胞与10nm荧光标记的、蛋白酶处理的pcw1645进行竞争结合实验，持续1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中，并立即在millipore guava easycyte流式细胞仪上分析。用经切割的双特异性抗原结合多肽(pjb0189 hep.2-hcd3.9或ac1984 hep.2-hcd3.23)对荧光标记的、蛋白酶处理的pcw1645与jurkat细胞的竞争结合得到hcd3.9对cd3结合的表观结合常数为75nm，并且hcd3.23对cd3结合的表观结合常数为300nm，以及对epcam结合的表观结合常数为0.5nm。
[0556]
结论：cd3.23对jurkat细胞上的cd3的结合亲和力为300nm，其比cd3.9的亲和力弱4倍。hep.2对jurkat细胞上的epcam的结合亲和力为0.5nm。
[0557]
实施例5：抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽组合物的结合亲和力。
[0558]
使用流式细胞术，用选自ht-29、hct-116、nci-h1573、nci-h1975的egfr阳性人细胞和用于cd3的jurkat细胞测量抗egfr
×
抗cd3双特异性抗原结合多肽构建体对人egfr和人cd3的结合亲和力。
[0559]
通过与荧光标记的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽的竞争结合，测量抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽结合表达egfr的细胞和表达cd3的细胞的结合常数。通过将alexa fluor 647 c2马来酰亚胺(thermo fisher,目录号a20347)缀合至具有hegfr.2-hcd3.23和两个xten的含有半胱氨酸的双特异性抗原结合多肽突变体(mmp-9处理的pjb0297)，制备荧光标记的双特异性抗原结合多肽。通过将alexa fluor 647 c2马来酰亚胺(thermo fisher,目录号a20347)缀合至含有半胱氨酸的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽突变体(mmp-9处理的pjb0297)，制备荧光标记的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽。在4℃在总体积100μl的结合缓冲液(2％fcs、5mm edta、hbss)中，在10,000个细胞上进行结合实验，持续1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中，并立即在millipore guava easycyte流式细胞仪上分析。预期荧光标记的、蛋白酶处理的pjb0297对带有hegfr的细胞的结合具有低nm浓度中的表观kd值，并且对cd3 jurkat细胞的结合具有约300nm的表观kd值。与荧光标记的、蛋白酶处理的双特异性抗原结合多肽对带有hegfr的细胞和cd3 jurkat细胞的结合相比，预期荧光标记的具有两个xten的pjb0297的结合具有弱约10至100倍的表观kd值。
[0560]
在4℃在总体积100μl的结合缓冲液(2％fcs、5mm edta、hbss)中，在接近来自前述结合实验的kd的荧光标记的、蛋白酶处理的pjb0297浓度，在10,000个带有hegfr的细胞上进行竞争结合实验，持续1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中，并立即在millipore guava easycyte流式细胞仪上分析。预期用pjb0244双特异性抗原结合多肽对荧光标记的、蛋白酶处理的pjb0297与hegfr细胞的竞争结合具有与荧光标记的pjb0297的直接结合常数相似的表观结合常数。
[0561]
在4℃在总体积100μl的结合缓冲液(2％fcs、5mm edta、hbss)中，在10,000个jurkat细胞与约300nm(或接近来自前述结合实验的kd的浓度)的荧光标记的、蛋白酶处理的pjb0297上进行竞争结合实验，持续1小时。将细胞用冷结合缓冲液洗涤一次，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的1％甲醛中，并立即在millipore guava easycyte流式细胞仪上分析。预期用pjb0244双特异性抗原结合多肽对荧光标记的、蛋白酶处理的pjb0297与jurkat细胞的竞争结合具有与荧光标记的pjb0297的直接结合常数(其预期是在低微摩尔至纳摩尔浓度范围内)相似的表观结合常数。
[0562]
实施例6：含有rsr-1517的xten ac1611(rsr-1517)的酶活化、储存和消化。
[0563]
本实施例证实，在试管中，含有rsr-1517的xten构建体ac1611可以被各种肿瘤相关的蛋白酶(包括重组人upa、间质蛋白酶、豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9和mmp-14)切割。ac1611的氨基酸序列列于下表18中。
[0564]
1.酶活化
[0565]
使用的所有酶均从r&d systems获得。重组人u-纤溶酶原活化物(upa)和重组人间质蛋白酶以活化的酶提供并储存在-80℃直到使用。重组小鼠mmp-2、重组人mmp-7和重组小鼠mmp-9以酶原(zymogen)提供，并需要用醋酸4-氨基苯汞(apma)活化。首先将apma溶解在0.1m naoh中至10mm的终浓度，然后使用0.1m hcl将ph重新调整为中性。在50mm tris ph 7.5、150mm nacl、10mm cacl2中将apma原液进一步稀释至2.5mm。为了活化mmp原，将在50mm tris ph 7.5、150mm nacl、10mm cacl2中的1mm apma和100μg/ml mmp原在37℃温育1小时(mmp-2,mmp-7)或24小时(mmp-9)。为了活化mmp-14，将0.86μg/ml重组人弗林蛋白酶和40μg/ml mmp-14原在50mm tris ph 9、1mm cacl2中在37℃温育1.5小时。为了活化豆荚蛋白，将100μg/ml豆荚蛋白原(pro-legumain)在50mm醋酸钠ph 4、100mm nacl中在37℃温育2小时。将100％超纯甘油添加到所有活化的酶(包括upa和mtsp1)中至50％甘油的终浓度，然后在-20℃储存数周。
[0566]
2.酶消化
[0567]
测试了一组酶以确定每种酶对ac1611的切割效率。在20μl反应中按照以下酶与底物摩尔比和条件将6μm底物与每种酶一起温育：upa(1:25在50mm tris ph 8.5中)、间质蛋白酶(1:25在50mm tris ph 9、50mm nacl中)、豆荚蛋白(1:20在50mm mes ph 5、250mm nacl中)、mmp-2(1:1200在50mm tris ph 7.5、150mm nacl、10mm cacl2中)、mmp-7(1:1200在50mm tris ph 7.5、150mm nacl、10mm cacl2中)、mmp-9(1:2000在50mm tris ph 7.5、150mm nacl、10mm cacl2中)和mmp-14(1:30在50mm tris ph 8.5、3mm cacl2、1μm zncl2中)。将反应在37℃温育两小时，然后如下停止：在mmp反应的情况下添加edta至20mm，在upa和间质蛋白酶反应的情况下在85℃加热15分钟，以及在豆荚蛋白的情况下将ph调至8.5。
[0568]
3.切割效率的分析。
[0569]
通过在sds-page上加载2μl未消化的底物(在12μm)和4μl消化的(在6μm)反应混合物并用stains-all(sigma aldrich)染色，对样品进行分析以确定切割产物的百分比，如图75所示。使用imagej软件分析相应的条带强度并确定切割百分比。在释放区段被各种蛋白酶切割后，底物含有rsr-1517的xten将产生两种片段，且较大的片段用于切割百分比计算(反应产物的量除以进入反应的初始底物总量)，而较小产物的条带强度太低而无法量化。对于upa、间质蛋白酶、豆荚蛋白、mmp-2、mmp-7、mmp-9、mmp-14，在当前标准实验条件下对ac1611的切割百分比分别为31％、14％、16％、40％、51％、38％、30％。
[0570]
结论：我们选择了一种特定的释放区段rsr-1517(氨基酸序列eagrsanheplglvat(seq id no:53))并确定了它的切割特性，如所有七种酶在当前标准实验条件下的切割百分比所定义的。对于所有酶，该释放区段具有中等切割效率，因此在筛选过程中，较快或较慢变体的切割将落在测定窗口内以允许实现准确排序。
[0571]
表18：具有释放区段rsr-1617的ac1611的氨基酸序列
[0572][0573]
实施例7：使用rsr-1517(ac1611)作为对照筛选释放区段
[0574]
这里我们选择upa作为实例来展示如何进行释放区段筛选。对所有七种肿瘤相关蛋白酶应用相同的程序来定义每种底物的相对切割特性，这是七个数字的阵列，以描述当与对照底物rsr-1517相比时每种酶的切割效果。表19的所有多肽都具有ac1611的氨基酸序列，但指定构建体的释放区段肽被替换为对ac1611的eagrsanheplglvat序列(seq id no:53)的取代；例如，bsrs-4具有释放区段序列lagrsdnhsplglags(seq id no:945)，但在其它方面具有与ac1611的完全序列同一性。
[0575]
1.酶消化
[0576]
在单独的eppendorf管中将所有含有释放区段的xten变体和对照ac1611在50mm tris ph 7.5、150mm nacl、10mm cacl2中稀释至12μm。制备upa的主混合物，使得在与每种底物1:1混合后，总反应体积为20μl，初始底物浓度为6μm，且酶与底物的比例在1:20至1:3000之间变化(取决于酶)，以便在终点时反应产物和未切割的底物可以可视化。所有反应均在37℃温育2小时，然后通过添加edta至20mm终浓度来停止。通过非还原sds-page和随后的stains-all分析所有产物。对于每块凝胶，ac1611消化产物始终被包括在内作为染色对照，以将不同凝胶之间的差异染色归一化。
[0577]
2.相对切割效率计算
[0578]
单个底物的切割百分比通过imagej软件进行分析并如前所述计算。对于每种变体，相对切割效率计算如下：
[0579][0580]
在上述实验条件下，相对切割效率的 1值指示，当与ac1611对照相比时，底物产生了多达两倍的产物，而相对切割效率的-1值指示，当与ac1611对照相比时，底物仅产生了多达50％的产物。
[0581]
在本实验中，ac1611的切割百分比(％切割)为20％，通过imagej量化。在本实验中筛选的底物显示出21％、39％、1％、58％、24％、6％、15％、1％、1％和25％的切割，其中1％基本上代表低于检测限，并且不指示准确值。基于上述公式计算的相对切割效率分别为0.08、0.95、-4.34、1.51、0.26、-1.76、-0.47、-4.34、-4.34和0.32。
[0582]
结论：我们确定了当经受upa切割时，当与同一实验中的ac1611相比时，10种释放区段变体的相对切割效率。按照类似的程序，我们使用rsr1517(ac1611)作为参考对照，确定了134种释放区段的切割特性，其结果列于表19中。这些释放区段涵盖了单个酶以及组合的切割效率的广泛范围。例如，对于mmp-14，rsr-1478具有-2.00的值，意味着当用mmp-14消化时，与参考对照rsr-1517相比，该底物仅产生25％的产物。某些释放区段，诸如rsr-1951，表现为是测试的所有七种蛋白酶的更好底物。如果全身毒性是低的/可控的，而效力(部分取决于切割发生使双特异性抗原结合组合物成为活化形式有多快)需要改进，则这些更快的释放区段可能被证明在临床中是有用的。
[0583]
表19：当经受七种人蛋白酶切割时释放区段的切割特性，使用rsr-1517作为对照
[0584]
[0585]
[0586]
[0587][0588]
nd＝未确定
[0589]
实施例7：使用rsr-1517作为内部对照的竞争性消化
[0590]
开发这种竞争性测定以使同一实验中不同小瓶中的反应之间酶浓度或反应条件的任何变异性最小化。为了解决同一实施例中的对照底物和感兴趣的rs两者，构建了新的对照质粒。
[0591]
1.含有rsr-1517的内部对照的分子克隆
[0592]
两种内部对照质粒ac1830(hd2-v5-ae144-rsr-1517-xten288)和ac1840(hd2-v5-ae144-rsr-1517-xten432)以与实施例6中描述的ac1611类似的方式构建，唯一差别是c-端xten的长度。
[0593]
2.酶消化
[0594]
通过将纯化的ac1830或ac1840与感兴趣的rs混合和稀释于测定缓冲液中，使得单个底物的最终浓度为6μm，制备2
×
底物溶液。制备酶主混合物，使得与2
×
底物溶液1:1混合后，总反应体积为20μl，每种组分的最终底物浓度为3μm，且酶与底物的比例如在测定开发中所选择的。将反应在37℃温育2小时，然后按上述程序停止。
[0595]
3.相对切割效率计算
[0596]
通过非还原4-12％sds-page分析反应混合物。由于内部对照和感兴趣的底物具有不同的分子量，因此在切割后，同一样品泳道中应该可见四个条带。可以计算两者的切割百分比，并且可以从实施例6中的相同公式推导出相对切割效率：
[0597][0598]
唯一的差别是，现在两个值都是从同一个小瓶中的反应混合物计算出，而以前是从共享相同酶混合物的两个反应计算出。
[0599]
结论：我们预计，当与实施例6中描述的测定相比时，这种使用rsr-1517作为内部对照的竞争性消化测定具有较小的测定间变异性。我们期望将该方法用于将来的释放片段筛选。
[0600]
实施例9：抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合组合物的体外胱天蛋白酶3/7测定
[0601]
在凋亡细胞的胱天蛋白酶3/7活性的基于体外细胞的测定中，评估了未掩蔽的(通过蛋白酶解除去xten)、掩蔽的(具有2个xten和2个通过蛋白酶解可切割的释放区段)、和不可切割的(具有2个xten并且释放区段被对蛋白酶解不敏感的肽替换)抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽组合物的重定向的细胞毒性。类似于上文实施例中描述的胱天蛋白酶细胞毒性测定，将pbmc与egfr阳性肿瘤靶细胞以10个效应细胞比1个靶细胞的比例混合。使用10-点、5x系列稀释的剂量浓度测试所有抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽组合物。以0.000012至10nm的最终剂量范围评价未掩蔽的抗-egfr
×
抗-cd3组合物。在0.00064至250nm的最终剂量范围分析掩蔽的和不可切割的双特异性抗原结合多肽组合物。适当的
egfr阳性人肿瘤靶细胞系包括fadu(头颈部鳞状细胞癌，scchn)、scc-9(scchn)、hct-116(带有kras突变的结肠直肠)、nci-h1573(带有kras突变的结肠直肠)、ht-29(带有braf突变的结肠直肠)和nci-h1975(egfr t790m突变)。选择细胞系以代表具有野生型egfr以及t790m、kras和braf突变的结肠直肠和scchn肿瘤。
[0602]
在细胞裂解后，培养物上清液中释放的胱天蛋白酶3/7通过发光性胱天蛋白酶3/7底物(promega caspase-glo 3/7目录号g8091)被胱天蛋白酶3/7切割产生“发光型(glow-type)”发光信号的量来测量。发光的量与胱天蛋白酶活性的量成正比。
[0603]
结果：如在表20中所示，当在egfr kras突变hct-116细胞系中评价时，掩蔽的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽的ec
50
活性为3,408pm。不可切割变体活性的ec
50
为》100,000pm，并且未掩蔽的组合物的未掩蔽的ec
50
活性为0.8pm。
[0604]
当在egfr braf突变体ht-29细胞系中评价时，掩蔽的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽的ec
50
活性为10,930pm。不可切割的和未掩蔽的组合物的ec
50
活性分别为》100,000pm和0.8pm。
[0605]
在所测试的两种egfr突变细胞系中，掩蔽的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽的活性比未掩蔽的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽低～4,000至14,000倍。如预期的，不可切割变体的活性是评价的3种形式中活性最低的，具有大于100,000pm的ec
50
。
[0606]
结论：结果证实，抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽对egfr kras和braf突变细胞系具有细胞毒性活性。带有两个xten的掩蔽的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽提供了细胞毒性活性的强阻断，与未掩蔽形式相比，细胞毒性低4000至14,000倍。
[0607]
表20：未掩蔽的、掩蔽的/可切割的和不可切割的抗-egfr
×
抗-cd3变体在ht-29和hct-116人细胞系中的体外细胞毒性活性
[0608][0609]
实施例10：抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽组合物在早期治疗ht-29体内模型中的抗肿瘤性能。
[0610]
进行了体内效力实验以在免疫缺陷的nod/scid小鼠(特征在于t和b细胞的缺乏以及受损的天然杀伤细胞)中评价基于pjb0169构建体的egfr-cd3双特异性抗原结合多肽组合物。将小鼠维持在无菌的标准化的环境条件下，并根据美国机构动物护理协会评价和使用委员会(us institutional animal care association for assessment and use committee)(iacuc实验室动物护理认证(aaalac))指南进行实验。使用egfr braf突变体人ht-29腺癌异种移植物模型评价蛋白酶处理的和蛋白酶未处理的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合多肽(例如pjb0169)的效力。简而言之，在第0天，将6只nod/scid小鼠在右肋腹皮下植入3
×
106个ht-29细胞/小鼠(组群1)。在同一天，每组各由6只nod/scid小鼠组成的组群2至7在右肋腹皮下注射每只小鼠6
×
106个人pbmc和3
×
106个ht-29细胞的混合物。在ht-29或ht-29/pbmc混合物接种后四小时，开始治疗。组群1和2静脉内注射媒介物(pbs 0.05％tween 80)，组群3和4分别注射0.05mg/kg完整的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性构建体和0.5mg/kg用蛋白酶处理过以从多肽除去xten的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性构建体，组群5
和6注射0.143mg/kg和1.43mg/kg完整的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性构建体，并且组群7注射50mg/kg西妥昔单抗作为阳性对照。组群1至6从第1天至第7天还接受七次额外的每天施用的剂量(总共8剂)。组群7每周施用两次西妥昔单抗，持续4周，共施用8剂。
[0611]
用卡尺在两个垂直维度上每周两次测量小鼠的肿瘤，预计33天，并通过应用(宽度2×
长度)/2公式计算肿瘤体积。还密切监测体重、一般外观和临床观察诸如癫痫发作、震颤、嗜睡、过度反应、立毛、费力/快速呼吸、肿瘤的着色和溃疡以及死亡，作为治疗相关毒性的量度。通过应用下式计算每个治疗组的肿瘤生长抑制指数百分比(％tgi)：((组群2媒介物对照的平均肿瘤体积-测试品治疗的平均肿瘤体积)/组群2媒介物对照的平均肿瘤体积)
×
100。％tgi≥60％的治疗结果被认为具有治疗活性。
[0612]
结果：在第33天，媒介物治疗的携带肿瘤细胞的组群1小鼠仅具有250
±
113mm3的平均肿瘤负荷。在存在人效应细胞的情况下用媒介物治疗的组群2小鼠没有抑制肿瘤进展，具有238
±
228mm3的平均肿瘤负荷，表明单独的人效应细胞本身不能引起抗肿瘤作用。在存在人效应细胞的情况下用蛋白酶处理的0.05mg/kg和0.5mg/kg的抗-egfr
×
抗-cd3构建体治疗(分别是组群3和4)表现出明显的肿瘤生长抑制，两个治疗组的％tgi为99％。重要的是，在存在人效应细胞的情况下，用0.143mg/kg和1.43mg/kg的抗-egrf x抗-cd3xpat治疗(分别是组群5和6)也以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长，0.143mg/kg剂量组的％tgi为70％，并且1.43mg/kg组群的％tgi为96％。数据提示，在0.143mg/kg和1.43mg/kg剂量，足够量的抗-egfr
×
抗-cd3构建体被体内肿瘤环境中的蛋白酶有效切割成更有活性的、未xten化的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合片段以产生观察到的效力。值得注意的是，用50mg/kg西妥昔单抗治疗的组群7没有诱导肿瘤消退，％tgi为-20％。
[0613]
结论：结果表明，抗-egfr
×
抗-cd3双特异性构建体可以在体内有效切割成活性形式，并且在egfr braf突变体ht-29肿瘤环境中有效抑制肿瘤进展。此外，在实验条件下，抗-egfr
×
抗-cd3双特异性构建体在抗肿瘤活性方面优于西妥昔单抗对照。值得注意的是，在所有测试品治疗组和媒介物对照中均未观察到显著的体重减轻，表明所有治疗均被良好耐受。
[0614]
实施例11：通过流式细胞术评估的细胞结合。
[0615]
还通过基于流式细胞术的测定，利用cd3阳性人jurkat细胞和egfr阳性人细胞，评价了抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合组合物的双特异性结合，所述egfr阳性人细胞选自ht-29、hct-116、nci-h1573、nci-h1975、fadu和scc-9或表达egfr的稳定cho细胞系。将cd3
和egfr
细胞与一定剂量范围的未处理的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169，包含2个xten和2个rs)、蛋白酶处理的pjb0169和抗-cd3 scfv和抗-egfr scfv阳性对照一起在结合缓冲液中在4℃温育30min，所述结合缓冲液含有含2％bsa和5mm edta的hbss。用结合缓冲液洗涤以除去未结合的试验材料后，将细胞与fitc-缀合的抗-his标签抗体(abcam目录号ab1206)一起在4℃温育30min。通过用结合缓冲液洗涤除去未结合的fitc-缀合抗体，并将细胞重新悬浮在结合缓冲液中以便在facs calibur流式细胞仪(becton dickerson)或等效仪器上采集。将所有流式细胞术数据使用flowjo软件(flowjo llc)或等效软件进行分析。
[0616]
虽然预计抗-egfr scfv不会与jurkat细胞结合，但抗-cd3 scfv、未处理的pjb0169和蛋白酶处理的pjb0169都预计会与jurkat细胞结合，如相对于与单独的fitc-缀
合的抗-his标签抗体一起温育的jurkat细胞荧光强度的增加所表明的。类似地，抗-egfr scfv、蛋白酶处理的和未处理的pjb0169均预期与egfr阳性细胞结合，而抗-cd3 scfv预期不会与egfr阳性细胞结合。预计的是，这些数据将反映抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合组合物识别cd3和egfr抗原两者的双特异性结合能力，所述抗原分别在jurkat和表达egfr的人细胞系的组上表达。此外，由于xten聚合物对表面结合提供了一些干扰，预计未处理的抗-egfr
×
抗-cd3双特异性抗原结合组合物以低于蛋白酶处理的双特异性抗原结合组合物的亲和力结合cd3和epcam抗原两者。
[0617]
实施例12：通过流式细胞术评估的细胞裂解。
[0618]
利用人pbmc和egfr阳性细胞系通过流式细胞术评价了抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物的细胞裂解。根据生产商的说明书用荧光膜染料cellvue maroon染料(affymetrix/ebioscience,目录号88-0870-16)标记egfr阳性的hct-116靶细胞(或选自ht-29、nci-h1573、nci-h1975、fadu和scc-9或表达egfr的稳定cho细胞系的靶细胞)。可替换地，还可以使用pkh26(sigma,目录号mini26和pkh26gl)。简而言之，将hct-116细胞用pbs洗涤两次，然后将2
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106个细胞重新悬浮在由cellvue maroon标记试剂盒提供的0.1ml稀释剂c中。在单独的试管中，将2μlcellvue maroon染料与0.5ml稀释剂c混合，并且然后将0.1ml添加到hct-116细胞悬浮液中。将细胞悬浮液和cellvue maroon染料混合并在室温温育2分钟。然后通过添加0.2ml胎牛血清(fcs)猝灭标记反应。将标记的细胞用完全细胞培养基(含有10％fcs的rpmi-1640)洗涤两次，并通过锥虫蓝排除确定活细胞的总数。为了在每孔200μl的总体积中实现10:1的效应物与靶标之比，在存在或不存在指示剂量范围浓度的蛋白酶处理的和未处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169，包含2个xten和2个rs)样品的情况下，在96-孔圆底板中，每孔将1
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105个pbmc与1
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104个cellvue maroon标记的hct-116细胞共培养。24小时后，用accutase(innovative cell technologies，目录号at104)收获细胞，并用2％fcs/pbs洗涤。在guava easycyte流式细胞仪(millipore)上采集细胞之前，将细胞重新悬浮在100μl补充了2.5微克/ml 7-aad(affymetrix/ebioscience,目录号00-6993-50)的2％fcs/pbs中，以区分活细胞(7-aad阴性)和死细胞(7-aad阳性)。用guavasoft软件(millipore)分析facs数据；并通过将7-aad阳性/cellvue maroon阳性细胞的数目除以cellvue maroon阳性细胞的总数计算出死靶细胞的百分比。
[0619]
使用graphpad prism通过4参数-逻辑回归方程式分析细胞毒性百分比相对于双特异性抗原结合组合物浓度的剂量响应杀伤曲线；并从而确定诱导半最大细胞毒性百分比的双特异性抗原结合组合物的浓度。
[0620]
预计使用流式细胞术获得的细胞毒性结果与用其它细胞毒性测定(包括ldh和胱天蛋白酶)获得的结果一致。在不存在pbmc的情况下将hct-116细胞暴露于蛋白酶切割的和未切割的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物，预计没有影响。类似地，在存在双特异性抗原结合组合物而不存在靶细胞的情况下，预计pbmc不会被活化。预期这些结果表明，双特异性抗原结合组合物需要簇集在靶细胞的表面上才能刺激pbmc的细胞毒性活性。在存在pbmc和靶细胞的情况下，将存在由用蛋白酶预处理或未处理的双特异性抗原结合组合物引起的浓度依赖性的细胞毒性效应。此外，预期结果表明，在存在pbmc的情况下，将hct-116细胞暴露于未处理的双特异性抗原结合组合物(无蛋白酶)将显示出比蛋白酶切割的双特
异性抗原结合组合物降低的细胞毒性。
[0621]
实施例13：抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物的t-细胞活化标志物测定。
[0622]
为了测量抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物诱导的活化标志物(cd69和cd25)，在96-孔圆底板中，在存在抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169，包含2个xten和2个rs)的情况下，将每个测定孔1
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105个pbmc或纯化的cd3 细胞与1
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104个hct-116或ht-29细胞在含有10％fcs的rpmi-1640中共培养(即，效应物与靶标之比为10:1)，总计最终体积为200μl。在37℃、5％co2保湿培养箱中温育20小时后，将细胞用pecy5-缀合的抗-cd4、apc-缀合的抗-cd8、pe-缀合的抗-cd25和fitc-缀合的抗-cd69(所有抗体来自biolegend)在facs缓冲液(1％bsa/pbs)中在4℃染色，用facs缓冲液洗涤两次，并且然后重新悬浮在facs缓冲液中以在guava easycyte流式细胞仪(millipore)上采集。
[0623]
预计三种双特异性抗原结合组合物分子的t-细胞活化标志物表达趋势与通过细胞毒性测定(包括ldh和胱天蛋白酶)所观察到的趋势相似。预计未处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169)对pbmc的cd8和cd4群体或cd3 细胞上的cd69的活化活性低于蛋白酶处理的pjb0169双特异性抗原结合组合物；并且预计不可切割的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0172)的活性低于未处理的pjb0169。
[0624]
实施例14：使用受刺激的正常健康人pbmc以及完整的和蛋白酶处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物对人th1/th2细胞因子的细胞测量珠阵列(cytometric bead array)分析
[0625]
作为完整的与切割的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169，包含2个xten和2个rs)刺激t-细胞相关细胞因子的释放的能力的安全性评估，在基于细胞的体外测定中，使用细胞测量珠阵列(cba)对上清液分析了一组细胞因子，包括il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α、ifn-γ，所述上清液来自用蛋白酶处理的和未处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物样品刺激的培养的人pbmc。将抗-人cd3抗体okt3用作阳性对照，且未处理的孔充当阴性对照。
[0626]
简而言之，通过允许孔在生物安全柜中蒸发过夜，将okt3(0、10nm、100nm和1000nm)和蛋白酶处理的和未处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(10nm、100nm、1000nm和2000nm的pjb0169)干燥包被到96-孔平底板上。然后将孔用pbs温和洗涤一次，并将在200μl中的1
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106个pbmc添加到每个孔中。然后将板在37℃、5％co2条件下温育24小时，然后从每个孔收集组织培养物上清液，并使用经过验证的商业cba试剂盒(bd cba人th1/th2细胞因子试剂盒,目录号551809)按照生产商的说明书通过流式细胞术分析释放的细胞因子。
[0627]
预计okt3会诱导评价的所有细胞因子(il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α、ifn-γ)的强烈分泌，但未处理的孔不会，从而证实cba细胞因子测定的性能。对于测试的所有细胞因子，预计用蛋白酶处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物刺激会触发显著的细胞因子表达，尤其是在浓度高于100nm时。相比之下，当完整的未切割的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物分子为10至2000nm的浓度范围内的刺激物时，预计il-2、il-6、il-10、tnf-α和ifn-γ为基线水平。这些数据支持，与其中抗egfr
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抗-cd3部分从组合物释放的蛋白酶处理的双特异性抗原结合组合物相比，完整的双特异性抗原结合组合物的xten聚合物提供了相当大的屏蔽作用并阻碍了pbmc刺激的细胞因子应答。
[0628]
实施例15：在存在纯化的cd3阳性t细胞情况下抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物的细胞毒性测定。
[0629]
为了证实双特异性抗原结合组合物分子的细胞毒性活性由cd3阳性t细胞介导，在存在纯化的人cd3阳性t细胞的情况下，在egfr 人细胞系(例如hct-116或ht-29)中评价了不具有释放区段的不可切割的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0172，包含2个xten)以及蛋白酶处理的和未处理的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169，包含2个xten和2个rs)。纯化的人cd3阳性t细胞购自bioreclamationiv，其中使用magcellect人cd3 t细胞分离试剂盒通过阴性选择从健康供体的全血中分离它们。在本实验中，将纯化的人cd3阳性t细胞与egfr 细胞系以约10:1的比例混合，并且所有三种双特异性抗原结合组合物分子均在如上所述的ldh测定中测试为12-点、5
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系列稀释剂量曲线。预计用cd3 细胞分析的三种双特异性抗原结合组合物分子的活性趋势与用pbmc对相同细胞系的分析相似。预计未处理的pjb0169的活性低于蛋白酶处理的pjb0169；且预计不可切割的pjb0172的活性低于未处理的pjb0169。这样的结果将证实，双特异性抗原结合组合物分子的细胞毒性活性确实由cd3阳性t细胞介导。包含在可切割的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物分子中的释放区段对假定从肿瘤细胞释放的蛋白酶的敏感性和/或测定混合物中的活化的cd3阳性t细胞可能因细胞系而异。
[0630]
实施例16：抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物的t-细胞活化标志物和细胞因子释放测定。
[0631]
为了测量抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物诱导的细胞因子表达，在96-孔圆底板中，在存在抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合组合物(pjb0169，包含2个xten和2个rs)的情况下，在每个测定孔中将纯化的cd3 细胞与hct-116细胞共培养(即，效应物与靶标之比为约10:1)，总计最终体积为200μl。在37℃、5％co2保湿培养箱中温育20小时后，收获细胞上清液用于细胞因子测量。该测定也可以用选自ht-29、nci-h1573、nci-h1975、fadu和scc-9的其它靶细胞以及用pbmc代替纯化的cd3 细胞进行。
[0632]
分泌到细胞培养物上清液中的白介素(il)-2、il-4、il-6、il-10、肿瘤坏死因子(tnf)-α和干扰素(ifn)-γ的细胞因子分析，使用人th1/th2细胞因子细胞测量珠阵列(cba)试剂盒(bd biosciences目录号550749)按照生产商的说明书来量化。在不存在双特异性抗原结合组合物的情况下，预计纯化的cd3 细胞不会分泌高于背景的细胞因子。在存在egfr阳性靶细胞和纯化的cd3 细胞的情况下，预计pjb0169会活化t细胞并分泌一系列t细胞细胞因子，其中含有高比例的th1细胞因子诸如ifn-γ和tnf-α。与完整的pjb0169相比，较低浓度的蛋白酶处理的pjb0169预计会活化t细胞并分泌t细胞细胞因子，从而支持xten聚合物在双特异性抗原结合组合物中的屏蔽作用。
[0633]
实施例17：抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合多肽在非人类灵长类动物中的单次和多次剂量药代动力学确定
[0634]
在原初的、健康的非人类灵长类动物(nhp)(例如，食蟹猴)中评价了带有2个xten聚合物的抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合多肽(即，pjb0169)在单次和多次静脉内施用后的药代动力学(pk)和一般耐受性。简而言之，通过头静脉向一只雌性猴和一只雄性猴静脉内输注8.5μg/kg组合物。监测两只动物两周。在没有观察到不良事件后，动物接受多次剂量方案，起始为每三天一剂，持续三周(在研究中总共9剂)。多次剂量阶段从第15天开始，并
在第36天结束。在整个研究中的特定时间点，收集血液用于测定药代动力学、细胞因子、血液学和血清化学。
[0635]
在研究过程期间，动物监测包括体重、体温和笼边观察，每天一次或两次。监测动物的一般健康和外观；疼痛和痛苦的迹象，发热、寒战、恶心、呕吐和皮肤完整性。在给药日，在施用组合物之前和之后，检查动物的注射部位反应。在给药前和第一次单剂量后24小时确定血液学和血清化学。在给药前和第一次单剂量后72小时内和在多次剂量阶段中以适当间隔评价细胞因子。
[0636]
在夹心elisa上使用在电化学发光链霉亲和素板上捕获的egfr-生物素定量在血浆中存在的pjb0169的量，其中磺基-标记的抗-xten-抗体作为检测。使用winnonlin软件分析药代动力学参数，包括cmax、tmax、曲线下面积、半衰期和暴露特性。
[0637]
细胞因子组包括按照生产商的说明书使用meso-scale discovery平台测量ifn-γ、il-1β、tnf-α、il-1β、il-2、il-4、il-6和il-10。这些细胞因子的检测下限分别为2.0pg/ml、0.32pg/ml、0.11pg/ml、0.68pg/ml、0.04pg/ml、0.23pg/ml和0.10pg/ml。血液学组包括测量白细胞、红细胞、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞血红蛋白体积、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板、平均血小板体积、嗜中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比和嗜碱性粒细胞百分比。血清化学组包括测量丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶、球蛋白、白蛋白/球蛋白比率、γ-谷氨酰转移酶、葡萄糖、尿素、肌酸酐、钙、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、钠、钾、氯和肌酸激酶。
[0638]
结果：pjb0169在8.5μg/kg的剂量被良好耐受。体重没有下降。未观察到寒战、发热、恶心、呕吐、皮疹、测试物注射部位反应。除il-6外，所有测量的细胞因子水平均低于检测限。虽然在单次剂量和多次剂量阶段可检测到，但检测到的il-6水平被认为是背景，在评价的时间点范围内，最高水平在雄性动物中不超过51pg/ml，在雌性动物中不超过19pg/ml。血液学和临床组均在正常范围内。在第1天施用后，在8.5μg/kg，平均c
max
值是372ng/ml，平均auc
0-168h
是15839ng*h/ml，平均auc
0-inf
是16342ng*h/ml，平均cl值是0.00886ml/min/kg，并且平均t
1/2
值是24.2小时。分布容积(vd)是0.0238l/kg。在第36天施用后，平均c
max
值是410ng/ml，平均auc
0-168h
是22985ng*h/ml，平均auc
0-inf
是24663ng*h/ml，平均cl值是0.00578ml/min/kg，并且平均t
1/2
值是44.0小时。分布容积(vd)是0.0196l/kg。以8.5μg/kg单次或多次静脉内输注施用pjb0169后，猴中c
max
和auc
0-168h
的累积指数为1.10和1.45。在第1天和第36天施用之间的全身暴露没有显著差异。数据还表明没有出现抗-药物抗体。
[0639]
实施例18：抗-egfr
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抗-cd3双特异性抗原结合多肽在非人类灵长类动物中的剂量范围发现
[0640]
pjb0169双特异性抗原结合多肽在非人类灵长类动物中的剂量范围发现研究在健康的、原初食蟹猴中进行，每个组群有一只雌性猴和一只雄性猴。简而言之，通过头静脉向一只雌性猴和一只雄性猴静脉内输注pjb0169。监测两只动物两周。在没有观察到不良事件后，动物接受多次剂量方案，起始为每三天一剂，持续三周(在研究中总共9剂)。多次剂量阶段从第15天开始，并在第36天结束。在整个研究中的特定时间点，收集血液用于测定药代动力学、细胞因子、血液学和血清化学。在最后一次施用后二十四小时(即第37天)，对动物进行尸体剖检以进行组织病理学评价。当在第一剂之后一周在组群中未观察到不良事件时，
在下一组群中将pjb0169剂量递增2或3倍。剂量递增将进行直到观察到不良事件。
[0641]
在研究过程期间，动物监测包括体重、食物消耗、体温和笼边观察，每天一次或两次。监测动物的一般健康和外观；疼痛和痛苦的迹象；发热、寒战、恶心、呕吐和皮肤完整性。在给药日，在xpat施用之前和之后检查动物的注射部位反应。
[0642]
将在夹心elisa上使用在电化学发光链霉亲和素板上捕获的egfr-生物素定量在血浆中存在的pjb0169的量，其中磺基-标记的抗-xten-抗体作为检测。将使用winnonlin软件分析药代动力学参数，包括cmax、tmax、曲线下面积、半衰期和暴露特性。
[0643]
细胞因子组包括使用beckon dickinson细胞测量珠阵列测量il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-13、ifn-γ和tnfα。
[0644]
血液学组包括测量白细胞、红细胞、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞血红蛋白体积、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板、平均血小板体积、嗜中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比和嗜碱性粒细胞百分比。
[0645]
血清化学组包括测量丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶、球蛋白、白蛋白/球蛋白比率、γ-谷氨酰转移酶、葡萄糖、尿素、肌酸酐、钙、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、钠、钾、氯和肌酸激酶。
[0646]
对一组组织进行用h&e染色法的组织病理学评价，所述一组组织包括肾上腺、主动脉、骨、脑、附睾、食管、眼、输卵管(仅雌性)、心脏、肾、大肠、肝脏和胆囊、肺、淋巴结、乳腺(仅雌性)、卵巢(仅雌性)、胰腺、垂体、前列腺、唾液腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、睾丸(仅雄性)、胸腺、甲状腺、气管、膀胱、子宫和注射部位。
[0647]
中期结果：在该剂量范围发现研究中的起始剂量是组群1在25.5μg/kg pjb0169。在单次剂量和多次剂量阶段未观察到可观察到的不良事件，诸如发热、寒战、皮疹、恶心、呕吐、异常的血液学和血清化学。因此，在组群2中将pjb0169剂量递增3倍至76.5μg/kg。在组群2中没有观察到可观察到的不良事件，并且在组群3中将pjb0169剂量递增3倍至230μg/kg。除了ast、alt和总胆红素读数高于正常范围的可逆增加之外，没有观察到其它不良事件，并且接下来在组群4中将pjb0169剂量递增2倍至460μg/kg。在组群4中没有观察到可观察到的不良事件。pjb0169的进一步剂量递增正在进行中。
[0648]
在整个研究期间没有发现死亡和垂死的动物。在任何治疗组中都没有测试物相关的器官重量变化。在所有测试动物中均未观察到眼观病变。在显微镜下，主要发现是在一些动物的注射部位处的皮下出血、组织坏死、嗜中性粒细胞浸润、静脉坏死或血栓形成以及皮肤结痂(skin crust)。这些变化可能归因于静脉内输注程序。
[0649]
中期结论：在高达460μg/kg的剂量，pjb0169双特异性抗原结合多肽在非人类灵长类动物中良好耐受。在所有测试剂量组中均未观察到测试物相关的器官重量和病理变化。
[0650]
实施例19：抗原结合片段的等电点(pi)的确定
[0651]
为了确定每种cd3和egfr变体抗原结合片段的等电点，使用maestro(德国)的biologics套件中的蛋白滴定曲线组(protein titration curve panel)分析每种片段。如下从可滴定基团(单个可电离残基和末端)的pka值计算出蛋白的滴定曲线：将每个这样的基团在ph值的间隔内的电荷分数相加。用propka产生pka值(sondergaard,c.等人toxicol lett.205(2):116(2011)；olsson,m.等人proteins 79:3333(2011))。绘制滴定曲线并确定每条曲线的等电点(pi)，结果列于下表中。
[0652]
表21：cd3变体的等电点
[0653]
抗体变体等电点(pi)cd33.96.8cd3cd3.306.8cd3cd3.316.2cd3cd3.326.2cd3cd3.336.2
[0654]
表22：egfr变体的等电点
[0655][0656]
再多了解一些
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