对糖基化的CTLA-4特异性的抗体及其使用方法与流程

4与cd86和cd80的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd86和cd80的相互作用。
11.在某些方面，所述抗体结合(诸如选择性地)一个或多个糖基化基序。在某些方面，所述抗体结合糖肽，所述糖肽包含糖基化基序和邻近肽。在某些方面，所述抗体结合在三维上位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列。
12.在某些方面，抗-glycctla-4抗体对糖基化的ctla-4的结合亲和力是0.1至13nm或0.1至10nm或0.1nm至5nm，包括下限值和上限值。在某些方面，所述抗体结合糖基化的ctla-4的kd小于相对于未糖基化的clta-4表现出的kd的一半。在其它方面，所述抗体结合糖基化的ctla-4的kd是相对于未糖基化的ctla-4表现出的kd的至多十分之一。
13.在一个特定方面提供了抗-glycclta-4单克隆抗体stc1807，其具有分别具有seq id no:3和5的氨基酸序列(没有任何信号序列的成熟vh和v
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区氨基酸序列)的重链可变结构域和轻链可变结构域、及其抗原结合部分、及其人源化和嵌合形式。本文提供了抗-glycctla-4抗体，其与stc1807 mab竞争对糖基化的ctla-4的结合和/或结合与stc1807相同的表位。在其它方面是抗-glycctla-4重链抗体，其具有含有seq id no:3的氨基酸序列的重链可变结构域。
14.下文表3中提供了stc1807 mab的重链和轻链可变(v)结构域的核酸(dna)和对应氨基酸序列。seq id no:2和3是stc1807 vh结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，且seq id no:4和5是stc1807κ轻链可变结构域的成熟形式的核苷酸序列和氨基酸序列。表4提供了stc1807的chothia、abm、kabat和contact重链和轻链v结构域cdr。
15.在一个实施方案中，特异性地和优先地结合糖基化的ctla-4的抗-glycctla-4抗体包含具有seq id no:3的氨基酸序列的vh结构域和/或具有seq id no:5的氨基酸序列的v
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结构域。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含seq id no:3的vh结构域和seq id no:5的v
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结构域。在其它实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体包含与seq id no:3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh结构域和/或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的v
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结构域。这些抗-glycctla-4抗体可以是嵌合抗体且包含人恒定结构域，例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4的人恒定结构域。
16.在一个实施方案中，特异性地和优先地结合糖基化的ctla-4的抗-glycctla-4抗体包含vh结构域，所述vh结构域包含分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的chothia cdr1-3；包含分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的abm cdr1-3；包含分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的kabat cdr 1-3；或包含分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的contact cdr 1-3，或它们的组合。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含vh结构域，所述vh结构域包含分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的chothia cdr1-3；包含分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的abm cdr 1-3；包含分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的kabat cdr 1-3；或包含分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基
酸序列的contact cdr 1-3，或它们的组合。优选地，所述vh和v
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结构域具有相同类别的cdr，即，两者都具有chothia、abm、kabat或contact cdr。
17.在其它的实施方案中，所述抗-glycctla-4-1抗体具有包含cdr h1、cdr h2和cdr h3的vh结构域，所述cdr h1、cdr h2和cdr h3具有在以下cdr中的1个、2个或3个中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的chothia cdr，或分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的abm cdr，或分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的cabat cdr，或分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的contact cdr。所述抗-glycctla-4抗体可以具有在vh和v
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结构域二者的cdr中的氨基酸置换。在某些实施方案中，所述氨基酸置换是保守置换。
18.优选地，前述抗体具有人框架区，即，是stc1807的人源化形式，且任选地，包含人恒定结构域，例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4的人恒定结构域。
19.本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的cdr和/或框架区中做出一个或多个氨基酸置换以改善结合亲和力或其它参数。在实施方案中，所述抗-glycctla-4-1抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含上述的vh和v
l
结构域和在其中的cdr。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4的kd为0.1-10nm或1-20nm，包括下限值和上限值。在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4的kd小于所述抗体与未糖基化的ctla-4的结合所表现出的kd的一半。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4蛋白的kd是相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd的至多五分之一。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4蛋白的kd是所述抗体与未糖基化的ctla-4蛋白的结合所表现出的kd的至多十分之一。
20.在一个实施方案中，在抗体中和测定中，所述抗体抑制ctla-4和重组人cd86-fc蛋白之间的相互作用，表示为与表达野生型ctla-4的细胞的结合的绿色计数对象/mm2是与表达未糖基化的ctla-4的细胞的结合的绿色计数对象/mm2的3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
21.在一个实施方案中，所述抗体是通过荧光标记或标志物直接或间接可检测的。在一个实施方案中，所述抗体用荧光标记或标志物(诸如fitc)直接标记，或通过荧光标记的二级抗体进行检测。在一个实施方案中，stc1807 mab、或其嵌合或人源化形式对糖基化的ctla-4的结合亲和力是0.1-13nm或0.1-5nm，包括下限值和上限值。在一个实施方案中，所述抗体抑制ctla-4与cd86和/或cd80的相互作用。
22.在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含上述的vh和v
l
结构域和在其中的cdr。优选地，这些抗体具有人框架区，即，是stc1807的人源化形式，且任选地，包含人恒定结构域，例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4的人恒定结构域。本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的cdr或框架区中做出一个或多个氨基酸置换以改善结合亲和力或其它参数。在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4的kd小于相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd的一半。在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4的kd小于相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd的一半。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的
ctla-4蛋白的kd是所述抗体与未糖基化的ctla-4的结合所表现出的kd的至多五分之一。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4蛋白的kd是所述抗体与未糖基化的ctla-4蛋白的结合所表现出的kd的至多十分之一。在一个实施方案中，在细胞流式细胞术结合测定中，所述抗体表现出的与表达wt ctla-4的细胞的结合(表示为绿色计数对象/mm2)是与表达未糖基化的ctla-4的细胞的结合的绿色计数对象/mm2的3倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍。在一个实施方案中，所述抗体是通过荧光标记或标志物直接或间接可检测的。在一个实施方案中，所述抗体用荧光标记或标志物(诸如fitc)直接标记。在一个实施方案中，stc1807 mab或其结合结构域或人源化或嵌合形式对糖基化的ctla-4的结合亲和力是0.1-13nm或0.1-10nm或0.1-5nm，包括下限值和上限值。在一个实施方案中，所述抗体抑制ctla-4与cd86的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd86的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体抑制ctla-4与cd80的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd80的相互作用。
23.在某些方面，所述抗体是重组的。在某些方面，所述抗体是igg、igm、iga或其抗原结合片段。在其它方面，所述抗体是fab'、f(ab')2、f(ab')3、单价scfv、二价scfv、双特异性抗体、双特异性的scfv或单结构域抗体。在某些方面，所述抗体是人或人源化抗体。在其它方面，所述抗体缀合至成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。
24.在另一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的承载体中的实施方案的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4)。
25.在另一个实施方案中，提供了分离的多肽，其包含人ctla-4的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，该片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸。在其它方面，实施方案的分离的多肽包含人ctla-4的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，该片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，且其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化。在某些方面，实施方案的多肽融合或缀合至免疫原性多肽(例如，钥孔血蓝蛋白，klh)。在某些方面，所述多肽进一步包含在c-或n-末端处的cys残基。例如，在某些方面，所述多肽通过在cys残基处的二硫键缀合至免疫原性多肽。
26.在另一个实施方案中，提供了一种包含多肽的组合物，所述多肽包含人ctla-4的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，该片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化，其中所述多肽被配制在药学上可接受的承载体中。在某些方面，所述组合物是免疫原性组合物。在某些方面，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂，诸如明矾或弗氏佐剂。
27.在另一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的实施方案的抗体或分离的多肽。在某些方面，一种用于治疗癌症的方法包括给受试者施用有效量的多肽(例如，糖基化的ctla-4多肽)。在其它方面，一种治疗癌症的方法包括给受试者施用有效量的实施方案的抗体(例如，相对于未糖
基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4的抗体)，诸如，但不限于stc1807的人源化或嵌合形式，或与stc1807竞争对糖基化的ctla-4的结合的抗体。在某些方面，所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，所述癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成年人的脑/cns肿瘤、儿童的脑/cns肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、青少年的癌症、儿童的癌症、年轻成年人的癌症、不明原发灶的癌症、卡斯尔曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、妊娠性滋养细胞病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉头或下咽癌、白血病(例如，成年人急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓样白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓样白血病(cml)、慢性粒单核细胞白血病(cmml)、儿童期白血病)、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、肺类癌瘤、淋巴瘤、皮肤的淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、儿童的非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如，成年软组织癌)、皮肤癌(例如，基底和鳞状细胞癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌)、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、waldenstrom巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在某些方面，所述抗体是在药学上可接受的组合物中。在其它方面，全身性地施用所述抗体。在特定方面，静脉内地、真皮内地、肿瘤内地、肌肉内地、腹膜内地、皮下地或局部地施用所述抗体。
28.在某些方面，所述方法进一步包括给所述受试者至少施用第二抗癌疗法。在某些方面，其中所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、辐射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
29.在另一个实施方案中，本文提供了一种用于评估ctla-4糖基化、n-连接的糖基化或n-糖基化的方法，所述方法包括使含有ctla-4的样品与实施方案的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4)接触。在某些方面，所述方法是体外方法。在某些方面，所述样品是细胞样品。
30.在另一个实施方案中，提供了一种制备抗体的方法，其包括：给动物施用根据实施方案的多肽(例如，具有人ctla-4的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化)，和从所述动物分离所述抗体。例如，所述动物可以是小鼠、大鼠、兔或人。在某些方面，一种方法进一步包括鉴定抗体的cdr和将所述cdr周围的序列人源化以产生人源化抗体。在其它方面，所述方法包括重组地表达人源化抗体。因而，在另一个实施方案中，本文提供了通过前述方法生产的分离的抗体。因而，在某些实施方案中，本文提供了分离的抗体，其相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合实施方案的多肽(例如，包含人ctla-4的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化)。
附图说明
31.图1a-1c.ctla-4与cd80的结合是糖基化特异性的。绿色荧光标记的cd80-fc和
ctla-4之间的动态相互作用的时间序列显微镜检(time-lapse microscopy)和定量。(a)显示ctla-4与表达野生型clta-4和clta-4 2nq突变体(即，未糖基化的ctla-4)的293t细胞之间的动态相互作用的时间序列显微镜检图像(在20小时时间点)。显示了ctla-4wt(a)或2nq ctla-4突变体(b)表达细胞的绿色荧光(绿色荧光标记的ctla-4/fc蛋白)合并图像(20x)。(c)该图显示了在每小时时间点ctla-4/fc蛋白与表达clta-4wt或ctla-4 2nq的hek293t细胞的定量结合。
32.图2a-c.ctla-4与cd86的结合是糖基化特异性的。绿色荧光标记的cd86-fc和ctla-4之间的动态相互作用的时间序列显微镜检和定量。(a)显示在最后一个时间点ctla-4与表达野生型clta-4和clta-4 2nq突变体(未糖基化形式)的293t细胞之间的相互作用的时间序列显微镜检图像(在20小时时间点)。显示了ctla-4wt(a)或2nq ctla-4突变体(b)表达细胞的绿色荧光(绿色荧光标记的ctla-4/fc蛋白)合并图像(20x)。(c)该图显示了在每个小时时间点ctla-4/fc蛋白与表达clta-4wt或ctla-4 2nq的hek293t细胞的定量结合。
33.图3a和3b.对糖基化的ctla4特异性的单克隆抗体的开发。使用纯化的ctla4或pngase f处理过的ctla4对ctla4抗体的斑点印迹分析。(a)斑点印迹膜描述了几种抗体(包括stc1807和stc1810)的糖特异性结合活性。(b)相应96-孔斑点印迹测定板的样品布局。
34.图4.抗-glycctla-4-1抗体的中和活性。随着时间的推移，65种纯化的单克隆抗体的阻断cd86-fc蛋白与表达ctla-4的细胞结合的活性。使用了10μg/ml的抗体。
35.图5.通过octet分析的抗-ctla4抗体的传感图。来自高通量kd筛选的数据总结。将数据拟合至1:1结合模型以提取缔合速率和解离速率。使用比率kd:ka计算kd。图显示了应答相对于时间的关系，显示了相互作用的进展。
36.图6a和b.stc1807和对照抗体对表达野生型和突变体ctla-4蛋白的293t细胞的结合分析。a.抗-glycctla-4抗体stc1807与表达标志物标记的野生型和突变体ctla-4蛋白的293t细胞和对照293t细胞的结合。stc1807识别n113糖基化，但既不识别n145也不识别2nq。n113，在ctla-4(seq id no:1)的位置113处用q代替n，n145，在位置145处用q置换n，和2nq，在位置113和145的每一个处用q置换n，或对照293t细胞。抗-标志物显示为加载对照。
37.图7a-d.抗-glycctla-4抗体stc1807的中和活性和ec
50
。(a)随抗体浓度变化的stc1807阻断cd86-fc蛋白与表达ctla-4的细胞的结合的活性。(b)作为stc1807浓度的函数的ctla-4-cd86结合的抑制。ec
50
是2.189μg/ml。(c)随抗体浓度变化的stc1808阻断cd86-fc蛋白与表达ctla-4的细胞的结合的活性。(d)随抗体浓度变化的stc1813阻断cd86-fc蛋白与表达ctla-4的细胞的结合的活性。
38.图8a-d.抗-glycctla-4抗体hstc1807和fda批准的抗-ctla4伊匹木单抗的中和活性和ec
50
。(a)随抗体浓度变化的人嵌合体stc1807(hstc1807)阻断cd86-fc蛋白与表达ctla-4的细胞的结合的活性。(b)作为stc1807浓度的函数的ctla-4-cd86结合的抑制。ec
50
是0.3313μg/ml。(c)随抗体浓度变化的伊匹木单抗阻断cd86-fc蛋白与表达ctla-4的细胞的结合的活性。(d)作为伊匹木单抗浓度的函数的ctla-4-cd86结合的抑制。ec
50
是0.3068μg/ml。
39.图9a和b.伊匹木单抗和stc1807之间的不同结合位点。用表位分箱(epitope binning)实验评估stc1807和伊匹木单抗之间的竞争性结合。第二抗体的额外结合指示未被占用的表位(非竞争物)，且无结合指示表位封闭(竞争物)。(a)stc1807的加载。(b)伊匹
木单抗的加载。
40.图10a和b.stc1807显示出与伊匹木单抗相比增加的结合亲和力。使用biacore结合测定对比stc1807与伊匹木单抗的结合亲和力(减小的平衡解离常数[kd]值)。图描绘了应答相对于时间的关系，显示了(a)stc1807(kd0.47nm)和(b)伊匹木单抗(kd 13.4nm)的相互作用的进展。
[0041]
图11a和b.在stc1807存在下增加的ifn-γ和il-2分泌。hstc1807对响应于刺激细胞(dc，树突细胞)的t细胞增殖(t)的影响。图显示了在stc1807和对照鼠igg存在下的ifn-γ(a)和il-2(b)细胞因子水平。在第5天通过elisa对上清液中的细胞因子进行定量。
具体实施方式
[0042]
n-糖基化是在内质网(er)中起始并随后在高尔基体中加工的翻译后修饰(schwarz和aebi,current opinion in structural biology 21,576-582(2011))。这种类型的修饰首先由膜相关寡糖基转移酶(ost)复合物催化，该复合物将由寡糖组成的预制聚糖转移到位于nxt基序(-asn-x-ser/thr-)内的天冬酰胺(asn)侧链受体(cheung和reithmeier,methods 41(4):451-59(2007)；helenius和aebi,science 291(5512):2364-69(2001))。来自预制聚糖的糖的添加或移除分别是由一组糖转移酶和糖苷酶介导，它们以细胞依赖性和位置依赖性的方式严格调节n-糖基化级联。
[0043]
ctla-4与cd86和cd80之间的细胞外相互作用对肿瘤相关免疫逃逸具有显著影响。ctla-4的n-连接糖基化可以增强其与cd80和/或cd86的结合，从而导致t细胞介导的免疫应答的抑制。因此，相对于更一般的ctla-4抗体，抗ctla-4抗体可以表现出增强的抑制作用。
[0044]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“细胞毒性的t-淋巴细胞相关蛋白4”或“ctla-4”表示来自任何脊椎动物来源的ctla-4，所述脊椎动物包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人类、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。除非另外指出，ctla-4还包括各种ctla-4异构体、相关的ctla-4多肽，包括其snp变体，以及ctla-4的不同修饰形式，包括、但不限于磷酸化的ctla-4、糖基化的ctla-4和泛素化的ctla-4。
[0045]
下面提供了人ctla-4的示例性氨基酸序列，其中n-连接糖基化位点以粗体和下划线标出(n113和n145)：
[0046][0047]
如下表1所示，两个n-糖基化位点均位于ctla-4的细胞外结构域中。
[0048][0049]
特定ctla-4异构体或变体的具体糖基化位点可能不同于该特定ctla-4异构体或变体的位置113或145处的氨基酸。
[0050]
在那些情况下，基于序列比对和本领域中的其它常见知识，本领域普通技术人员将能够确定与上述示例的人ctla-4的n113和n145相对应的任何特定ctla-4异构体或变体的糖基化位点。这样，本文还提供了相对于未糖基化的ctla-4异构体或变体选择性地结合ctla-4异构体或变体的糖基化形式的抗体。ctla-4异构体或变体的糖基化位点可以是上面提供的人ctla-4序列的n113和n145的对应位点。本文还提供了多肽，其包含ctla-4异构体或变体的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，该片段包含与上面提供的示例性人ctla-4序列的位置n113或n145对应的至少一个氨基酸。
[0051]
如本文中使用的，且除非另外指出，冠词“一个”、“一种”和“所述”表示该冠词的一个或超过一个语法对象。作为例子，一种抗体表示一种抗体或超过一种抗体。
[0052]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“或”与“和/或”互换使用，除非明确指出仅表示备选方案，或者备选方案是相互排斥的。如本文中使用的，且除非另外指出，“另一种”表示至少第二种或更多种。
[0053]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“约”指示值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变差，或在研究对象之间存在的变化。
[0054]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“抗体”表示在免疫球蛋白(或“ig”)类多肽中的b细胞的多肽产物，其能够结合特定分子抗原，诸如igg、igm、iga、igd、ige、以及具有其抗原结合片段的其它分子。抗体可以由相同的两对多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kda)和一条轻链(约25kda)，并且每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，且每条链的每个羧基末端部分包括一个恒定区(参见borrebaeck(编)(1995)antibody engineering,第二版,oxford university press.；kuby(1997)immunology,第三版,w.h.freeman and company,new york)。在这里，具体的分子抗原包括糖基化的人ctla-4。本文提供的抗体包括、但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组生产的抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼源化的抗体、嵌合抗体、胞内抗体(intrabodies)、抗-独特型(抗-id)抗体。
[0055]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“分离的”当用于提及抗体、抗原结合片段或多核苷酸时是指，所提及的分子不含至少一种在自然界中发现的组分。该术语包括从在其自然环境中发现的一些或所有其它组分中提取的抗体、抗原结合片段或多核苷酸。抗体的自然环境的组分包括，例如，红细胞、白细胞、凝血细胞、血浆、蛋白、核酸、盐和营养物。抗原结合片段的或多核苷酸的自然环境的组分包括，例如，脂质膜、细胞细胞器、蛋白、核酸、
盐和营养物。本发明的抗体、抗原结合片段或多核苷酸也可以不含或完全不含、或基本上不含所有这些组分或从中分离或重组产生它的细胞的任何其它组分。
[0056]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“单克隆抗体”表示作为单细胞克隆或杂交瘤或源自单细胞的细胞群的产物的抗体。单克隆抗体也意指通过重组方法从编码重链和轻链的免疫球蛋白基因产生的抗体，以产生单分子免疫球蛋白种类。单克隆抗体制剂中抗体的氨基酸序列是基本上同质的，并且这种制剂中抗体的结合活性表现出基本上相同的抗原结合活性。相比之下，多克隆抗体得自群体中的不同b细胞，它们是结合特定抗原的免疫球蛋白分子的组合。多克隆抗体的每个免疫球蛋白可以结合相同抗原的不同表位。生产单克隆抗体和多克隆抗体的方法是本领域众所周知的(harlow和lane.,antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press(1989)和borrebaeck(编),antibody engineering:a practical guide,w.h.freeman and co.,publishers,new york,第103-120页(1991))。
[0057]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“人抗体”表示具有与人种系免疫球蛋白序列对应的人可变区和/或人恒定区或其部分的抗体。这样的人种系免疫球蛋白序列描述于kabat等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,第五版,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242。在这里，人抗体可以包括结合糖基化的人ctla-4并由核酸序列编码的抗体，该核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。
[0058]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“嵌合抗体”表示这样的抗体：重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(参见美国专利号4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。
[0059]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“人源化抗体”表示包括人免疫球蛋白的嵌合抗体(例如，受体抗体)，其中天然互补性决定区(“cdr”)残基被来自非人物种(例如，供体抗体)的具有期望的特异性、亲和力和能力的对应cdr的残基替换，所述非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个fr区残基被被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以具有在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以具有基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有的或基本上所有的cdr对应于非人免疫球蛋白的cdr，并且所有的或基本上所有的fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体可以具有免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其它细节，参见，jones等人,nature,321:522-525(1986)；riechmann等人,nature,332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)；carter等人,proc.natl.acd.sci.usa 89:4285-4289(1992)；和美国专利号：6,800,738、6,719,971、6,639,055、6,407,213,和6,054,297。
[0060]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“重组抗体”表示通过重组方式制备、表达、建立或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体，从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因和/或转染
色体的动物(例如小鼠或牛)中分离的抗体(参见，例如，taylor,l.d.等人,nucl.acids res.20:6287-6295(1992))，或通过任何其它方式制备、表达、建立或分离的抗体，所述其它方式包含将免疫球蛋白基因序列剪接至其它dna序列。这样的重组抗体可以具有可变区和恒定区，包括源自人种系免疫球蛋白序列的那些(参见kabat,e.a.等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,第五版,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242)。也可以对重组抗体进行体外诱变(或者，当使用人ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的vh和v
l
区的氨基酸序列可以是这样的序列：其尽管衍生自人种系vh和v
l
序列并与其相关，但是在体内人抗体种系库中天然不存在。
[0061]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“抗原结合片段”和类似的术语表示抗体的一部分，该部分包括免疫特异性地结合抗原并赋予抗体对该抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗原结合片段可以被称作抗体的功能片段。抗原结合片段可以是单价的、二价的或多价的。
[0062]
具有抗原结合片段的分子包括，例如，fd、fv、fab、f(ab’)、f(ab)2、f(ab’)2、f(ab)3、f(ab’)3、单链fv(scfv)、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体(minibody)或单结构域抗体。scfv可以是单价scfv或二价scfv。具有抗原结合片段的其它分子可以包括例如重链或轻链多肽、可变区多肽或cdr多肽或其部分，只要这样的抗原结合片段保留结合活性。这样的抗原结合片段可以发现描述于例如harlow和lane,antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york(1989)；myers(编),molec.biology and biotechnology:a comprehensive desk reference,new york:vch publisher,inc.；huston等人,cell biophysics,22:189-224(1993)；pl
ü
ckthun和skerra,meth.enzymol.,178:497-515(1989)和day,e.d.,advanced immunochemistry,第二版,wiley-liss,inc.,new york,ny(1990)。抗原结合片段可以是具有至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。
[0063]
抗体的重链表示约50-70kda的多肽链，其中氨基端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区，且羧基端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称作alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的五种不同类型中的一种。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五类众所周知的抗体：iga、igd、ige、igg和igm，包括igg的四个亚类，即igg1、igg2、igg3和igg4。重链可以是人重链。
[0064]
抗体的轻链表示约25kda的多肽链，其中氨基端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，且羧基端部分包括恒定区。轻链的近似长度是211-217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，有两种不同的类型，被称作kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。轻链可以是人轻链。
[0065]
抗体的可变结构域或可变区表示抗体轻链或重链的一部分，一般位于轻链或重链
的氨基端，且具有在重链中约120-130个氨基酸和在轻链中约100-110个氨基酸的长度，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。不同抗体之间的可变结构域的序列差异很大。序列的可变性集中在cdr中，而可变结构域中不太可变的部分被称作框架区(fr)。轻链和重链的cdr主要负责抗体与抗原的相互作用。本文使用的氨基酸位置的编号是根据eu索引，如在kabat等人(1991)sequences of proteins of immunological interest.(u.s.department of health and human services,washington,d.c.)第5版中。可变区可以是人可变区。
[0066]
cdr表示在免疫球蛋白(ig或抗体)vhβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(h1、h2或h3)之一，或在抗体v
l
β-折叠框架的非框架区内的三个高变区(l1、l2或l3)之一。因此，cdr是散布在框架区序列中的可变区序列。cdr区是本领域技术人员众所周知的，并且已被例如kabat定义为在抗体可变结构域内具有最高变异性的区域(kabat等人,j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat,adv.prot.chem.32:1-75(1978))。cdr区序列也在结构上被chothia定义为不是保守β-折叠框架的一部分的那些残基，且因此能够适应不同的构象(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。这两个术语在本领域中都是公认的。在规范抗体可变结构域内的cdr的位置已通过众多结构的对比进行确定(al-lazikani等人,j.mol.biol.273:927-948(1997)；morea等人,methods 20:267-279(2000))。由于不同抗体中高变区内的残基数目不同，因此与规范位置相关的额外残基通常在规范可变结构域编号方案中用在残基编号旁边的a、b、c等编号(al-lazikani等人,出处同上(1997))。这样的命名法对于本领域技术人员来说同样是众所周知的。
[0067]
一种通用编号系统已经被开发并被广泛采用，即immunogenetics(imgt)information(lafranc等人,2003,dev.comp.immunol.,27(1):55-77)。imgt是一个综合信息系统，专门研究人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(ig)、t细胞受体(tr)和主要组织相容性复合物(mhc)。在本文中，以氨基酸序列和在轻链或重链中的位置的方式表示cdr。由于cdr在免疫球蛋白v结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的并存在于被称为环的结构中，通过使用根据结构特征、cdr和框架残基比对可变结构域序列的编号系统，并易于识别。该信息可以用于将来自一个物种的免疫球蛋白的cdr残基移植和替换到通常来自人抗体的受体框架中。honegger等人,2001,j.mol.biol.,309:657-670已经开发了另一种编号系统(ahon)。编号系统之间的对应关系，包括、例如，kabat编号和imgt唯一编号系统，是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，kabat,出处同上；chothia等人,出处同上；martin,2010,antibody engineering,第2卷,第3章,springer verlag；和lefranc等人,1999,nuc.acids res.,27:209-212)。
[0068]
abm和contact方法也已经定义了cdr区序列。abm高变区代表kabat cdr和chothia结构环之间的折衷，并被oxford molecular的abm抗体建模软件使用(参见，例如，martin,2010,antibody engineering,第2卷,第3章,springer verlag)。“contact”高变区是基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些高变区或cdr中的每一个的残基如下所述。
[0069]
cdr区序列的示例性描述在下表2中说明。在规范抗体可变区内的cdr的位置已通过众多结构的对比进行确定(al-lazikani等人,1997,j.mol.biol.,273:927-948)；morea等人,2000,methods,20:267-279)。由于不同抗体中高变区内的残基数目不同，因此与规范位置相关的额外残基通常在规范可变结构域编号方案中用在残基编号旁边的a、b、c等编号
(al-lazikani等人,出处同上)。这样的命名法对于本领域技术人员来说同样是众所周知的。
[0070]
表2.cdr区序列的示例性描述
[0071] imgtkabatabmchothiacontactv
h cdr127-3831-3526-3526-3230-35v
h cdr256-6550-6550-5853-5547-58v
h cdr3105-11795-10295-10296-10193-101v
l cdr127-3824-3424-3426-3230-36v
l cdr256-6550-5650-5650-5246-55v
l cdr3105-11789-9789-9791-9689-96
[0072]
也可以将一个或多个cdr共价地或非共价地掺入分子中以使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可以掺入一个或多个cdr作为较大多肽链的一部分，可以将一个或多个cdr共价地连接至另一条多肽链，或者可以非共价地掺入一个或多个cdr。cdr允许免疫粘附素与特定目标抗原结合。
[0073]
如本文中使用的和除非另外指出，否则术语“结合”表示分子之间的相互作用。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。抗体与靶分子(诸如糖基化的人ctla-4)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体对该表位的亲和力。“结合亲和力”通常表示分子(例如，结合蛋白，诸如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。
[0074]
结合分子x(诸如抗体)对其结合配偶体y(诸如抗体的同源抗原)的亲和力通常可以用解离常数(kd)或平衡解离常数(kd)表示。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且易于解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原且倾向于保持结合较长时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开内容的目的。可以通过本领域已知的测定，例如通过结合测定，来测量“k
d”或“kd值”。可以在放射性标记的抗原结合测定(ria)中测量kd，例如，用感兴趣的抗体的fab形式及其抗原进行(chen,等人,(1999)j.mol.biol.293:865-881)。也可以如下测量kd或kd值：通过使用biacore进行的表面等离子体共振测定，例如使用biacoretm-2000或biacoretm-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)，或通过生物层干扰量度法，例如使用octetqk384系统(fortebio,menlo park,ca)。如本文中使用的，且除非另外指出，如果抗体以比第二分子抗原更高的亲和力结合第一分子抗原，则认为所述抗体相对于第二分子抗原能够“选择性地结合”第一分子抗原。抗体通常不结合完全不相关的抗原。
[0075]
如本文中使用的，且除非另外指出，本文中使用的术语“多肽”包括具有2-30个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25或30个氨基酸)以及更长氨基酸链的寡肽，例如，超过30个氨基酸、超过50个氨基酸、超过100个氨基酸、超过150个氨基酸、超过200个氨基酸、超过300个氨基酸、超过400个氨基酸、超过500个氨基酸或超过600个氨基酸。可以例如通过重组表达或通过化学合成来生产多肽。本公开内容的多肽可以被翻译后修饰或化学修饰(例如，糖基化、氨基甲酰化、磷酸化、生物素化、荧光染料的附着等)。多肽可以在特定位点被糖基化。多肽可以包括不由天然遗传密码编码的非天然氨基酸。例如，多肽可以包括甲基化的主链结构、类肽主链结构(聚-n-取代的甘氨酸)、l-氨基酸、r-氨基酸等。多
肽可以具有野生型序列、天然存在的变体序列、突变体序列(例如，点突变体、缺失突变体)等。
[0076]
抗-glycctla-4抗体
[0077]
本文提供了分离的抗体，其相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4。ctla-4可以是人ctla-4。糖基化的ctla-4可以是ctla-4的特定n-聚糖结构或ctla-4的糖肽。在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗原结合片段，其相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4。
[0078]
在某些实施方案中，本文提供的分离的抗体相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合在n113、n1145、或n113和n145处糖基化的人ctla-4。在某些实施方案中，所述分离的抗体选择性地结合具有n113糖基化的人ctla-4。在某些实施方案中，所述分离的抗体选择性地结合具有n145糖基化的人ctla-4。在某些实施方案中，所述分离的抗体选择性地结合具有n113和n145糖基化的人ctla-4。
[0079]
在某些方面，所述抗-glycctla-4抗体抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd86或cd80的相互作用。在某些方面，所述抗-glycctla-4抗体结合ctla-4并掩蔽或筛选一个或多个糖基化基序以阻断分子与该基序的结合或其它相互作用并且可以阻断ctla-4在该糖基化位点处的糖基化。在具体实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体掩蔽在n113和n145中的一个或多个处的糖基化位点。
[0080]
在某些实施方案中，本文提供的抗体选择性地结合ctla-4的一个或多个糖基化基序。在某些实施方案中，所述抗体选择性地结合具有糖基化基序的糖肽和邻近肽。在某些实施方案中，所述抗体选择性地结合糖基化的ctla-4的kd比相对于未糖基化的pd-1所表现出的kd小至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，所述抗原结合片段结合糖基化的ctla-4的kd比相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd小50％。在某些实施方案中，所述抗体结合糖基化的ctla-4的kd比相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd小1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％。在其它方面，所述抗体结合糖基化的ctla-4的kd是相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd的至多十分之一。
[0081]
提供了本文描述的优先结合糖基化的ctla-4的单克隆抗体，具体地，stc1807。还提供了stc1807的人源化和嵌合形式以及竞争与stc1807的结合的抗体。在下面表3中提供了stc1807的重链和轻链可变结构域。
[0082]
在一个特定方面提供了抗-glycctla-4单克隆抗体stc1807，其具有分别具有seq id no:3和5的氨基酸序列(没有任何信号序列的成熟vh和v
l
区氨基酸序列)的重链和轻链可变结构域、及其抗原结合部分、及其人源化和嵌合形式。本文提供了抗-glycctla-4抗体，其与stc1807 mab竞争对ctla-4的结合和/或结合与stc1807相同的表位。
[0083]
提供了单克隆抗体，stc1807 mab的重链和轻链可变(v)结构域的核酸(dna)和对应氨基酸序列显示在下文表3中。seq id no:2和3是stc1807 vh结构域的核苷酸和氨基酸序列，且seq id no:4和5是stc1807κv
l
结构域的成熟形式的核苷酸和氨基酸序列。表4提供了stc1807的chothia、abm、kabat和contact重链和轻链v结构域cdr。
[0084]
在一个实施方案中，特异性地和优先地结合糖基化的ctla-4的抗-glycctla-4抗体包含具有seq id no:3的氨基酸序列的vh结构域和/或具有seq id no:5的氨基酸序列的vl
结构域。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含seq id no:3的vh结构域和seq id no:5的v
l
结构域。在其它实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体包含vh结构域和/或v
l
结构域，所述vh结构域与seq id no:3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，所述v
l
结构域与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。这些抗-glycctla-4抗体可以是嵌合抗体且包含人恒定结构域，例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4的人恒定结构域。
[0085]
在一个实施方案中，特异性地和优先地结合糖基化的ctla-4的抗-glycctla-4抗体包含vh结构域，所述vh结构域包含分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的chothia cdr1-3；包含分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的abm cdr1-3；包含分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的kabat cdr 1-3；或包含分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的contact cdr 1-3，或它们的组合。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含vh结构域，所述vh结构域包含分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的chothia cdr1-3；包含分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的abm cdr 1-3；包含分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的kabat cdr1-3；或包含分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的contact cdr 1-3，或它们的组合。在一个实施方案中，特异性地和优先地结合糖基化的ctla-4的抗-glycctla-4抗体包含v
l
结构域，所述v
l
结构域包含分别具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的氨基酸序列的chothia、abm或kabat cdr1-3；或包含分别具有seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21的氨基酸序列的contact cdr 1-3，或它们的组合。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含v
l
结构域，所述v
l
结构域包含分别具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的氨基酸序列的chothia、abm或kabat cdr1-3；或包含分别具有seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21的氨基酸序列的contact cdr 1-3，或它们的组合。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体包含特定抗体或竞争对特定抗体的结合，所述特定抗体包含vh结构域且包含v
l
结构域，所述vh结构域包含分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的chothia cdr1-3；包含分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的abm cdr 1-3；包含分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的kabat cdr 1-3；或包含分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的contact cdr 1-3；所述v
l
结构域包含分别具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的氨基酸序列的chothia、abm或kabat cdr1-3；或包含分别具有seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21的氨基酸序列的contact cdr 1-3。优选地，vh和v
l
结构域具有相同类别的cdr，即，两者都具有chothia、abm、kabat或contact cdr。
[0086]
在其它实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体具有包含cdr h1、cdr h2和cdr h3的vh结构域，所述cdr h1、cdr h2和cdr h3具有在以下cdr中的1、2或3个中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序
列的cdr，或分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的cdr，或分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的cdr，或分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的cdr。所述抗-glycctla-4抗体可以具有v
l
结构域，其包含cdr l1、cdr l2和cdr l3，它们具有在1、2或3个cdr中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的氨基酸序列的cdr，或分别具有seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21的氨基酸序列的cdr。所述抗-glycctla-4抗体可以具有在vh和v
l
结构域二者的cdr中的氨基酸置换。在某些实施方案中，所述氨基酸置换是保守置换。
[0087]
优选地，前述抗体具有人框架区，即，是stc1807的人源化形式，且任选地，包含人恒定结构域，例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4的人恒定结构域。
[0088]
本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的cdr和/或框架区中做出一个或多个氨基酸置换以改善结合亲和力或其它参数。在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体与特定抗体竞争对糖基化的ctla-4的特异性结合，所述特定抗体包含上述的vh和v
l
结构域和在其中的cdr。在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4的kd小于相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd的一半。在实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4的kd小于相对于未糖基化的ctla-4所表现出的kd的一半。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4蛋白的kd是所述抗体与未糖基化的ctla-4的结合所表现出的kd的至多五分之一。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体结合糖基化的ctla-4蛋白的kd是所述抗体与未糖基化的ctla-4蛋白的结合所表现出的kd的至多十分之一。在一个实施方案中，在细胞流式细胞术结合测定中，所述抗体表现出的与表达wt ctla-4的细胞的结合(表示为绿色计数对象/mm2)是与表达未糖基化的ctla-4的细胞的结合的绿色计数对象/mm2的3倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍。在一个实施方案中，所述抗体是通过荧光标记或标志物直接或间接可检测的。在一个实施方案中，所述抗体用荧光标记或标志物(诸如fitc)直接标记。在一个实施方案中，stc1807 mab或其结合结构域或人源化或嵌合形式对糖基化的ctla-4的结合亲和力是0.1-13nm或0.1-5nm，包括下限值和上限值。在一个实施方案中，所述抗体抑制ctla-4与cd86的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd86的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体抑制ctla-4与cd80的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd80的相互作用。
[0089]
在一个实施方案中，所述抗体抑制cd86与ctla-4的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd86的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体抑制cd80与ctla-4的相互作用，且具体地抑制由效应t细胞表达的糖基化的ctla-4与由抗原呈递细胞表达的cd80的相互作用。
[0090]
另一个实施方案提供了一种分离的核酸分子，其分别编码抗-glycctla-4vh结构域和/或编码抗-glycctla-4抗体v
l
结构域，编码抗-glycctla-4vh结构域的核酸包含与seq id no:2具有至少90-98％同一性的核苷酸序列，编码抗-glycctla-4抗体v
l
结构域的核酸包含与seq id no:4具有至少90-98％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，编码vh和/或v
l
结构域的核苷酸序列分别与seq id no:2或seq id no:4具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
[0091]
下面表3提供了stc1807的重链和轻链可变结构域的核苷酸和氨基酸序列。
[0092]
表3.stc1807的重链和轻链可变结构域核苷酸和氨基酸序列
[0093][0094]
下面表4中提供了根据chothia、abm、kabat和contact cdr的stc1807抗体的cdr序列。因此，提供了stc1807的人源化形式，与包含移植进人框架区中的下面表4中的cdr的未糖基化的ctla-4相比，其优先结合糖基化的ctla-4。
[0095]
表4.stc1807的cdr序列
[0096][0097][0098]
在某些实施方案中，本文提供的抗-glycctla-4-1抗体可以是igg、igm、iga、igd或ige。抗-glycctla-4-1抗体还可以是嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体或人抗体。抗-glycclta-4抗体还可以是骆驼源化的抗体、胞内抗体、抗-独特型(抗-id)抗体。在某些实施方案中，抗-glycctla-4抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0099]
在某些实施方案中，本文提供的抗体是相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4的抗原结合片段。所述抗原结合片段可以是fd、fv、fab、f(ab’)、f(ab)2、f(ab’)2、f(ab)3、f(ab’)3、单链fv(scfv)、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体(minibody)或单结
构域抗体。scfv可以是单价scfv或二价scfv。
[0100]
通过已知方式和如本文中所述，可以产生多克隆或单克隆抗体、抗原结合片段和结合结构域和cdr(包括前述任何一种的工程化形式)，它们对糖基化的ctla-4、其各种表位中的一种或多种或前述任一种的缀合物是特异性的，无论这样的抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体。
[0101]
可以从任何动物来源生产抗体，包括禽类和哺乳动物。在某些实施方案中，所述抗体是羊、鼠(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。此外，较新的技术允许开发和从人组合抗体文库中筛选人抗体。例如，细菌噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫接种的情况下生产特异性抗体，如美国专利号6,946,546中所述，该专利特此通过引用整体并入。这些技术进一步描述于marks等人,bio/technol.,10:779-783(1992)；stemmer,nature,370:389-391(1994)；gram等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:3576-3580(1992)；barbas等人,proc.natl.acad.sci.usa,91:3809-3813(1994)；和schier等人,gene,169(2):147-155(1996)；它们特此通过引用整体并入。
[0102]
在各种动物物种中生产多克隆抗体的方法，以及生产各种类型的单克隆抗体(包括人源化、嵌合和全人单克隆抗体)的方法是本领域众所周知的。例如，以下美国专利提供了对这样的方法的有效描述，并通过引用并入本文：美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,196,265、4,275,149、4,277,437、4,366,241、4,469,797、4,472,509、4,606,855、4,703,003、4,742,159、4,767,720、4,816,567、4,867,973、4,938,948、4,946,778、5,021,236、5,164,296、5,196,066、5,223,409、5,403,484、5,420,253、5,565,332、5,571,698、5,627,052、5,656,434、5,770,376、5,789,208、5,821,337、5,844,091、5,858,657、5,861,155、5,871,907、5,969,108、6,054,297、6,165,464、6,365,157、6,406,867、6,709,659、6,709,873、6,753,407、6,814,965、6,849,259、6,861,572、6,875,434、6,891,024、7,407,659和8,178,098，它们特此通过引用整体并入。
[0103]
在某些实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体可以是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗-glycctla-4可以是多克隆抗体。可以给动物接种抗原，诸如糖基化的ctla-4多肽，以便生产对糖基化的ctla-4多肽特异性的抗体。抗原经常与另一种分子结合或缀合以增强免疫应答。缀合物可以是与用于在动物中引发免疫应答的抗原结合的任何肽、多肽、蛋白或非蛋白性物质。动物响应于抗原接种而产生的抗体具有多种不同的分子(多克隆抗体)，所述分子由多种单独的产生抗体的b淋巴细胞制成。在动物体内产生多克隆抗体的正确条件下，动物血清中的大多数抗体都能识别动物已免疫的抗原化合物上的集体表位。
[0104]
这种特异性可以通过亲和纯化进一步增强，以仅选择识别感兴趣的抗原或表位的那些抗体。生成单克隆抗体(mab)的方法可以与制备多克隆抗体的方法相同。在某些实施方案中，使用啮齿类动物诸如小鼠和大鼠产生单克隆抗体。在某些实施方案中，使用兔、绵羊或青蛙细胞产生单克隆抗体。大鼠的应用是众所周知的并且可以提供某些优点。常规使用小鼠(例如，balb/c小鼠)，并且通常提供高百分比的稳定融合物。
[0105]
杂交瘤技术涉及将先前用糖基化的ctla-4多肽免疫的小鼠的单个b淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞(经常是小鼠骨髓瘤)融合。该技术提供了一种方法，其将单个抗体生产细胞无限代繁殖，从而可以生产无限数目的在结构上相同的抗体，它们具有相同的抗原或表位特异性(单克隆抗体)。
[0106]
通过本领域已知的可用于生产多肽的任意方法，例如，体外合成、重组dna生产等，可以生产抗-glycctla-4抗体。可以通过重组dna技术生产人源化抗体。还可以使用重组免疫球蛋白表达技术生产本文所述的抗体。包括人源化抗体在内的免疫球蛋白分子的重组生产描述于美国专利号4,816,397(boss等人)、美国专利号6,331,415和4,816,567(二者授权给cabilly等人)、英国专利gb 2,188,638(winter等人)和英国专利gb 2,209,757；它们特此通过引用整体并入。免疫球蛋白(包括人源化的免疫球蛋白)的重组表达技术还可以参见goeddel等人,gene expression technology methods in enzymology第185卷academic press(1991),和borreback,antibody engineering,w.h.freeman(1992)；它们特此通过引用整体并入。关于重组抗体的产生、设计和表达的其它信息可以参见mayforth,designing antibodies,academic press,san diego(1993)。
[0107]
已经开发了用人来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域而使外源抗体的可变区保持完整的方法。备选地，在人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或大鼠中生产全人单克隆抗体。还已经开发了通过重组构建具有啮齿动物和人氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更加人形式的方法。在人源化的单克隆抗体中，只有高变cdr来源于非人(例如，小鼠、大鼠、鸡、美洲驼)单克隆抗体，且框架区来源于人氨基酸序列。有人认为，将抗体中啮齿类动物特有的氨基酸序列替换为在人抗体的相应位置发现的氨基酸序列将降低在治疗使用过程中发生不良免疫反应的可能性。生产抗体的杂交瘤或其它细胞也可能发生基因突变或其它变化，这可能改变或不改变由杂交瘤生产的抗体的结合特异性。
[0108]
通过使用单克隆抗体和其它抗体以及重组dna技术产生保留原始抗体的抗原或表位特异性的其它抗体或嵌合分子，即所述分子具有结合结构域，可以产生经工程改造的抗体。这样的技术可以涉及将编码免疫球蛋白可变区或抗体的cdr的dna引入到不同抗体的框架区、恒定区或恒定区加框架区的遗传物质。参见，例如，美国专利号5,091,513和6,881,557，它们通过引用并入本文。
[0109]
在某些实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体是人抗体。通过本领域已知的多种方法，包括上述噬菌体展示方法，其使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库(参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和国际公开号wo 98/46645、wo 98/50433、wo 98/24893、wo 98/16654、wo 96/34096、wo 96/33735和wo 91/10741)，可以制备人抗体。使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，可以生产人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。备选地，除了人重链和轻链基因之外，可以将人可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以单独地失去功能或随着通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座同时失去功能。特别是，jh区域的纯合缺失会阻止内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。使用常规方法用选定的抗原(例如，糖基化的ctla-4多肽的全部或部分)免疫转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术(参见，例如，美国专利号5,916,771)，可以从免疫的转基因小鼠获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在b细胞分化过程中重新排列，并随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这样的技术，可以生产治疗上有用的igg、iga、igm和ige抗体。关于用于生产人抗体的这种技术的概述，参见
lonberg和huszar(1995,int.rev.immunol.13:65-93，其通过引用整体并入本文)。关于用于生产人抗体和人单克隆抗体的该技术以及用于生产这样的抗体的方案的详细讨论，参见，例如，国际公开号wo 98/24893、wo 96/34096和wo 96/33735；和美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，它们通过引用整体并入本文。另外，诸如abgenix,inc.(freemont,calif.)和medarex(princeton,n.j.)等公司可以致力于使用与上述类似的技术提供针对选定抗原的人抗体。
[0110]
在一个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体，例如，包含来自非人供体的抗原结合序列的抗体，所述抗原结合序列移植到异源非人、人或人源化的序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)。在一个实施方案中，所述非人供体是大鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如，通过诱变(例如，人噬菌体文库的噬菌体展示筛选等)获得。在一个实施方案中，本文提供的嵌合抗体具有鼠v区域和人c区域。在一个实施方案中，所述鼠轻链v区域融合至人κ轻链。在一个实施方案中，所述鼠重链v区域融合至人igg1 c区域。
[0111]
生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，morrison,science229:1202(1985)；oi等人,biotechniques 4:214(1986)；gillies等人,j.immunol.methods 125:191-202(1989)；和美国专利号6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397；它们都特此通过引用整体并入。使用本领域已知的多种技术，包括例如cdr移植(ep 239,400；国际公开号wo 91/09967；和美国专利号5,225,539,5,530,101,和5,585,089)、覆盖或表面重建(ep 592,106；ep 519,596；padlan,molecular immunology 28(4/5):489-498(1991)；studnicka等人,protein engineering 7:805(1994)；和roguska等人,proc.natl.acad.sci.usa 91:969(1994))和链改组(美国专利号5,565,332)(它们都特此通过引用整体并入)，可以生产包含来自非人物种的一个或多个cdr和来自人免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体。
[0112]
用于生产重组嵌合抗-glycctla-4抗体的一种示例性方法可以包括以下：a)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该载体编码和表达抗体重链，其中鼠抗-glycctla-4单克隆抗体的cdr和可变区融合至来源于人免疫球蛋白的fc区，从而产生用于表达嵌合抗体重链的载体；b)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该载体编码和表达鼠抗-glycctla-4单克隆抗体的抗体轻链，从而产生用于表达嵌合抗体轻链的载体；c)通过常规分子生物学方法将表达载体转移到宿主细胞中以产生用于表达嵌合抗体的转染的宿主细胞；和d)通过常规细胞培养技术培养转染的细胞从而生产嵌合抗体。
[0113]
用于生产重组人源化抗-glycctla-4抗体的一种示例性方法可以包括以下：a)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该载体编码和表达抗体重链，其中保持供体抗体结合特异性所需的cdr和可变区框架的最小部分来源于非人免疫球蛋白，诸如鼠抗-glycctla-4单克隆抗体，且抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体重链的载体；b)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该载体编码和表达抗体轻链，其中保持供体抗体结合特异性所需的cdr和可变区框架的最小部分来源于非人免疫球蛋白，诸如鼠抗-glycctla-4单克隆抗体，且抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体轻链的载体；c)通过常规分子生物学方法将表达载体转移到宿主细胞中以产生用于表达人源化抗体的转染的宿主细胞；和d)通过常规细胞培养技术培养转染的细胞从而生产人源化抗体。
[0114]
对于任一种示例性方法，可以用这样的表达载体共转染宿主细胞，所述表达载体可以含有不同的选择标记，但是除了重链和轻链编码序列之外，优选是相同的。该程序提供了重链和轻链多肽的相等表达。备选地，可以使用编码重链和轻链多肽的单一载体。重链和轻链的编码序列可以包含cdna或基因组dna或两者。用于表达重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞诸如大肠杆菌，或更优选真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢(cho)细胞或hek-293细胞)。表达载体的选择取决于宿主细胞的选择，并且可以进行选择以在所选宿主细胞中具有期望的表达和调节特征。可以使用的其它细胞系包括、但不限于cho-k1、nso和per.c6(crucell,leiden,荷兰)。此外，当选择宿主细胞以考虑物种特异性密码子选择偏好和增强蛋白表达时，可以优化密码子使用。例如，对于cho细胞表达，编码抗体的dna可以掺入中国仓鼠(cricetulus griseus)(中国仓鼠卵巢细胞来源于此)优先使用的密码子。密码子优化方法可以用于促进期望的宿主细胞的改善表达(参见例如，wohlgemuth等人,philos.trans.r.soc.lond.b biol.sci.366(1580):2979-2986(2011)；jestin等人,j.mol.evol.69(5):452-457(2009)；bollenbach等人,genome res.17(4):401-404(2007)；kurland等人,prog.nucleic acid res.mol.biol.31:191-219(1984)；grosjean等人,gene 18(3):199-209(1982))。
[0115]
在一个实施方案中，所述抗体是免疫球蛋白单可变结构域，其来源于骆驼科抗体，优选重链骆驼科抗体，不具有轻链，它们被称作vhh结构域序列或nanobodies
tm
。nanobody
tm
(nb)是天然存在的单链抗体的最小功能片段或单可变结构域(vhh)，并且是本领域技术人员已知的。它们来源于在骆驼科动物中看到的仅重链抗体(hamers-casterman等人,nature 363:446-448(1993)；desmyter等人,nat.struct.biol.,803-811(1996))。在“骆驼科动物”家族中，发现了缺乏多肽轻链的免疫球蛋白。“骆驼科动物”包括旧世界骆驼科动物(双峰驼(camelus bactrianus)和单峰驼(camelus dromedarius))和新世界骆驼科动物(例如，小羊驼(lama paccos)、大羊驼(lama glama)、原驼(lama guanicoe)和瘦驼(lama vicugna))。单可变结构域重链抗体在本文中被命名为nanobody
tm
或vhh抗体。nb的小尺寸和独特的生物物理特性在识别不常见或隐藏的表位以及结合到蛋白靶标的腔体或活性部位方面优于常规抗体片段。此外，nb可以设计为多特异性和多价抗体，附着至报告分子，或人源化。nb是稳定的，可以耐受胃肠道系统，并且可以容易地制造。这样的实施方案可以包括结合glyc-ctla-4的单可变结构域抗体，其包含重链，所述重链包含cdr h1、cdr h2和cdr h3，所述cdr h1、cdr h2和cdr h3具有在以下cdr中的1、2或3个中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8的氨基酸序列的cdr，或分别具有seq id no:9、seq id no:10和seq id no:8的氨基酸序列的cdr，或分别具有seq id no:11、seq id no:12和seq id no:8的氨基酸序列的cdr，或分别具有seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15的氨基酸序列的cdr。
[0116]
通过将两种不同特异性的抗原结合位点统一到单个构建体中，双特异性抗体具有以极高特异性使两种离散抗原在一起的能力，并因此具有作为治疗剂的巨大潜力。双特异性抗体最初可以通过融合两种杂交瘤来制备，每种杂交瘤能够生产不同的免疫球蛋白。也可以通过连接两个scfv抗体片段同时省略存在于完整免疫球蛋白中的fc部分来生产双特异性抗体。这样的构建体中的每个scfv单元可以由抗体重链(vh)和轻链(v
l
)中的每一个的一个可变结构域组成，通过合成的多肽接头彼此连接，所述接头经常经过基因工程改造以
便具有最低限度的免疫原性，同时保持对蛋白酶解的最大抵抗力。可以通过多种技术连接各个scfv单元，包括掺入桥接两个scfv单元的短(通常少于10个氨基酸)多肽间隔物，从而产生双特异性单链抗体。因此，得到的双特异性单链抗体是在单个多肽链上包含两个具有不同特异性的vh/v
l
对的物质，其中各个scfv单元中的vh和v
l
结构域被多肽接头隔开，所述接头足够长以允许这两个结构域之间的分子内结合，并且其中由此形成的scfv单元通过多肽间隔物彼此连续连接，所述多肽间隔物保持足够短以防止不希望的缔合，例如在一个scfv单元的vh结构域和另一个scfv单元的v
l
之间的缔合。
[0117]
抗原结合片段的例子包括、但不限于：(i)fab片段，由v
l
、vh、c
l
和c
h1
结构域组成；(ii)由vh和c
h1
结构域组成的“fd”片段；(iii)由单个抗体的vl和vh结构域组成的“fv”片段；(iv)“dab”片段，其由vh结构域组成；(v)分离的cdr区；(vi)f(ab')2片段，包含两个连接的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(“scfv”)，其中vh结构域和v
l
结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合形成结合结构域；(viii)双特异性的单链fv二聚体(美国专利号5,091,513)；和(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公开号20050214860)。通过掺入连接vh和vl结构域的二硫键，可以稳定fv、scfv或双抗体分子。还可以制备具有与ch3结构域连接的scfv的微体(hu等人,cancer res.,56:3055-3061(1996))。
[0118]
在实施方案中也涵盖了抗体样结合肽拟似物。liu等人,cell mol.biol.,49:209-216(2003)描述了“抗体样结合肽拟似物”(abip)，它们是充当缩减(pared-down)抗体的肽并且具有更长的血清半衰期以及繁琐性较小的合成方法的某些优点。
[0119]
糖基化的ctla-4多肽
[0120]
在另一个实施方案中，提供了一种包含多肽的组合物，所述多肽包含人ctla-4的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，该片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化，其中所述多肽被配制在药学上可接受的承载体中。
[0121]
在某些实施方案中，本文还提供了人ctla-4的至少7个连续氨基酸的多肽，所述多肽具有至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化。在某些实施方案中，所述多肽具有人ctla-4的至少7个连续氨基酸，所述氨基酸具有被糖基化的与位置n113对应的氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽具有人ctla-4的至少7个连续氨基酸，所述氨基酸具有被糖基化的与位置n145对应的氨基酸。
[0122]
例如，所述多肽可以是人ctla-4的氨基酸107-114或110-116的片段，其中n113被糖基化。又例如，所述多肽可以是人ctla-4的氨基酸140-146或143-149的片段，其中n145被糖基化。又例如，所述多肽可以是人ctla-4的氨基酸112-146的片段，其中n113和n145被糖基化。
[0123]
在某些实施方案中，所述多肽具有人ctla-4的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽具有人ctla-4的至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270、280个连续氨基酸。在某些实
施方案中，本文提供了一种组合物，其具有本文提供的至少两种多肽。所述至少两种多肽可以是分开的分子或连接成一个分子。在某些实施方案中，所述组合物具有至少3种多肽、至少4种多肽或至少5种多肽。在某些实施方案中，所述组合物具有2种多肽、3种多肽、4种多肽或5种多肽。
[0124]
在某些实施方案中，本文提供的多肽包括非天然的氨基酸。在某些实施方案中，所述非天然的氨基酸在α-氨基基团处被甲基化以产生具有甲基化主链的肽。在某些实施方案中，所述非天然的氨基酸是r-氨基酸。在某些实施方案中，所述非天然的氨基酸可以包括染料(例如，荧光染料)或亲和标签。在某些实施方案中，本文提供的多肽包括化学修饰。化学修饰包括，例如，用生物素、荧光染料的化学修饰。熟练的技术人员会认识到，将非天然氨基酸引入多肽中和化学修饰多肽的方法是本领域众所周知的。
[0125]
在某些实施方案中，实施方案的多肽融合或缀合至免疫原性多肽(例如，钥孔血蓝蛋白，klh)。在某些方面，所述多肽进一步包含在c-或n-末端处的cys残基。例如，在某些方面，所述多肽通过在cys残基处的二硫键缀合至免疫原性多肽。
[0126]
在另一个实施方案中，本文提供了一种免疫原性组合物，其具有包含人ctla-4的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化，其中所述多肽被配制在药学上可接受的承载体中。在某些方面，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂，诸如明矾或弗氏佐剂。
[0127]
在某些实施方案中，提供了一种制备抗体的方法，其包括给动物施用多肽和从所述动物分离所述抗体，其中所述多肽具有人ctla-4的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段具有至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，且其中与人ctla-4的位置n113和n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化。所述动物可以是小鼠、大鼠、兔或人。在某些方面，一种方法进一步包括鉴定抗体的cdr和将所述cdr周围的序列人源化以产生人源化抗体。在其它方面，所述方法包括重组地表达人源化抗体。因而，在另一个实施方案中，提供了通过前述方法生产的分离的抗体。因而，在某些实施方案中，本文提供了一种分离的抗体，其相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合实施方案的多肽(例如，包含人ctla-4的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸，其中所述与人ctla-4的位置n113或n145对应的氨基酸中的至少一个被糖基化)。
[0128]
通过本领域已知的任何方法，可以制备本文提供的多肽。例如，可以通过化学合成或重组生产来制备多肽。用于表达和纯化重组多肽的示例性方法可以参见例如scopes r.k.,protein purification-principles and practice,springer advanced texts in chemistry,第3版(1994)；simpson r.j.等人,basic methods in protein purification and analysis:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,第1版(2008)；green m.r.和sambrook j.,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,第4版(2012)；jensen k.j.等人,peptide synthesis and applications(methods in molecular biology),humana press,第2版(2013)。使用本领域众所周知的方法可以完成多肽的化学合成(参见kelley和winkler,1990，见：genetic engineering principles and methods,setlow j.k,编,plenum press,n.y.,第12卷,第1-19页；stewart等人,1984,j.m.young,j.d.,solid phase peptide synthesis,
pierce chemical co.,rockford,ill；marglin和merrifield,ann.rev.biochem,39:841-866,862(1970).merrifield,r.b.,1963,j.am.chern.soc.85:2149-2154；chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins,williams等人,编,1997,crc press,boca raton fla.；solid phase peptide synthesis:a practical approach,atherton和sheppard,编,1989,irl press,oxford,england；也参见uspn.4,105,603；3,972,859；3,842,067；和3,862,925)。
[0129]
修饰和衍生物
[0130]
针对糖基化的ctla-4的抗体能够具有中和或抵消糖基化的ctla-4的作用的能力，而与动物物种、单克隆细胞系或抗体的其它来源无关。某些动物物种可能不太优选用于产生治疗性抗体，因为它们可能更可能造成变应性应答，这是由于通过抗体的fc部分对补体系统的活化。但是，完整抗体可以被酶促地消化成fc(补体结合)片段，以及具有结合结构域或cdr的抗体片段。fc部分的除去降低了抗体片段引发不希望的免疫学应答的可能性，且因此，没有fc的抗体可以用于预防性或治疗性治疗。如上所述，也可以将抗体构建为嵌合的、部分或完全人的，以减少或消除由于向动物施用已经在其它物种中生产或具有来自其它物种的序列的抗体而导致的不利免疫学后果。
[0131]
通过筛选表现出期望性能的变体，可以进一步改善抗-glycctla-4抗体的结合特性。例如，这样的改善可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来完成。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面，所述噬菌体颗粒携带编码它们的多核苷酸序列。在一个特定实施方案中，这样的噬菌体可以用于展示从库或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合片段，诸如fab和fv或二硫键稳定的fv。可以用抗原选择或鉴定噬菌体(所述噬菌体表达结合感兴趣的抗原的抗原结合片段)，例如，使用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠子的抗原进行。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和m13。抗原结合片段表达为与噬菌体基因iii或基因viii蛋白融合的重组融合蛋白。可以用于制备如本文所述的抗体或多肽的噬菌体展示方法的例子包括在以下文献中公开的那些：brinkman等人,j immunol methods,182:41-50(1995)；ames等人,j.immunol.methods,184:177-186(1995)；kettleborough等人,eur.j.immunol.,24:952-958(1994)；persic等人,gene,187:9-18(1997)；burton等人,adv.immunol.57:191-280(1994)；pct公开wo 92/001047、wo 90/02809、wo 91/10737、wo 92/01047、wo 92/18619、wo 93/11236、wo 95/15982、wo 95/20401；和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；它们都特此通过引用整体并入。
[0132]
如在以上参考文献中所述，在噬菌体选择以后，可以从噬菌体中分离抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人源化抗体，或任何其它期望的片段，并在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，例如，如在下面详细描述的。例如，使用本领域已知的方法，诸如在以下文献中公开的那些，也可以采用重组生产fab、fab
′
和f(ab
′
)2片段的技术：pct公开wo 92/22324；mullinax,r.l.等人,biotechniques,12(6):864-869(1992)；和sawai等人,am.j.reprod.immunol.34:26-34(1995)；和better,m.等人.science 240:1041-1043(1988)；它们都特此通过引用整体并入。可以用于生产单链fv和抗体的技术的例子包括在以下文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；
huston,j.s.等人,methods in enzymology203:46-88(1991)；shu,l.等人,proc.natl.acad.sci.(usa)90:7995-7999；和skerra.a.等人,science 240:1038-1040(1988)；它们都特此通过引用整体并入。
[0133]
如本文所述，噬菌体展示技术可以用于增加抗-glycctla-4抗体的亲和力。该技术可以用于获得可用于本文所述的组合方法中的高亲和力抗体。被称作亲和力成熟的这种技术采用诱变或cdr行走(cdr walking)和重新选择，其中使用这样的受体或配体(或其细胞外结构域)或其抗原片段来鉴定与初始或亲本抗体相比以更高亲和力结合抗原的抗体(参见，例如，glaser,s.m.等人,j.immunol.149:3903-3913(1992))。诱变处理整个密码子而不是单个核苷酸会导致氨基酸突变的半随机库。可以从一组变体克隆构建文库，每种变体克隆的不同之处在于单个cdr中的单个氨基酸改变，并且其含有代表每个cdr残基的每种可能氨基酸置换的变体。通过使固定化的突变体与标记的抗原接触，可以筛选对抗原具有增加的结合亲和力的突变体。本领域已知的任何筛选方法可以用于鉴定对抗原具有增加的亲合力(avidity)的突变抗体(例如，elisa)(参见，例如，wu,h.等人,proc.natl.acad.sci.(usa)95(11):6037-6042(1998)；yelton,d.e.等人,j.immunol.155:1994-2004(1995)。也可以使用随机化轻链的cdr行走(参见schier等人,j.mol.biol.263:551-567(1996))。
[0134]
随机诱变可以与噬菌体展示方法一起使用，以鉴定改进的cdr和/或可变区。噬菌体展示技术可以备选地用于通过定向诱变(例如，亲和力成熟或“cdr行走”)增加(或降低)cdr亲和力。该技术使用靶抗原或其抗原片段来鉴定这样的抗体：其具有与初始抗体或亲本抗体相比以更高(或更低)的亲和力结合抗原的cdr(参见，例如，glaser,s.m.等人,j.immunol.149:3903-3913(1992))。
[0135]
用于实现这样的亲和力成熟的方法描述于例如：krause,j.c.等人,mbio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mbio.00345-10(2011)；kuan,c.t.等人,int.j.cancer 10.1002/ijc.25645；hackel,b.j.等人,j.mol.biol.401(1):84-96(2010)；montgomery,d.l.等人,mabs 1(5):462-474(2009)；gustchina,e.等人,virology 393(1):112-119(2009)；finlay,w.j.等人,j.mol.biol.388(3):541-558(2009)；bostrom,j.等人,methods mol.biol.525:353-376(2009)；steidl,s.等人,mol.immunol.46(1):135-144(2008)；和barderas,r.等人,proc.natl.acad.sci.(usa)105(26):9029-9034(2008)；它们都特此通过引用整体并入。
[0136]
本文还提供了抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽的衍生物，其相对于“亲本”(或野生型)分子具有1、2、3、4、5个或更多个氨基酸置换、添加、缺失或修饰。这样的氨基酸置换或添加可以引入天然存在的(即，dna编码的)或非天然存在的氨基酸残基。这样的氨基酸可以被糖基化(例如，具有改变的甘露糖、2-n-乙酰基葡糖胺、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-n-乙酰基神经氨酸、5-羟乙酰神经氨酸等含量)、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接至细胞配体或其它蛋白等。在某些实施方案中，改变的碳水化合物修饰调节以下一项或多项：抗体的溶解，抗体的亚细胞转运和分泌的促进，抗体组装的促进，构象完整性，和抗体介导的效应子功能。在某些实施方案中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子功能。导致改变的抗体介导的效应子功能的碳水化合物修饰是本领域众所周知的(例如，参见shields,r.l.等人,j.biol.chem.277(30):26733-26740(2002)；davies j.等
人.biotechnology&bioengineering 74(4):288-294(2001)；它们都特此通过引用整体并入)。改变碳水化合物含量的方法是本领域技术人员已知的，参见，例如，wallick,s.c.等人,j.exp.med.168(3):1099-1109(1988)；tao,m.h.等人,j.immunol.143(8):2595-2601(1989)；routledge,e.g.等人,transplantation60(8):847-53(1995)；elliott,s.等人,nature biotechnol.21:414-21(2003)；shields,r.l.等人,j.biol.chem.277(30):26733-26740(2002)；它们都特此通过引用整体并入。
[0137]
置换变体可以含有在本文提供的抗体或多肽内的一个或多个位点处的一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以被设计为调节抗体或多肽的一种或多种性质，具有或不具有其它功能或性能的丧失。置换可以是保守的，即一个氨基酸被一个具有相似形状和电荷的氨基酸替换。保守置换是本领域众所周知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸,亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。备选地，置换可以是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守变化通常涉及用化学上不同的残基置换一个残基，诸如用极性的或带电荷的氨基酸置换非极性的或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
[0138]
在某些实施方案中，抗体可以包含如表4中所列的第一组cdr，但在另一组或所有其它cdr组中不保守的残基处具有置换(例如，保守置换)。例如，抗体可以包含abm、kabat或contact组的cdr，但在cdr2序列(seq id no:10、12或14)内在与chothia-型cdr2序列(seq id no:7)中的那些不对应的残基处具有一个或多个置换。类似地，seq id no:18上的尾随残基可以被置换，例如用保守置换。类似地，seq id no:20上的残基1-4可以被置换，例如用保守置换。这些只是几个示例，但普通技术人员可以理解可以基于表4中所示的内容做出哪些置换。
[0139]
在某些实施方案中，具有第一组cdr(例如，chothia、abm、kabat和contact)的抗体可以包含具有一个或多个氨基酸置换的框架区，所述氨基酸置换使得一个或多个置换的残基与第二组cdr在相应位置一致(如通过序列比对和/或根据kabat编号所评估的)，所述第二组cdr具有在第一组cdr中不存在的前导(即，n端)或尾随(即，c端)残基。例如，与重链的contact-型cdr2的c端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:12的氨基酸序列(kabat-型cdr2)的尾随残基12-18中的一个或多个。类似地，在某些实施方案中，与重链的abm-型cdr2的c端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:12的氨基酸序列(kabat-型cdr2)的尾随残基11-18中的一个或多个。在某些实施方案中，与重链的chothia-型cdr2的c端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:12的氨基酸序列(kabat-型cdr2)的尾随残基8-18中的一个或多个。在某些实施方案中，与轻链的chothia-、abm-或kabat-型cdr1的c端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:19的氨基酸序列(contact-型cdr1)的尾随残基5-6中的一个或多个。在某些实施方案中，与重链的kabat-或abm-型cdr2的n端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:14的氨基酸序列(contact-型cdr2)的前导残基1-3中的一个或多个。在某些实施方
案中，与重链的chothia-型cdr2的n端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:14的氨基酸序列的前导残基1-5中的一个或多个。在某些实施方案中，与重链的chothia-、abm-或kabat-型cdr3的n端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:15的氨基酸序列(contact型cdr3)的前导残基1-2中的一个或多个。在某些实施方案中，与轻链的chothia-、abm-或kabat-型cdr2的n端末端邻近的框架区具有置换的残基，其对应于seq id no:20的氨基酸序列(contact-型cdr2)的前导残基1-4中的一个或多个。
[0140]
在某些实施方案中，人源化抗体是衍生抗体。这样的人源化抗体包括在一个或多个非人cdr中的氨基酸残基置换、缺失或添加。与非衍生人源化抗体相比，人源化抗体衍生物可以具有基本上相同的结合、更好的结合或更差的结合。在某些实施方案中，cdr的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基已经被突变，诸如置换、缺失或添加。
[0141]
在某些实施方案中，多肽是衍生多肽。与野生型人ctla-4相比，这样的多肽包括氨基酸残基置换、缺失或添加。与非衍生多肽相比，衍生多肽可以具有基本上相同的与抗-glycctla-4抗体的结合、更好的结合或更差的结合。在某些实施方案中，人ctla-4的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基已经被突变，诸如置换、缺失或添加。
[0142]
使用本领域技术人员已知的技术，包括、但不限于特异性化学裂解、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成等，可以通过化学修饰来修饰如本文所述的抗体或多肽。在一个实施方案中，衍生多肽或衍生抗体具有与亲本多肽或抗体相似或相同的功能。在另一个实施方案中，衍生多肽或衍生抗体表现出相对于亲本多肽或亲本抗体改变的活性。例如，衍生抗体(或其片段)可以比亲本抗体更紧密地结合其表位或更耐受蛋白酶解。
[0143]
衍生化的抗体中的置换、添加或缺失可以是在抗体的fc区中，并从而可以用来改变抗体对一种或多种fcγr的结合亲和力。用于修饰抗体(其具有改变的与一种或多种fcγr的结合)的方法是本领域已知的，参见，例如，pct公开号wo 04/029207、wo 04/029092、wo 04/028564、wo 99/58572、wo 99/51642、wo 98/23289、wo 89/07142、wo 88/07089和美国专利号5,843,597和5,642,821；它们都特此通过引用整体并入。在某些实施方案中，所述抗体或其它分子可以具有改变的对活化fcγr(例如，fcγriiia)的亲和力。优选地，这样的修饰还具有改变的fc介导的效应子功能。影响fc介导的效应子功能的修饰是本领域众所周知的(参见美国专利号6,194,551和wo 00/42072)。在某些实施方案中，fc区的修饰导致抗体具有改变的抗体介导的效应子功能、改变的与其它fc受体(例如，fc活化受体)的结合、改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)活性、改变的c1q结合活性、改变的补体依赖性的细胞毒性活性(cdc)、吞噬活性或其任何组合。
[0144]
衍生抗体或多肽也可以在哺乳动物、优选人中具有改变的亲本分子或抗体的半衰期(例如，血清半衰期)。在某些实施方案中，这样的改变导致大于15天、优选地大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月的半衰期。人源化抗体或多肽在哺乳动物、优选人中增加的半衰期，导致所述抗体或多肽在哺乳动物中的更高血清滴度，并因此降低了所述抗体或多肽的施用频率和/或降低了要施用的所述抗体或多肽的浓度。通过本领域技术人员已知的技术，可以产生具有增加的体内半衰期的抗体或多肽。例如，通过修饰(例如，置换、缺失或添加)被鉴定为参与fc结构域和fcrn受体之间的相互作用的氨基酸残基，可以产生具有增加的体内半衰期的抗体或多肽。可以工程改造如本文所述的人源化抗体以增加生物学半衰期(参见，例如美国专利
号6,277,375)。例如，如本文所述的人源化抗体可以在fc-铰链结构域中进行工程改造以具有增加的体内或血清半衰期。
[0145]
通过向所述抗体或多肽连接聚合物分子诸如高分子量聚乙二醇(peg)，可以产生本文所述的具有增加的体内半衰期的抗体或多肽。peg可以用或不用多功能接头连接至抗体或多肽，无论是通过peg与所述分子或抗体的n-或c端的位点特异性缀合，还是通过在赖氨酸残基上存在的ε-氨基。可以使用导致最小生物活性损失的直链或支链聚合物衍生化。可以通过sds-page和质谱法密切监测缀合程度，以确保peg分子与抗体的适当缀合。通过例如尺寸排阻或离子交换色谱法，可以从抗体-peg缀合物分离未反应的peg。
[0146]
如本文所述的抗体或多肽也可以通过davis等人描述的方法和偶联剂(参见美国专利号4,179,337)进行修饰，以提供可以注射到哺乳动物循环系统中而基本上没有免疫原性应答的组合物。fc部分的除去可以降低抗体片段引发不希望的免疫学应答的可能性，且因此，不含fc的抗体可以用于预防性或治疗性治疗。如上所述，也可以将抗体构建为嵌合的、部分或全人的，从而减少或消除由于向动物施用已经在其它物种中生产或具有来自其它物种的序列的抗体而导致的不利免疫学后果。
[0147]
融合体和缀合物
[0148]
本文提供的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽也可以表达为与其它蛋白的融合蛋白或化学缀合至另一个部分。
[0149]
在某些实施方案中，本文提供了具有fc部分的抗体或多肽，其中fc部分可以因同种型或亚类而不同，可以是嵌合的或杂合的，和/或可以被修饰，例如以改善效应子功能、半衰期控制、组织可达性、增强生物物理学特征(诸如稳定性)和提高生产效率(并且成本更低)。许多可用于构建公开的融合蛋白的修饰和制备它们的方法是本领域已知的，参见例如mueller,j.p.等人,mol.immun.34(6):441-452(1997),swann,p.g.,curr.opin.immun.20:493-499(2008)，和presta,l.g.,curr.opin.immun.20:460-470(2008)。在某些实施方案中，所述fc区是天然igg1、igg2或igg4 fc区。在某些实施方案中，所述fc区是杂合体，例如具有igg2/igg4 fc恒定区的嵌合体。对fc区的修饰包括、但不限于修饰igg4以防止与fcγ受体和补体结合，修饰igg1以改善与一种或多种fcγ受体的结合，修饰igg1以最小化效应子功能(氨基酸变化)，具有改变的聚糖/无聚糖的igg1(通常通过改变表达宿主)，以及具有改变的ph依赖性的与fcrn的结合的igg1。fc区可以包括整个铰链区，或小于整个铰链区。
[0150]
另一个实施方案包括igg2-4杂合体和igg4突变体，它们与fcr的结合减少，从而增加了它们的半衰期。代表性的ig2-4杂合体和igg4突变体描述于angal等人,molec.immunol.30(1):105-108(1993)；mueller等人,mol.immun.34(6):441-452(1997)；和美国专利号6,982,323；它们都特此通过引用整体并入。在某些实施方案中，缺失了igg1和/或igg2结构域，例如，angal等人描述了丝氨酸241被脯氨酸替换的igg1和igg2。
[0151]
在某些实施方案中，本文提供了具有至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的融合蛋白或多肽。
[0152]
在某些实施方案中，本文提供了与至少一个部分连接或共价结合或形成复合物的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽。这样的部分可以是、但不限于增加分子作为诊断剂或治疗剂的功效的部分。在某些实施方案中，所述部分可以是成像剂、毒素、治疗酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。
[0153]
在某些实施方案中，所述部分可以是酶、激素、细胞表面受体、毒素(诸如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白a、假单胞菌外毒素(即，pe-40)、白喉毒素、蓖麻蛋白、白树毒素或美洲商陆抗病毒蛋白)、蛋白(诸如肿瘤坏死因子、干扰素(例如，α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织型纤溶酶原激活物或细胞凋亡剂(例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β))、生物应答调节剂(诸如，例如，淋巴因子(例如，白介素-1(“il-1”)、白介素-2(“il-2”)、白介素-6(“il-6”))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒细胞集落刺激因子(“g-csf”)或巨噬细胞集落刺激因子、(“m-csf”))或生长因子(例如，生长激素(“gh”)))、细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂，诸如紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)、单甲基澳瑞他汀e(mmae；例如，维汀(vedotin))和嘌呤霉素及其类似物或同系物)、抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、thioepa chlorambucil、美法仑、(卡莫司汀；bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素c和顺式二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、普卡霉素和安曲霉素(amc))或抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
[0154]
用于将这样的治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的；参见，例如，amon等人,“monoclonal antibodies for immunotargeting of drugs in cancer therapy”，见monoclonal antibodies and cancer therapy,reisfeld等人(编),1985,第243-56页,alan r.liss,inc.)；hellstrom等人,“antibodies for drug delivery”，见controlled drug delivery(第2版),robinson等人(编),1987,第623-53页,marcel dekker,inc.)；thorpe,“antibody carriers of cytotoxic agents in cancer therapy:a review”，见monoclonal antibodies'84:biological and clinical applications,pinchera等人(编),1985,第475-506页)；“analysis,results,and future prospective of the therapeutic use of radiolabeled antibody in cancer therapy”，见monoclonal antibodies for cancer detection and therapy,baldwin等人(编),1985,第303-16页,academic press；thorpe等人,immunol.rev.62:119-158(1982)；carter等人,cancer j.14(3):154-169(2008)；alley等人,curr.opin.chem.biol.14(4):529-537(2010)；carter等人,amer.assoc.cancer res.educ.book.2005(1):147-154(2005)；carter等人,cancer j.14(3):154-169(2008)；chari,acc.chem res.41(1):98-107(2008)；doronina等人,nat.biotechnol.21(7):778-784(2003)；ducry等人,bioconjug chem.21(1):5-13(2010)；senter,curr.opin.chem.biol.13(3):235-244(2009)；和teicher,curr cancer drug targets.9(8):982-1004(2009)。澳瑞他汀e)(mmae)，例如，维汀(vedotin)；或它们的组合。
[0155]
在优选的实施方案中，所述抗体缀合至美坦辛，美坦辛是最初从埃塞俄比亚灌木美登木(maytenus ovatus)的树皮分离的苯并桥环大环内酯。这种细胞毒性剂及其衍生物(例如，拟美坦辛)结合在长春花生物碱结合位点附近的微管蛋白。它们被认为对位于微管末端的微管蛋白具有高亲和力，而对分布在整个微管中的位点具有较低的亲和力。微管动
力学的抑制导致细胞停滞在细胞周期的g2/m期，最终导致细胞因凋亡而死亡(oroudjev等人,mol.cancer ther.,10l2700-2713(2010))。两种美坦辛衍生物(含硫醇的拟美坦辛)包括dm1和dm4(immunogen，inc.，waltham，ma)，其已经广泛与不可逆的和可逆的接头组合使用。具体地，用硫醚接头连接至抗体的dm1被称为“emtansine”；用spp接头连接至抗体的dm1被称为“美坦辛(mertansine)”。用spdb接头连接的dm4被称为“ravtansine”；且用sspdb接头连接的dm4被称为“soravtansine”(immunogen,inc.,waltham,ma)。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体-adc包含作用于微管蛋白的拟美坦辛有效负载dm1。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体-adc包含作用于微管蛋白的拟美坦辛有效负载dm4。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体-adc包含作用于dna的有效负载，例如，dgn462(immunogen,inc.,waltham,ma)。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体-adc的抗-glycctla-4抗体组分是stc1807的嵌合或人源化形式或其结合部分。在一个实施方案中，所述抗-glycctla-4抗体-adc的抗-glycctla-4抗体组分是stc1807的嵌合或人源化形式或其结合部分。
[0156]
在一个特定实施方案中，缀合至抗-glycctla-4抗体的细胞毒性剂是mmae(单甲基澳瑞他汀e(或去甲基-澳瑞他汀e))，一种高毒性的抗肿瘤剂，其抗有丝分裂活性涉及通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。维汀(vedotin)(一个国际非专有名称)表示在mmae-抗体缀合物中的mmae及其与抗体的连接结构。在更具体的实施方案中，adc是stc1807(嵌合或人源化形式)-mmae或stc1807(嵌合或人源化形式)-mmae。
[0157]
许多化学接头是已知的并且用于将细胞毒性的或作用于dna的药物有效负载与抗体缀合以产生adc。被包含用于生产包含抗-glycctla-4抗体的adc(具体地，如本文所述在结合其靶标后内化的那些)的某些接头(单独或联合使用的)包括smcc(4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯)；spdb(n-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)；spp(n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯)；磺基-spdb或sspdb(n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯)；硫醚接头琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(mcc)；和vc(缬氨酸-瓜氨酸二肽接头)。作为例子，经工程改造的接头(例如，smcc、spdb、s-spdb)(immunogen,inc.)已被设计为在adc与肿瘤结合之前保持稳定，并且然后在acd被内化到癌细胞内后优化有效负载功效。其它接头，诸如二肽vc接头(它是一种组织蛋白酶可切割的接头)，可以用于将抗体缀合至细胞毒性剂，诸如澳瑞他汀，它是一种从多拉司他汀10衍生出的有丝分裂抑制剂，例如，单甲基澳瑞他汀e(mmae)，例如，维汀。细胞毒素可以与抗体缀合，使得多于一个的毒素分子连接到每个抗体分子上，例如，平均而言，每个抗体可以有2、3、4、5、6、7或8个毒素分子。
[0158]
在一个特定实施方案中，mmae通过马来酰亚胺基己酰基(mc)连接基团与抗体半胱氨酸间接连接，所述连接基团与缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄氧基羰基-mmae(mc-vc-pab-mmae)偶联。在“mc-vc-pab-mmae”线性结构中，“mc”由马来酰亚胺和己酸组成，且是与抗体连接的部分，通常通过h链上的半胱氨酸基团连接。反过来，“mc”连接到由缬氨酸(val)和瓜氨酸(cit)组成的“vc”接头，且该接头是组织蛋白酶可切割的接头，其在肿瘤或癌细胞内被组织蛋白酶切割。“vc”连接到间隔物“pab”，即对氨基苯甲酸，mmae细胞毒素与其连接。mc-vc-pab-mmae adc在被蛋白酶诸如组织蛋白酶b切割时释放游离的、膜可渗透的mmae。在一个实施方案中，与抗体的接头在细胞外液中是稳定的，但一旦adc进入肿瘤或癌细胞就被组
织蛋白酶切割，从而活化mmae或其它毒素药物的抗有丝分裂机制。在另一个实施方案中，单甲基澳瑞他汀f(mmaf)通过马来酰亚胺基己酰基与抗体半胱氨酸连接(mc-mmaf)。与mc-vc-pab-mmae adc相比，mc-mmaf adc与mcc-dm1 adc一样是不可切割的，并且必须内化和在细胞内降解，在细胞内释放半胱氨酸-mc-mmaf作为活性药物。
[0159]
在一个实施方案中，所述细胞毒性的有效负载在adc内化到细胞中后在溶酶体中释放。在溶酶体中，溶酶体酶消化adc的抗体组分。在溶酶体降解后，药物(和药物-接头)有效负载被释放到细胞质中，在那里药物与细胞内靶标结合，最终导致细胞死亡。最佳的是，在接头仍然连接着的情况下，释放的有效负载是完全有活性的。在与adc结合的靶标导致向溶酶体的运输不良的其它实施方案中，在靶细胞外稳定但一旦进入细胞就将有效负载从抗体组分上切割下来的接头提供了在细胞内、但在溶酶体之外释放有效负载的替代模式。在其它实施方案中，所述接头在细胞外液中是稳定的，但是一旦adc进入肿瘤或癌细胞就被组织蛋白酶切割，从而活化毒素药物的抗有丝分裂或其它细胞毒性机制。在其它实施方案中，通过可切割接头的作用释放的有效负载能够进入相邻的癌细胞并通过旁观者效应(bystander effect)杀死它们，从而增强adc的靶向和肿瘤杀死活性。
[0160]
在某些实施方案中，本文所述的抗体和多肽可以缀合至标志物，诸如肽，以促进纯化。在某些实施方案中，所述标志物是：六组氨酸肽；血凝素“ha”标签(seq id no:22:ypydvpdya)，其对应于从流感血凝素蛋白衍生出的表位(wilson,i.a.等人,cell,37:767-778(1984))；或“flag”标签(knappik,a.等人,biotechniques 17(4):754-761(1994))。
[0161]
在某些实施方案中，所述部分可以是可在测定中检测到的成像剂。这样的成像剂可以是酶、辅基、放射性标记、非放射性的顺磁金属离子、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、生物发光分子、光亲和性分子、有色颗粒或配体，诸如生物素。
[0162]
在某些实施方案中，所述酶包括、但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；所述辅基复合物包括、但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；所述荧光材料包括、但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰基氯或藻红蛋白；所述发光材料诸如，但不限于鲁米诺；所述生物发光材料包括、但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；所述放射性物质包括、但不限于铋(
213
bi)、碳(
14
c)、铬(
51
cr)、钴(
57
co)、氟(
18
f)、钆(
153
gd、
159
gd)、镓(
68
ga、
67
ga)、锗(
68
ge)、钬(
166
ho)、铟(
115
in、
113
in、
112
in、
111
in)、碘(
131
i、
125
i、
123
i、
121
i)、镧(
140
la)、镥(
177
lu)、锰(
54
mn)、钼(
99
mo)、钯(
103
pd)、磷(
32
p)、镨(
142
pr)、钷(
149
pm)、铼(
186
re、
188
re)、铑(
105
rh)、钌(
97
ru)、钐(
153
sm)、钪(
47
sc)、硒(
75
se)、锶(
85
sr)、硫(
35
s)、锝(
99
tc)、铊(
201
ti)、锡(
113
sn、
117
sn)、氚(3h)、氙(
133
xe)、镱(
169
yb、
175
yb)、钇(
90
y)、锌(
65
zn)；使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属和非放射性的顺磁金属离子。
[0163]
使用本领域已知的技术可以将成像剂直接地或通过中间体(例如，本领域已知的接头)间接地缀合至本文提供的抗体或多肽。关于可以缀合至抗体的金属离子和用于用作诊断剂的本文所述的其它分子，参见，例如，美国专利号4,741,900。一些缀合方法涉及使用金属螯形络合物，采用，例如，有机螯合剂诸如二亚乙基三胺五乙酸酸酐(dtpa)；乙三胺四乙酸；n-氯-对甲苯磺酰胺；和/或与抗体连接的四氯-3-6α-二苯基甘脲-3。单克隆抗体也可以在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应，可以制备具有荧光素标志物的缀合物。
[0164]
在某些实施方案中，如本文所述的抗体或多肽可以与第二抗体缀合以形成如segal在美国专利号4,676,980中描述的抗体异源缀合物。这样的异源缀合物抗体可以另外结合半抗原(例如，荧光素)或细胞标志物(例如，4-1-bb、b7-h4、cd4、cd8、cd14、cd25、cd27、cd40、cd68、cd163、ctla4、gitr、lag-3、ox40、tim3、tim4、tlr2、light、icos、b7-h3、b7-h7、b7-h7cr、cd70、cd47)或细胞因子(例如，il-7、il-15、il-12、il-4tgf-β、il-10、il-17、ifnγ、flt3、blys)或趋化因子(例如，ccl21)。
[0165]
在某些实施方案中，本文所述的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽也可以附着于固体支持物，其可以用于免疫测定或靶抗原或其它分子的纯化，所述其它分子能够结合已经被固定在支持物上的靶抗原(通过结合本文所述的抗体或抗原结合片段)。这样的固体支持物包括、但不限于：玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
[0166]
蛋白纯化
[0167]
蛋白纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术在一个层面上涉及将细胞、组织或器官均质化和粗分离成多肽和非多肽级分。除非另外指出，否则可以使用色谱和电泳技术进一步纯化感兴趣的蛋白或多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、反相色谱法、羟磷灰石色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱法、免疫亲和色谱法和等电聚焦。纯化肽的一种特别有效的方法是快速液相色谱法(fplc)或甚至高效液相色谱法(hplc)。如本领域公知的，据信可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备基本上纯化的多肽的合适方法。
[0168]
纯化的多肽意图表示可与其它组分分离的组合物，其中所述多肽被纯化至相对于其天然可获得状态的任何程度。因此，分离的或纯化的多肽也表示脱离其可能天然存在的环境的多肽。通常，“纯化的”表示已经进行分级分离以除去各种其它组分的多肽组合物，并且该组合物基本上保留了其表达的生物活性。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称将表示一种组合物，其中多肽形成组合物的主要组分，例如占在组合物中的蛋白的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
[0169]
鉴于本公开内容，本领域技术人员已知用于量化多肽纯化程度的各种方法。这些包括，例如，确定活性级分的比活性，或通过sds/page分析评估级分内多肽的量。用于评估级分纯度的优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行对比，并从而计算其中的纯度，通过“纯化倍数”进行评估。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于所选择的在纯化后进行的特定测定技术，以及表达的多肽是否表现出可检测的活性。
[0170]
通常不要求多肽总是以其最纯化的状态提供。实际上，考虑到基本纯化程度较低的产品在某些实施方案中可能具有实用性。通过组合使用更少的纯化步骤，或通过使用相同一般纯化方案的不同形式，可以完成部分纯化。例如，应当理解，使用hplc设备进行的阳离子交换柱色谱法通常导致比使用低压色谱系统的相同技术更大的“倍数”纯化。表现出较低相对纯化程度的方法可以在蛋白产物的总回收率或保持表达的蛋白的活性方面具有优势。
[0171]
亲和色谱法是一种依赖于待分离物质与它可以特异性结合的分子之间的特异性亲和力的色谱程序。这是一种受体-配体类型的相互作用。通过将结合配偶体之一共价偶联
到不溶性基质上来合成柱材料。然后柱材料能够从溶液中特异性地吸附物质。通过将条件更改为不会发生结合的条件(例如，改变的ph、离子强度、温度等)，发生洗脱。基质应该是一种不会以任何显著程度吸附分子并且具有宽的化学、物理和热稳定性范围的物质。配体应该以不影响其结合特性的方式偶联。配体还应该提供相对紧密的结合。应该可能在不破坏样品或配体的情况下洗脱物质。
[0172]
尺寸排阻色谱法(sec)是一种色谱方法，其中将溶液中的分子基于其尺寸或用更专业的术语是基于其流体动力学体积进行分离。它通常应用于大分子或大分子复合物，诸如蛋白和工业聚合物。通常，当使用水溶液将样品输送穿过色谱柱时，该技术称为凝胶过滤色谱法，而当使用有机溶剂作为流动相时，使用名称凝胶渗透色谱法。sec的基本原理是，不同尺寸的颗粒将以不同的速率穿过固定相洗脱(过滤)。这导致基于尺寸的颗粒溶液的分离。假如所有颗粒同时或几乎同时加载，相同尺寸的颗粒应该一起洗脱。
[0173]
高效液相色谱法(或高压液相色谱法，hplc)是柱色谱法的一种形式，常用于生物化学和分析化学中用于分离、鉴定和量化化合物。hplc使用装有色谱填料(固定相)的柱、使一个或多个流动相移动穿过柱的泵和显示分子的保留时间的检测器。保留时间随固定相、被分析分子和所用的一种或多种溶剂之间的相互作用而异。
[0174]
本文还提供了一种用于评估ctla-4糖基化、n-连接的糖基化或n-糖基化的方法，包括使含有ctla-4的样品与实施方案的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的ctla-4选择性地结合糖基化的ctla-4)接触。在某些方面，所述方法是体外方法。在某些方面，所述样品是细胞样品。
[0175]
核酸
[0176]
本公开内容还涵盖编码本文所述的任何抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽的核酸分子(dna或rna)。本文还提供了载体分子(诸如质粒)，其被构造成传输或复制这样的核酸分子。核酸可以是单链的、双链的，并且可以含有单链的和双链的部分。
[0177]
药物制剂
[0178]
在进行含有抗体的药物组合物的临床应用时，制备适合预期应用的药物或治疗组合物通常是有益的。通常，药物组合物可以具有有效量的本文所述的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽，或具有溶解或分散在药学上可接受的承载体中的另外药剂。
[0179]
本文还提供了组合物，其具有本文所述的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽。在某些实施方案中，所述组合物可以具有至少0.1重量％的抗体或多肽。在某些实施方案中，所述组合物可以具有按重量计至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽。在其它实施方案中，例如，抗-glycctla-4或糖基化的ctla-4多肽可以占组合物重量的约2％至约75％、约25％至约60％、约30％至约50％，或其中的任何范围。在每种治疗上有用的组合物中的一种或多种活性化合物的量可以以这样的方式制备，使得在化合物的任何给定单位剂量中都将获得合适的剂量。制备这类药物制剂的本领域技术人员将考虑多种因素，诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品贮存期限、以及其它药理学考虑因素，且因此，可能有多种剂量和治疗方案是合乎需要的。
[0180]
所述组合物可以是具有作为活性成分的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多
肽以及药学上可接受的承载体的药物组合物。所述药物组合物可以进一步包括一种或多种额外的活性成分。药学上可接受的承载体可以是被美国联邦或州政府的管理机构批准、或在美国药典、欧洲药典或其它普遍公认的药典中列出用于动物且更特别是人类的承载体。
[0181]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“承载体”表示与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、赋形剂、稳定剂或媒介物。“药学上可接受的承载体”是在所采用的剂量和浓度对暴露于它的细胞或哺乳动物无毒的承载体，其可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的分子实体或组合物在适当地施用给动物例如人时不会产生不利的、变应性的或其它不良的反应。鉴于本公开内容，具有抗体或额外活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员已知的，如remington's pharmaceutical sciences,第18版,1990所示例，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应该理解，制剂应满足fda生物标准办公室要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
[0182]
考虑组合物包括每毫升(ml)约0.001mg至约10mg的总抗体或多肽。因此，组合物中抗体或多肽的浓度可以为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或其中可导出的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％可以是抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽。
[0183]
鉴于本公开内容，具有如本文所述的抗体或其它多肽作为活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员已知的，如remington's pharmaceutical sciences,第18版,1990所示例，其通过引用并入本文。此外，对于动物(包括人)施用，应当理解，制剂应满足fda生物标准办公室要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
[0184]
药学上可接受的承载体包括液体、半固体(即，糊剂)或固体承载体。承载体或稀释剂的例子包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等或它们的组合。药学上可接受的承载体可以包括水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、乙醇、盐水溶液、胃肠外媒介物诸如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯诸如油酸乙酯)、分散介质、包衣剂(例如，卵磷脂)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等渗剂(例如，糖、氯化钠)、吸收延迟剂(例如，单硬脂酸铝、明胶)、盐、药物、药物稳定剂(例如，缓冲剂，氨基酸，诸如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物，诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养物补充剂、诸如此类物质及其组合，如本领域普通技术人员所公知的。除非任何常规介
质、试剂、稀释剂或承载体对接受者或其中所含组合物的治疗有效性有害，其在用于实施所述方法的可施用组合物中的用途是适当的。根据众所周知的参数调整药物组合物中各种组分的ph和准确浓度。根据本公开内容的某些方面，可以将组合物以任何方便和实用的方式与承载体组合，即通过溶解、悬浮、乳化、混合、包囊、吸收、碾磨等。这样的程序对于本领域技术人员来说是常规的。
[0185]
在某些实施方案中，药学上可接受的承载体可以是水性ph缓冲溶液。例子包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量((例如，小于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如edta；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；和/或非离子型表面活性剂诸如tweentm、聚乙二醇(peg)和pluronicstm。
[0186]
在某些实施方案中，药学上可接受的承载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水可以是承载体，特别是当静脉内施用药物组合物时。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液还可以用作液体承载体，尤其是可注射溶液的液体承载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、聚山梨酯-80等。所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等的形式。
[0187]
本公开内容的某些实施方案可以具有不同类型的承载体，取决于它是以固体、液体还是气溶胶形式施用，以及它是否需要对于施用途径(诸如注射)而言为无菌的。所述组合物可以配制用于如下施用：静脉内地，真皮内地，透皮地，鞘内地，动脉内地，腹膜内地，鼻内地，阴道内地，直肠内地，肌肉内地，皮下地，粘膜地，口服地，表面地(topically)，局部地，通过吸入(例如，气溶胶吸入)，通过注射，通过输注，通过连续输注，通过局部灌注直接浸浴靶细胞，通过导管，通过灌洗，在脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过其它方法或本领域普通技术人员会知道的前述的任意组合(参见，例如，remington’spharmaceutical sciences,第18版，1990，通过引用并入本文)。通常，这样的组合物可以制备成液体溶液或混悬液；也可以制备固体形式，其适用于在注射前加入液体后制备溶液或混悬液；并且，也可以乳化所述制剂。
[0188]
所述抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽可以以游离碱、中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白性组合物的游离氨基形成的那些，或其用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸或普鲁卡因。
[0189]
在其它实施方案中，本文提供了具有脂质的药物组合物。脂质可以广泛地包括一类特征性地不溶于水并且可用有机溶剂萃取的物质。例子包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或生产)。脂质可以是生物物质。生物脂质是本领域众所周知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、
溶血脂、鞘糖脂、糖脂、硫脂(sulphatide)、具有醚-和酯-连接的脂肪酸的脂质、可聚合脂质及其组合。也可以使用除本文具体描述的那些以外被本领域技术人员理解为脂质的化合物。
[0190]
本领域普通技术人员将熟悉可以用于将组合物分散在脂质媒介物中的一系列技术。例如，抗体或多肽可以分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束或脂质体中或与胶束或脂质体复合，或另外通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散体可能会或不会导致脂质体的形成。
[0191]
通常，将组合物的成分单独地供应或一起混合在单位剂型中，例如，作为在气密密封的容器中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器例如指示活性剂的量的安瓿或药囊。当要通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配它。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合各成分。
[0192]
每种治疗有用的组合物中活性成分的量可以以这样的方式制备，在化合物的任何给定单位剂量中都将获得合适的剂量。制备这类药物制剂的本领域技术人员可以考虑多种因素，诸如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品贮存期限、以及其它药理学考虑因素，且因此可能有多种剂量和治疗方案是合乎需要的。
[0193]
单位剂量或剂量表示适合用于受试者的物理上离散的单元，每个单元含有预定量的药物组合物，所述量经计算以产生上文讨论的与其施用(即适当的途径和治疗方案)相关的期望应答。根据治疗次数和单位剂量，要施用的量取决于期望的效果。施用给患者或受试者的本发明实施方案的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素确定，诸如受试者的体重、年龄、健康和性别、所治疗的疾病的类型、疾病渗透的程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、施用途径以及特定治疗物质的效能、稳定性和毒性。在其它非限制性例子中，剂量可以具有每次施用从约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000毫克/kg/体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在可从本文所列数字导出的范围的非限制性例子中，可以基于上述数字施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。在任何情况下，负责施用的从业人员将确定组合物中的一种或多种活性成分的浓度和用于个体受试者的一个或多个合适剂量。
[0194]
本领域普通技术人员会理解，本文所述的组合物不受限于治疗制剂的特定性质。例如，这样的组合物可以与生理上可耐受的液体、凝胶或固体承载体、稀释剂和赋形剂一起提供在制剂中。这些治疗制剂可以以类似于其它治疗剂的方式施用给哺乳动物用于兽医学用途，诸如用于家养动物，以及用于人类的临床用途。一般而言，治疗效果所需的剂量会根据用途类型和施用模式以及个体受试者的具体要求而变化。施用给动物患者(包括人患者)的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素确定，诸如体重、病症的严重程度、所治疗的疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病，以及施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可以根据受试者的应答而变化。在任何情况下，负责
施用的从业人员将确定组合物中的一种或多种活性成分的浓度和个体受试者的一个或多个合适剂量。
[0195]
疾病的治疗
[0196]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语”受试者”表示作为治疗、观察和/或实验的对象的动物。“动物”包括脊椎动物和无脊椎动物，诸如鱼、贝类、爬行动物、禽类，尤其是哺乳动物。“哺乳动物”包括、但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类动物，诸如猴、黑猩猩、猿和人。在某些实施方案中，所述受试者是人。
[0197]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“癌症”或“癌性的”表示哺乳动物中通常以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的例子包括、但不限于血液学癌症和实体瘤。
[0198]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“治疗”表示为了获得疾病或健康相关状况的治疗益处的目的向受试者施用或应用治疗剂或对受试者实施操作或模态。例如，治疗可以包括向受试者施用治疗有效量的抗-glycctla-4抗体。当提及癌症患者使用时，术语“治疗”表示这样的作用作：其可能降低癌症的严重程度，或延缓或减缓癌症的进展，包括(a)抑制癌症生长、降低癌症生长速率、阻止发展、降低癌症侵袭力或防止癌症转移，和(b)造成癌症消退、延迟或最小化与癌症存在相关的一种或多种症状，或延长癌症患者的生存。
[0199]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“治疗有效量”表示足以降低和/或改善给定疾病、病症或病况的严重程度和/或持续时间和/或与其相关的症状的药剂(例如，本文描述的抗体或多肽或本文描述的任意其它药剂)的量。药剂(包括治疗剂)的治疗有效量可以是实现以下目的所必需的量：(i)减少或改善给定疾病、病症或病况的进展或发展，(ii)减少或改善给定疾病、病症或病况的复发、发展或发作，和/或(iii)改善或增强另一种疗法(例如，除了施用本文提供的抗体之外的疗法)的预防或治疗效果。本公开内容的物质/分子/药剂(例如，抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽)的治疗有效量可以根据诸如以下因素而变化：疾病状态，个体的年龄、性别和体重，以及物质/分子/药剂在个体中引发期望应答的能力。治疗有效量涵盖其中物质/分子/药剂的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。
[0200]
如本文中使用的，且除非另外指出，术语“施用”表示将存在于体外的物质注射或以其它方式物理递送进患者体内的动作，诸如通过粘膜、真皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其它物理递送方法。当正在治疗疾病、病症或病况或其症状时，物质的施用通常发生在疾病、病症或病况或其症状发作之后。当正在预防疾病、病症或病况或其症状时，物质的施用通常发生在疾病、病症或病况或其症状发作之前。
[0201]
本文还提供了抗-glycctla-4抗体和糖基化的ctla-4多肽的治疗用途。这些抗体或多肽可以用于调节ctla-4/cd86信号传导的活性。这些抗体或多肽可以用于调节ctla-4/cd80信号传导的活性。这些抗体或多肽还可以用于通过抑制ctla-4在t细胞活化或增殖中的抑制活性来治疗疾病。因此，本文提供了这样的抗体或多肽在通过抑制或阻断ctla-4信号传导来上调受试者的免疫系统中的用途。在某些实施方案中，本文提供了抗体或多肽用于阻断ctla-4结合cd86的用途。在某些实施方案中，本文提供了抗体或多肽用于阻断ctla-4结合cd80的用途。
[0202]
在某些实施方案中，本文还提供了抗-glycctla-4抗体和糖基化的ctla-4多肽在治疗癌症中的治疗用途。免疫系统的上调在癌症的治疗中是特别需要的，因此本文还提供
了癌症治疗的方法。癌症表示由细胞的异常失控生长引起的赘生物或肿瘤。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。在具体实施方案中，癌细胞是cd86或cd80阳性的。
[0203]
在某些方面，可以施用实施方案的多肽或抗体(例如，糖基化的ctla-4多肽或结合糖基化的ctla-4的抗体)来治疗癌症。在具体实施方案中，抗-glycctla-4抗体是stc1807的嵌合或人源化形式。本治疗方法适用的癌症包括任何恶性细胞类型，诸如在实体瘤或血液学肿瘤中发现的那些。示例性的实体瘤可以包括、但不限于选自以下的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房。示例性的血液学肿瘤包括骨髓的肿瘤、t或b细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。使用本文提供的方法可以治疗的癌症的其它例子包括、但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、不同类型的头颈癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、雀斑恶性黑素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、以及b-细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中间等级/滤泡nhl；中间等级弥散性nhl；高等级成免疫细胞性nhl；高等级成淋巴细胞性nhl；高等级小无核裂细胞nhl(high grade small non-cleaved cell nhl)；巨大肿块(bulky disease)nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关的淋巴瘤；和waldenstrom巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性成淋巴细胞性白血病(all)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病(aml)和慢性成髓细胞白血病。
[0204]
癌症具体可以是以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；结合性肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉症；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包囊性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性腺管癌；髓样癌；小叶癌；炎症性癌；乳房佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；具有鳞状组织转化的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；恶性睾丸母细胞瘤(androblastoma,malignant)；塞尔托利细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性勃勒纳瘤；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨
的巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙原性瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性粒细胞性白血病；嗜酸性粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
[0205]
在某些实施方案中，本文提供的抗体或多肽可以用于治疗癌症，其为乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
[0206]
所述多肽或抗体可以在本文中以多种方式用作抗肿瘤剂。本文提供了使用多肽或抗体作为抗肿瘤剂的方法，且因此包括使肿瘤细胞群与治疗有效量的多肽或抗体接触足以抑制肿瘤细胞生长的时间段。
[0207]
各种递送系统也是已知的并且可以用于施用抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽的相关分子，或相关的药物组合物，诸如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体或融合蛋白、受体介导的胞吞作用的重组细胞中(参见，例如，wu和wu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。
[0208]
如本文提供的施用方法包括、但不限于注射，如通过胃肠外施用(例如，真皮内施用、肌肉内施用、腹膜内施用、静脉内施用和皮下施用)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在某些实施方案中，肌内地、静脉内地、皮下地、静脉内地、腹膜内地、口服地、肌肉内地、皮下地、腔体内、透皮地或真皮地施用本文提供的抗体、其它分子或药物组合物。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如，通过输注或快速推注，通过经上皮或皮肤粘膜内衬(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，也可以采用肺施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂一起配制。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,20、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078和pct公开号wo 92/19244、wo 97/32572、wo 97/44013、wo98/31346和wo 99/66903、它们都特此通过引用整体并入。在某些实施方案中，将本文提供的抗体、其它分子或药物组合物局部施用至需要治疗的区域，这可以如下实现：例如，局部输注，通过注射，或借助于植入物，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，例如硅橡胶膜，或纤维。在某些实施方案中，当施用如本文所述的抗体或其它分子时，注意使用抗体或其它分子不吸收的材料。
[0209]
在某些实施方案中，将本文提供的抗体或多肽配制在脂质体中用于靶向递送。脂质体是由包裹水相的同心有序的磷脂双层组成的囊泡。脂质体通常具有各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。脂质体的组分以双层构型排列，类似于生物膜的脂质排列。脂质体可以是有用的递送媒介物，部分原因在于它们的生物相容性、低免疫原性和低毒性。制备脂质体的方法是本领域已知的并且在本文中提供，参见，例如，epstein等人,1985,
糖基化的ctla-4抗体的免疫脂质体制剂可以特别有效地用作治疗剂，因为它们将活性成分递送至靶细胞(即包含抗体要结合的受体的细胞)的细胞质。在某些实施方案中，免疫脂质体可以在血液中具有增加的半衰期，特别是在靶细胞中，并且可以内化到靶细胞的细胞质中，从而避免治疗剂的损失或内溶酶体途径的降解。
[0213]
本文提供的免疫脂质体组合物可以具有一种或多种囊泡形成脂质、本发明的抗体或其它分子或其片段或衍生物，以及任选的亲水性聚合物。囊泡形成脂质可以是具有两条烃链(诸如酰基链和极性首基)的脂质。囊泡形成脂质的例子包括磷脂，例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和糖脂，例如，脑苷脂、神经节苷脂。可用于本文提供的制剂的其它脂质是本领域技术人员已知的并且被包含在本说明书中。在某些实施方案中，免疫脂质体组合物进一步包括亲水性聚合物，例如，聚乙二醇和神经节苷脂gm1，其增加脂质体的血清半衰期。将亲水性聚合物与脂质体缀合的方法是本领域众所周知的并且被包含在本说明书中。其它示例性免疫脂质体及其制备方法可以参见，例如，美国专利申请公开号2003/0044407；pct国际公开号wo 97/38731,vingerhoeads等人,1994,immunomethods,4:259-72；maruyama,2000,biol.pharm.bull.23(7):791-799；abra等人,2002,journal of liposome research,12(1&2):1-3；park,2002,bioscience reports,22(2):267-281；bendas等人,2001biodrugs,14(4):215-224,j.thomas august编，1997,gene therapy:advances in pharmacology,第40卷,academic press,san diego,calif.,第399-435页；它们都特此通过引用整体并入。
[0214]
本文还提供了通过给患者施用单位剂量的抗-glycctla-4抗体来治疗癌症患者的方法。本文还提供了通过给患者施用单位剂量的糖基化的ctla-4多肽来治疗癌症患者的方法。单位剂量表示适合作为受试者的单位剂量的物理离散单元，每个单元含有预定量的活性物质，其经计算与所需的稀释剂(即，承载体或媒介物)联合产生期望的治疗效果。
[0215]
以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效量施用所述抗体、多肽或组合物。要施用的量取决于要治疗的受试者、受试者的系统利用活性成分的能力以及期望的治疗效果的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业人员的判断，并且对于每个个体受试者都是特有的。但是，本文公开了全身应用的合适剂量范围，并且取决于施用途径。还考虑了用于初始施用和加强施用的合适方案，并且通常包括初始施用，随后是间隔一个或多个小时通过随后注射或其它施用的重复剂量。在本文中描述了示例性的多次施用，并且可用于维持多肽或抗体的连续高血清和组织水平。备选地，考虑了足以将血液中的浓度维持在为体内治疗指定的范围内的连续静脉内输注。
[0216]
治疗有效量是为达到期望效果而计算的预定量。通常，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果出现任何并发症，个体医师可以调整剂量。
[0217]
在某些实施方案中，将本文提供的抗体、多肽或药物组合物包装在气密密封的容器诸如安瓿或药囊中。在一个实施方案中，将本文提供的抗体、多肽或药物组合物以干燥的无菌冻干粉末或无水浓缩物形式提供在气密密封的容器中，并且可以例如用水或盐水重构至适当浓度以施用给受试者。在某些实施方案中，将本文提供的抗体、多肽或药物组合物以至少5mg、更优选地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg的单位剂量以干燥的无菌冻干粉末形式提供在气密密封的容器中。本文提供的冻干的
抗体、多肽或药物组合物应当在2至8℃储存在初始容器中，并应在重构后12小时内、优选在6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在一个替代实施方案中，将本文提供的抗体、多肽或药物组合物以液体形式提供在气密密封的容器中，所述容器指示抗体、多肽或药物组合物的量和浓度。在某些实施方案中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物的液体形式以至少1mg/ml、更优选地至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml提供在气密密封的容器中。
[0218]
要在制剂中采用的精确剂量还取决于施用途径和病情严重程度，且应当根据从业人员的判断和每位患者的情况来决定。从由体外或动物模型试验系统导出的剂量-反应曲线，可以外推出有效剂量。对于所述抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽，施用给患者的剂量通常为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重。在某些实施方案中，施用给患者的剂量是在0.01mg/kg至20mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至5mg/kg、0.01至2mg/kg、0.01至1mg/kg、0.01mg/kg至0.75mg/kg、0.01mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至0.25mg/kg、0.01至0.15mg/kg、0.01至0.10mg/kg、0.01至0.05mg/kg或0.01至0.025mg/kg患者体重之间。施用给患者的剂量可以是0.2mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg。预计低至0.01mg/kg的剂量会显示出可察觉的药效动力学作用。预计0.10-1mg/kg的剂量水平是最合适的。也可以预期更高的剂量(例如，1-30mg/kg)是有活性的。通常，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比来自其它物种的抗体长。因此，可以实施更低剂量的人抗体和更低频率施用。此外，通过修饰，例如，脂质化，通过增强抗体的摄取和组织渗透，可以降低本文提供的抗体或多肽的施用剂量和频率。
[0219]
在另一个实施方案中，可以在控释或缓释系统中递送组合物。本领域技术人员已知的任何技术可以用于生产缓释制剂，其具有一种或多种本文提供的抗体、分子或药物组合物。参见，例如，美国专利号4,526,938；pct公开wo91/05548；pct公开wo 96/20698；ning等人,radiotherapy&oncology39:179-189(1996),song等人,pda journal of pharmaceutical science&technology 50:372-397(1995)；cleek等人,pro.int'l.symp.control.rel.bioact.mater.24:853-854(1997)；和lam等人,proc.int'l.symp.control rel.bioact.mater.24:759-760(1997)；它们都特此通过引用整体并入。在一个实施方案中，可以将泵用在控释系统中(参见langer,出处同上；sefton,1987,crc crit.ref biomed.eng.14:20；buchwald等人,1980,surgery 88:507；和saudek等人,1989,n.engl.j.med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料以实现抗体或多肽的控释(参见例如，medical applications of controlled release,langer和wise(编),crc pres.,boca raton,fla.(1974)；controlled drug bioavailability,drug product design and performance,smolen和ball(编),wiley,new york(1984)；ranger和peppas,1983,j.,macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61；也参见levy等人,1985,science 228:190；during等人,1989,ann.neurol.25:351；howard等人,1989,j.neurosurg.7 1:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；pct公开号wo 99/15154；和pct公开号wo 99/20253)；它们都特此通过引用整体并入。
[0220]
可以用于缓释制剂的聚合物的例子包括、但不限于聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲
基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(plg)、聚酸酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(pla)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和聚原酸酯。在又一个实施方案中，控释系统可以放置在治疗靶标(例如，肺)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，goodson，见medical applications of controlled release,出处同上,第2卷,第115-138页(1984))。在另一个实施方案中，根据dunn等人(参见美国专利号5,945,155，其特此通过引用整体并入)，使用可用作控释植入物的聚合物组合物。基于生物活性物质从聚合物系统中原位控释的治疗效果，植入通常可以发生在患者体内需要治疗性治疗的任何地方。
[0221]
在另一个实施方案中，使用非聚合物持续递送系统，由此受试者体内的非聚合物植入物用作药物递送系统。在植入体内后，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围的组织液中，并且非聚合材料将逐渐凝结或沉淀以形成固体多微孔基质(参见美国专利号5,888,533)。langer(1990,science249:1527-1533)的综述中也讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可以用于生产包含一种或多种本文提供的治疗剂的缓释制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938；国际公开号wo 91/05548和wo 96/20698；ning等人,1996,radiotherapy&oncology 39:179-189；song等人,1995,pda journal of pharmaceutical science&technology 50:372-397；cleek等人,1997,pro.int'l.symp.control.rel.bioact.mater.24:853-854；和lam等人,1997,proc.int'l.symp.control rel.bioact.mater.24:759-760；它们都特此通过引用整体并入。
[0222]
本文还提供了其中组合物具有编码本文提供的抗体或多肽的核酸的实施方案，其中可以如下在体内施用所述核酸以促进其编码的抗体或多肽的表达：将它构建为适当的核酸表达载体的一部分并施用它，以便使它变成胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道,dupont),或通过包被有脂质或细胞-表面受体或转染剂，或通过将它与已知能进入核中的同源框-样肽一起连合施用(参见例如，joliot等人,1991,proc.natl.acad.sci.usa 88:1864-1868)。备选地，可以将核酸引入细胞内并整合到宿主细胞dna中以通过同源重组进行表达。
[0223]
用治疗有效量的本文提供的抗体、多肽或药物组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。考虑可以全身性地或局部地施用本文提供的抗体、多肽或药物组合物以治疗疾病，诸如在患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中抑制肿瘤细胞生长或杀死癌细胞。可以静脉内地、鞘内地和/或腹膜内地施用它们。它们可以单独施用或与抗增殖药物联合施用。在一个实施方案中，在手术或其它操作之前施用它们以减少患者中的癌症负荷。备选地，可以在手术后施用它们，以确保任何剩余的癌症(例如，手术没有消除的癌症)不会存活。在某些实施方案中，可以在原发性癌症消退后施用它们以防止转移。
[0224]
联合治疗
[0225]
在某些实施方案中，实施方案的组合物和方法涉及与第二或另外的疗法联合施用糖基化的ctla-4多肽或选择性地结合糖基化的ctla-4的抗体。这样的疗法可以用于治疗与ctla-4或糖基化的ctla-4相关的任何疾病。例如，所述疾病可以是癌症，且所述第二疗法是抗癌或抗过度增殖疗法。
[0226]
所述方法和组合物，包括联合疗法，增强另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗或
保护作用，和/或增加其治疗作用。治疗性和预防性方法和组合物可以以有效实现期望作用的组合量提供，所述期望作用是例如杀死癌细胞和/或抑制细胞的过度增殖。该方法可以涉及施用多肽或抗体和第二疗法。第二疗法可能具有或不具有直接的细胞毒性作用。例如，第二疗法可以是上调免疫系统而不具有直接细胞毒性作用的药剂。可以将组织、肿瘤或细胞暴露于包含一种或多种药剂(例如，抗体或抗癌剂)的一种或多种组合物或药理学制剂，或通过向组织、肿瘤和/或细胞暴露两种或更多种不同的组合物或制剂，其中一种组合物提供1)多肽或抗体，2)抗癌剂，或3)多肽或抗体和抗癌剂。此外，考虑这样的联合疗法可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。
[0227]
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗性多肽或抗体和化疗剂或放疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置的过程。例如，为了实现细胞杀死，将两种药剂以有效杀死细胞或阻止其分裂的组合量递送给细胞。
[0228]
抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽可以相对于第二或另外的抗癌治疗在之前、期间、之后或以各种组合施用。施用的时间间隔范围可以从同时到几分钟到几天到几周不等。在将抗体或多肽与抗癌剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送时间之间不会度过较长一段时间，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合效应。在这样的情况下，考虑可以在彼此的约12-24或72小时内且更具体地在彼此的约6-12小时内给患者提供抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽和第二疗法。在某些情况下，治疗时间段可以显著延长，其中在各个施用之间度过几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
[0229]
在具体实施方案中，将抗-glycctla-4抗体与一种或多种其它抗-ctla-4抗体联合施用，包括与伊匹木单抗联合施用给患者进行癌症治疗。在其它实施方案中，将抗-glycctla-4抗体与一种或多种抗-pd-1抗体联合施用，并且在一个具体实施方案中，抗-pd-1抗体是派姆单抗、纳武单抗或匹地利珠单抗，施用给患者进行癌症治疗。在其它实施方案中，将抗-glycctla-4抗体与抑制ctla-4、pd-l1或pd-1的活性的药剂一起施用，所述药剂是例如免疫粘附素，其具有与fc结构域融合的pd-1、pd-l1或ctla-4蛋白的细胞外受体或配体结合部分。在某些实施方案中，将抗-glycctla-4抗体与度伐单抗联合施用。
[0230]
在具体实施方案中，将抗-glycctla-4抗体与相对于未糖基化的pd-l1优先结合糖基化的pd-l1的抗体联合施用。具体地，可以将抗-glycctla-4抗体与抗-pd-l1抗体stm004或stm115的嵌合或人源化形式联合施用，所述嵌合或人源化形式相对于未糖基化的pd-l1优先结合糖基化的pd-l1，并且重链和轻链可变结构域的氨基酸序列(和编码核苷酸序列)公开在2016年10月6日公布的标题为“antibodies specific to glycosylated pd-l1 and methods of use thereof”的pct公开wo2016/160792中，其通过引用并入本文。还将抗-glyc-ctla-4抗体与抗-pd-l1抗体stm073和smt108的嵌合或人源化形式联合施用，所述嵌合或人源化形式相对于未糖基化的pd-l1优先结合糖基化的pd-l1，且重链和轻链可变结构域的氨基酸序列(和编码核苷酸序列)公开在2016年3月29日提交的标题为“dual function antibodies specific to glycosylated pd-l1 and methods of use thereof”的美国临时申请号62/314,652中，其通过引用并入本文。在某些实施方案中，将抗-glycctla-4抗体与阿特朱单抗或阿维鲁单抗联合施用。
[0231]
在某些实施方案中，一个疗程可以持续1-90天或更长时间(这个这样的范围包括
间隔天数)。考虑可以在第1天到第90天中的任何一天(这个这样的范围包括间隔天数)或其任何组合施用一种药剂，并且在第1天到第90天中的任何一天(这个这样的范围包括间隔天数)或其任何组合施用另一种药剂。在一天(24小时时段)内，可以给患者施用一种或多种药剂的一次或多次施用。此外，在疗程以后，考虑有一段时间不施用抗癌治疗。该时间段可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长(这个这样的范围包括间隔天数)，取决于患者的状况，诸如他们的预后、强度、健康等。必要时，可以重复治疗周期。
[0232]
可以采用各种组合。下面列出了一些用抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽作为“a”和用第二抗癌疗法作为“b”的治疗的一些例子：a/b/a b/a/b b/b/a a/a/b a/b/b b/a/a a/b/b/b b/a/b/b b/b/b/a b/b/a/b a/a/b/b a/b/a/b a/b/b/a b/b/a/a b/a/b/a b/a/a/b a/a/a/b b/a/a/a a/b/a/a a/a/b/a
[0233]
本文提供的任何抗体、多肽或药物组合物与第二疗法向患者的联合施用将遵循施用这样的第二疗法的一般方案，考虑到第二疗法的毒性(如果有的话)。因此，在某些实施方案中，存在监测可归因于联合治疗的毒性的步骤。
[0234]
化学疗法
[0235]
根据本发明的实施方案，可以使用多种化学治疗剂作为第二疗法。化疗剂可以是在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物可以根据它们在细胞内的活性模式进行分类，例如，它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期。备选地，基于其直接交联dna、嵌入dna或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力，可以表征药剂。
[0236]
化学治疗剂的例子包括：烷化剂，诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；cc-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成的类似物、kw-2189和cb1-tm1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γli和卡奇霉素ωi1)；达内霉素，包括达内霉素a；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素c、麦考酚酸、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似
物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗-肾上腺药，诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；拟美坦辛，诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是t-2毒素、疣孢菌素(verracurin)a、杆孢菌素a和蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，cpt-11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维a酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0237]
放射疗法
[0238]
可以与本文所述的方法和组合物联合使用的另一种常规抗癌疗法是放射疗法或辐射疗法。放射疗法包括使用γ-射线、x-射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其它形式的dna损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利号5,760,395和4,870,287；它们都特此通过引用整体并入)和紫外光照射。最可能的是，所有这些因素对dna、dna前体、dna的复制和修复以及染色体的组装和维持造成宽范围的损害。
[0239]
由于浸润肿瘤并发挥作用以抑制免疫应答的骨髓衍生的抑制细胞和调节性t细胞的存在，肿瘤微环境固有地是抑制性的。此外，某些抑制性分子在t细胞和抗原呈递细胞(apc)上的表达可以限制有效的免疫应答。辐射通过诱导肿瘤细胞凋亡、衰老、自噬来介导抗肿瘤作用，并且在某些情况下，可以刺激更有效的免疫应答。
[0240]
伴随远隔效应是一种生理过程，其中原发肿瘤的靶向辐射在非辐射场的远处部位诱导抗肿瘤应答。负责伴随远隔效应的机制被认为是免疫介导的，并涉及增强的肿瘤抗原向t细胞的呈递以及细胞因子和其它促炎因子的释放，所述因子刺激局部和全身免疫应答。由于伴随远隔效应影响位于接受辐射治疗的原发肿瘤远端的肿瘤，因此可以触发伴随远隔效应的药剂在治疗转移性肿瘤方面是特别有利的，转移性肿瘤一旦已经扩散到体内的继发部位经常就更难治疗。
[0241]
本文描述的抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽可以刺激局部和全身免疫应答。在某些实施方案中，将治疗有效量的如本文所述的抗体、多肽或药物组合物在放射疗法之前、同时或之后施用以实现协同的伴随远隔效应。
[0242]
在某些实施方案中，施用治疗有效量的本文所述的抗体、多肽或药物组合物，其有
效地使宿主中的肿瘤对辐射敏化。辐射可以是电离辐射，尤其是γ辐射。在某些实施方案中，γ辐射由线性加速器或放射性核素发射。放射性核素对肿瘤的辐照可以是外部的或内部的。
[0243]
在某些实施方案中，在肿瘤辐照前至多一个月，特别是至多10天或一周，开始本文所述的抗体、多肽或药物组合物的施用。此外，肿瘤的辐照是分段的，在第一个和最后一个辐照期之间的区间内维持本文所述的抗体、多肽或药物组合物的施用。
[0244]
辐照也可以是x-射线辐射。x射线的剂量范围为从以50-200伦琴的日剂量持续长时间段(3至4周)至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围宽泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
[0245]
免疫疗法
[0246]
熟练的技术人员会理解，免疫疗法可以与实施方案的方法联合或结合使用。在癌症治疗的情形下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗是这样的一个实例。检查点抑制剂例如伊匹木单抗(ipilumimab)、派姆单抗(pembrolizuman)、纳武单抗和阿特朱单抗是其它实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应物，或者它可以募集其它细胞来实际影响细胞杀死。抗体也可以缀合至药物或毒素(例如，化学治疗剂、放射性核素、蓖麻蛋白a链、霍乱毒素、百日咳毒素)并仅用作靶向试剂。备选地，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接地或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。多种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。
[0247]
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞带有一些易于靶向的标志物，即其不存在于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任何一种都可以适合用于在本发明实施方案的情形中靶向。常见的肿瘤标志物包括cd20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag-72、hmfg、唾液酸基路易斯抗原、muca、mucb、plap、层粘连蛋白受体、erb b和p155。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，诸如il-2、il-4、il-12、gm-csf、γ-ifn，趋化因子，诸如mip-1、mcp-1、il-8，和生长因子，诸如flt3配体。
[0248]
目前处在研究中或在使用中的免疫疗法的例子是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利号5,801,005和5,739,169；hui和hashimoto,infect immun.,66(11):5329-36(1998)；christodoulides等人,microbiology,66(11):5329-36(1998))；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β和γ、il-1、gm-csf和tnf(bukowski等人,clin cancer res.,4(10):2337-47(1998)；davidson等人,j immunother.,21(5):389-98(1998)；hellstrand等人,acta oncol.37(4):347-53(1998))；基因疗法，例如，tnf、il-1、il-2和p53(qin等人,proc natl acad sci u s a,95(24):14411-6(1998)；austin-ward和villaseca,rev med chil,126(7):838-45(1998)；美国专利号5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如，抗-pd1、抗-pdl1、抗-cd20、抗-神经节苷脂gm2和抗-p185(topalian等人,the new england journal of medicine,366:2443-2454(2012)；brahmer等人,the new england journal of medicine 366:2455-2465(2012)；hollander,front immunol(2012):3:3.doi:10.3389/fimmu.2012.00003；hanibuchi等人,int j cancer,78(4):480-5(1998)；美国专利号5,
824,311)；它们都特此通过引用整体并入。考虑一种或多种抗癌疗法可以与本文所述的包括使用抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽的疗法一起使用。
[0249]
手术
[0250]
大约60％的癌症患者会经历某种类型的手术，这包括预防性的、诊断性的或分期性的、治愈性的和姑息性的手术。治愈性手术包括切除术，其中将全部或部分癌性组织物理移除、切离和/或破坏，并可能与其它疗法(诸如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术表示肿瘤的至少一部分的物理除去。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和在显微镜下控制的手术(莫氏手术)。
[0251]
在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，可能在体内形成空腔。可以通过给该区域灌注、直接注射或局部应用额外抗癌疗法来完成治疗。可以例如每1、2、3、4、5、6或7天、或每1、2、3、4和5周、或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这样的治疗。这些治疗也可以有不同的剂量。
[0252]
其它药剂
[0253]
考虑其它药剂可以与本发明实施方案的某些方面联合使用以改善治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和gap连接的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖性细胞对细胞凋亡诱导物的敏感性的药剂、或其它生物药剂。通过增加gap连接的数目来增加细胞间信号传导，可以增加对邻近过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面联合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。考虑细胞粘附抑制剂以改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的例子是粘着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖性细胞对细胞凋亡的敏感性的其它药剂(诸如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面联合使用以改善治疗功效。
[0254]
试剂盒和诊断剂
[0255]
在各个方面，本文提供了含有治疗剂和/或其它治疗剂和递送剂的试剂盒。在某些实施方案中，考虑了用于制备和/或施用本文提供的疗法的试剂盒。所述试剂盒可以包含一个或多个密封小瓶，所述小瓶含有本文提供的任何药物组合物。所述试剂盒可以包括，例如，至少抗-glycctla-4抗体或糖基化的ctla-4多肽，以及用于制备、配制和/或施用本文提供的组分或执行本文提供的方法的一个或多个步骤的试剂。
[0256]
在某些实施方案中，所述试剂盒可以包括抗-glycctla-4抗体和至少一种辅助试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒可以包括糖基化的ctla-4多肽和至少一种辅助试剂。
[0257]
在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括第二抗癌剂。所述第二抗癌剂可以是化学治疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂或细胞因子。
[0258]
在某些实施方案中，所述试剂盒还可以包括合适的容器装置，其是不与试剂盒的组分反应的容器，诸如eppendorf管、测定板、注射器、瓶子或试管。所述容器可以由可灭菌的材料(诸如塑料或玻璃)制成。
[0259]
所述试剂盒可以进一步包括指令图表，其概述了本文所述方法的程序步骤，并且将基本上遵循与本文所述或普通技术人员已知的相同的程序。所述指令信息可以是在含有机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行所述指令时，其造成递送药学有效
量的本文提供的抗体或多肽的真实或虚拟程序的显示。所述试剂盒还可以包括呈管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公示，该公示反映了所述机构关于人施用而生产、使用或销售的批准。
[0260]
实施例
[0261]
应当理解，还考虑不显著改变本文所述的各种实施方案的性质和精神的修改。因此，以下实施例旨在举例说明而非以任何方式限制。
[0262]
材料和方法
[0263]
免疫印迹分析、免疫细胞化学和免疫沉淀。如前所述进行免疫印迹分析(lim等人,2008,gastroenterology,135:2i 28-40；和lee等人,2007,cell,130:440-455)。使用bio-rad chemidoc成像系统(bio-rad,hercules,ca.usa)进行图像采集和条带强度的量化。对于免疫细胞化学，将细胞在室温在4％低聚甲醛中固定15分钟，在5％triton x-100中透化5分钟，并然后使用一级抗体染色。使用的二级抗体是抗-小鼠alexafluor 488或594染料缀合物和/或抗-兔alexa fluor 488或594染料缀合物(life technologies)。将细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi蓝)(life technologies)染色。封固后，使用多光子共聚焦激光扫描显微镜(nikon a1 ,melville,ny,usa)观察细胞。
[0264]
ctla-4和cd80/cd86(cd80/ctla-4或cd86/ctla-4)相互作用测定。为了测量ctla-4蛋白和cd80或cd86蛋白的相互作用，将表达ctla-4的细胞在室温在4％低聚甲醛中固定15分钟，并然后与重组人cd80-fc或cd86-fc嵌合蛋白(r&d systems)一起温育1小时。使用的二级抗体是抗-人alexa fluor 488染料缀合物(life technologies)。然后使用实时显微镜incucyte(essen bioscience,ann arbor,michigan,usa)监测alexa fluor 488染料的荧光强度。
[0265]
kd确定和通过octet分箱。对于高通量kd筛选，将抗体配体通过20nm溶液加载到传感器上。在含有1mg/ml牛血清白蛋白的pbs(测定缓冲液)中建立基线，通过将传感器浸没在测定缓冲液中的单一浓度分析物中来执行缔合步骤。在新鲜的测定缓冲液中进行并监测解离。在1,000rpm传感器摇振下进行所有实验。使用fortebio的数据分析软件将数据拟合到1:1结合模型以提取缔合速率和解离速率。使用比率kd/ka计算kd。在典型的表位分箱测定中，将抗原ctla-4-his(10nm)与第二抗体(10nm)在室温预温育1小时。将对照抗体(20nm)加载到amc传感器(fortebio)上，并用完整小鼠igg抗体(jackson immunoresearch)封闭传感器上的剩余fc结合位点。将传感器暴露于预温育的抗原-第二抗体混合物。使用fortebio的数据分析软件7.0处理原始数据，并评估抗体对的竞争性结合。第二抗体的额外结合指示未被占用的表位(非竞争物)，而无结合指示表位封闭(竞争物)。
[0266]
ctla-4的糖基化分析。为了确认ctla-4蛋白的糖基化，如生产商所述，用酶pngase f、endo h、0-糖苷酶(new england biolabs,ipswich,ma,usa)处理细胞裂解物。
[0267]
统计分析。条形图中的数据表示相对于未处理组或对照组的平均倍数变化和三个独立实验的标准差。使用spss(ver.20,spss,chicago,il)进行统计分析。使用spearman相关性和mann-whitney检验，分析蛋白表达和blbc子集之间的相关性。对实验数据进行student t检验。《0.05的ap值被认为是统计上显著的。
[0268]
实施例1:糖基化的ctla-4结合cd80/86
[0269]
为了测量ctla-4/cd80或cd86相互作用，将表达ctla-4的细胞与重组人cd80-fc或
cd86-fc嵌合蛋白(r&d systems)一起温育1小时，然后与抗-人alexa fluor 488染料缀合物(life technologies)一起温育。然后根据生产商的说明书，使用实时显微镜incucyte(essen bioscience,ann arbor,michigan,usa)监测alexa fluor 488染料的荧光强度。为了研究ctla-4聚糖结构是否对其与cd80或cd86的结合而言是重要的，我们将纯化的cd80-或cd86-fc与来自表达flag标记的ctla-4wt或ctla-4 2nq(未糖基化形式)的293t细胞的裂解物一起温育，并然后通过活细胞成像分析ctla-4/cd80(图1a-c)和ctla-4/cd86(图2a-c)相互作用。如在图1和2中所示，发现仅ctla-4wt(图1a和c,图2a和c)与cd80和cd86结合，而ctla4 2nq(图1b和图2b)不与cd80和cd86结合。因而，这些结果提示，ctla-4的聚糖结构的完整性对其与cd80和cd86的相互作用而言是至关重要的。
[0270]
实施例2：抗-ctla-4抗体的生产
[0271]
开发了对糖基化的ctla-4具有特异性的单克隆抗体。从过表达重度糖基化的ctla-4的293f细胞纯化ctla-4-his。根据标准方案，通过将sp2/0鼠骨髓瘤细胞与从人ctla-4-免疫的balb/c小鼠(n＝4；antibody solutions,inc.,sunnyvale,ca,usa)分离的脾细胞融合，得到生产针对糖基化的人ctla-4产生的单克隆抗体的杂交瘤。在融合之前，使用facs分析验证来自免疫小鼠的血清与ctla-4免疫原的结合。产生了超过3000个产生单克隆抗体(mab)的杂交瘤。再次试验产生抗体的杂交瘤的特异性。
[0272]
在它们中，使用表达ctla-4wt或2nq(未糖基化形式)的293t细胞通过facs选择65种候选的生产mab的候选杂交瘤，并在dcgf培养基(antibody solutions)中生长，并将含有单克隆抗体的上清液浓缩和纯化。从过表达重度糖基化的ctla-4的293t细胞中纯化ctla-4，并且在斑点印迹测定中筛选了超过39个杂交瘤上清液(图3)。其中的一些，包括stc1807和stc1810，表现出糖特异性结合活性。
[0273]
使用活细胞成像测定incucyte(essen bioscience)，检测了纯化的mab中和或抑制ctla-4和cd86之间的相互作用(ctla4/cd86结合相互作用)的能力。为此目的，将表达ctla-4的293t细胞接种在96孔板中，并与ctla-4抗体、重组人cd86-fc蛋白和抗-人-fc alexa fluor 488染料缀合物(life technologies)一起温育。每2小时测量一次绿色荧光信号，并使用incucyte zoom系统(essen bioscience)进行量化。该测定的结果表明，在所试验的65种mab中，只有一种称为stc1807的mab完全阻断了ctla-4与cd86的结合(图4)。stc1807的重链和轻链可变结构域的序列提供在表3中。
[0274]
为了试验stc1807对ctla-4抗原糖基化的特异性，使用完全糖基化的人ctla-4蛋白和非糖基化或单糖基化的ctla-4(即，n113q、n145q和2nq)进行蛋白质印迹分析。stc1807识别n113糖基化，但既不识别n145也不识别2nq(图5)。
[0275]
为了以高通量形式确定ctla-4抗体的kd值，将抗体配体通过20nm溶液加载到octet传感器。在含有1mg/ml牛血清白蛋白的pbs(测定缓冲液)中建立基线，并且通过将传感器浸入测定缓冲液中单一浓度的分析物来执行缔合步骤。在新鲜的测定缓冲液中进行和监测解离。在以每分钟1,000转的速度摇振传感器的情况下进行所有实验。使用fortebio(menlo park,ca,usa)数据分析软件将数据拟合到1:1结合模型以提取缔合速率和解离速率。使用比率kd:ka计算kd。数据总结在图6和表3中。
[0276]
表3.通过octet确定的抗-ctla-4抗体的动力学参数。
[0277][0278][0279]
实施例3.抗-glycctla-4抗体中和活性
[0280]
为了测量抗体对ctla-4和cd86相互作用的抑制作用，将表达ctla-4的293t细胞接种在96孔板中，并与ctla-4抗体(stc1807、stc1808或stc1813)、重组人cd86-fc蛋白和抗-人-fc alexa fluor 488染料缀合物(life technologies)一起温育。每2小时测量一次绿色荧光信号，并使用incucyte zoom系统(essen bioscience)进行量化。图7a显示了在
0.125μg/ml至8μg/ml浓度的抗-glycctla-4抗体stc1807存在下cd86-fc与表达ctla-4的细胞的结合。图7b显示了stc1807在该测定中对ctla4/cd86相互作用的有效抑制，发现中和活性(降低的半数最大有效浓度ec
50
)为2.189μg/ml。图7c显示了在0.125μg/ml至8μg/ml浓度的抗-glycctla-4抗体stc1808存在下cd86-fc与表达ctla-4的细胞的结合。图7d显示了在0.125μg/ml至8μg/ml浓度的抗-glycctla-4抗体stc1813存在下cd86-fc与表达ctla-4的细胞的结合。
[0281]
当将stc1807的人嵌合体(hstc1807)与fda批准的抗体伊匹木单抗进行对比时，hstc1807显示出与之相当的中和作用。图8a显示了在0.125μg/ml至8μg/ml浓度的人嵌合体抗体hstc1807存在下在24小时内cd86-fc与表达ctla-4的细胞的结合。图8b显示了stc1807在该测定中对ctla-4/cd86相互作用的有效抑制，发现中和活性为0.3313μg/ml。图8c显示了在0.125μg/ml至8μg/ml浓度的伊匹木单抗存在下在24小时内cd86-fc与表达ctla-4的细胞的结合。图8d显示了伊匹木单抗在该测定中对ctla-4/cd86相互作用的有效抑制，发现中和活性为0.3068μg/ml。
[0282]
实施例4.stc1807和伊匹木单抗的抗体结合测定
[0283]
在典型表位分箱测定中，将抗原ctla-4-his(10nm)与第二抗体(10nm)一起在室温预温育1小时。将对照抗体(20nm)加载到amc传感器(fortebio)上，并将传感器上的剩余fc-结合位点用完整小鼠igg抗体(jackson immunoresearch,west grove,pa,usa)封闭。将传感器暴露于预温育的抗原-第二抗体混合物。使用fortebio数据分析软件7.0处理原始数据，并评估抗体对的竞争性结合。第二抗体的额外结合指示未被占用的表位(非竞争物)，且无结合指示表位封闭(竞争物)。图9a显示了伊匹木单抗(与cd86-his预温育的第二抗体)在加载stc1807的传感器上的额外结合。图9b显示了stc1807(与cd86-his预温育的第二抗体)在加载伊匹木单抗的传感器上的额外结合，提示其不同的结合表位。这些结果提示，stc1807和伊匹木单抗结合ctla-4的不同表位。
[0284]
实施例5.通过biocore测定法确定kd
[0285]
使用biacore结合测定将stc1807的结合亲和力(减小的平衡解离常数[kd]值)与fda批准的抗-ctla4抗体伊匹木单抗的结合亲和力进行了对比。使用biacore x100仪器(ge healthcare,uppsala,瑞典)通过表面等离子体共振进行kd测定。使用标准程序将小鼠igg1固定在研究级cm5芯片上，并使抗体在hbs-ep

缓冲液中以2μg/ml流过芯片。接着，使六种浓度的ctla4(各2倍稀释)经过芯片。通过biacore x100评价软件2.0.1版用1:1结合动力学分析传感图数据。发现stc1807具有0.47nm的kd，指示非常强的结合亲和力，而伊匹木单抗表现出较低的对ctla4蛋白的亲和力(kd为13.4nm)(图10和表5)。
[0286]
表5.抗-glyc-ctla-4抗体与ctla-4结合的biacore测定。
[0287]
抗体抗原ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)stc1807ctla-4-his4.63x1052.17x10-4
4.69x10-10
伊匹木单抗ctla-4-his2.04x1052.73x10-3
1.34x10-8
[0288]
实施例6.抗-glyc抗体对t细胞增殖的影响
[0289]
为了评价stc1807在体外的功效，使用在有il-4(500u/ml)和gm-csf(250u/ml)存在下培养7天的树突细胞(dc，从同种异体供体的pbmc(immunospot#ctl-cp1)诱导)进行混合淋巴细胞反应(mlr)。根据生产商的推荐，通过人泛-dc富集试剂盒(miltenyi biotech#
130-100-777)分离dc，并用于刺激同种异体记忆或幼稚cd4

t-细胞。还通过cd4微珠(miltenyi biotech#130-045-101)从另一个同种异体供体的pbmc(immunospot#ctl-cp1)富集cd4

t细胞。将dc(1
×
104个dc/孔)在96孔平底平板(nunc)中与1
×
105个t-细胞/孔一起在stc1807存在下在培养基中共培养。培养5天后，根据生产商的说明书，通过细胞因子elisa试剂盒(biolegend)测定培养上清液中ifn-γ和il-2的浓度。如在图11中所示，在stc1807存在下，t细胞增殖标志物ifn-γ和il-2的分泌显著增加。
[0290]
实施例7：抗体人源化-框架区
[0291]
如上面指出的，为了某些目的，包括例如用于人疾病的体内治疗，优选采用小鼠单克隆抗体的人源化衍生物。为了形成这样的人源化抗体，首先将小鼠单克隆抗体的框架序列(“亲本(parental)”序列)与一组“受体(acceptor)”人抗体的框架序列进行比对以鉴定框架序列中的差异。通过置换亲本和受体之间不匹配的框架残基来实现人源化。关于将来的回复突变，分析在潜在重要位置的置换，诸如在vernier区、vh/vl链间界面或cdr规范类别决定位置中的那些(参见，foote,j.等人,j.molec.biol.224:487-499(1992))。
[0292]
保守结构域数据库(cod)(marchler-bauer,等人(2011)nucleic acids res.39:d225-d229)可以用于确定每个氨基酸链的结构域内容和每个结构域的大致边界。根据几种常用的定义，可以与cdr的边界一起精确确定可变结构域边界(kabat,e.a.等人(1991)“sequences of proteins of immunological interest,”第五版.nih publication no.91-3242；chothia,c.等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；honegger,a.等人,j.molec.biol.309(3):657-670(2001))。
[0293]
使用mafft(katoh,k.等人,nucleic acids res.30:3059-3066(2002))产生亲本序列与小鼠和人种系序列的多重比对，并且将每个比对中的条目根据与亲本序列的序列同一性进行排序。通过以100％的序列同一性分簇并排除冗余条目，将参考集简化为序列的唯一集合。
[0294]
最佳受体框架选择是基于在两条链的框架中针对受体的整个亲本抗体序列同一性；但是，构成vh/vl链间界面的位置是特别令人感兴趣的。此外，将负责已经为5个cdr定义的离散规范结构集(chothia,c.等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；martin,a.c.等人,j.molec.biol 263:800-815(1996)；al-laziniki,b.等人,j.molec.biol.273:927-948(1997))的cdr环长度和cdr位置与所述种系进行对比，以确定哪些种系框架具有相同的界面残基并已知支持相似的cdr环构象。
[0295]
基于亲本抗体与人种系的序列比对，鉴定最接近的匹配条目。优选的人种系的选择是基于有序标准：(1)整个框架的序列同一性；(2)相同或相容的链间界面残基；(3)支持具有亲本cdr规范构象的环；(4)在表达的抗体中发现重和轻种系的组合；和(5)存在必须除去的n-糖基化位点。
[0296]
生成了人源化抗体的fv区的结构模型。将fr和cdr以及完整fv的候选结构模板片段基于其与靶标的序列同一性以及模板结构的定性晶体学测量(诸如分辨率，以埃为单位)评分、排序和从抗体数据库中选择。
[0297]
为了在结构上将cdr与fr模板比对，将cdr的任一侧上的5个残基包含在cdr模板中。基于重叠区段和生成的结构序列比对，生成片段的比对。通过modeller(sali,a.等人；j.molec.biol.234:779-815(1993))处理模板片段以及比对。该方案创建了从一组比对的
结构模板衍生出的构象约束。通过缀合物梯度和模拟的退火优化程序，创建满足约束的结构集合。基于能量评分从该集合中选择模型结构，所述能量评分源自蛋白结构的评分和构象约束的满足。检查模型，并使用侧链优化算法和最小化的能量优化在靶标和模板之间不同的位置的侧链。将一套可视化和计算工具用于评估cdr构象变异性、局部堆积和表面分析，以选择一个或多个优选模型。
[0298]
构建亲本抗体的结构模型并检查缺陷，诸如原子堆积不良、键长中的应力、键角或二面角。这些缺陷可能指示抗体结构稳定性的潜在问题。建模方案旨在使这样的缺陷最小化。人源化fv的初始结构模型含有所有安全置换(即不会影响结合亲和力或稳定性的置换)和谨慎置换(即进行位置置换，但所述位置可能对结合亲和力而言是重要的)。不改变在被认为与结合亲和力降低或稳定性降低的风险相关的位置处的置换。模板搜索和选择与亲本模板搜索分开执行，以便创建良好的独立模型，而不是亲本的紧密匹配变体模型。随着进行潜在置换的评估，将模型更新以反映优选的置换和回复突变的影响。
[0299]
实施例8：抗体人源化-恒定区：
[0300]
通过分别在pfusess-chig-hg1和pfusess-clig-hk载体(invivogen)中用人igg1恒定区(ch1-ch3)替换小鼠恒定区，而修饰stc1807重链的可变区(vh)及其κ轻链的可变区(vl)。将重和轻嵌合体构建体以1:1的比例转染到293f悬浮细胞中5天。在hplc上通过蛋白a亲和柱纯化嵌合抗体(hstc1807)。
[0301]
贯穿本技术，已经参考了各种出版物。这些出版物的公开内容特此通过引用整体并入本技术，以更全面地描述本公开内容所涉及的现有技术。尽管本文提供了某些特定实施方案的实施例，但是本领域技术人员显而易见，可以做出各种改变和修改。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。