香榧内生真菌代谢产物的制备方法及其作为抑菌剂的应用

1.本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种香榧内生真菌代谢产物的制备方法及其作为抑菌剂的应用。


背景技术：

2.植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，包括内生真菌和内生细菌。内生菌定殖在宿主植物体内，一方面能够促植物生长，另一方面能够增强宿主植物对生物(植物病原菌、害虫等)和非生物胁迫的抗性。植物内生菌在一定的发育阶段和外界环境下，自身产生或促进宿主植物产生一系列次生代谢产物，其中相当一部分次生代谢产物具有很高的生物活性并具有广泛的应用前景，如抗生素和免疫抑制剂等。近年来，国内陆续报道了从多种药用植物中已分离获得了产生多种药理活性物质的内生菌。香榧(torreya grandis)，别名榧树、榧子等，为裸子植物门，红豆杉科榧树属的常绿针叶乔木，为我国特有树种。其具有抗菌、驱虫、抗病毒和抗肿瘤等多种药理活性。目前，以药用植物内生菌为途径的对天然药物的开发和利用日益成为研究热点，具有高效低耗，安全性高的特点。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明目的是提供一种香榧内生真菌代谢产物的制备方法及在制备抑菌剂中的应用。
4.本发明采用的技术方案是：本发明提供一种香榧内生真菌代谢产物，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将橘绿木霉(trichoderma citrinoviride) tg.z4-01发酵液经超声破碎后抽滤，滤液及滤渣用乙酸乙酯萃取，取有机相浓缩至恒重，获得代谢粗产物；所述橘绿木霉(trichoderma citrinoviride) tg.z4-01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:m 2022156，保藏日期：2022年3月4日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编：430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集体积比100:2二氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7；(3)将步骤(2)组分fr.7用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比15:1-0:1二氯甲烷-乙酸乙酯为流动相洗脱，每75ml收集一份，收集第21-27份的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7-5；(4)组分fr.7-5以体积比5:3的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析，每10ml收集一份，收集得到15-19份均有浅黄色晶体析出，浓缩至干，记为组分fr.7-5-1；(5)将步骤(4)组分fr.7-5-1用乙酸乙酯进行重结晶后得香榧内生真菌代谢产物。
5.进一步，步骤(1)所述发酵液制备方法为：将橘绿木霉tg.z4-01接种于发酵培养基中，28 ℃，180r/min培养5 d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：蛋白胨10 g/l，蔗糖40 g/l，溶剂为蒸馏水，ph为5.6。
6.进一步，步骤(1)所述代谢粗产物制备方法为：在40%功率条件下，每超声3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液超声破壁处理后抽滤，滤液用1倍体积乙酸乙酯萃取3次，滤渣用乙酸乙酯浸泡12 h，合并有机相，浓缩至恒重，获得橘绿木霉tg.z4-01代谢粗产物。
7.进一步，步骤(2)的具体操作过程为：将步骤(1)橘绿木霉tg.z4-01代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，采用体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集体积比100:5二氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7；所述硅胶与代谢粗产物质量比为1:1。
8.进一步，步骤(3) 的具体操作过程为:将步骤(2)组分fr.7用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分fr.7的硅胶，将吸附组分fr.7的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比依次为15:1,10:1,7:1,5:1,2:1,1:1,0:1的二氯甲烷-乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，每75ml收集一份，收集第21-27份的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7-5；所述硅胶与组分fr.7质量比为1：1。
9.进一步，步骤(4) 的具体操作过程为：将步骤(3)组分fr.7-5用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分fr.7-5的硅胶，将吸附组分fr.7-5的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比5:3的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析，每10ml收集一份，收集得到15-19份均有浅黄色晶体析出，浓缩至干，记为组分fr.7-5-1；所述硅胶与组分fr.7-5质量比为1:1。
10.进一步，步骤(5) 的具体操作过程为：将步骤(4)组分fr.7-5-1用乙酸乙酯进行重结晶，用石油醚将晶体中少量黄色物质洗去，用氮吹仪将晶体吹干后得香榧内生真菌代谢产物。
11.更进一步，本发明所述香榧内生真菌代谢产物按如下方法制备：(1)将橘绿木霉tg.z4-01接种于发酵培养基中，28 ℃，180 r/min培养5 d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，滤液用1倍体积乙酸乙酯萃取3次(优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，滤渣用乙酸乙酯浸泡12 h，合并有机相，浓缩至恒重，获得橘绿木霉tg.z4-01代谢粗产物；所述发酵培养基组成：蛋白胨10 g/l，蔗糖40 g/l，溶剂为蒸馏水,ph为5.6；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20 min；(2)将步骤(1)代谢粗产物用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶(200～300目)，混合均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶，所述硅胶与发酵粗产物质量比为1:1；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(优选8cm*60cm)中，装柱量3/4，采用体积比100-0:0-100(优选100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:1000，v/v)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集体积比100:5二氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7；(3)将组分fr.7用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分fr .7的硅胶，所述硅胶与组分fr.7质量比为1：1，将吸附组分fr.7的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比15:1
→
0:1(15:1,10:1,7:1,5:1,2:1,1:1,0:1)的二氯甲烷-乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，每75ml收集一份，收集第21-27份的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7-5；(4)组分fr.7-5用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分fr.7-5的硅胶，所述硅胶与组分fr.7-5质量比为1:1，将吸附组分fr.7-5的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比5:3的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析，每10ml收集一
份，收集得到15-19份均有浅黄色晶体析出，浓缩至干，记为组分fr.7-5-1；(5)步骤(4)组分fr.7-5-1用乙酸乙酯进行重结晶，用石油醚将晶体中少量黄色物质洗去，用氮吹仪将晶体吹干，得香榧内生真菌代谢产物，记为产物fr.7-5-1。
12.本发明所述橘绿木霉tg.z4-01，菌落呈白色疏松绒毛状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成黄绿色。
13.本发明还提供一种所述香榧内生真菌代谢产物作为抑菌剂的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(cmcc(b)26003)抑菌剂。
14.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明制备得到的香榧内生真菌代谢产物对金黄色葡萄球菌表现出良好的抑菌活性，mic＝0.39mg/ml，为天然成分，安全性高，有望开发成天然抑菌剂产品。
附图说明
15.图1为菌株tg.z4-01系统发育树。
16.图2为菌株tg.z4-01代谢产物对金黄色球菌的抑菌能力。
17.图3为产物fr.7-5-1主要结构。
18.图4为香榧内生真菌代谢产物的1h-nmr图谱。
19.图5为香榧内生真菌代谢产物的
13
c-nmr图谱。
20.图6为香榧内生真菌代谢产物的ms图谱。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明所述香榧(torreya grandis)，别名榧树、榧子等，为裸子植物门，红豆杉科榧树属的常绿针叶乔木，为我国特有树种、国家二级保护植物，主产于江浙等地。
22.本发明所述超纯水是指电阻率达到18mω*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。
23.实施例1：橘绿木霉tg.z4-01的分离。
24.1 .植物样本采集：新鲜健康的香榧枝条采于浙江省金华市，香榧种子用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75%乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2%次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡15分钟，然后用无菌水漂洗三次，收集最后一次漂洗液，用干燥的无菌吸收纸干燥，获得表面消毒后的香榧种子。在生物安全柜中，分别放置无菌pda培养基平板作为空白对照1，用于检查生物安全柜的洁净程度；将最后一次漂洗液分别接种于无菌pda培养基平板作为空白对照2，用于漂洗液的检查；将表面消毒后的香榧种子，置于pda培养基的无菌平板中滚一圈后取出，作为空白对照3，用于植物组织印迹法筛选无菌的组织块。
25.2 .内生真菌的筛选以及分离纯化：于生物安全柜中，将步骤1中消毒后的香榧种子切成薄片，取假种皮部位，作为无菌组织，然后接种在pda培养基中，在28℃倒置培养，待出现内菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3进行比较，采用尖端菌丝挑选
的方法，将不同形态的菌落划线接种于pda培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌pda培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种真菌生长时说明纯化完成，得到8株真菌菌株，1号菌株为白色疏松绒毛状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成黄绿色，无肉眼可见孢子，菌落背面为深黄色；2号菌株为白色绒毛状，有大量灰绿色孢子，菌落背面成点状，代谢物无明显颜色；3号菌株为浅橙色絮状，有大量橙色孢子，菌落背面为橙色；4号菌株为白色疏松绒毛状，干燥，菌落背面为白色；5号菌株为棕色绒毛状，无肉眼可见孢子，菌落背面为棕黑色；6号菌株为白色点状，无肉眼可见孢子，菌落背面为深黄色，菌落老化后成棕黄色；7号菌株为橙红色点状，无肉眼可见孢子，菌落背面为红色；8号菌株为白色绒毛状，无肉眼可见孢子，菌落背面为粉色点状，代谢物无明显颜色；1号菌株记为菌株tg.z4-01。pda培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 ml，ph为5.6。
26.3 .总dna的提取：将菌株tg.z4-01接种于pda培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d，采用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海) 股份有限公司，产品编号：b518259-0050，以及相关操作说明提取基因组dna：
①
取50-100 mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1 .5ml离心管中，依次加入200
µ
l buffer digestion,2
µ
lβ-巯基乙醇和20
µ
l proteinase k溶液，震荡混匀。65℃水浴1 h至细胞完全裂解。
②
加入100
µ
l buffer pf，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
③
室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中。
④
加入200
µ
lbuffer bd，充分颠倒混匀。
⑤
加入200
µ
l无水乙醇，充分颠倒混匀。
⑥
将吸附柱放入收集管中，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
⑦
将吸附柱放回收集管，加入500
µ
lpw solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
⑧
将吸附柱放回收集管，加入500
µ
lwash solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
⑨
将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的wash solution。
⑩
取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50
µ
lte buffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集dna溶液。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。
27.4 .菌株tg.z4-01的its序列扩增：采用真菌扩增通用引物its1和its4 扩增内部转录区间序列。
28.its1: 5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’its4: 5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’表1 pcr反应体系试剂体积(
µ
l)dna模板1上游引物1下游引物12
×
hieffpcrmastermix12.5ddh2o9.5体系25pcr扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃低温保存。
29.5 .pcr反应产物确认：取2.5
ꢀµ
l pcr产物与0.5
ꢀµ
l loading buffer混合后点样于 1.2 %琼脂糖凝胶，120v条件下电泳20分钟，于凝胶成像系统中观察条带，如出现 600-750 bp左右条带，则初步判断扩增成功。
30.6 .pcr反应产物测序：将pcr产物送样北京擎科生物科技有限公司进行测序，双向测序结果使用dnaman进行序列拼接，菌株tg.z4-01的its序列见seq id no .1所示。
31.7 .数据分析：将菌株tg. z4-01的序列在ncbi中与genbank中的序列进行同源性比对，blast检索表明，菌株tg. z4-01的its序列与trichoderma citrinoviride(橘绿木霉) (genbank登录号nr077178.1)的序列相似度为96.73％，绘制系统发育树见图1所示，由图1可知支持率为91％，根据基因亲缘性对比结合形态学鉴定，确定菌株tg.z4-01 为trichoderma属，命名为橘绿木霉(trichoderma citrinoviride)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc m 2022156，保藏日期：2022年3月4日。
32.实施例2：香榧内生菌代谢产物的分离。
33.1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的橘绿木霉tg.z4-01接种于pda 培养基中，置于28 ℃恒温培养箱中培养5 d；2、香榧内生菌代谢产物的制备：在生物安全柜中，用无菌打孔器将步骤1的tg.z4-01菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含300ml发酵培养基的 1500ml锥形瓶中，28 ℃，180 r/min培养5d，以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液，采用jy92-iidn型超声波细胞粉碎机在40%功率条件下，每超声3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理，然后抽滤得滤液，用1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，滤渣用乙酸乙酯浸泡12 h，合并乙酸乙酯萃取相，利用旋转蒸发仪浓缩干燥至恒重，获得香榧内生菌代谢粗产物(简称：tg-1ea)62.82g，于-20℃保存。
34.所述发酵培养基组成：蛋白胨：10 g/l，葡萄糖：40 g/l，溶剂为蒸馏水，ph为5.6。利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20 min。
35.3、分离纯化代谢粗产物：(1)称取60 g tg-1ea，用10-15ml乙酸乙酯溶解，加入60 g硅胶(200～300目)，混合均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶。将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(8cm*60cm)中，装柱量3/4，采用二氯甲烷-甲醇(100:0、100:1、100:2、100:5、100:10、100:20、50:50、0:100，v/v)梯度洗脱，分别得到fr.1～fr.10，共10个组分,收集体积比100:5二氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分fr. 7；(2)将8g组分fr.7用微量乙酸乙酯溶解，加入8g硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分fr.7的硅胶，将吸附组分fr.7的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比依次为15:1,10:1,7:1,5:1,2:1,1:1,0:1的二氯甲烷-乙酸乙酯为流动相梯度洗脱，每75ml收集一份，收集第21-27份的流出液，浓缩至干，记为组分fr.7-5；(3)将1.2g组分fr.7-5用微量乙酸乙酯溶解，加入1.2g硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分fr.7-5的硅胶，将吸附组分fr.7-5的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比5:3的石油醚：乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析，每10ml收集一份，收集得到15-19份均有浅黄色晶体析出，浓缩至干，记为组分fr.7-5-1；(4)组分fr.7-5-1用乙酸乙酯进行重结晶，用石油醚将晶体中少量黄色物质洗去，用氮吹仪将晶体吹干，得121.8mg香榧内生真菌代谢产物，记为产物fr.7-5-1，溶于氘代氯仿中，进行核磁波谱以及质谱分析，结果见于图4-6，主要成分为木霉菌醇
trichomerol。
36.实施例3：香榧内生菌代谢产物对金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003)抑制能力的测定。
37.称取实施例2获得的25mg香榧内生菌代谢产物，溶于1mldmso中，配置25mg/ml 的样品储备液。在生物安全柜台中，储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，取200μl 过滤后的样品于96孔板a、b和c中，用无菌lb液体培养基依次二倍稀释为不同浓度 (25，12 .5，6 .25，3 .125，1 .5625，0 .7812，0 .3906，0 .1953，0 .0976，0 .0488，0.0244，0.0122mg/ml)，即a1,b1与c1：25mg/ml，a2,b2与c2：12 .5mg/ml，a3,b3与c3：6 .25mg/ml，a4,b4与c4：3 .125，a5,b5与c5：1 .5625mg/ml，a6,b6与c6：0 .7812mg/ml，a7,b7与c7：0 .3906mg/ml，a8,b8与c8：0 .1953mg/ml，a9,b9与c9：0 .0976mg/ml，a10,b10与c10：0 .0488mg/ml,a11,b11与c11：0.0244mg/ml,a12,b12与c12：0.0122mg/ml。
38.将金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003，南京茂捷微生物科技有限公司)，在生物安全柜台中接种于含lb固体培养基的无菌平板中进行活化(37℃，24h)，将活化后的金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003，取一环接种于含有lb液体培养基(3ml)的无菌试管(10ml)中进行培养(37℃，180r/min，12h)，用无菌水将菌液进行稀释使得菌悬液浓度为106cfu/ml备用，在96孔板的a/b/c三排每一孔中加入稀释好的菌液100ul。在同一块板上的d排做阴性对照（仅加空白培养基，不加菌液），e排做阳性对照（加菌液不加药液）。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养1d，肉眼观察孔中培养基是否浑浊，是否有菌体沉淀于孔底部，结果见于图2；mic＝0.39mg/ml。