人重组精氨酸酶1的生产方法及其用途与流程

1.本公开一般涉及精氨酸酶1缺乏症或高精氨酸血症的酶替代疗法和治疗。本公开还包括用于生产人重组精氨酸酶1的方法。精氨酸酶1也可用于治疗癌症。


背景技术：

2.精氨酸酶1缺乏症或高精氨酸血症是由精氨酸酶1缺乏引起的一种罕见的氨基酸代谢紊乱。精氨酸酶1是对尿素循环的正常功能至关重要的6种酶之一；它在该循环的最后一步催化l-精氨酸到尿素和鸟氨酸的转化。然后鸟氨酸重新进入线粒体以继续该循环。
3.精氨酸酶1主要存在于红细胞(rbc)和肝脏中。arg1是目前已知的唯一一种其突变导致精氨酸酶1缺乏症的基因。临床上，精氨酸酶1缺乏症的特征是大脑皮层和锥体束的缓慢衰退，导致进行性痴呆、精神运动迟缓、痉挛性瘫痪、癫痫发作和生长障碍。如果不及时治疗，该疾病会发展为严重的痉挛、无法行走、失去肠道和膀胱控制以及严重的智力残疾。精氨酸酶1缺乏症患者通常具有升高的血液精氨酸水平(正常上限[uln]的3至4倍)、轻度高氨血症和尿乳清酸的轻度升高。大多数患者的rbc中没有可检测到的精氨酸酶1酶活性(《正常值的1％)。
[0004]
目前对于精氨酸酶1缺乏症的治疗集中在通过终生饮食蛋白质限制将血浆精氨酸浓度维持在尽可能接近正常的水平。蛋白质摄入量限制在维持蛋白质生物合成和生长所需的最低限度。一半或更多的膳食蛋白质以不含精氨酸的必需氨基酸混合物的形式提供。这种饮食调整可以降低大多数患者的血浆精氨酸水平，但这种饮食令人不快、昂贵且难以维持和管理，尤其对于在成长中的儿童。
[0005]
精氨酸酶1缺乏症患者的治疗选择的短缺凸显了对将精氨酸水平降低至正常范围内并促进终生维持正常精氨酸水平的治疗的显著未满足的需求。这种治疗方法的开发可能有助于尽量减少患者暴露于精氨酸及其代谢物的神经毒性作用，并为这些患者的正常神经认知发育提供潜力。
[0006]
除了治疗精氨酸酶1缺乏症或高精氨酸血症外，这些方法产生的精氨酸酶还可用于治疗其他疾病。精氨酸酶1已用于临床试验，调查其在癌症治疗中的用途以及与免疫肿瘤药物诸如派姆单抗(pembrolizumab)联合使用。


技术实现要素：

[0007]
精氨酸酶的生产
[0008]
本发明的一个方面涉及用于生产和/或纯化重组人精氨酸酶蛋白的方法。在一个或多个实施例中，重组人精氨酸酶蛋白为重组人精氨酸酶1(rharg1)(seq id no:1；如图1(a)所示)。在其他实施例中，重组人精氨酸酶蛋白为重组人精氨酸酶2(rharg2)(seq id no:3；如图1(c)所示)。尽管本文具体参考rharg1，但本文所述的方法、制剂和用途也可应用于rharg2。
[0009]
经受本发明方法的人精氨酸酶1和2蛋白具有两个mn
2
位点；一个或两个位点可以
被取代以产生具有非天然金属辅因子的修饰的精氨酸酶1或2蛋白。在一些实施例中，该蛋白质在ph 7.4下表现出大于200mm-1
s-1
的k
cat
/km。在特定实施例中，该蛋白质在ph 7.4下表现出在约200mm-1
s-1
至约4,000mm-1
s-1
范围内的k
cat
/km。在另一实施例中，该蛋白质在ph 7.4下在37℃表现出在约400mm-1
s-1
至约2,500mm-1
s-1
范围内的k
cat
/km。在特定实施例中，本发明预期一种包含人精氨酸酶1或2的氨基酸序列和非天然金属辅因子的蛋白质，其中所述蛋白质在37℃、ph 7.4下表现出大于400mm-1
s-1
的k
cat
/km。在ph 7.4下在37℃的示例性k
cat
/km值包括约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约800、约900、约1,000、约1,100、约1,200、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约3,500和约4,000mm-1
s-1
。
[0010]
在一个或多个实施例中，提供一种用于生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法。在一个或多个实施例中，该方法包括以下步骤：对表达rharg1的大肠杆菌细胞进行菌株发酵，用钴取代rharg1中的锰以提供co-精氨酸酶1中间体(co-rharg1)，纯化该co-精氨酸酶1中间体，以及将co-精氨酸酶1中间体聚乙二醇化以形成原料药(co-rharg1-peg)。在一个或多个实施例中，co-rharg1-peg包含聚乙二醇精氨酸酶(pegzilarginase)。
[0011]
在一个或多个实施例中，该方法包括几个步骤：在生产重组人精氨酸酶(rharg)的生物反应器中培养大肠杆菌细胞，裂解大肠杆菌细胞，从裂解物中去除细胞碎片，将细胞裂解物加载到阳离子交换柱上，用高盐溶液洗脱重组人精氨酸酶蛋白(rharg)，将洗脱的重组人精氨酸酶蛋白(rharg)与钴盐一起孵育以形成钴取代重组人精氨酸酶蛋白(co-rharg)，将钴取代重组人精氨酸酶蛋白(co-rharg)施加至阴离子交换柱并收集流通物，将流通物添加到第三色谱柱上，并且用高盐浓度从第三色谱柱洗脱钴取代重组人精氨酸酶蛋白(co-rharg)。
[0012]
在一个或多个实施例中，用于生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法包括将每升阳离子交换树脂高达60克的重组人精氨酸酶蛋白(rharg)加载到阳离子交换柱上。
[0013]
在一个或多个实施例中，用于生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法包括使用高达约0.5m盐浓度的高盐溶液从阳离子交换柱洗脱重组人精氨酸酶蛋白(rharg)。在一些实施例中，使用0.1m浓度的高盐溶液从阳离子交换柱洗脱重组人精氨酸酶蛋白(rharg)。在一些实施例中，使用约0.0至约0.5m盐浓度的梯度从阳离子交换柱洗脱重组人精氨酸酶蛋白(rharg)。。在一些实施例中，使用约0.0至约0.2m盐浓度的梯度从阳离子交换柱洗脱重组人精氨酸酶蛋白(rharg)。
[0014]
在一个或多个实施例中，生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法包括将从阳离子交换柱洗脱的重组人精氨酸酶蛋白(rharg)与包含co
2
的钴盐一起孵育。在一些实施例中，钴盐包括cocl2。
[0015]
在一个或多个实施例中，用于生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法包括将重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)流通物添加到包含多模式色谱(mmc)柱的第三色谱柱上。
[0016]
在一个或多个实施例中，生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法包括使重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)或重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)与聚乙二醇化反应物反应以提供聚乙二醇化的蛋白质。在一些实施例中，聚乙二醇化的蛋白质
在k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k222、k223、k312和k321处包含一个或多个聚乙二醇化的氨基酸残基。在一些实施例中，聚乙二醇化的蛋白质包含以下项中的一者或多者被聚乙二醇化：约15％至约60％的k16、约35％至约80％的k32、约20％至约85％的k38、约10％至约60％的k40、约10％至约60％的k47、约40％至约90％的k67、约30％至约95％的k74、约30％至约98％的k82、约15％至约65％的k87、约25％至约70％的k88、约25％至约85％的k152、约15％至约65％的k154、约20％至约75％的k171、0％至约30％的k222、0％至约35％的k223、0％至约45％的k312、和0％至约45％的k321。在一些实施例中，聚乙二醇化的蛋白质至少在k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k312和k321处包含聚乙二醇化的氨基酸残基。在一些实施例中，聚乙二醇化的蛋白质在k3、k149、k190、k195、k29、k265和k283处不具有聚乙二醇化的氨基酸残基。
[0017]
co-rharg1-peg的一个或多个实施例涉及在大肠杆菌中表达的钴取代的聚乙二醇化人重组精氨酸酶1酶，其经配制用于静脉内(iv)或皮下(sc)施用。在精氨酸酶1的活性位点处用钴(co
2
)取代天然的锰(mn
2
)可增强生理ph下的稳定性和催化活性。聚乙二醇化还延长了重组精氨酸酶1的循环半衰期(t
1/2
)。
[0018]
在各种实施例中，该方法包括在生物反应器中培养大肠杆菌细胞以生产重组人精氨酸酶1，裂解大肠杆菌细胞并纯化重组人精氨酸酶1(参见图2和3)。co-精氨酸酶1中间体的纯化可通过包括以下一个或多个步骤的纯化程序进行：通过高压均质化进行细胞破碎、匀浆澄清、sp sepharose ff阳离子交换捕获色谱法、钴交换、超滤/渗滤、q sepharose ff阴离子交换流通色谱、capto mmc多模式色谱和超滤/渗滤。经纯化的co-精氨酸酶1中间体可以加工形成聚乙二醇化的原料药或冷冻并储存以供以后转化为原料药。
[0019]
在该方法的优选实施例中，将含有rharg1的大肠杆菌裂解物加载到阳离子交换(cex)色谱柱(也称为“柱1”)上以捕获rharg1，然后用高盐溶液洗脱以提供第一种蛋白质产物(“第一蛋白质产物”)。
[0020]
在一个或多个实施例中，该方法进一步包括将第一蛋白质产物加载到阴离子交换(aex)色谱柱(也称为“柱2”)上并收集流通物以提供第二种蛋白质产物(“第二蛋白质产物”)。在该方法的另一个方面，该方法进一步包括将第二蛋白质产物加载到多模式色谱(mmc)柱上，该柱捕获精氨酸酶1，然后洗脱以提供第三种蛋白质产物(“第三蛋白质产物”)。在一些实施例中，该第三色谱柱(也称为“柱3”)可以是尺寸排阻色谱(sec)柱。
[0021]
各种实施例包括将精氨酸酶的天然锰辅酶改变为钴辅酶。钴取代(也称为钴加载)可以在制造过程中的任何步骤进行。例如，可以在大肠杆菌裂解物、第一蛋白质产物、第二蛋白质产物、第三蛋白质产物上或在任何步骤在聚乙二醇化的精氨酸酶1上进行精氨酸酶1钴加载。在其他实施例中，钴加载可以在从柱1洗脱的精氨酸酶1，或从柱2洗脱的精氨酸酶1，或从柱3洗脱的精氨酸酶1上进行。钴加载可以在从cex柱洗脱的精氨酸酶1、从aex柱洗脱的精氨酸酶1、从mmc柱洗脱的精氨酸酶1或从sec柱洗脱的精氨酸酶1上进行。
[0022]
精氨酸酶1的钴加载可以使用各种含钴溶液并在各种温度完成。在一个或多个实施例中，钴盐包括co
2
诸如cocl2。在一个优选实施例中，精氨酸酶1的钴加载用cocl2在或大约室温进行，诸如在约15至约25℃或约20至约25℃进行。钴加载率可以通过提高或降低反应温度来控制。钴加载也可以在一定的ph值范围内进行。
[0023]
本公开的一个方面涉及改变与cex色谱(柱1)相关的条件。可以增加或减少加载到
柱1的蛋白质的量，以选择不同的精氨酸酶1电荷变体。可以操纵加载因子以引起向更理想的cex电荷种类分布的转变。高达约60g/l的加载因子(以克为单位的蛋白质量/以升为单位的cex柱树脂体积)可以产生具有高比活性的精氨酸酶1。在各种实施例中，加载因子高达约10g/l、约20g/l、约30g/l、约40g/l、约50g/l或约60g/l。
[0024]
在一个优选实施例中，精氨酸酶1首先在柱1上捕获，之后在柱2上然后在柱3上依次纯化。在一个替代实施例中，可以将大肠杆菌裂解物加载到aex柱(例如柱2)上，并将流通物施加到cex柱上以捕获精氨酸酶1。在另一实施例中，精氨酸酶1的钴加载可以在聚乙二醇化反应之后发生。此外，其他色谱柱可用于替代mmc柱，诸如sec柱。
[0025]
本发明的一个方面涉及用于生产重组钴取代人精氨酸酶蛋白(co-rharg)的方法。在一个或多个实施例中，重组人精氨酸酶蛋白(rharg)包含与seq id no:1至少98％相同的氨基酸序列。该方法包括几个步骤：在生产重组人精氨酸酶(rharg)的生物反应器中培养大肠杆菌细胞，裂解大肠杆菌细胞，从裂解物中去除细胞碎片，将细胞裂解物加载到阳离子交换柱上，用高盐溶液洗脱重组人精氨酸酶蛋白(rharg)，将洗脱的重组人精氨酸酶蛋白(rharg)与钴盐一起孵育以形成钴取代重组人精氨酸酶蛋白(co-rharg)，将钴取代重组人精氨酸酶蛋白(co-rharg)施加至阴离子交换柱并收集流通物，将流通物添加到第三色谱柱上，用高盐溶液从mmc柱洗脱钴取代重组人精氨酸酶蛋白(co-rharg)，与摩尔过量的甲氧基peg琥珀酰亚胺基羧甲基酯反应，以及去除过量peg。
[0026]
重组人精氨酸酶1、药物组合物和制剂
[0027]
本发明的另一方面涉及通过本文所述的方法产生的rharg1、co-rharg1和/或co-rharg1-peg，或包含它们的组合物。
[0028]
在一个或多个实施例中，蛋白质在k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k222、k223、k312和k321中的一者或多者处共价连接至聚乙二醇。
[0029]
本发明的另一方面涉及包含重组人精氨酸酶(rharg)蛋白的组合物，其中该蛋白质包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:1至少98％相同，其中蛋白质与非天然金属辅因子复合，其中该非天然金属辅因子为钴，并且其中该蛋白质在k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k222、k223、k312和k321中的一者或多者处共价连接至聚乙二醇。
[0030]
在一个或多个实施例中，蛋白质包含在选自由以下项组成的组的位置处的氨基酸取代：h100、d123、h125、d127、d231、d233、w121、d180、s229、c302和e255。
[0031]
在一个或多个实施例中，蛋白质包含至少一个选自由以下项组成的组的氨基酸取代：d180s、s229c、s229g、c302f、c302i、e255q、d180e和s229a。
[0032]
在一个或多个实施例中，该至少一个氨基酸取代为c302。
[0033]
在一个或多个实施例中，蛋白质包含至少两个氨基酸取代。
[0034]
在一个或多个实施例中，蛋白质为截短的精氨酸酶i蛋白。
[0035]
在一个或多个实施例中，蛋白质进一步包含外源性蛋白质片段。
[0036]
在一个或多个实施例中，外源性蛋白质片段包含免疫球蛋白的fc区或免疫球蛋白的fc区的一部分。
[0037]
在一个或多个实施例中，co-rharg-peg的比活性在约400u/mg至约700u/mg的范围内。
[0038]
在一个或多个实施例中，当在体外测定时，该蛋白质在ph 7.4下针对精氨酸水解表现出在约200mm-1
s-1
至约4,000mm-1
s-1
范围内的k
cat
/km。
[0039]
在一个或多个实施例中，当在体外测定时，该蛋白质在ph 7.4下针对精氨酸水解表现出在约400mm-1
s-1
至约2,500mm-1
s-1
范围内的k
cat
/km。
[0040]
在一个或多个实施例中，peg:co-rharg的摩尔比在约7摩尔/摩尔至约15摩尔/摩尔的范围内。
[0041]
在一个或多个实施例中，游离peg浓度小于或等于100μg/ml。
[0042]
在一个或多个实施例中，组合物的总钴含量在约9μg/ml至约15μg/ml的范围内。
[0043]
在一个或多个实施例中，当组合物加载到成像毛细管等电聚焦(icief)上时，产生至少9个峰，其中峰1小于20％，峰2小于30％，峰3 4在10-30％的范围内，峰5在15-30％的范围内，峰6在10-25％的范围内，峰7小于25％，峰8小于15％，并且峰9小于8％。
[0044]
在一个或多个实施例中，当组合物加载到icief上时，产生至少9个峰，其中峰1在5-7％的范围内，峰2在8-11％的范围内，峰3 4在16-20％的范围内，峰5在21-24％的范围内，峰6在21-22％的范围内，峰7在14-15％的范围内，峰8在5-8％的范围内，并且峰9在2-3％的范围内。
[0045]
本发明的另一方面涉及药物组合物，该药物组合物包含rharg1、co-rharg1和/或co-rharg1-peg以及药用载体。在一个或多个实施例中，该组合物经配制用于静脉内或皮下施用。在一个或多个实施例中，该组合物包含磷酸钾、氯化钠和甘油。在一个或多个实施例中，该组合物包含约50mm nacl、约1mm k2hpo4、约4mm kh2po4和约1.5％w/v甘油。
[0046]
治疗精氨酸酶1缺乏症的方法
[0047]
本发明的另一方面涉及重组人精氨酸酶1诸如co-rharg1-peg的施用。这种施用可以通过任何合适的方法进行，包括iv或sc施用。在该方面的一个或多个实施例中，co-rharg1-peg的剂量由特定算法确定：
[0048]
在该算法的一个或多个实施例中，患者以0.10mg/kg开始治疗。监测血浆精氨酸水平。如果血浆精氨酸水平为》150μm，则将剂量增加至0.20mg/kg。如果血浆精氨酸水平为《50μm，则将剂量减少至0.05mg/kg。否则，患者保持0.10mg/kg的剂量。
[0049]
在该算法的一个或多个实施例中，剂量修改如下：
[0050]
·
如果血浆精氨酸水平为》150μm，则将会使用单个168小时样品将剂量增加下表中的2个剂量水平(不超过0.20mg/kg)，前提是此样品前的2个剂量为a)以mg/kg计的相同剂量水平并且b)连续的(没有遗漏剂量)。
[0051]
·
如果来自2个连续168小时样品的血浆精氨酸水平(无论是否遗漏剂量)两者均为《50μm，则将剂量降低下表中的1个剂量水平，但不降低至低于0.05mg/kg。
[0052]
剂量水平
(a)
剂量1(最小可能剂量)0.05mg/kg2(开始剂量)0.10mg/kg30.15mg/kg4(最大可能剂量)0.20mg/kg
[0053]
(a)聚乙二醇精氨酸酶剂量从水平2，即0.10mg/kg开始。
[0054]
需要时，剂量增加2个剂量水平。剂量减少1个剂量水平。
附图说明
[0055]
本发明的其他特征将从以下书面描述和附图中变得显而易见，其中：
[0056]
图1示出精氨酸酶1的氨基酸和dna序列，以及精氨酸酶2的氨基酸序列。图1(a)示出在大肠杆菌中表达的重组人精氨酸酶1的氨基酸序列(seq id no：1)；并且图1(b)示出重组人精氨酸酶1的密码子优化的dna序列(seq id no：2)。所表达的精氨酸酶1单体缺少在天然人精氨酸酶1单体中发现的n端甲硫氨酸。图1(c)示出精氨酸酶2的氨基酸序列，该序列缺少天然人精氨酸酶2单体中发现的n端甲硫氨酸。
[0057]
图2为大肠杆菌发酵和精氨酸酶1表达的示例性过程的示意图。
[0058]
图3为用于纯化重组人精氨酸酶1、钴取代重组人精氨酸酶1和聚乙二醇化的钴取代重组人精氨酸酶1的示例性过程的示意图。图3(a)示出一种示例性过程，包括阳离子交换柱(柱1)、阴离子交换柱(柱2)和capto多模式柱(柱3)，以及钴加载步骤。图3(b)示出co-精氨酸酶1中间体的聚乙二醇化，之后进行最终过滤和配制以提供原料药。
[0059]
图4示出精氨酸酶1的柱色谱纯化。图4(a)示出将大肠杆菌细胞裂解物加载到阳离子交换柱(柱1)上，洗涤该柱，然后用高盐溶液洗脱(以提供第一蛋白质产物)。通过测量280nm处的uv吸光度来评估蛋白质加载和洗脱。将大约3升(l)的细胞裂解物施加到柱上，然后用大约1.5l缓冲液洗涤柱，然后用少于约1l进行洗脱。图4(b)示出将柱1洗脱的精氨酸酶1(第一蛋白质产物)加载到阴离子交换柱(柱2)上，使用在280nm处的吸光度测量蛋白质浓度。在来自该柱2的流通物中收集精氨酸酶1，以提供第二蛋白质产物。图4(c)示出将精氨酸酶1捕获到capto多模式阳离子交换柱(柱3)上并用高盐溶液洗脱以提供第三蛋白质产物。
[0060]
图5示出分析型阳离子交换hplc方法的结果，该方法用于确定从柱1洗脱的co-精氨酸酶1中间体样品(也称为第一蛋白质产物)的电荷异质性分布。将1mg/ml精氨酸酶1样品加载到阳离子交换柱上，流动相为20mm mes缓冲液，ph 6.0，流速为1.0ml/分钟。在40分钟内引入0-500mm nacl梯度，并通过在280nm处的吸光度估计从该柱洗脱的蛋白质的量。图5(a)示出精氨酸酶1的电荷异质性物质的代表性色谱图。10-20分钟后，精氨酸酶1电荷变体从该分析型hplc柱中洗脱下来。图5(b)示出与图5(a)相同的色谱图，峰放大倍数更大。图5(c)示出将峰号分配给精氨酸酶1阳离子交换电荷变体。图5(d)示出通过成像毛细管等电聚焦(icief)方法解析的原料药的典型电荷异质性分布。
[0061]
图6示出lc/ms方法的结果，用于确定通过在大肠杆菌中表达rharg而生产的精氨酸酶1葡糖酰化变体。lc/ms分析鉴定了未修饰的精氨酸酶1(单体)、葡萄糖酸化的精氨酸酶1、磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶1和2倍(2x)葡萄糖酸化的精氨酸酶1。踪迹来自药物中间体的两次独立生产运行。在35℃在rp lcms上历经33-35分钟对质谱叠加进行汇总；将光谱归一化至未经修饰的精氨酸酶1所产生的信号的峰强度。变体的峰强度与相对丰度成正比。
[0062]
图7示出将0.0-0.2m nacl梯度应用于色谱柱1的结果。通过该梯度，收集每0.25cv(柱体积)的级分。数据代表使用两个不同批次的所收获的细胞浆作为进料的两次柱1运行。用于评估的加载因子为30g/l。该梯度成功地分离了不同的葡萄糖酸化的物质，同时维持了产品回收率。
[0063]
图8示出co-精氨酸酶1中间体和co-rharg1-peg原料药的酶活性。图8(a)示出co-精氨酸酶1中间体的代表性酶动力学分析(在37℃，底物浓度范围为0-2mm的精氨酸到鸟氨酸的转化)。图8(b)示出co-rharg1-peg原料药的代表性酶动力学分析。
[0064]
图9示出co-rharg1-peg原料药的药代动力学分析。图9(a)和(b)示出在单次iv剂量施用co-rharg1-peg后，患者的平均(
±
sd)精氨酸酶1浓度与时间曲线：第1部分.示出线性图(a)和半对数图(b)。请注意，第一平均bql浓度绘制在lloq的一半(0.125μg/ml)处。所有患者的平均循环药物浓度随着co-rharg1-peg剂量的增加而增加。图9(c)至9(f)示出在qw(每周)iv剂量施用co-rharg1-peg后，患者的平均(
±
sd)co-rharg1-peg浓度与时间曲线：第2部分.第1周(c)和第8周(d)的线性图；第1周(e)和第8周(f)的半对数图。
[0065]
图10示出1/2期开放标签研究中的药代动力学(pk)和药效学(pd)的三个代表性综合图(a、b、c)，以评估对精氨酸酶1缺乏症患者的co-rharg1-peg施用。使用递增停止标准，第2部分中决定采用的剂量为：针对患者1的0.09mg/kg，针对患者3的0.12mg/kg，以及0.04mg/kg(针对第2部分所示期间)。通过应用剂量递增停止标准，试验中的其他患者决定采用第2部分的各种剂量水平。这些相同的标准可用于调整(增加或减少)任何已经服用co-rharg1-peg的患者的剂量，作为对超出优选(健康)范围的精氨酸水平的应答。
[0066]
图11示出co-rharg1-peg的iv和皮下施用的比较。患者的优选血浆精氨酸浓度在40μm与和115μm之间(虚线)。co-rharg1-peg的皮下施用导致精氨酸浓度处于该优选范围内的时间比通过iv施用时更长。图11(a)包括来自第2部分结束后第一周的数据，而图11(b)不包括第1周扩展期的iv数据。图作为患者值的平均值示出，且数据来自针对每个患者确定的停止标准的剂量。
[0067]
图12示出在co-rharg1-peg施用后的血浆精氨酸水平和血浆胍基化合物水平。图12(a)示出在基线时、在第1剂后、在第8剂后和在开放标签扩展(ole)期间的血浆精氨酸水平。图12(b)示出在基线时和在ole期间的胍基乙酸(gaa)、n-α-乙酰基-l-精氨酸(naa)、α-酮基-δ-胍基新戊酸(gva)和精氨酸(arga)的血浆水平。
[0068]
图13示出基线缺陷和临床应答结果。图13(a)示出6分钟步行测试(6mwt)、粗大运动功能测量(gmfm)d和e部分以及适应性行为评估系统(abas)的精氨酸酶1缺乏症患者的基线缺陷。图13(b)示出6mwt、gmfm-d和gmfm-e的临床应答。
[0069]
图14示出6mwt、gmfm-d和gmfm-e的时间依赖性改善。图14(a)示出6mwt的临床有应答者占所有患者的百分比，以及在第8剂和第20剂时具有6mwt基线缺陷的患者占所有患者的百分比。图14(b)示出gmfm-d的临床有应答者占所有患者中的百分比，以及在第8剂和第20剂时具有6mwt基线缺陷的患者占所有患者的百分比。图14(c)示出gmfm-e的临床有应答者占所有患者中的百分比，以及在第8剂和第20剂时具有6mwt基线缺陷的患者占所有患者的百分比。
[0070]
图15示出不同批次co-rharg1-peg的位点特异性聚乙二醇化分析。
具体实施方式
[0071]
重组人精氨酸酶1
[0072]
人精氨酸酶1被鉴定为harg1，是一种双核锰金属酶，其催化l-精氨酸(l-arg)水解以生成l-鸟氨酸和尿素。精氨酸酶1是三个非共价键合的相同单体单元的三聚体。单体精氨酸酶1具有酶活性但不太稳定。在精氨酸酶1的活性位点用钴(co
2
)取代天然的锰(mn
2
)可增强生理ph下的催化活性。本文所述的生产钴取代精氨酸酶1酶的方法提供了一种高纯度和高活性的酶。该方法还可以提供co-精氨酸酶1(co-rharg1)作为原料药制造中的分离中
间体。在一个或多个实施例中，该原料药为聚乙二醇化的co-精氨酸酶1(co-rharg1-peg)。co-精氨酸酶1的聚乙二醇化显著延长了循环半衰期。同样，尽管本文具体参考rharg1，但本文所述的方法、制剂和用途也可应用于rharg2。
[0073]
如本文所用，术语“rharg1”是指重组人精氨酸酶1酶，例如与seq id no:1具有至少98％序列同一性的重组酶。
[0074]
如本文所用，术语“co-rharg1”、“co-精氨酸酶1中间体”等是指天然锰辅因子中的至少一些被钴替代的rharg1。在一个或多个实施例中，co-rharg1是co-rharg1-peg的生产和/或纯化过程中的可分离中间体。
[0075]
如本文所用，术语“co-rharg1-peg”、“聚乙二醇化的co-精氨酸酶1”等是指具有一个或多个peg单元的co-rharg1，这些peg单元诸如在n端氨基酸处和/或在一个或多个赖氨酸残基处的一个或多个游离胺处共价连接至酶。
[0076]
co-rharg1-peg原料药的量可以表示为未聚乙二醇化的酶的质量。在该方法的一个实施例中，每mg(以酶为基准)co-rharg1-peg原料药还含有大约1-2mg peg，诸如约1.4mg peg。
[0077]
图1(a)示出在大肠杆菌中表达的氨基酸序列。harg1蛋白质序列获自ncbi数据库(uniprotkb：基因座argi1_human，登录号p05089)。在pcr反应中使用重叠的寡核苷酸来生成精氨酸酶1dna，该dna经过密码子优化以在大肠杆菌中表达(图1(b))。大肠杆菌表达的321个氨基酸的精氨酸酶1单体缺少天然人精氨酸酶1单体中发现的n端甲硫氨酸。co-精氨酸酶1的计算分子量为34721.6道尔顿(表1)。同源三聚co-精氨酸酶1的计算分子量为104164.8道尔顿。精氨酸酶1没有任何二硫键。
[0078]
表1：示例性co-精氨酸酶1中间体的结构信息
[0079]
co-精氨酸酶1的分子量34721.6道尔顿(用钴计算的值)同源三聚co-精氨酸酶1104164.8道尔顿(用钴计算的值)单体的长度321个氨基酸残基二硫键无氨基酸序列重组人精氨酸酶1的一级序列提供在图1中
[0080]
在一个或多个实施例中，单体co-rharg1-peg的计算分子量为约75-115kda。在一个或多个实施例中，同源三聚co-rharg1-peg的计算分子量为约224-344kda。在一个或多个实施例中，peg的平均数为约8至约25摩尔peg/摩尔co-精氨酸酶1单体，诸如约8至约16摩尔peg/摩尔co-精氨酸酶1单体。peg的示例性量包括约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15和约16摩尔peg/摩尔co-精氨酸酶1单体。在一个或多个实施例中，每个peg具有约1,000至约10,000道尔顿的平均分子量，诸如约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,000、约7,000、约8,000、约9,000或约10,000道尔顿。在特定实施例中，peg的平均mw为约5,000道尔顿。
[0081]
在一个或多个实施例中，co-rharg1-peg包含聚乙二醇精氨酸酶(pegzilarginase)。聚乙二醇精氨酸酶有以下两个化学名称：
[0082]
a.α-(羧甲基)-ω-甲氧基-聚(氧-1,2-乙二基)酰胺与精氨酸酶1[钴辅因子](合成人)(1:10)三聚体
[0083]
b.des-met
1-精氨酸酶-1(肝型精氨酸酶，ec 3.5.3.1)(智人)，其中锰已被钴替
代，平均有10个伯胺(n端丝氨酸和n
6-赖氨酸)用[甲氧基聚(乙烯氧基)]乙酰基进行酰胺化，非共价均三聚体，在大肠杆菌中生产。聚乙二醇精氨酸酶的分子式为c
1554h2492n416o453
s6[c3h4o2(c2h4o)n]a单体。三聚体聚乙二醇精氨酸酶的平均分子量为284kda。聚乙二醇精氨酸酶的cas注册号为1659310-95-8。
[0084]
聚乙二醇精氨酸酶的潜在聚乙二醇化位点如下所示：
[0085]
单体序列
[0086][0087]
潜在的修饰残基
[0088][0089]
通常，聚乙二醇化反应在co-rharg1上进行。在一些实施例中，可以对rharg1进行聚乙二醇化反应。在一个或多个实施例中，反应物的量、时间、温度和溶液以及反应物处理(诸如混合、添加速率、peg处理)对于生产一致的聚乙二醇化产物是重要的。通常，co-rharg1上的聚乙二醇化反应在反应缓冲液中在ph 8.4下进行。在一个或多个实施例中，co-rharg1在0.1m磷酸钠缓冲液中在ph 8.4下聚乙二醇化。在一个或多个实施例中，聚乙二醇化反应包括反应物比率，即peg(g)与co-rharg1(g)的比率，在4∶1至1∶1的范围内。在一个或多个实施例中，聚乙二醇化反应包括反应物比率，即peg(g)与co-rharg1(g)的比率为约2.77∶1。在一个或多个实施例中，通过将peg和co-rharg1雾化约5分钟至约300分钟、约10分钟至约300分钟、约20分钟至约300分钟、约30分钟至约300分钟、约5分钟至约280分钟、约10分钟至约280分钟、约20分钟至约280分钟、约30分钟至约280分钟、约5分钟至约260分钟、约10分钟至约260分钟、约20分钟至约260分钟、约30分钟至约260分钟、约5分钟至约240分钟、约10分钟至约240分钟、约20分钟至约240分钟、约30分钟至约240分钟来进行聚乙二醇化反应。在一个或多个实施例中，通过去除过量peg并降低反应缓冲液的ph来停止聚乙二醇化反应。在一些实施例中，通过过滤技术去除过量peg。在一个或多个实施例中，通过将反应缓冲液与储存缓冲液交换来降低ph。在一些实施例中，储存缓冲液包含5mm磷酸钾、50mm nacl、1.5％w/v甘油，且ph 7.4。
[0090]
在一个或多个实施例中，co-rharg1-peg在k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k222、k223、k312和k321氨基酸残基中的一者或多者处被聚乙二醇化。在一些实施例中，co-rharg1-peg至少在k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k312和k321氨基酸残基处被聚乙二醇化。在一些实施例中，co-rharg1-peg在k222和/或k223氨基酸残基处被聚乙二醇化。在一些实施例中，co-rharg1-peg在k222和/或k223氨基酸残基处未被聚乙二醇化。在一些实施例中，co-rharg1-peg在k3、k149、k190、k195、k29、k265和k283氨基酸残基中的一者或多者处未被聚乙二醇化。在一些实施例中，co-rharg1-peg在k3、k149、k190、k195、k29、k265和k283氨基酸残基处未被聚
乙二醇化。
[0091]
在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k16在约15％至约60％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k32在约35％至约80％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k38在约20％至约85％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k40在约10％至约60％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k47在约10％至约60％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k67在约40％至约90％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k74在约30％至约95％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k82在约30％至约98％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k87在约15％至约65％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k88在约25％至约70％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k152在约25％至约85％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k154在约15％至约65％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k171在约20％至约75％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k222在0％至约30％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k223在0％至约35％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k312在0％至约45％的范围内被聚乙二醇化。在co-rharg1-peg的一个或多个实施例中，k321在0％至约45％的范围内被聚乙二醇化。
[0092]
peg-蛋白质摩尔比是聚乙二醇化程度的属性指标。在一个或多个实施例中，约1至约20摩尔的peg已将一摩尔的co-rharg1聚乙二醇化。peg:co-rharg1摩尔比的示例性范围包括1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1和20:1。在一些实施例中，peg:co-rharg摩尔比在约7摩尔/摩尔至约15摩尔/摩尔的范围内。
[0093]
测量游离peg以证明peg清除和稳定性。在一些实施例中，聚乙二醇化的co-rharg1(ml)中的游离peg浓度(μg)为小于或等于500μg/ml、小于或等于400μg/ml、小于或等于300μg/ml、小于或等于200μg/ml、小于或等于100μg/ml和小于或等于50μg/ml。
[0094]
人精氨酸酶1催化尿素循环的第五步也是最后一步，即将l-精氨酸转化为l-鸟氨酸和尿素。聚乙二醇化的原料药co-rharg1-peg催化相同的反应。评估酶活性的测定在ph 7.4和37℃在固定反应时间内测量l-精氨酸到l-鸟氨酸的转化。将产物的转化量换算为反应速率并拟合至michaelis-menten方程以确定km和k
cat
。
[0095][0096]vmax
是在饱和底物浓度下达到的最大反应速率；km是michaelis-menten结合常数，用于测量获得v
max
的一半速度时的底物浓度。酶的转换数k
cat
由v
max
/[e]计算。
[0097]
通过将2mm精氨酸下的反应速度(以微摩尔/分钟表示)除以酶浓度(以mg表示)来确定比活性。
[0098]
在酶活性测定中测量的co-rharg1-peg原料药km和k
cat
值通常分别为0.15-0.22mm和大约200-300/sec。在将co-精氨酸酶1中间体聚乙二醇化以形成原料药后，与未聚乙二醇化的中间体相比，酶活性没有显著变化。然而，与co-精氨酸酶1中间体相比，聚乙二醇化显
著增加了co-rharg1-peg药物产物的循环半衰期。
[0099]
在一个或多个实施例中，蛋白质(例如co-rharg1或co-rharg1-peg)在ph 7.4下表现出大于200mm-1
s-1
的k
cat
/km。在特定实施例中，该蛋白质在ph 7.4下表现出在约200mm-1
s-1
至约4,000mm-1
s-1
范围内的k
cat
/km。在另一实施例中，蛋白质在ph 7.4在37℃表现出在约400mm-1
s-1
至约2,500mm-1
s-1
范围内的k
cat
/km。在特定实施例中，本发明预期一种包含人精氨酸酶1的氨基酸序列和非天然金属辅因子的蛋白质，其中所述蛋白质在37℃、ph 7.4下展现出大于400mm-1
s-1
的k
cat
/km。示例性k
cat
/km值包括在ph 7.4在37℃的约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约800、约900、约1,000、约1,100、约1,200、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约3,500和约4,000mm-1
s-1
，或这些值之间的任何范围。
[0100]
比活性是蛋白质(例如co-rharg1或co-rharg1-peg)效力的指标。在一个或多个实施例中，co-rharg-peg的比活性在约200u/mg至约1000u/mg的范围内。比活性的示例性范围包括约200u/mg至约1000u/mg、约300u/mg至约1000u/mg、约400u/mg至约1000u/mg、约200u/mg至约900u/mg、约300u/mg至约900u/mg、约400u/mg至约900u/mg、约200u/mg至约800u/mg、约300u/mg至约800u/mg、约400u/mg至约800u/mg、约200u/mg至约700u/mg、约300u/mg至约700u/mg和约400u/mg至约700u/mg。
[0101]
在一个或多个实施例中，rharg1、co-rharg1或co-rharg1-peg可以与seq id no:1具有至少98％、98.5％、99％或99.5％的同一性。在一个或多个实施例中，相对于由seq id no:1描述的氨基酸序列，rharg1、co-rharg1或co-rharg1-peg可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多的缺失、取代和/或插入。各种比对算法和/或程序可用于计算两个序列之间的同一性，包括可在国家生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的fasta或blast。
[0102]
在一个或多个实施例中，rharg1、co-rharg1或co-rharg1-peg在选自h100、d123、h125、d127、d231、d233、d180、s229和c302的位置处具有至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，rharg1、co-rharg1或co-rharg1-peg包含至少一个选自由以下项组成的组的氨基酸取代：d180s、s229c、s229g、c302f、c302i、e255q、d180e和s229a。在一个或多个实施例中，rharg1、co-rharg1或co-rharg1-peg在c302处包含至少一个氨基酸取代。
[0103]
使用本文所述的方法，可以用钴替代精氨酸酶1中几乎所有的锰辅因子。钴辅因子的变化导致精氨酸在ph 7.4下的km从2.8mm变化至约0.18mm。在一个或多个实施例中，co-rharg1-peg包含约0.1至约2μgco/mg蛋白质。示例性钴加载量包括约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9和约2μg co/mg蛋白质。
[0104]
测量游离钴以证明钴的清除和稳定性。在一些实施例中，游离钴小于或等于0.10μg/ml、小于或等于0.09μg/ml、小于或等于0.08μg/ml、小于或等于0.07μg/ml、小于或等于0.06μg/ml，小于或等于0.05μg/ml和小于或等于0.04μg/ml。
[0105]
总钴影响蛋白质的效力，并且是结合钴的指标，因为游离钴的量相对较小。在一些实施例中，总钴浓度在约5μg/ml至约20μg/ml、约6μg/ml至约20μg/ml、约7μg/ml至约20μg/ml、约8μg/ml至约20μg/ml、约9μg/ml至约20μg/ml、约5μg/ml至约19μg/ml、约6μg/ml至约19μg/ml、约7μg/ml至约19μg/ml、约8μg/ml至约19μg/ml、约9μg/ml至约19μg/ml、约5μg/ml至
约18μg/ml、约6μg/ml至约18μg/ml、约7μg/ml至约18μg/ml、约8μg/ml至约18μg/ml、约9μg/ml至约18μg/ml、约5μg/ml至约17μg/ml、约6μg/ml至约17μg/ml、约7μg/ml至约17μg/ml、约8μg/ml至约17μg/ml、约9μg/ml至约17μg/ml、约5μg/ml至约16μg/ml、约6μg/ml至约16μg/ml、约7μg/ml至约16μg/ml、约8μg/ml至约16μg/ml、约9μg/ml至约16μg/ml、约5μg/ml至约15μg/ml、约6μg/ml至约15μg/ml、约7μg/ml至约15μg/ml、约8μg/ml至约15μg/ml、和约9μg/ml至约15μg/ml的范围内。
[0106]
在各种实施例中，co-rharg1-peg包含少于约1μg mn/mg蛋白质，诸如少于约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6、约0.5、约0.4、约0.3、约0.2、约0.15、约0.1、约0.09、约0.08、约0.07、约0.06、约0.05、约0.04、约0.03、约0.02或约0.01μg mn/mg蛋白质。在特定实施例中，co-rharg1-peg原料药含有约2μg co/mg蛋白质和约0.05μg mn/mg蛋白质。
[0107]
在各种实施例中，co-rharg1-peg包含少于约1μg fe/mg蛋白质，诸如少于约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6、约0.5、约0.4、约0.3、约0.2、约0.15、约0.1、约0.09、约0.08、约0.07、约0.06、约0.05、约0.04、约0.03、约0.02或约0.01μg fe/mg蛋白质。
[0108]
rharg1、co-rharg1和pegrharg1的生产和纯化
[0109]
示例性上游和下游生产方法的概述见图2和图3。
[0110]
摇瓶扩张
[0111]
摇瓶扩张/发酵的目的是生成接种物，从而为生产发酵罐接种。摇瓶扩张产生用于生产反应器接种的细胞团以及用于分析目的的额外细胞团。精氨酸酶1发酵过程的代表性概述见图2。
[0112]
将接种培养基的等分试样引入一个500ml烧瓶(原代烧瓶)和六个3l一次性烧瓶(二代烧瓶)中。将烧瓶高压灭菌，并将灭菌后添加物转移到每个烧瓶中。在接种之前，将初级培养基预热到37℃的处理温度。在二次接种前，将二代烧瓶预热至37℃的处理温度。
[0113]
从冷藏库中取出一瓶表达精氨酸酶1的大肠杆菌工作细胞库(wcb)并解冻。将目标体积的解冻细胞(约1.1ml)无菌地添加到原代烧瓶中，并将烧瓶在37℃搅拌下孵育。从接种后几个小时开始，每小时从烧瓶中取出样品，以通过在600nm处的光密度(od600)跟踪细胞生长。一旦原代烧瓶中的目标od600达到≥1.0，就将目标体积(15ml)的原代培养物无菌地转移到每个二代烧瓶中。二代烧瓶在37℃搅拌下孵育。从接种后4小时开始，每小时从一个二代烧瓶中取出样品，一旦od600达到≥1.5，就增加至每30分钟一次。当测量达到≥2.0od600的规定密度时，对剩余的二代烧瓶进行取样。如果所有二代烧瓶的平均od600满足指定的转移标准，则将烧瓶合并，并将接种物转移到生产发酵罐中。精氨酸酶1发酵过程的代表性概述见图2。
[0114]
生产发酵
[0115]
生产发酵的目的是扩大摇瓶培养并诱导精氨酸酶1的生产。生产发酵可以产生大量的精氨酸酶1。在摇瓶扩张阶段建立细胞团之后，发酵过程生产精氨酸酶1(在大肠杆菌中)作为可溶性蛋白质。在一个实施例中，1500l发酵罐含有包括接种前的无菌添加物的初始分批培养基。接种后，发酵罐的输入包括营养物进料、消泡剂溶液、添加酸或碱以维持培养物的ph值。二级容器盛放营养物进料培养基。自动控制策略维持重要参数以进行一致的细胞生长，包括溶解氧、喷射速率、搅拌速率、ph、压力和温度。精氨酸酶1表达通过添加iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷)诱导，大约18小时后收获。在生产结束时通过监测细胞密度、
固体百分比和可溶性精氨酸酶1的比例来评估发酵罐的性能。
[0116]
在优选实施例中，发酵培养基直接在生产发酵罐中制备。在原位灭菌(sip)之前，将经纯化的水添加到发酵培养基中至所需重量。培养基冷却后，将灭菌后添加物卡那霉素、葡萄糖和磷酸钾灭菌过滤到生产发酵罐中。如有必要，使用0.2μm无菌过滤器将无菌培养基与经纯化的水混合至指定的接种前重量。发酵培养基用碱(氢氧化铵)滴定至受控的ph值。
[0117]
使用合并的接种物通过压力辅助转移对37℃的生产发酵罐进行无菌接种。以固定频率收集发酵液样品并测量，以进行从接种时间到发酵冷却的od600分析。从接种后3小时开始以固定间隔采集葡萄糖样品，并在接种后9小时增加频率。在发酵过程期间根据需要添加消泡剂溶液，以避免培养物过度起泡。溶解氧由搅拌级联控制，按需喷氧。使用酸和碱输入来维持培养物的ph值。生长培养基优选维持在36-38℃和7.0-7.4的ph值，同时搅拌和通气。
[0118]
营养物进料由酵母提取物、martone b-1、l-半胱氨酸盐酸盐和甘油组成。当葡萄糖浓度小于10g/l(接种后12-14小时)时开始进料，并以固定速率持续到生产结束。通过添加iptg触发表达。诱导持续18小时。发酵过程完成后进行冷却，为收获操作做准备。生产发酵罐可生成约6g/l的可溶性精氨酸酶1滴度。生产发酵的概述见图3。
[0119]
收获操作
[0120]
收获操作捕获含有可溶性精氨酸酶1的细胞，破开细胞/裂解细胞，并通过使用离心和/或过滤清除裂解物中的细胞碎片。回收的细胞浆可以冷冻或低温保存，以长期储存。收获操作可以通过离心收集细胞，通过匀浆器两次裂解或在压力下(french压力机)破碎细胞，第二次离心，并在第一个色谱步骤之前进行膜过滤。
[0121]
在优选实施例中，使用碟式离心机将全细胞从发酵培养基中分离出来。将得到的细胞浆液重新悬浮在ph 7.6的25mm hepes中，然后通过匀浆器处理两次。也可以使用在ph 7.2-7.6的范围内的25mm hepes的ph值。使用离心机澄清裂解的材料以去除细胞碎片，然后通过0.2μm级过滤器进行膜过滤。在优选实施例中，收获步骤在≤15℃的目标温度进行。
[0122]
在另一实施例中，使用高压进行细胞破碎。将细胞浆液以受控的速率转移到均质器中，并且使经均质化的流出物通过热交换器以减少在压力均质化期间出现的温度升高。冷冻细胞经历两次均质化。将第一次裂解的合并物从收集容器转移回进料容器。两次处理之间的保持时间缩至最短，以减少潜在的微生物生长。
[0123]
通过离心澄清裂解后的物质，以从裂解物的可溶性成分中去除细胞碎片。将裂解物以受控的速率转移到碟式间歇卸料离心机中。收集澄清的裂解物用于进一步处理。
[0124]
过滤澄清的裂解物，诸如使用约0.2μm过滤器。过程转换过滤器也可用于过程操作期间的微生物控制。为此，过滤器可以是0.5μm或0.2μm过滤器。该步骤还从在澄清操作期间可能未分离的澄清材料中去除小颗粒。使用前，过滤器用经纯化的水彻底冲洗，并用25mm hepes缓冲液，ph 7.6平衡。每个下游过程步骤之前都可以有一个预过滤器，以减轻潜在的生物负担负荷。
[0125]
rharg1、co-rharg1和co-rharg1-peg的纯化
[0126]
不管用于培养表达rharg1的细胞的方法(例如上述发酵过程)如何，本文所述的纯化方法可用于捕获rharg1并进一步纯化酶。纯化方法可以包括任选的步骤，诸如加载钴以生产co-rharg1和/或与聚乙二醇化反应物反应以提供co-rharg1-peg。
[0127]
纯化过程的各种实施例涉及使用阳离子交换(cex)柱来捕获rharg1。在一个或多个实施例中，cex柱是具有多个色谱柱的系统中的第一个柱(“柱1”)。从柱1洗脱的蛋白质产物为“第一蛋白质产物”。
[0128]
在一个或多个实施例中，柱1使用阳离子交换色谱法在约7至约8范围内的ph诸如约7.6的ph下结合rharg1。在一个或多个实施例中，rharg1在无盐或低盐浓度下结合。在一个或多个实施例中，rharg1用具有高盐(例如nacl)浓度的缓冲液诸如高达约0.5m nacl洗脱。示例性盐浓度包括约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、0.1、约0.2、约0.3、约0.4和约0.5m nacl。
[0129]
在各种实施例中，使用盐梯度来分离rharg1的不同电荷变体。示例性盐梯度为约0至约0.5m nacl、约0至约0.4m nacl、约0至约0.3m nacl、约0至约0.2m nacl、或约0至约0.1m nacl。
[0130]
在一个或多个实施例中，该方法进一步包括将第一蛋白质产物(任选地在钴取代之后)加载到阴离子交换(aex)色谱柱(“柱2”)上并收集流通物以提供第二种蛋白质产物(“第二蛋白质产物”)。在该方法的另一个方面，该方法进一步包括将第二蛋白质产物加载到捕获精氨酸酶1的第三柱上，然后被洗脱以提供第三种蛋白质产物(“第三蛋白质产物”)。在一些实施例中，该第三色谱柱(“柱3”)可以是尺寸排阻色谱(sec)柱或多模式色谱(mmc)柱。
[0131]
各种实施例提供rharg1加载有co以代替mn辅因子。在一个或多个实施例中，使用co
2
盐诸如cocl2进行co加载。孵育时间是温度依赖性的，因此较低的钴取代温度需要较长的孵育时间，较高的钴取代温度不需要较长的孵育时间。钴加载温度可低至1℃或高于50℃，而相应的孵育时间可长达8小时以上或小于10分钟。
[0132]
各种实施例提供rharg1或co-rharg1与聚乙二醇化反应物诸如甲氧基peg琥珀酰亚胺羧甲基酯(mw 5000)反应。与酶相比，聚乙二醇化反应物通常以10-40的摩尔过量提供。孵育时间可以在0.5到4小时的范围内。聚乙二醇化期间的ph可以是约8至约9，诸如约8.4的ph。
[0133]
在一个或多个实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含精氨酸酶i单体、葡萄糖酸化的精氨酸酶i、磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶i、2x葡萄糖酸化的精氨酸酶i、葡萄糖酸化的 磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶i和2x磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶i。
[0134]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含至少70％的精氨酸酶i单体。示例性的量包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的精氨酸酶i单体。在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含少于10％的葡萄糖酸化的精氨酸酶i。示例性的量包括约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％或约9％葡萄糖酸化的精氨酸酶i，或这些值之间的任何范围。在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含少于10％的磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶i。示例性的量包括约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％或约9％的磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶i。在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含至少70％的精氨酸酶i单体、少于10％的葡萄糖酸化的精氨酸酶i和少于10％的磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶i。
[0135]
由于聚乙二醇化三聚体中的异质性水平，成像毛细管等电聚焦(icief)提供了聚
乙二醇化蛋白质一致性的测量。在一个或多个实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1的icief分析包含九个不同的峰，即峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8和峰9，每个对应九种带不同电荷的物质，即物质1、物质2、物质3、物质4、物质5、物质6、物质7、物质8和物质9。每个峰的曲线下面积对应于该特定物质的比例。在一个或多个实施例中，某些峰可以组合在一起用于相关物质，例如峰1 2或峰3 4。
[0136]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰1的曲线下面积，其比例小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％和小于约10％。
[0137]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰2的曲线下面积，其比例小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％和小于约10％。
[0138]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰1 2的曲线下面积，其比例小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％和小于约10％。
[0139]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰3 4的曲线下面积，其比例在约2％至约40％、约2％至约35％、约2％至约30％、约2％至约25％、约4％至约40％、约4％至约35％、约4％至约30％、约4％至约25％,约6％至约40％、约6％至约35％、约6％至约30％、约6％至约25％、约8％至约40％、约8％至约35％、约8％至约30％、约8％至约25％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、和约10％至约25％的范围内。
[0140]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰5的曲线下面积，其比例在约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约5％至约25％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、和约15％至约25％的范围内。
[0141]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰6的曲线下面积，其比例在约2％至约35％、约2％至约30％、约2％至约25％、约2％至约20％、约4％至约35％、约4％至约30％、约4％至约25％、约4％至约20％,约6％至约35％、约6％至约30％、约6％至约25％、约6％至约20％、约8％至约35％、约8％至约30％、约8％至约25％、约8％至约20％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、和约10％至约20％的范围内。
[0142]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰7的曲线下面积，其比例小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％和小于约10％。
[0143]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰8的曲线下面积，其比例小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％和小于约5％。
[0144]
在一些实施例中，经纯化的聚乙二醇化蛋白质rharg1或co-rharg1包含峰9的曲线下面积，其比例小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约8％、小于约6％和小于约4％。
[0145]
rharg1、co-rharg1和co-rharg1-peg的施用
[0146]
如本文所述的rharg1、co-rharg1和co-rharg1-peg(以及包含它们的组合物)可以
通过任何合适的途径施用，包括静脉内、鞘内、皮下、肌内、瘤内和/或腹膜内。在一个或多个实施例中，rharg1、co-rharg1和co-rharg1-peg(或包含它们的组合物)静脉内(iv)或皮下(sc)施用。
[0147]
其含有rharg1、co-rharg1和co-rharg1-peg的组合物可以与生理上可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂和赋形剂一起以制剂形式提供。此类组合物通常制备为液体溶液或悬浮液，作为注射剂。合适的稀释剂和赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油等，以及它们的组合。此外，如果需要，组合物可以含有少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、稳定剂或ph缓冲剂。
[0148]
下面提供了关于施用rharg1、co-rharg1和co-rharg1-peg(例如聚乙二醇精氨酸酶)的示例性方法和说明。尽管以下描述是具体针对聚乙二醇精氨酸酶，但这些方法和说明也适用于其他重组精氨酸酶1和2酶。
[0149]
推荐的静脉给药方案：
[0150]
在开始治疗前获得基线血浆精氨酸浓度。针对arg1-d患者的聚乙二醇精氨酸酶初始推荐剂量为0.10mg/kg，每周一次，作为单次静脉输注施用。如果0.10mg/kg的初始剂量不能将血浆精氨酸降低至≤150μmol/l的水平，则可以将剂量调整至最大0.20mg/kg，每周一次。如果在治疗期间，血浆精氨酸水平下降至低于50微摩尔/升，则考虑减少剂量。在施用5次或更多iv剂量的聚乙二醇精氨酸酶后，考虑对arg1-d患者皮下施用聚乙二醇精氨酸酶，并继续定期监测血浆精氨酸水平。
[0151]
推荐的皮下给药方案：
[0152]
当从聚乙二醇精氨酸酶静脉内疗法过渡到皮下施用时，施用第一次皮下剂量，而不是计划内的下一次静脉内剂量。初始皮下剂量应与最后一次iv剂量施用的mg/kg剂量相同。皮下剂量可以根据临床指示进行调整，以确保血浆精氨酸水平保持在50至150微摩尔/升的范围内。
[0153]
血液精氨酸监测：
[0154]
开始使用聚乙二醇精氨酸酶治疗后，应进行血浆精氨酸监测，直到患者的血浆精氨酸水平在50至150μmol/l的目标范围内。此后，建议定期监测血浆精氨酸以评估血液精氨酸控制。在改为皮下剂量施用或改变饮食时，可能需要额外的血浆精氨酸监测。
[0155]
制备和施用说明
[0156]
聚乙二醇精氨酸酶以冷冻液体制剂形式提供，装在10ml一次性使用的玻璃小瓶中，其中含有5ml浓度为1mg/ml或5mg/ml的聚乙二醇精氨酸酶。每个一次性使用的玻璃小瓶的聚乙二醇精氨酸酶旨在用作单次静脉注射或皮下注射。施用前目视检查聚乙二醇精氨酸酶是否有颗粒物质和变色。聚乙二醇精氨酸酶是一种无色至淡黄色或淡粉色的溶液。如果变色、混浊或小瓶中存在颗粒物，请丢弃。从小瓶去除翻盖。用酒精棉签擦拭小瓶的橡胶塞进行消毒。使用带有18g针头的无菌注射器从小瓶中取出适当体积的药物。如果需要一瓶以上，请使用单独的针头从每个小瓶中吸取溶液。计算要从小瓶中取出用于注射泵中的溶液。将适当体积的药物吸入注射器后，使用单独的针头吸取生理盐水以达到40ml的总体积。如下计算所需的药物的量：
[0157]
1.0mg/ml聚乙二醇精氨酸酶的量＝患者体重(kg)x剂量水平(mg/kg)
[0158][0159]
使用注射泵历经30分钟通过静脉输注施用聚乙二醇精氨酸酶。
[0160]
表2：针对每周一次施用0.1mg/kg的基于体重的给药
[0161][0162][0163]
在一个或多个实施例中，用于皮下注射的体积具有最大体积，诸如对于成年患者而言最大为每次注射2ml，且/或对于儿童患者而言最大体积为每次注射1ml。如果计算出的皮下施用体积大于最大体积，则可以使用更高的小瓶浓度(例如5mg/ml而不是1mg/ml)并且/或可以将该体积分成多个较小的注射剂(例如将4ml注射分为2次注射，每次2ml)。
[0164]
剂型和强度
[0165]
聚乙二醇精氨酸酶注射液是一种可作为下述者获得的无色至微黄色或微粉红色溶液，装在10ml小瓶中：
[0166]
a.注射液：5ml，1.0mg/ml
[0167]
b.注射液：5ml，5.0mg/ml
[0168]
警告和注意事项
[0169]
使用聚乙二醇精氨酸酶可能会发生超敏反应。在聚乙二醇精氨酸酶输注期间和之后监测所有患者的急性过敏反应的体征和症状(例如荨麻疹、瘙痒、红斑、低血压、心动过速)。在发生严重超敏反应的情况下，立即减慢或停止施用聚乙二醇精氨酸酶并施用适当的医疗护理。考虑在给药前对患者进行非镇静抗组胺药的术前用药。在需要皮质类固醇的情况下，应谨慎使用皮质类固醇，因为它们可能导致高氨血症。
[0170]
妊娠：妊娠类别b
[0171]
已在小鼠和大鼠中以高达100mg/kg的剂量进行了生殖研究。没有证据表明聚乙二醇精氨酸酶对胎儿造成伤害。然而，没有对孕妇进行充分和良好对照的研究。由于动物生殖研究并不总是能预测人类的应答，因此只有在明确需要时才应在妊娠期间使用聚乙二醇精氨酸酶。
[0172]
哺乳期妇女
[0173]
不知道人乳中是否存在聚乙二醇精氨酸酶。母乳喂养的发育和健康益处应与母亲对聚乙二醇精氨酸酶的临床需求以及该药物对于母乳喂养的儿童的任何潜在不利影响一起考虑。
[0174]
说明
[0175]
聚乙二醇精氨酸酶是一种钴取代重组人精氨酸酶i酶，它与单甲氧基聚乙二醇(mpeg)共价缀合，通过催化与精氨酸酶1相同的反应而起作用，将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。人精氨酸酶1是一种双核锰金属酶。为了生产聚乙二醇精氨酸酶，锰辅因子被钴替代以产生co-精氨酸酶i。在精氨酸酶i的活性位点用钴(co 2)取代天然锰(mn 2)增强了生理ph值下的稳定性和催化活性。聚乙二醇化延长循环半衰期。聚乙二醇精氨酸酶的平均分子量为大约284kda。聚乙二醇精氨酸酶的比活性范围为大约每mg蛋白质含量320-600单位。一个活性单位定义为在37℃每分钟将1微摩尔精氨酸转化为鸟氨酸所需的酶量。
[0176]
聚乙二醇精氨酸酶旨在用于静脉内或皮下输注，以无菌、透明、无色至淡黄色或淡粉色溶液的形式提供，在含有50mm氯化钠、5mm磷酸钾和1.5％w/v甘油的缓冲液，ph为7.4中，配制为1mg/ml和5mg/ml浓度。它以不含防腐剂的无菌溶液形式提供，装在一次性使用的透明玻璃小瓶中。每瓶1mg/ml聚乙二醇精氨酸酶成品药含有5ml成品药(每瓶5mg聚乙二醇精氨酸酶)。每瓶5mg/ml聚乙二醇精氨酸酶成品药含有5ml成品药(每瓶25mg聚乙二醇精氨酸酶)。小瓶用带涂层的橡胶塞塞住并用铝翻盖密封，在≤-60
°
℃冷冻储存，并在使用前解冻。
[0177]
药效学
[0178]
对精氨酸酶1缺乏症的成人和儿童患者进行聚乙二醇精氨酸酶治疗后，血液精氨酸浓度从治疗前的基线值降至40至115微摩尔/升的正常血液精氨酸范围。在给药后大约8小时观察到l-精氨酸的最大抑制，以剂量依赖性方式降低，并在给药后168小时恢复至给药前水平。在聚乙二醇精氨酸酶与精氨酸之间观察到强烈的相关性，在iv施用后对精氨酸具有立即抑制作用，并且在给药后24小时内达到精氨酸浓度的最大降低。
[0179]
药代动力学
[0180]
在对14名受试者进行iv施用后，在0-168小时的整个给药间隔期间收集药代动力学样品，以表征聚乙二醇精氨酸酶药代动力学与精氨酸之间的关系。在整个剂量范围
(0.015mg/kg至0.2mg/kg)中，通过c
max
和auc
0-168
测量的聚乙二醇精氨酸酶暴露量，与剂量大致成正比增加，其中剂量增加13倍导致c
max
和auc
0-168
增加14倍。在每周一次的iv给药方案后未观察到聚乙二醇精氨酸酶的积累，在整个剂量范围内的t
1/2
为大约30小时，并且在暴露度量中具有低至中等的受试者间变异性(13％至46％cv)。
[0181]
动物毒理学和/或药理学
[0182]
在精氨酸酶i的新生转基因小鼠模型和他莫昔芬诱导的精氨酸酶缺乏症的成年小鼠模型中评估了聚乙二醇精氨酸酶对精氨酸水平的药理效应。这些模型模拟其中存在显著过量的循环精氨酸和精氨酸分解代谢物的人类疾病；然而，与患有精氨酸酶i缺乏症的人类不同，这些动物会发展出严重且通常致命的高氨血症。还在精氨酸诱导的高精氨酸血症大鼠模型中评估了药理作用。聚乙二醇精氨酸酶以剂量依赖性方式降低血浆精氨酸水平。
[0183]
在出生后(pnd)第21天(相当于2岁人类)幼年大鼠中评估聚乙二醇精氨酸酶的潜在毒性和tk，每周一次静脉推注0.1、0.3和1.0mg/kg，持续6个月，然后是6-周的恢复期。聚乙二醇精氨酸酶耐受良好，没有与测试品相关的死亡率，也没有观察到测试品对以下方面的显著影响：食物消耗、凝血、尿液分析、检眼镜检查、性成熟、生长激素分析、骨髓分析、功能观察组(fob)评估和神经行为测试(听觉惊吓习惯、运动活动或莫里斯水迷宫)。在6个月终末期和6周恢复间隔结束时，没有与聚乙二醇精氨酸酶相关的宏观发现。在0.3和1.0mg/kg时，不利的微观变化仅限于睾丸和附睾，并与男性生殖器官的重量减轻和不利精子分析结果相关。在1.0mg/kg时，观察到对精子分析的不利影响，即精子活力降低、附睾尾部精子数量减少、精子浓度降低和观察到的异常精子百分比增加。这些观察结果被认为是与治疗直接相关的效应，并与在0.3mg/kg和1.0mg/kg时的睾丸中微小管状变性的微观变化相关。在对照组和1.0mg/kg组的6-周恢复期之后，这些变化总体上是可逆的，但异常精子百分比和精子计数增加除外。6周后的部分可逆性并不出人意料，因为正常的精子发育周期为大约9周或比6周的恢复期更长。
[0184]
重要的是，组织病理学没有观察到明显的聚乙二醇化效应。毒代动力学数据表明，在整个研究过程中维持了聚乙二醇精氨酸酶暴露量。总之，女性的noael为1.0mg/kg。在男性中，根据睾丸在0.3mg/kg和1.0mg/kg时的微观变化，noael为0.1mg/kg。
[0185]
以0.1、0.3和1.0mg/kg的剂量每周一次向食蟹猴静脉推注注射，持续13周，然后进行4周的恢复期后，评估聚乙二醇精氨酸酶的潜在毒性和tk。在1.0mg/kg时观察到的临床体征包括体重下降、毛发稀疏(全身)、皮肤干燥/变色(全身)、颤抖、食欲不振、水样粪便、活动减少、共济失调、肌肉萎缩和/或不整洁/驼背的外观。在临床病理参数(凝血、生长激素和尿液分析)、ecg和眼科检查、呼吸频率和血压评估中未发现与治疗相关的效应。
[0186]
如何提供/储存和处理
[0187]
聚乙二醇精氨酸酶作为注射液提供。
[0188]
聚乙二醇精氨酸酶冷冻供应(≤-60℃)。稀释的聚乙二醇精氨酸酶应立即使用。如果无法立即使用，稀释的聚乙二醇精氨酸酶可在施用期间在2℃至8℃(36
°
f至46
°
f)储存长达8小时。
[0189]
实例
[0190]
在描述本公开的若干示例性实施例之前，应理解本公开不限于以下具体说明中阐述的构造或过程步骤的细节。本公开能够用于其他实施例并且能够以各种方式来实践或执
行。
[0191]
在以下实验公开中，采用以下缩写：eq(当量)；m(摩尔浓度)；μm(微摩尔浓度)；mm(毫摩尔浓度)；n(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；l(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；mw(分子量)；pbs(磷酸盐缓冲盐水)；min(分钟)。
[0192]
实例1：阳离子交换柱色谱(柱1)
[0193]
在优选实施例中，精氨酸酶1被捕获在阳离子交换柱(cex)上，以减少与产物相关的杂质和与过程相关的杂质，诸如宿主细胞蛋白(hcp)、dna和内毒素(关于纯化过程的概述参见图3)。在特定实施例中，精氨酸酶1纯化过程中的第一柱(柱1)色谱步骤使用sp sepharose ff树脂和入口热交换器。柱1使用阳离子交换色谱法不存在盐的情况下在ph 7.6结合精氨酸酶1，并用盐浓度增加的缓冲液洗脱(图4(a))。在一个实施例中，盐是nacl，柱1的洗脱在室温用25mm hepes、0.1m nacl，ph 7.2-7.6进行。然而，替代性实施例是可能的，诸如将nacl梯度应用于柱1。
[0194]
图4(a)示出在柱1上的精氨酸酶1的代表性纯化。将大约三升澄清的大肠杆菌裂解物加载到阳离子交换柱上。从在280nm处的高吸光度可以看出，大量蛋白质没有结合至色谱柱上，而是在流通物中被检测到。然后用大约两升的柱洗涤溶液洗涤该柱。通过在280nm处的吸光度检测，然后用0.1m nacl洗脱富含精氨酸酶1的级分(最终峰)。
[0195]
实例2：钴取代
[0196]
在优选实施例中，精氨酸酶1天然锰辅酶被钴替代。在钴取代(也称为钴加载)期间，正常情况下存在于精氨酸酶1中的两个锰离子中的一者或两者被钴离子替代。钴取代步骤可以使用多种温度以及多种钴浓度(参见表2)。用于钴取代的孵育时间可短至10分钟，并在50℃以上进行。相反，钴加载温度可低至1℃或5℃，并进行8小时以上。此外，加载到精氨酸酶1中的钴比例越高，比活性越高。
[0197]
从柱1洗脱的精氨酸酶1(也称为柱1合并物)可以保持在室温，用于钴取代步骤。在一个实施例中，通过将氯化钴原液(0.5m cocl2)以规定的速率添加到柱1合并物中而将该原液稀释50倍，最终氯化钴浓度为10mm。然后将钴取代反应物在20℃混合两小时。在另一实施例中，精氨酸酶1钴加载在室温在10mm cocl2溶液中进行约2小时至约8小时。
[0198]
钴加载步骤的概述见表3。
[0199]
表3
[0200]
co-精氨酸酶e l钴加载
[0201][0202]
*图表
[0203]
实例3：超滤/渗滤1(uf/df 1)
[0204]
uf/df 1去除游离钴离子并将co-精氨酸酶1交换至溶液中，为阴离子交换色谱法做准备。uf/df1步骤使用截留分子量为30kda的膜。此步骤的一个重要功能是在阴离子交换色谱之前降低游离钴的水平并对co-精氨酸酶1合并物进行缓冲液交换。用清洁溶液(0.5n naoh)对膜进行消毒并用水冲洗。进行标准化透水性测试(nwp)，然后在用于生产之前平衡。一旦uf/df系统平衡，co-精氨酸酶1合并物将针对25mm hepes、o.1m nacl，ph 7.6渗滤三倍渗滤体积，然后针对50mm tris，ph 8.4渗滤四倍渗滤体积。渗滤后，使用两倍于系统滞留体积的50mm tris，ph 8.4将该合并物再循环并从系统中回收。
[0205]
通过下述步骤清洁uf/df1膜：进行2m nacl冲洗，之后使用0.5n naoh进行变性清洁步骤，再循环30分钟。该系统用经纯化的水冲洗，并测试nwp以评估清洁程序的有效性。膜可以储存在0.1n naoh中。
[0206]
在另一实施例中，第一次缓冲液交换为到25mm hepes，0.1m nacl，ph 7.2-7.6中，第二次交换为到50mm tris，ph 8.1-8.5中。
[0207]
实例4：阴离子柱色谱(柱2)
[0208]
精氨酸酶1纯化的优选实施例使用作为阴离子交换柱色谱的另一个柱(“柱2”)。柱2的一个实施例为q sepharose ff树脂。此柱2步骤的一个功能是减少uf/df1合并物中与过程相关的杂质，诸如宿主细胞dna和内毒素。柱2结合这些杂质，而co-精氨酸酶1流通并在加载和洗涤步骤期间被收集在色谱柱流出物中。在一个实施例中，柱2的阴离子交换流通色谱使用q sepharose ff进行，并且使用缓冲液50mm tris，ph 8.1-8.5将高达40g蛋白质/l树脂加载到柱上。
[0209]
在该方法的另一实施例中，将第一蛋白质产物加载到阴离子交换柱上以捕获杂质，同时在流通物中收回精氨酸酶1。图4(b)是在阴离子交换柱(柱2)上纯化精氨酸酶1的代表性色谱图。从在280nm处的吸光度可以看出，在流通物中检测到大量蛋白质。杂质被捕获在柱2上，不会被洗脱到柱2合并物(也称为第二蛋白质产物)中，该合并物进一步富集精氨酸酶1。
[0210]
实例5：capto多模式柱色谱(柱3)
[0211]
在优选实施例中，精氨酸酶纯化过程使用第三个柱色谱柱(柱3)。在一个实施例中，柱3为capto多模式色谱(mmc)柱或替代性地尺寸排阻柱。使用mmc的实施例将精氨酸酶1捕获在柱上，而与过程相关的杂质诸如宿主细胞蛋白(hcp)、dna和内毒素在流通物中被洗掉。在此实施例中，可在不存在盐的情况下在ph 8.4由柱捕获co-精氨酸酶1，然后用盐浓度增加的缓冲液洗脱co-精氨酸酶1。capto多模式阳离子交换色谱柱的代表性示例如图4(c)所示。
[0212]
在一个实施例中，mmc色谱(柱3)使用大约15个柱体积来加载高达30g蛋白质/l树脂，并且使用50mm tris、250mm nacl，ph 8.1-8.5进行高盐步骤洗脱。在几个实施例中，将来自阴离子交换柱(柱2)的流通物在ph 8.4加载到capto mmc柱上，洗涤，然后使用50mm氨丁三醇、250mm氯化钠洗脱所结合的co-精氨酸酶1。
[0213]
实例6：超滤/渗滤2(uf/df 2)
[0214]
uf/df 2浓缩精氨酸酶1并将蛋白质交换到预聚乙二醇化的中间体中。uf/df2步骤使用截留分子量为30kda的膜。此步骤的一个重要功能是在聚乙二醇化之前(或在额外的过滤和储存之前)，对未聚乙二醇化的co-精氨酸酶1中间体的柱3合并物进行缓冲液交换。用清洁溶液(0.5n naoh)对膜进行消毒并用水冲洗。一旦uf/df系统达到平衡，柱3合并物(也称为第三蛋白质产物)将针对20mm磷酸钠、50mm氯化钠、1.5％(w/v)甘油，ph 7.4渗滤五倍渗滤体积。如果柱3合并物浓度为《8g/l，则将该合并物进一步浓缩至8g/l。渗滤(和浓缩，如果需要)后，使用两倍于系统滞留体积的20mm磷酸钠、50mm氯化钠、1.5％(w/v)甘油，ph 7.4将该合并物再循环并从系统中回收。回收后，可以采用渗滤溶液进行两步稀释。第一次稀释的目标浓度为6g/l，第二步的目标浓度为5g/l。可以使用两个步骤来达到目标。如果第一次稀释后的浓度在目标范围内，则可能不需要第二步。
[0215]
实例7：中间体过滤和uf/df 3
[0216]
在聚乙二醇化反应之前，含钴的精氨酸酶1可以长期储存，包括长期冷冻。中间体co-精氨酸酶可通过0.2μm过滤器过滤，并可冷冻长期储存。
[0217]
uf/df3步骤使用截留分子量为30kda的膜。此步骤的一个功能是对经过滤的uf/df2合并物(新鲜或解冻)进行缓冲液交换和浓缩，以提供最适合聚乙二醇化的条件。如果使用冷冻的co-精氨酸酶1中间体作为起始材料，将在室温下解冻长达36小时。用清洁溶液(0.5n naoh)对膜进行消毒并用水冲洗。进行标准化透水性测试(nwp)，然后在用于生产之前平衡。一旦uf/df系统达到平衡，co-精氨酸酶1中间体将针对0.1m磷酸钠，ph 8.4渗滤五倍渗滤体积。渗滤后，将该合并物浓缩，使用两倍于系统滞留体积的0.1m磷酸钠，ph 8.4将其再循环并从系统中回收。回收后，采用渗滤溶液进行两步稀释。第一次稀释的目标浓度为11g/l，第二步的目标浓度为10g/l。使用两个步骤来促进达到目标水平。如果第一次稀释后的浓度在目标范围内，则可能不需要第二步。
[0218]
关于uf/df 2和uf/df 3步骤，第一次缓冲液交换可以是到20mm磷酸钠、50mm nacl、1.5％甘油，ph 7.4中，≥5dv，且蛋白质浓缩至大约5.0mg/ml。第二次缓冲液交换可交换到0.1m磷酸钠，ph 8.1-8.5中，且蛋白质浓缩至大约10.0mg/ml(为原料药的聚乙二醇化做准备)。
[0219]
实例8：精氨酸酶1的聚乙二醇化
[0220]
聚乙二醇化将peg(聚乙二醇)共价连接至co-精氨酸酶1(原料药)分子(聚乙二醇化步骤的代表性实施例参见表4)。在一个实施例中，聚乙二醇化反应将5000da peg分子共价结合至co-精氨酸酶1。在替代性实施例中，可以在精氨酸酶1的钴取代之前或在生产过程中的其他点进行聚乙二醇化。在一个实施例中，peg缀合反应可以使用固体或液体甲氧基peg琥珀酰亚胺基羧甲基酯，其与co-精氨酸酶1上的空间可用赖氨酸反应。所得经聚乙二醇化的蛋白质(co-rharg1-peg)的分子量为大约280kda。经聚乙二醇化的合并物可以过滤并储存在2-8℃直到uf/df4操作。
[0221]
表4：co-rharg1原料药的聚乙二醇化过程
[0222][0223]
在一个实施例中，可以将固体甲氧基peg琥珀酰亚胺基羧甲基酯(mw 5000)以19.3x摩尔过量添加到含有精氨酸酶1的溶液中，并孵育0.5-4.0小时，ph 8.4。
[0224]
在聚乙二醇化之后，超滤/渗滤去除未结合的peg，将精氨酸酶1交换至制剂缓冲液中并浓缩精氨酸酶1用于配制步骤。此uf/df4步骤使用截留分子量为100kda的膜。此步骤的一个功能是将peg合并物缓冲液交换到最终制剂中，同时去除游离peg。用于此目的的膜用清洁溶液(0.5n naoh)消毒并用水冲洗。一旦uf/df系统达到平衡，peg合并物将针对5mm磷酸钾、50mm氯化钠、1.5％(w/v)甘油，ph 7.4渗滤十倍透析体积。渗滤后，从系统中加压回收该合并物。在最终过滤和填充步骤之前，将回收的uf/df4合并物用5mm磷酸钾、50mm氯化钠、1.5％(w/v)甘油，ph 7.4稀释至5g/l。在一个替代实施例中，将精氨酸酶1交换到20mm磷酸钠、50mm nacl、1.5％甘油，ph 7.4中，并调节至约5.0mg/ml的蛋白质浓度。
[0225]
在一些实施例中，发现与其他缓冲液诸如磷酸钠缓冲液相比，制剂缓冲液5mm磷酸钾、50mm氯化钠、1.5％甘油，ph 7.4增强了精氨酸酶1储存时的稳定性。在一个或多个实施例中，缓冲液5mm磷酸钾包含1mm k2hpo4和4mm kh2po4。
[0226]
原料药(co-rharg1-peg)是一种经聚乙二醇化的钴取代人精氨酸酶1，通过将活化的peg分子与赖氨酸的ε-氨基和n端氨基酸的胺基缀合而制成。基于染料的荧光测定用于使用邻苯二醛确定每个蛋白质的peg分子的摩尔比。邻苯二甲醛在硫醇存在下特异性地与伯胺反应，以形成荧光衍生物。荧光信号的测量允许对蛋白质分子中存在的活性游离胺进行定量。基于使用n-乙酰赖氨酸的标准曲线进行定量。每个蛋白质的经聚乙二醇化的胺的数量可以通过从未缀合的co-精氨酸酶1中存在的游离胺的理论数量减去通过经聚乙二醇化的药物的荧光测定法测量的游离胺的数量来确定。来自赖氨酸残基加上n端氨基酸的游离胺的理论数量为25。通过sec-hplc并通过折射率进行检测来测量原料药中的游离未缀合peg，。结果可以表示为游离peg的μg/ml(参见表5)。
[0227]
表5：sec-hplc方法参数/游离peg/co-rharg1-peg原料药
[0228][0229][0230]
实例9：药物中间体的ciex-hplc表征
[0231]
在大肠杆菌发酵期间，可能会产生各种精氨酸酶1电荷变体。可以使用tsk凝胶阳离子交换柱通过阳离子交换hplc(ciex-hplc)方法分析电荷变体。此分析使用流动相(a)20mm mes，ph 6.0和流动相b 20mm mes、500mm nacl ph 6.0的；流速为1.0ml/分钟；运行时间40.0分钟；柱温22℃；以及根据表6的流动相梯度。
[0232]
表6：ciex-hplc电荷变体co-精氨酸1中间体梯度程序
[0233]
分钟％流动相b0.0001.95017.003023.006025.0010030.0010030.10040.000
[0234]
样品在分析前用制剂缓冲液稀释。结果描述为百分比电荷变体分布。图5(a)示出代表性色谱图，其中通常观察到co精氨酸酶1中间体的六个主要峰。
[0235]
实例10：原料药的icief表征
[0236]
药物中间体被聚乙二醇化以形成原料药。药物中间体的聚乙二醇化使得药物中间体ciex-hplc方法的使用不如作为本发明的一部分开发的其他实施例适合。评估了阴离子iex-hplc，但没有得到充分的分离。替代性地，开发了一种成像毛细管等电聚焦(icief)方法来分析原料药的电荷变体。
[0237]
在存在所施加的电场的情况下，成像毛细管等电聚焦(icief)中的分析物通过水合氢离子(阳极电解液)和氢氧根离子(阴极电解液)的反向迁移而迁移通过毛细管。样品在含有载体两性电解质和pi标志物的基质中稀释。蛋白质的分离发生在两个聚焦步骤中。初始预聚焦步骤建立ph梯度。在第二个更高电压的聚焦步骤中，电荷变体更清晰地聚焦和分离。每30秒和完成聚焦步骤后，以数字方式捕获整个毛细管的紫外光吸收图像。
[0238]
结果可以表示为电荷变异分布百分比。图5(b)示出一个代表性的电泳图，其中观察到原料药的九个主要峰。峰3和4整合在一起，因为这些峰之间的分辨率已被证明是可变的。表7中提供了这些峰的相对面积：
[0239]
表7：co-rharg1-peg电荷变体的icief表征
[0240][0241]
实例11：co-精氨酸酶1中间体和原料药的酶活性
[0242]
用于测量活性和确定co-精氨酸酶1中间体和co-rharg1-peg原料药身份的酶测定法监测精氨酸至鸟氨酸的转化。反应混合物具有在0至2mm范围内的七种不同精氨酸底物浓度下测试的一种酶浓度。反应在37℃执行固定的时间。已建立反应时间以确保在任何给定底物浓度下的底物消耗少于10％。淬灭反应，将产物鸟氨酸衍生化并通过反相uplc进行定量。
[0243]
图8(a)(co-精氨酸酶1中间体)和图8(b)(co-rharg1-peg原料药)示出反应速度与底物浓度图的示例以及代表性的k
cat
、km和k
cat
/km。
[0244]
实例12：钴和锰的分析
[0245]
使用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测量钴、残留锰和游离钴。样品通过微波消解，并使用1％硝酸和6％过氧化氢从基质中释放所有金属。通过icp-ms分析所得的消解物。钴和残留锰样品在没有进行任何样品处理的情况下进行消解。对已超滤以从渗透物中分离
酶的渗透物样品测量游离钴，以测量与酶无关的钴。表8总结了co-精氨酸酶1中间体的一些特征。
[0246]
表8：典型的co-精氨酸酶1中间体特征
[0247][0248]
表9：典型的co-rharg1-peg原料药特征
[0249][0250][0251]
实例13：co-精氨酸酶1中间体翻译后修饰
[0252]
使用多种技术检测co-精氨酸酶1中间体翻译后修饰，诸如肽图分析、lc-ms完整质谱和反相lc/ms。表10列出了所有经鉴定的修饰的总结。
[0253]
表10：经鉴定的co-精氨酸酶1中间体的修饰
[0254][0255][0256]
表征确定当存在co-精氨酸酶1中间体修饰时，主要修饰是n端葡萄糖酸化(通过肽图分析证实)。通过测试在三个时间点(发酵、柱1后和来自柱3的药物中间体)采集的样品，对精氨酸酶1经修饰的物质进行了额外的表征。分析方法通常需要将精氨酸酶解离为单体并作为单体进行分析。精氨酸酶1n端葡萄糖酸化(作为单体进行分析)通常为10.8％至13.9％。在三个时间点的样品中，其他修饰为n端磷酸葡萄糖酸化单体(4.3％至6.5％)和二葡萄糖酸化的单体(0.7％至1.2％)。在来自标准化参考生产运行的样品中，未修饰的co-精氨酸酶1(单体)和co-精氨酸酶1中间体的水平是相当的，分别为80.6％至83.6％。用于纯化过程的标准条件(即柱1未应用盐梯度)适度改变了被带入co-精氨酸酶1中间体的未修饰单体的相对水平(81.1％至83.6％)。
[0257]
表11：co-精氨酸酶1表征lc/ms结果
[0258]
[0259]
实例14：柱1条件的变化
[0260]
在替代性实施例中，可以将nacl梯度应用于柱1。在柱1上使用nacl梯度能够分离不同的精氨酸酶1变体以选择优选实施例。图7示出施加到色谱柱1的0.0至0.2m nacl梯度。通过se-hplc、cex-hplc和rp-hplc分析从柱1洗脱物中收集的各个级分。
[0261]
使用分析型cex-hplc方法，将精氨酸酶1电荷变体峰号指定为1到6(参见图5(c))。峰号与各种葡萄糖酸化状态以及未葡萄糖酸化的精氨酸酶1匹配。此分析示出从nacl梯度洗脱的精氨酸酶1中的六个峰。指定峰号为1、2和3的精氨酸酶1变体在柱1洗脱物峰中较早洗脱。峰4以所洗脱的精氨酸酶1中的最高浓度部分洗脱，并且峰5(未修饰的精氨酸酶1)和峰6在洗脱峰中较晚洗脱。因此，0.0至0.2m nacl成功分离了精氨酸酶1的不同电荷变体。
[0262]
替代性nacl梯度可用于柱1洗脱，诸如0至0.5m nacl。发现使用nacl梯度可再现地将精氨酸酶1分离成六个不同的峰，从而能够选择具体的精氨酸酶1变体，以在原料药或成品药的制造中进行进一步加工。
[0263]
还通过lc/ms分析了第一个蛋白质产物(和精氨酸酶1变体)的进一步分析(参见图6)。lc/ms分析鉴定通过在大肠杆菌中生产精氨酸酶1而生成的具体类型的葡萄糖酸化。lc/ms分析鉴定未修饰的精氨酸酶1、葡萄糖酸化的精氨酸酶1、磷酸葡萄糖酸化的精氨酸酶1和2倍(2x)葡萄糖酸化的精氨酸酶1。
[0264]
表12示出应用0至0.2m nacl梯度(和相对应的分级cex峰1至6)产生具有不同葡萄糖酸化水平的级分。通过lc/ms分析峰号1至6中的每一个。数据显示，主峰(峰5)具有高百分比的非葡萄糖酸化的精氨酸酶1以及高比活性。根据所需的特性，可以收集不同的级分(对应于峰1至6)以进行进一步处理。
[0265]
表12：药物中间体峰1至6的lc/ms分析。
[0266][0267]
除了改变柱1上的nacl浓度外，还可以将不同数量的蛋白质加载到柱1上，以增强对非葡萄糖酸化的精氨酸酶1物质的纯化。
[0268]
改变柱1的加载因子并在柱1上使用nacl梯度可以补偿在生产葡萄糖酸化的精氨酸酶1物质的大肠杆菌发酵期间经历的意外扰动。
[0269]
实例15：发酵条件的变化
[0270]
进行实验以确定用于生产精氨酸酶1的发酵条件的稳健性。表13示出，大肠杆菌在7.6的次优ph下发酵产生比在7.2的优选ph下发酵更多的葡萄糖酸化作用。容器b1、b8和b12
使用最佳发酵条件：ph 7.2，溶解氧30％，培养基进料速率0.06ml/min。容器b3用于在ph 7.6(高于最佳条件的ph)下发酵表达精氨酸酶1的大肠杆菌。ph值的增加导致磷酸葡萄糖酸化的加合物的比例更高(23％，对比对照运行的10-12％)
[0271]
表13：在发酵容器中观察到的葡萄糖酸化的精氨酸酶1
[0272][0273]
实例16：柱1加载因子的变化
[0274]
将不同量的大肠杆菌细胞裂解物施加至柱1，以确定对精氨酸酶1电荷变体的纯化以及产率和纯度的影响。在各种条件下使用15至60g蛋白质/l树脂的加载因子，显示ciex电荷种类曲线的变化(表14)。较高的加载因子导致葡萄糖酸化的变体的更好分离(但取决于所收集的级分，可能会导致收率的权衡)。例如，加载因子为20mg蛋白质/ml树脂，则峰5为45.8％，而加载因子为40mg/ml时增加到50.0％。
[0275]
表14：柱1加载因子对蛋白质产物1的影响
[0276][0277]
实例17：1/2期临床研究
[0278]
通过本发明的方法生产的成品药用于1/2期开放标签研究，以评估co-rharg1-peg在精氨酸酶1缺乏症和高精氨酸血症中的施用。本研究的主要终点是评估co-rharg1-peg在高精氨酸血症/精氨酸酶1缺乏症受试者中静脉内(iv)施用的安全性和耐受性。次要终点是：确定iv施用的研究药物对血浆精氨酸浓度的影响；确定iv施用的研究药物对血浆胍基化合物(gc)的影响；并表征iv施用的研究药物的药代动力学(pk)曲线。其他终点包括评估在获取临床益处方面的临床结果评估，诸如：6分钟步行测试(6mwt)、粗大运动功能测量(gmfm)d和e部分以及适应性行为评估系统(abas)。
[0279]
1/2期数据表明，co-rharg1-peg在持续降低血浆精氨酸方面非常有效。此外，患者血浆精氨酸水平的控制伴随着活动性和适应性行为的具有临床意义的应答。治疗一般耐受性良好。超敏反应很少发生，并且可以通过标准措施进行控制。
[0280]
为研究提供的co-rharg1-peg成品药为装在10ml一次性玻璃小瓶中的液体制剂，
含有5ml浓度为1mg/ml的配制成品药。该药物在50mm nacl、1mm k2hpo4、4mm kh2po4和1.5％w/v甘油中配制。
[0281]
1/2期研究分两部分执行：第1部分(单次上行递增剂量)和第2部分(重复给药)。此1/2期试验101a和102a开放标签扩展的研究设计如下图所示：
[0282][0283]
第1部分使患者尝试该药物，并着重于安全性。第2部分设计为让患者接受一致的剂量并寻找临床有效性的标志物。每个部分之前都进行精氨酸水平的基线评估。参与第1部分的所有患者如果符合继续给药的条件，则可以在第2部分中继续进行精氨酸酶1给药。
[0284]
在该研究中，每位患者接受的起始剂量可能会在第1部分中递增，每个连续剂量水平之间有2周的清除/观察期。第1部分中每位患者的可能剂量为0.015、0.03、0.06、0.10、0.15、0.20和0.30mg/kg，根据需要以2周为间隔，以优化血浆精氨酸。如果来自先前剂量水平的新出现的数据符合某些标准，则可以重复任何特定剂量，或者在指定剂量水平之间增加/减少剂量。例如，如果满足以下一项或多项剂量递增停止标准，则剂量递增可能会终止：对于在给药后至少连续40(
±
2)小时的时间段内收集的所有样品，患者的血浆精氨酸水平为《40μm，或者对于在给药后至少连续112(
±
2)小时的时间段内收集的所有样品，患者的血浆精氨酸水平平均《115μm。
[0285]
如果这些事件均未发生，则可每2周将患者的精氨酸酶1剂量递增至下一个更高剂量，直到达到任何剂量递增停止标准或患者已接受本方案下0.30mg/kg的最高剂量。最终，出于治疗目的，剂量也可能增加超过0.30mg/kg。
[0286]
第2部分是完成第1部分的患者的重复给药期。第2部分为每位患者找到了一种剂量和方案，可在重复剂量施用期间将血浆精氨酸安全地优化在约40μm至约115μm的范围内，重点是将给药前水平维持在低于150-200μm。如果数据表明有可能更好地研究重复剂量施用期间的剂量应答结果，则可以在第2部分中使用多个剂量水平。还将治疗中的精氨酸水平与在治疗前确定的精氨酸水平进行比较。
[0287]
完成101a第2部分的患者符合参加长期开放标签扩展(ole)试验(nct03378531)的条件。进行24个每周iv剂量的治疗，可选择在3年ole期的剩余时间内改用皮下给药。
[0288]
结果
[0289]
在所有患者中，平均c
max
和平均auc
0-168
的增加与剂量成正比。对于0.015、0.03、0.06、0.1和0.2mg/kg的co-rharg1-peg剂量水平，平均(
±
sd)c
max
分别为0.428
±
0.0915、0.723
±
0.247、1.73
±
0.538、2.27
±
0.238和6.13(n＝1)μg/ml。ada阳性与ada阴性患者中，存在对于平均c
max
的轻微的抗药物抗体(ada)影响(图9)。
[0290]
auc的变化(auc
0-168
，auc
0-∞
)在所研究的剂量范围内与剂量成正比，注意，在0.06
与0.1mg/kg之间没有显著变化(使用可用的数据)。平均清除率(cl)估计值范围在所有患者中为0.789至1.57ml/hr/kg，在ada阴性患者中为0.776至1.33ml/hr/kg。平均分布容积(vss)估计值范围在所有患者中为35.3至52.1ml/kg，在ada阴性患者中为32.8至52.1ml/kg。
[0291]
该研究的第1部分帮助使用观察到的pd(精氨酸)应答为第2部分的每位患者选择最佳(个体)起始剂量。在第2部分的第1周，在所评估的剂量范围内，在使用递增剂量的co-rharg1-peg的所有患者中，平均循环药物浓度都有增加的趋势。在第2部分中首次给药co-rharg1-peg后，在所有患者中，平均c
max
增加与剂量成正比。对于0.015、0.03、0.04、0.06、0.09、0.1和0.12mg/kg的co-rharg1-peg剂量水平，平均(
±
sd)c
max
分别为0.292(n＝1)、0.395(n＝1)、1.01
±
0.221、1.75
±
0.391、1.99(n＝1)、2.34(n＝1)和2.87
±
0.626μg/ml。
[0292]
在第2部分第8周，在所有患者中，平均循环药物浓度通常随着co-rharg1-peg的递增剂量而增加。在第8周，可用的pk浓度没有明显的ada影响。作为该数据的结果，此时假设大多数(13/14)患者达到稳定状态。在第8次qw剂量的co-rharg1-peg后，在所有患者中平均c
max
和auc
0-168
的增加与剂量成正比。
[0293]
除了药代动力学数据，还收集了药效学(精氨酸)数据(图10)。在第2部分中，对精氨酸酶1缺乏症患者施用(每周)qw iv剂量的co-rharg1-peg，并在第1部分中基于观察到的pd(精氨酸)应答选择起始剂量。在首个qw iv剂量的co-rharg1-peg后，循环精氨酸水平显著降低，特别是对于等于或高于0.04mg/kg的co-rharg1-peg剂量。在某些情况下，个体精氨酸浓度降至低于40μm。此外，在剂量≥0.04mg/kg和就在第二个qw(每周)co-rharg1-peg剂量施用之前，大多数患者未完全恢复至起始精氨酸水平。
[0294]
总体而言，co-rharg1-peg的暴露量通常会增加，并且精氨酸抑制随着剂量的递增而增加。在第1部分中进行了个体化剂量优化，使得在第2部分的第1周和第8周中每个剂量水平的患者数量不同。
[0295]
实例18：皮下施用
[0296]
在实例17的1/2期研究的第2部分完成后，一些患者从co-rharg1-peg的iv施用转换为皮下施用。令人惊讶的是，co-rharg1-peg的皮下施用给出了似乎优于iv施用的药效学特征。同样出乎意料的是，与用于iv施用者相同的制剂成功地用于co-rharg1-peg的皮下施用。
[0297]
co-rharg1-peg的皮下施用将患者精氨酸水平维持在血浆精氨酸浓度的优选(健康)目标范围内，持续时间比iv施用更长(图11)。患者的优选优化血浆精氨酸浓度在约40μm至约115μm的范围内(在重复剂量施用期间)，重点是将水平维持在低于给药前的150-200μm。如图11所示，co-rharg1-peg的皮下施用导致精氨酸浓度高于40μm的较低水平且低于115μm的较高水平。令人惊讶的是，皮下施用给出完全在优选范围内的精氨酸浓度。这意味着患者将保持在适当的精氨酸浓度血浆范围内，直到接受另一个每周co-rharg1-peg剂量。
[0298]
实例19：1/2期临床研究和开放标签扩展的药效学和临床应答
[0299]
16名患者(11名儿童和5名成人)被纳入101a第1部分，且15名患者进入101a第2部分。2名患者因个人原因退出试验(1名患者在第1部分第3剂后退出，1名患者在第2部分第3剂后退出)。完成101a第2部分的所有14名患者都进入了ole试验。
[0300]
患者的基线特征显示在表15中。
[0301]
表15：基线特征
[0302][0303]
血浆精氨酸和胍基化合物水平的分析发现血浆精氨酸水平显著且持续降低(图12(a)表明，在20剂聚乙二醇精氨酸酶后，中位数相对于基线降低274μm。血浆精氨酸从基线到第1剂、第8剂和ole的降低具有统计学意义(p《0.001)。血浆精氨酸减少伴随着血浆胍基化合物(gc)水平的降低。图12(b)示出在基线时的胍基乙酸(gaa)、n-α-乙酰基-l-精氨酸(naa)、α-酮基-δ-胍基新戊酸(gva)和精氨酸(arga)的血浆水平以及在ole期间的血浆gc水平的降低。
[0304]
16名患者中有15名在基线时完成了所有活动性评估(患者13只能坐轮椅)(图13(a))。缺陷定义为：6mwt：小于下方第5百分位；gmfm d部分：39分中《35分；gmfm e部分：72分中《68分；abas-3：≤85分。患者中有88％(16名中的14名)在基线时至少有一项活动缺陷；16名患者中有88％、50％和56％分别被归类为在6mwt、gmfm d部分和gmfm e部分中具有基线缺陷。10名患者在基线时可进行适应性行为abas-3评估。6名患者因技术原因(包括语言、年龄和认知障碍造成的限制)未进行测试，10名患者中有8名(80％)在通过abas-3评估的1个或多个域内存在基线缺陷。
[0305]
总体临床应答显示，基于在6mwt、gmfm-d或gmfm-e评估中的至少一者中的≥1mcid改善，14名患者中有11名(79％)被定义为在第20剂有应答者(图13(b))。20剂数据表明，6mwt、gmfm-d和gmfm-e对在arg1-d患者中获得临床益处的变化足够敏感。从第8剂到第20剂，总体有应答者的百分比显著增加。达到第44剂的所有5名患者(100％)均维持其作为有应答者的第20剂总体临床应答状态。
[0306]
单个评估量表的所有有应答者都有≥1的mcid改善(图13(b)和图14)。对于6mwt，13名患者中有7名(54％)仅对此评估量表有应答。6mwt的平均变化在所有患者中为32米，在7名有应答者中为66米。对于gmfm-d：8名具有基线缺陷的患者中有5名(63％)仅对这一评估量表有应答(平均mcid为1.84，范围为1.21至3.33)。对于gmfm-e：8名具有基线缺陷的患者中有5名(63％)仅对这一评估量表有应答(平均mcid为4.79，范围为1.67至8.33)。相对于第8剂，在第20剂时，单个活动评估量表的有应答者的百分比显著更高。
[0307]
来自在20剂聚乙二醇精氨酸酶后的所有患者的数据表明，血浆精氨酸显著且持续
降低，重要疾病表现得到改善，且临床有应答者占比为79％。1/2期试验和ole试验证明了利用6mwt、gmfm-d或gmfm-e作为工具获取聚乙二醇精氨酸酶酶临床益处的价值。聚乙二醇精氨酸酶具有良好的耐受性，并且与治疗相关的不良事件发生率随着时间的推移而降低。在聚乙二醇精氨酸酶治疗后精氨酸控制的改善和临床益处的证据进一步验证了关键的3期peace试验(nct03921541)的关键终点和设计要素。
[0308]
实例20：3期临床试验设计
[0309]
正在使用通过本发明的方法生产的co-rharg1-peg进行一项关于co-rharg1-peg在患有精氨酸酶1缺乏症的儿童和成人中的功效和安全性的随机、双盲、安慰剂对照的3期研究。该试验目前正在进行中，作为聚乙二醇精氨酸酶(p)影响(e)精氨酸酶1缺乏症(a)临床(c)终点(e)或peace(caeb1102-300a；nct03921541)。
[0310]
此3期试验的研究设计如下图所示：
[0311][0312]
关键纳入标准
[0313]
a.年龄≥2岁，诊断为arg1-d且血浆精氨酸水平≥250μmol/l，以对实现血浆精氨酸低于医学指导值200μmol/l的患者比例进行统计测试
[0314]
b.能够在盲测期间维持稳定一致的饮食
[0315]
c.在盲测期间能够保持稳定剂量的氨清除剂、抗癫痫疗法和/或针对痉挛的药物
[0316]
d.能够进行并成功完成临床评估，并且必须在次要临床应答终点的评估量表之一中存在基线缺陷，如表16所示。
[0317]
关键排除标准
[0318]
a.在开始治疗前6周内的需要住院的高氨血症发作
[0319]
b.在接受第一次聚乙二醇精氨酸酶剂量前3周内的活动性感染
[0320]
c.极度行动不便，定义为无法在吉列功能评估问卷(gfaq)上进行评估或gfaq得分为1(根本无法完成任何步骤)
[0321]
d.参与过既往聚乙二醇精氨酸酶介入研究或目前正在参与其他临床试验
[0322]
e.聚乙二醇过敏史
[0323]
表16：关键临床应答终点的基线缺陷的定义
[0324][0325]
2mwd＝2分钟步行距离；gmfm＝粗大运动功能测量；d部分＝站立；e部分＝步行、跑步、跳跃
[0326]
*nih工具箱(美国卫生与公众服务部，美国华盛顿特区)运动域数据集(2分钟步行耐力测试)
[0327]
此3期试验的主要终点是血浆精氨酸降低(基于从基线变化的治疗方法，活性物组和安慰剂组个体患者的血浆精氨酸水平在第24周时相对于基线的变化)。
[0328]
次要终点措施包括：
[0329]
a.临床应答终点：临床有应答者定义为在第24周时在2mwt、gmfm-d或gmfm-e临床应答终点中的至少一者中具有改善的患者，如表17中所定义
[0330]
b.临床应答终点的每个单个评估量表的应答率
[0331]
c.其他临床结果评估
[0332]
i.功能性活动量表5、50、500米
[0333]
ii.吉列功能评估问卷(gfaq)
[0334]
iii.文兰适应性行为量表
–
ii
[0335]
d.包括免疫原性在内的安全性评估
[0336]
e.血浆精氨酸《200μm以及在正常范围内(40-115μm)的患者比例
[0337]
f.表征聚乙二醇精氨酸酶的药代动力学特征
[0338]
表17：定义临床有应答者的临床应答终点
[0339][0340]
研究的总持续时间预计为每位受试者约178周，包括长期开放标签扩展期(3至4周筛选期、24周治疗期，之后是长达150周的开放标签扩展期)。受试者将每周接受一次co-rharg1-peg或体积调整安慰剂的每周iv输注(大约30分钟)。仅基于血浆精氨酸值的co-rharg1-peg的剂量修改将由知情药剂师和/或医生根据给药算法实施。在盲测长期扩展期的前8周后，在获得研究者和赞助者批准的情况下，受试者可以选择通过皮下施用接受co-rharg1-peg。初始mg/kg皮下剂量可以与iv剂量相同。
[0341]
分配给co-rharg1-peg的受试者从剂量水平2(见下表18)即0.10mg/kg开始。从第5次就诊开始，如果需要，将由知情医师根据以下给药算法基于血浆精氨酸值进行剂量修改：
[0342]
·
如果血浆精氨酸水平为＞150μm，则将会使用单个168小时样品将剂量增加2个剂量水平(不超过0.20mg/kg)，前提是此样品前的2个剂量为a)以mg/kg计的相同剂量水平并且b)连续的(没有遗漏剂量)。
[0343]
·
如果来自2个连续168小时样品的血浆精氨酸水平两者(无论是否遗漏剂量)均为＜50μm，则将剂量降低1个剂量水平(参见表17)，但不降低至低于0.05mg/kg。
[0344]
表18：co-rharg1-peg的剂量调整
[0345]
剂量水平
(a)
剂量1(最小可能剂量)0.05mg/kg2(开始剂量)0.10mg/kg30.15mg/kg
4(最大可能剂量)0.20mg/kg
[0346]
(a)聚乙二醇精氨酸酶剂量从水平2，即0.10mg/kg开始。
[0347]
需要时，剂量增加2个剂量水平。剂量减少1个剂量水平。
[0348]
统计学考虑
[0349]
初步分析将基于满足严格的预先指定标准的最后四次血浆精氨酸测量结果的平均值，在24个每周剂量后，将用聚乙二醇精氨酸酶治疗的患者的血浆精氨酸水平相对于基线的平均降幅与用安慰剂治疗的患者进行比较。
[0350]
使用双侧mann-whitney-wilcoxon检验，假设共同sd为120μm，分别随机分配至安慰剂和聚乙二醇精氨酸酶的10名和20名患者的样品量实现98％的功效，以证明在0.05显著性水平下，平均血浆精氨酸水平的差异为200μm。
[0351]
此外，此数量的受试者提供超过80％的功效，使用fisher精确检验检测到，在0.05显著性水平下，临床应答终点的组比例间的统计学显著差异为40％。
[0352]
实例21：位点特异性聚乙二醇化分析
[0353]
图15提供示例性的位点特异性聚乙二醇化分析。分析了三个co-rharg1-peg批次。通过下述进行肽图分析：用胍-hci将co-rharg1-peg原料药、co-arginase l中间体(非聚乙二醇化)批次和相应的参考标准变性，用dtt还原，并且用碘乙酰胺烷基化。这些样品用50mm tris缓冲液рн8.0稀释。每个样品在37℃用测序级胰蛋白酶消解约5小时。使用在0.05％三氟乙酸中的乙腈梯度，在waters acquityвен300с18柱、2.1
×
150mm、waters c/n 186003687上拆分所得肽。在waters xevo g2-xs qtof ms/ms上获得肽的lc-ms和ms/ms裂解。
[0354]
可以看出，三个批次无一在位点k3、k149、k190、k195、k29、k265或k283发生聚乙二醇化。此外，所有三个批次在位点k16、k32、k38、k40、k47、k67、k74、k82、l87、k88、k152、k154、k171、k312和k321都具有聚乙二醇化。一些批次在位点k222和k223的聚乙二醇化频率较低。
[0355]
贯穿本说明书的对“一个实施例”、“某些实施例”、“各种实施例”、“一个或多个实施例”或“实施例”的引用，意指结合该实施例描述的特定特征、结构、材料或特性包括在本公开至少一个实施例中。因此，在贯穿本说明书的各个地方出现的词语诸如“在一个或多个实施例中”、“在某些实施例中”、“在各个实施例中”、“在一个实施例中”或“在实施例中”不一定是指本发明的同一实施例。此外，具体特征、结构、材料或特性可在一个或多个实施例中以任何合适的方式组合。
[0356]
尽管本文中的公开提供了参考特定实施例的描述，但应理解，这些实施例仅是对本公开的原理和应用的例示性说明。对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本公开进行各种修改和变化而不脱离其精神和范围。因此，本公开旨在包括在所附权利要求及其等同物的范围内的修改和变化。