鼠李糖多糖

1.本发明涉及一种合成鼠李糖多糖的方法。本发明还涉及合成链球菌多糖、链球菌糖缀合物、包含链球菌多糖或糖缀合物的免疫原性组合物或疫苗、以及用于提高动物的免疫反应或用于治疗或预防由链球菌病因引起的疾病、病症或感染的多糖、糖缀合物、免疫原性组合物或疫苗。
背景技术：
：：2.链球菌属细菌是一组多功能的革兰氏阳性细菌，可感染广泛的宿主并导致大量疾病。3.酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)(a群链球菌，gas)是一种人类独有的致病性革兰氏阳性细菌，可引起多种疾病。对这种生物体的流行能力的可能被低估的评估表明，全世界每年有超过7亿人受到折磨，导致各种疾病，如脓疱病、咽炎、猩红热、坏死性筋膜炎、脑膜炎和中毒性休克综合征等。此外，自身免疫性感染后后遗症，如急性风湿热、急性肾小球肾炎或风湿性心脏病，可影响以前患有gas感染的个体，从而扩展了由该病原体引起的临床表现列表。a群碳水化合物(gac)是来自酿脓链球菌的肽聚糖锚定鼠李糖多糖(rhaps)，其对细菌生存至关重要，并有助于酿脓链球菌感染人类宿主的能力。4.无乳链球菌(streptococcusagalactiae)(b群链球菌，gbs)是一种(致病性)共生细菌，20-40％的成年人携带有该细菌。25％的女性的阴道内携带有gbs，在此其通常无症状地存在。然而，在孕妇中，gbs是早产、母体感染、死产和晚期流产的公认原因。尽管目前有预防策略，但在英国出生的每1000名婴儿中就有1名发生gbs感染。众所周知，早产儿特别容易感染gbs，因为他们的免疫系统发育不完善。这导致英国每周有一名婴儿死于gbs感染，一名婴儿得以幸存但伴随长期残疾。5.c群链球菌(gcs)可引起流行性咽炎和蜂窝组织炎，临床上与人类的gas疾病无法区分。还已知其在患有诸如糖尿病、癌症的易感疾病患者或老年患者中引起败血症、心内膜炎、脓毒性关节炎和坏死性感染。在马类动物中，gcs是一种高度传染性和严重的上呼吸道感染(称为腺疫)的原因，这种感染在世界范围内呈地方性流行。6.g群链球菌(ggs)是引起皮肤感染(例如人类皮肤感染)的重要人类病原体。ggs还感染口咽、胃肠道和女性生殖道。与ggs相关的其他感染包括几种可能危及生命的感染，例如败血症、心内膜炎、脑膜炎、腹膜炎、肺炎、积脓症和脓毒性关节炎。7.有效控制、治疗和预防gas感染的抗菌药物选择越来越有限。这是由于出现抗生素耐药性、大流行的发展和超强毒株的传播。因此，显然需要开发一种安全有效的候选疫苗。对于能够靶向120多种不同gas血清型中大多数的疫苗，它需要基于普遍存在的、保守的且必要的gas靶标。一个这样的靶标是gac，gac不仅是病原体的重要结构成分，而且还是毒力决定因素。8.当前的疫苗开发形式仅限于从天然细菌中化学和酶提取的方法以及与任何受体化合物(例如蛋白质或肽)的化学缀合。这是高劳动强度的，并导致产品的产量和质量有限。显然需要一种劳动强度较低并导致多糖的均质、纯净和高产率的生产gas多糖的方法。本发明是考虑到这些问题而设计的。9.描述10.本公开在其最广泛的意义上涉及一种合成多糖、特别是鼠李糖多糖的方法。11.根据第一方面，提供了一种合成鼠李糖多糖的方法，该方法包括：12.(i)使用己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶和/或己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体，将鼠李糖部分转移至己糖单糖、二糖或三糖，以形成在二糖、三糖或四糖的非还原端包含鼠李糖部分的二糖、三糖或四糖；和13.(ii)通过使用异源细菌酶酿脓链球菌a群碳水化合物酶c(gacc)和/或酿脓链球菌a群碳水化合物酶g(gacg)或其酶活性同源物、变体或片段从二糖、三糖或四糖的非还原端的鼠李糖部分延伸，生成鼠李糖多糖。14.酶gacc和/或酶gacg或其酶活性同源物、变体或片段所来源的细菌物种与步骤(i)中使用的己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体所来源的细菌物种是异源的。15.本发明人首次发现，起始gac鼠李糖多糖合成的酿脓链球菌酶gacb是α-d-glcnac-β-1,4-l鼠李糖基转移酶。完全令人惊讶的是，本发明人发现这些鼠李糖多糖可以使用来自不同于gacb所来源的细菌物种的鼠李糖基转移酶来合成。换言之，本发明人发现可以使用来自酿脓链球菌以外的细菌物种的鼠李糖基转移酶来合成鼠李糖多糖。这完全出乎意料，因为gacb的功能以前是未知的。同样令人惊讶的是，来自不同物种的酶可以共同合成鼠李糖多糖。16.在一些实施方式中，步骤(ii)包括通过使用异源细菌酶gacc或其酶活性同源物、变体或片段从二糖、三糖或四糖的非还原端的鼠李糖部分延伸，生成鼠李糖多糖。17.多糖是本领域已知术语，用于表示包含多个相同或不同单糖的、通常多于四个单糖的分子。因此，如本文所用的术语鼠李糖多糖将被理解为是指包含任选地连接到一个或多个其他单糖部分的多个、通常多于四个鼠李糖部分的分子。方便地，鼠李糖多糖可以是包含鼠李糖的重复单元的单个直链，所述重复单元通过α1,3或α1,2键彼此结合。每个重复单元可以仅由鼠李糖组成，或者每个重复单元可以包含鼠李糖和一个或多个不同的单糖。示例性的包含鼠李糖的重复单元是鼠李糖-半乳糖二糖重复单元。每个/任何重复单元和/或鼠李糖部分可以包括或不包括任何侧基。在一种实施方式中，不存在侧基，而在另一种实施方式中，可能存在一个或多个具有或不具有附加修饰(例如磷酸甘油；或磷酸盐)的侧基(例如糖)。18.在实施方式中，该方法在细菌中进行。19.在这样的实施方式中，该方法将被理解为微生物方法。除了在细菌中进行的实施方式之外的实施方式将被理解为体外方法。对于“细菌”，这将被理解为是指细菌细胞。应当理解，本发明还包括在细菌中进行的方法。这种微生物学方法非常适合生产大量且均质的特定产物，在这种情况下，即鼠李糖多糖。20.通过该方法产生的鼠李糖多糖将被理解为合成的鼠李糖多糖。如技术人员将理解的，合成的鼠李糖多糖将被理解为指不是天然存在过程的结果的鼠李糖多糖。这是因为第一方面的方法使用酶，该酶的组合不是天然存在的。在一种实施方式中，该细菌是除酿脓链球菌以外的链球菌属物种、埃希氏菌属物种(例如e.coli)、或志贺氏菌属物种(例如痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)或弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri))。21.通常，通过该方法生产的鼠李糖多糖是链球菌多糖。例如，多糖可包括选自由a群、b群、c群和g群碳水化合物组成的组中的多糖或其片段或变体。22.对于鼠李糖部分，这将被理解为指鼠李糖单糖或其衍生物。应当理解，鼠李糖衍生物是指通过在鼠李糖单糖中添加或取代的一个或多个基团或元素而被修饰的鼠李糖单糖，前提是鼠李糖单糖的至少一个碳仍然能够与至少一种其他鼠李糖单糖或鼠李糖部分形成糖苷键。鼠李糖的衍生物可以包括鼠李糖的乙酰或甲基形式、氨基鼠李糖、羧乙基鼠李糖、卤代鼠李糖和磷酸鼠李糖。除非上下文另有说明，否则下文将通常提及鼠李糖部分，但这不应被解释为限制性的。23.卤代鼠李糖应理解为指这样一种鼠李糖单糖，其中鼠李糖的一个或多个基团(例如一个或多个oh基团)被卤素例如氟离子或氯离子取代而分别形成氟代鼠李糖或氯代鼠李糖。24.氨基鼠李糖将被理解为指鼠李糖的一个或多个基团被氨基取代的鼠李糖单糖。25.示例乙酰鼠李糖可包括2-o-乙酰基-α-l-鼠李糖，而示例甲基鼠李糖可包括3-o-甲基-l-鼠李糖。鼠李糖的另一种示例性衍生物可以包括羧乙基鼠李糖，例如4-o-(1-羧乙基)-l-鼠李糖。26.通过酶活性片段或变体，我们囊括了，相关酶的序列可以不同于天然存在的序列，条件是该片段或变体基本上保留酶的酶活性。保留酶的酶活性是指，与天然酶相比，片段和/或变体保留至少一部分酶活性。通常，片段和/或变体保留至少50％，例如60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的活性。在一些情况下，片段和/或变体可具有比天然酶更高的酶活性。在一些实施方式中，与天然酶相比，片段和/或变体可以显示出另一种生理特征的增加。例如，与天然酶相比，片段和/或变体可以具有更长的体外和/或体内半衰期。用于确定酶或其片段或变体的半衰期的测试将是技术人员已知的。简而言之，体外测试可能涉及在特定温度和ph下将酶孵育不同的时间段。在每个时间段结束时，酶或其片段或变体的活性可以使用技术人员熟知的酶测定来测量。27.如本文所用，酶gacc将被理解为是指酿脓链球菌a群碳水化合物酶c(uniprotkb-q9a0g4(q9a0g4_strp1))。编码gacc的示例性氨基酸序列由seqidno：1提供。28.如本文所用，酶gacg将被理解为是指酿脓链球菌a群碳水化合物酶g(uniprotkb-q9a0g0(q9a0g0_strp1))。在一些实施方式中，酶gacg包含seqidno：2或其酶活性片段或变体或由seqidno：2或其酶活性片段或变体组成。29.在本发明的方法中，代替gacc使用gacg(或其酶活性同源物、变体或片段)，或除gacc之外还使用gacg(或其酶活性同源物、变体或片段)。gacc是鼠李糖-1,3α鼠李糖基转移酶，而gacg是一种预测的双功能糖基转移酶，该酶可合成gac的重复单元(alpha1,3-alpha1,2)。[0030]“同源物”可以包括表现出与gacc或gacg氨基酸序列具有至少约20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的酶。[0031]在一些实施方式中，酶活性同源物是gacc的同源物。[0032]两个或更多个氨基酸序列之间的“同源性”程度(或百分比)可以通过比对序列并确定比对的相同残基的数量并将此添加到保守氨基酸置换的数量来计算。然后将合并的总数除以比较的残基总数，然后将所得数字乘以100——这得出比对序列之间的同源性百分比。[0033]通常，gacc或gacg的同源物包括基本上保留gacc或gacg的酶活性的酶。[0034]在一些实施方式中，gacc的同源物包含rfbg或由rfbg组成。rfbg是一种源自弗氏志贺氏菌的α-1-3鼠李糖基转移酶，其与gacc具有30％的同一性。因此，在本发明的上下文中，rfbg是gacc的酶活性同源物。在一些实施方式中，rfbg包含seqidno:3或由seqidno:3组成。rfbg可以使用uniprotkb-a0a2d0wwb9(a0a2d0wwb9_9entr)来识别。[0035]gacc或gacg的同源物可以包含rfbg或由rfbg组成，rfbg是来源自除化脓链球菌以外的兰氏分群物种和/或除肺炎链球菌以外的非兰氏分群链球菌属物种的酶。[0036]在一些实施方式中，gacc或gacg的同源物是来源自酿脓链球菌以外的兰氏分群物种和/或肺炎链球菌以外的非兰氏分群链球菌物种的酶。[0037]如本领域技术人员将意识到的，细菌的兰氏分群是指一组不同的细菌物种，主要是链球菌属物种，它们是过氧化氢酶阴性和凝固酶阴性的。该分群基于细胞壁抗原的碳水化合物组成。[0038]兰氏分群细菌包括：[0039]·a群-酿脓链球菌、停乳链球菌类马亚种(streptococcusdysgalactiaesubsp.equisimilis)[0040]·b群-无乳链球菌(streptococcusagalactiae)[0041]·c群-类马链球菌(streptococcusequisimilis)、马链球菌(streptococcusequi)、兽疫链球菌(streptococcuszooepidemicus)、停乳链球菌、停乳链球菌类马亚种[0042]·d群-粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、耐久肠球菌(enterococcusdurans)和牛链球菌(streptococcusbovis)[0043]·e群-肠球菌[0044]·f、g和l群-咽峡炎链球菌(streptococcusanginosus)、停乳链球菌类马亚种。[0045]·h群-血链球菌(streptococcussanguis)[0046]·k群-唾液链球菌(streptococcussalivarius)[0047]·l群-停乳链球菌[0048]·m&o组-轻型链球菌(streptococcusmitior)[0049]·n群-乳酸乳球菌(lactococcuslactis)[0050]·r&s群-猪链球菌(streptococcussuis)[0051]非兰氏分群链球菌属物种可以包括变形链球菌(streptococcusmutans)或乳房链球菌(s.uberis)。在一些实施方式中，非兰氏分群链球菌属物种可包括变形链球菌或由变形链球菌组成。[0052]gacc或gacg的酶活性同源物可以选自链球菌b群、c群、g群、变形链球菌、乳房链球菌的同源物、或其酶活性片段或变体。[0053]在一些实施方式中，gacc或gacg的酶活性同源物可以选自链球菌b群、c群、g群、变形链球菌的同源物、或其酶活性片段或变体。[0054]在一些实施方式中，gacc的酶活性同源物选自链球菌b群、c群、g组、变形链球菌、乳房链球菌的gacc同源物、或其酶活性片段或变体。本领域技术人员将知道gacc的链球菌同源物。例如，gacc的b组同源物可以是gbcc(uniprotkb-q8dyq2(q8dyq2_stra5))。gacc的c组同源物可以是gccc(uniprotkb-m4ywq3(m4ywq3_streq))。gacc的g组同源物可以是ggcc(uniprotkb-c5wft8(c5wft8_strdg))，而gacc的变形链球菌同源物可以是sccc(uniprotkb-a0a0e2en43(a0a0e2en43_strmg))。gacc的乳房链球菌同源物可以是succ(uniprotkb-b9du25(b9du25_stru0))。[0055]gbcc的氨基酸序列可以包含seqidno：4或由seqidno：4组成。gccc的氨基酸序列可以由seqidno：5组成，而ggcc的氨基酸序列可以由seqidno：6组成。在一些实施方式中，sccc包含seqidno：7或由seqidno：7组成。succ的氨基酸序列可以包含seqidno：8或由seqidno：8组成。[0056]在一些实施方式中，gacg的酶活性同源物选自链球菌c群、g群、变形链球菌、乳房链球菌的gacg同源物、或其酶活性片段或变体。gacg的合适的酶活性同源物包括但不限于gacg的c群同源物gccg、gacg的g群同源物ggcg、gacg的乳房链球菌同源物sucg、和gacg的变形链球菌同源物sccg。[0057]在一些实施方式中，gccg包含seqidno:9并由seqidno:9组成。在一些实施方式中，gccg包含两种蛋白质或由两种蛋白质组成。这两种蛋白质可以包含seqidno:10和11或由seqidno:10和11组成。[0058]ggcg可以包含两种蛋白质或由两种蛋白质组成。这两种蛋白质可能分别具有uniprotkbsc5wfu2(c5wfu2_strdg)和c5wfu3(c5wfu3_strdg)。在一些实施方式中，ggcg可以包含seqidno:12和13或由seqidno:12和13组成。[0059]sucg可以包含由uniprotkb-b9du29(b9du29_stru0)鉴定的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。例如，sucg可以包含氨基酸序列seqidno：14或由氨基酸序列seqidno：14组成。[0060]sccg可以包含uniprotkb-o82878(o82878_strmg)鉴定的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，sccg包含氨基酸序列seqidno:15或由氨基酸序列seqidno:15组成。[0061]gacc或gacg的酶活性同源物可以选自变形链球菌、乳房链球菌或其片段或变体的同源物。[0062]在一些实施方式中，步骤(ii)包括通过使用来自变形链球菌的gacc和/或gacg的酶活性同源物或其活性变体或片段从二糖、三糖或四糖的非还原端的鼠李糖部分延伸，生成鼠李糖多糖。[0063]本发明还包括编码本发明的酶(和/或酶活性片段、变体或同源物)的核酸序列。[0064]如本文所用，当酶“来源自”特定细菌物种时，这意味着该酶天然存在于特定细菌物种中。在本发明的上下文中，“来源自”特定细菌物种的酶可以包括对可以在其中进行该方法的细菌而言内源的酶、从特定细菌物种分离的酶或编码该酶的核酸、或其变体或片段。在该方法在细菌中进行的实施方式中，可以将分离自特定细菌物种的酶或编码该酶的核酸转移到进行该方法的细菌中。[0065]在该方法在细菌中进行的实施方式中，步骤(i)的酶和/或步骤(ii)的酶可以在细菌中过表达。“过表达”将被理解为指酶的表达水平高于当在其天然细菌中内源表达时观察到的天然存在的酶的表达水平。用于过表达的各种技术是本领域技术人员已知的。有关过表达技术的更多信息可以在currentprotocolsinmolecularbiology(2019)中找到，其通过引用并入本文。[0066]在本发明的上下文中，异源用于指代不同。异源细菌物种将被理解为是指不同于另一细菌物种的细菌物种，或不同于另一细菌属的细菌属。[0067]应当理解，在本发明的上下文中，异源不包括不同于另一种细菌菌株的细菌菌株(即，例如，变形链球菌的两个菌株)。[0068]对于酶的“变体”，我们囊括氨基酸序列的插入、缺失和置换，无论是保守的还是非保守的，其中各个氨基酸的物理化学性质基本上没有改变(例如，保守置换，例如gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；和phe，tyr)。技术人员将理解此类保守置换不应影响相应酶的功能。此外，酶的非功能区域内的小缺失也是可以容忍的，因此出于本发明的目的被认为是“变体”。“变体”还包括其中氨基酸已经通过例如糖基化或二硫键形成进行翻译后修饰的重组酶蛋白。本领域技术人员可以容易地采用本文所述的实验程序来确定“变体”是否仍然可以用作酶。[0069]优选变体具有的氨基酸序列与酶的“天然存在的”氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、进一步优选至少85％、更进一步优选至少90％、最优选至少95％、97％、98％或99％的同一性。[0070]应当理解，变体还包括编码酶的核酸序列的变体。特别是，我们囊括了这样的核苷酸序列变体，这些变体中的这些变化不会显著改变其编码的酶的酶活性。技术人员会知道可以在不损失酶活性的情况下改变这样的序列。特别地，核苷酸序列中的单个改变可能不会导致序列表达后氨基酸序列的改变。[0071]在一些实施方式中，该方法在与酶gacc和/或gacg或其酶活性同源物、变体或片段所来源的细菌物种或属异源的细菌物种中进行。在一些实施方式中，该方法在革兰氏阳性细菌中进行。该方法可以在革兰氏阴性细菌中进行。例如，该方法可以在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌或弯曲杆菌属物种中进行。其他合适的革兰氏阴性菌是本领域技术人员已知的。在实施方式中，细菌物种可以与己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶或己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶所来源的细菌物种或属异源。[0072]在一些实施方式中，该方法在大肠杆菌中进行。[0073]该方法的步骤ii)可以包括使用来自细菌酶gac簇的一种或多种额外的酶、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段。[0074]如技术人员将理解的，gacb是由酿脓链球菌中的一个基因簇编码的多种酶之一。如vansorge等人在2014年定义的，该基因簇(也可称为gac基因簇)(gaca-gacl，mgas5005_spy_0602-0613)被理解为编码12种不同的酶。这12种酶是gaca、gacb、gacc、gacd、gace、gacf、gacg、gach、gaci、gacj、gack和gacl。因此，该方法的步骤ii)可以进一步包括使用来自细菌酶gac簇的一种或多种额外酶、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段。因此，在一些实施方式中，该方法的步骤ii)包括使用一种或多种额外酶、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段，该额外酶选自gaca、gacc、gacd、gace、gacf、gacg、gach、gaci、gacj、gack、gacl。[0075]在一些实施方式中，该方法的步骤ii)进一步包括使用gaca、gacc、gacd、gace、gacf、gacg、gach、gaci、gacj、gack、gacl中的一种或多种的一种或多种酶活性同源物、或其酶活性变体或片段。[0076]一种或多种酶活性同源物可以来源自变形链球菌和/或乳房链球菌。[0077]在一些实施方式中，一种或多种酶活性同源物来源自变形链球菌。[0078]步骤ii)可以进一步包括使用酶gaca或其酶活性同源物、片段或变体。在一些实施方式中，步骤ii)可以包括使用酶gacc和gacg、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段。[0079]在一些实施方式中，步骤ii)包括使用酶gacc、gaca和gacg、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段。步骤ii)可进一步包括使用酶gacd、gace和gacf、或其一种或多种酶活性同源物、片段或变体。[0080]步骤ii)可以包括使用酶gacc、gaca、gacg、gacd、gace和gacf、或其一种或多种酶活性同源物、片段或变体。[0081]在一些实施方式中，步骤ii)包括使用酶gaca、gacc、gacd、gace、gacf、gacg、gach、gaci、gacj、gack和gacl、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段。[0082]步骤ii)可以包括使用gaca、gacc、gacd、gace、gacf、gacg和gach的来自变形链球菌和/或乳房链球菌的酶活性同源物。[0083]在一些实施方式中，步骤ii)包括使用gaca、gacc、gacd、gace、gacf、gacg和gach的来自变形链球菌的酶活性同源物。[0084]gaca可以包含seqidno：16或由seqidno：16组成。不希望受理论束缚，据信gaca的功能是合成鼠李糖多糖生成所需的鼠李糖部分。gacg被认为通过从还原端的鼠李糖部分延伸而参与鼠李糖多糖的生成。[0085]gacd和gace可能起到形成atp依赖性abc转运蛋白的作用。如技术人员将理解的，atp依赖性abc转运蛋白跨膜转运底物。因此，不希望受理论束缚，gacd和gace可以帮助将鼠李糖多糖转运穿过细菌膜，使其随后可以呈递在细菌细胞壁上。[0086]gach可以包含seqidno：17或由seqidno：17组成。gach也可以使用uniprotkb-j7m7c2(j7m7c2_strp1)来识别。[0087]在一些实施方式中，步骤ii)进一步包括使用酶gach、gaci、gacj、gack和gacl、或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段。[0088]认为gaci和/或gacj可以提高合成鼠李糖多糖的方法的催化效率。[0089]gaca的酶活性同源物可以选自gaca的来自链球菌b群、c群、g群、变形链球菌、乳房链球菌的同源物、或其酶活性片段或变体。例如，gaca的b群链球菌同源物是rmid。gaca的c群链球菌同源物是rmid，gaca的g群链球菌同源物也是如此。[0090]gaca的b群链球菌同源物rmid可能具有uniprotkb-a0a0e1ep43(a0a0e1ep43_strag)。在一些实施方式中，gaca的b群链球菌同源物rmid包含seqidno：18或由seqidno：18组成。[0091]gaca的c群链球菌同源物rmid可能具有uniprotkb-k4q921(k4q921_streq)。在一些实施方式中，gaca的c群链球菌同源物rmid包含seqidno：19或由seqidno：19组成。[0092]gaca的g群链球菌同源物rmid可能具有uniprot-kba0a2x3ail5(a0a2x3ail5_strdy)。gaca的g群链球菌同源物可以包含seqidno：20或由seqidno：20组成。[0093]可以使用uniprotkb-o33664(o33664_strmg)鉴定gaca的变形链球菌同源物。在一些实施方式中，gaca的变形链球菌同源物可以包含seqidno：21或由seqidno：21组成。[0094]可以使用uniprotkb-b9du23(b9du23_stru0)识别gaca的乳房链球菌同源物。在一些实施方式中，gaca的乳房链球菌同源物可以包含seqidno：22或由seqidno：22组成。[0095]gacd、gace和/或gacf的酶活性同源物可以选自来自链球菌c群、g群、变形链球菌、乳房链球菌的同源物、或其酶活性片段或变体。gacd的合适同源物包括但不限于c群链球菌酶gccd、g群链球菌酶ggcd和变形链球菌酶sccd。gace的合适同源物包括但不限于c群链球菌酶gcce、g群链球菌酶ggce和变形链球菌酶scce。gacf的合适同源物包括但不限于c群链球菌酶gccf、g群链球菌酶ggcf、变形链球菌酶sccf和乳房链球菌酶sucf。[0096]在一些实施方式中，gccd包含氨基酸序列seqidno：23或由seqidno：23组成。gcce可以使用uniprotkb-a0a380kil0(a0a380kil0_streq)来识别。在一些实施方式中，gcce包含氨基酸序列seqidno：24或由seqidno：24组成。gccf可以使用uniprotkb-a0a3s4qir3(a0a3s4qir3_streq)来识别。任选地，gccf包含seqidno:25或由seqidno:25组成。[0097]在一些实施方式中，ggcd包含氨基酸序列seqidno：26或由氨基酸序列seqidno：26组成。ggcd可以使用uniprotkb-c5wft9(c5wft9_strdg)来识别。[0098]在一些实施方式中，ggce由uniprotkb-m4yxs7(m4yxs7_streq)识别。任选地，ggce包含seqidno:27或由seqidno:27组成。ggcf可以由uniprotkb-c5wfu1(c5wfu1_strdg)识别。在一些实施方式中，ggcf包含seqidno：28或由seqidno：28组成。[0099]sccd可以包含seqidno：29或由seqidno：29组成。任选地，使用uniprotkb-i6l8z4(i6l8z4_strmu)识别sccd。[0100]scce可以包含seqidno：30或由seqidno：30组成。任选地，使用uniprotkb-i6l8x8(i6l8x8_strmu)识别scce。[0101]可以使用uniprotkb-o82877(o82877_strmg)识别sccf。任选地，sccf包含seqidno：31或由seqidno：31组成。[0102]sucd可以使用uniprotkb-b9du26(b9du26_stru0)来识别。在一些实施方式中，sucd包含seqidno：32或由seqidno：32组成。[0103]suce可以使用uniprotkb-b9du27(b9du27_stru0)来识别。在一些实施方式中，suce包含seqidno：33或由seqidno：33组成。[0104]sucf可以使用uniprotkb-b9du28(b9du28_stru0)来识别。在一些实施方式中，sucf包含氨基酸序列seqidno：34或由seqidno：34组成。[0105]gach的酶活性同源物可以包含变形链球菌酶scch或其酶活性片段或变体或由变形链球菌酶scch或其酶活性片段或变体组成。酶scch可以使用uniprotkb-q8dus0(q8dus0_strmu)进行鉴定。[0106]在一些实施方式中，scch包含seqidno:35或由seqidno:35组成。[0107]在一些实施方式中，己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶不是n-乙酰葡糖胺(glcnac)-β-1,4-鼠李糖基转移酶。在一些实施方式中，己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶不是gacb。[0108]“己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶”将被理解为能够将鼠李糖部分转移至己糖从而在己糖和鼠李糖部分之间形成β-1,4连接的酶。一旦鼠李糖部分被转移，将理解己糖在还原端并且鼠李糖部分在非还原端，即从其延伸以生成鼠李糖多糖的末端。[0109]己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶可以包括以下或由以下组成：阿洛糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、阿卓糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、葡萄糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、甘露糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、木糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、艾杜糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、半乳糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、塔罗糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、二乙酰杆菌胺-β-1,4-鼠李糖基转移酶(diacetylbacillosamine-β-1,4-rhamnosyltransferase)、或其酶活性片段或变体。[0110]在一些实施方式中，己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶包含葡萄糖(glc)-β-1,4-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体。如本领域技术人员将理解的，葡萄糖(glc)-β-1,4-鼠李糖基转移酶是能够将鼠李糖部分转移至葡萄糖，从而在葡萄糖和鼠李糖部分之间形成β-1,4连接的酶。己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶可包含wchf酶、或其酶活性片段或变体。wchf酶应理解为来源自肺炎链球菌并且是葡萄糖(glc)-β-1,4-鼠李糖基转移酶。[0111]在一些实施方式中，wchf酶包含seqidno：36、或其酶活性片段或变体。[0112]wchf的酶活性片段或变体可以与wchf酶具有至少30％的氨基酸序列同一性。[0113]在一些实施方式中，wchf的酶活性片段或变体与wchf酶具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸同一性。例如，来自缓症链球菌(s.mitis)、口腔链球菌(s.oralis)、假肺炎链球菌(s.pseudopneumoniae)和栖口腔链球菌(s.perosis)的wchf同源物分别与wchf具有87％、93％、87％和81％的氨基酸同一性。在本发明的上下文中，这些特定的同源物因此将被理解为wchf的酶活性变体。[0114]己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶可以包括以下或由以下组成：阿洛糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、阿卓糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、葡萄糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、甘露糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、木糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、艾杜糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、α-半乳糖α-1,2-鼠李糖基转移酶、塔罗糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、二乙酰杆菌胺-α-1,2-鼠李糖基转移酶(diacetylbacillosamine-β-1,4-rhamnosyltransferase)、glcnac-α-1,2-鼠李糖基转移酶、或其酶活性片段或变体。[0115]在一些实施方式中，己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶包括以下或由以下组成：半乳糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、或其酶活性片段或变体组成。己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶可包括wbbr酶、或其酶活性片段或变体。如技术人员将理解的，wbbr酶(wp_001045977.1-uniprotkb-q32eg0(q32eg0_shids))源自痢疾志贺氏菌并且是半乳糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶。[0116]wbbr酶可以包含seqidno：37或由seqidno：37组成。[0117]己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶可包括以下或由以下组成：阿洛糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、阿卓糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、葡萄糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、甘露糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、木糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、艾杜糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、半乳糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、塔罗糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、二乙酰杆菌胺-α-1,3-鼠李糖基转移酶(diacetylbacillosamine-α-1,3-rhamnosyltransferase)、glcnac-α-1,3-鼠李糖基转移酶、或其酶活性片段或变体。[0118]在一些实施方式中，己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶包括以下或由以下组成：glcnac-α-1,3-鼠李糖基转移酶、dinacbac-α-1,3-鼠李糖基转移酶、glc-α-1,3-鼠李糖基转移酶、半乳糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、或其片段或变体。己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶可包含以下或由以下组成：glcnac-α-1,3-鼠李糖基转移酶或半乳糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、或其酶活性片段或变体。[0119]glcnac-α-1,3-鼠李糖基转移酶可包括wbbl酶或其酶活性片段或变体。wbbl酶来源自大肠杆菌。wbbl酶可以包含seqidno：38或其酶活性片段或变体或由seqidno：38或其酶活性片段或变体组成。[0120]wbbl的酶活性片段或变体可以与wchf酶具有至少20％或至少25％的氨基酸序列同一性。例如，已在结核分枝杆菌中鉴定出与wbbl具有27％氨基酸同一性的wbbl同源酶，也被称为wbbl。因此，在本发明的上下文中，该同源物将被理解为wbbl的酶活性变体。这种源自结核分枝杆菌的与wbbl同源的酶可以包含seqidno:39或由seqidno:39组成。wbbl的另一种合适的同源物包括酶rfbf或由酶rfbf组成，该酶rfbf来源自弗氏志贺氏菌。rfbf可以包含seqidno：40或由seqidno：40组成。可以使用uniprotkb-a0a2y2z3i0(a0a2y2z3i0_shifl)识别rfbf。[0121]半乳糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶可包含wsad酶或其酶活性片段或变体。wsad酶来源自嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)。在一些实施方式中，wsad酶包含seqidno：41或由seqidno：41组成。[0122]wsad的酶活性片段或变体可以来源自其他芽孢杆菌菌株，例如短芽孢杆菌属(brevibacillus)物种和类芽孢杆菌属(paenibacillus)物种。wsad的酶活性片段或变体可与wsad具有至少20％、30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸同一性。[0123]发明人惊奇地发现己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或酶活性变体、片段与gacb或其酶活性变体、片段或同源物的嵌合体能够将鼠李糖部分转移至己糖单糖、二糖或三糖。因此，在一些实施方式中，使用gacb/己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体嵌合体将鼠李糖部分转移至己糖单糖、二糖或三糖。应当理解，在这样的实施方式中，己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶不是gacb。[0124]嵌合体可以至少包含与己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、或其酶活性片段或变体的n端区连接的gacb的c端区。在一些实施方式中，嵌合体包含与wchf的n端区连接的gacb的c端区。[0125]在一些实施方式中，嵌合体包含除了最初的50、100、150、160、170、180、190或200个氨基酸以外的gacb的完整氨基酸序列，所述最初的50、100、150、160、170、180、190或200个氨基酸被相应的己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶取代、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、或其氨基酸的酶活性片段或变体取代。示例嵌合体可以包含除了gacb的前178个氨基酸的gacb的氨基酸序列，所述gacb的前178个氨基酸被相应的wchf氨基酸(1至186个氨基酸)取代。[0126]鼠李糖部分所转移到的己糖单糖、二糖或三糖可以是任何己糖。在实施方式中，己糖单糖不是鼠李糖部分。[0127]在其中鼠李糖部分被转移至己糖二糖或三糖的实施方式中，二糖或三糖的单糖可以彼此相同或不同。例如，二糖可以包含两个半乳糖单糖。可替代地，二糖可包含glcnac和半乳糖。glcnac可以在二糖的还原端，而半乳糖在非还原端。[0128]二糖可以包含一个鼠李糖部分。三糖可以包含一个或两个鼠李糖部分。[0129]在一些实施方式中，鼠李糖部分所转移到的己糖单糖、二糖或三糖的还原端的单糖(即，己糖单糖或二糖或三糖的第一单糖)是葡萄糖或葡萄糖衍生物。[0130]在本发明的上下文中，葡萄糖衍生物将被理解为指glcnac或dinacbac。在一些实施方式中，己糖单糖、二糖或三糖不包括glcnac。[0131]应当理解，在己糖单糖、二糖或三糖的非还原端的单糖决定了鼠李糖基转移酶的特异性。这是因为鼠李糖基转移酶将鼠李糖部分转移到己糖单糖、二糖或三糖的非还原端的单糖上。因此，当非还原端的单糖是半乳糖时，鼠李糖基转移酶是半乳糖鼠李糖基转移酶。[0132]二糖或三糖可在其非还原端包含鼠李糖部分。[0133]示例性二糖可包含与非还原端的鼠李糖部分连接的还原端葡萄糖。其他示例性二糖包括但不限于，与非还原端的鼠李糖部分连接的还原端的dinacbac，或与非还原端的鼠李糖部分连接的还原端的半乳糖。[0134]示例性三糖包括但不限于，与连接至非还原端的鼠李糖部分的己糖连接的还原端的葡萄糖，与连接至非还原端的鼠李糖部分连接的还原端的dinacbac，或与连接至非还原端的鼠李糖部分的己糖连接的还原端的glcnac。任选地，三糖的己糖可以是鼠李糖部分或半乳糖。[0135]当提及己糖之间的“连接”时，这将被理解为是指糖苷键。在二糖或三糖中，二糖或三糖中两个己糖之间的糖苷键可以是α或β糖苷键。α键可以是α1,3或α1,2键。β键可以是β1,4键。[0136]本文所述的己糖单糖、二糖和三糖的特征也适用于本发明链球菌多糖的己糖单糖、二糖和三糖。[0137]实施例2提供了在方法的步骤i)中鼠李糖部分可被转移到的单糖、二糖和三糖和/或包含本发明链球菌多糖的己糖单糖、二糖或三糖或由本发明链球菌多糖的己糖单糖、二糖或三糖组成的单糖、二糖和三糖的其他示例。[0138]在其中步骤(i)包括将鼠李糖部分转移至己糖二糖或三糖的实施方式中，该方法可以进一步包括形成己糖二糖或三糖。己糖二糖或三糖可以使用己糖基转移酶(即能够将己糖转移至另一种己糖的酶)形成。对于三糖己糖，如果三糖的每个单糖都是相同的(例如三糖是由三个葡萄糖组成的)，那么可以使用一种己糖基转移酶将每个己糖转移到另一个上，形成三糖。然而，在己糖三糖由至少两种不同的己糖形成的实施方式中，则需要两种不同的己糖基转移酶来形成己糖三糖。[0139]当该方法进一步包括形成己糖二糖时，可以使用己糖-α-1,3-己糖基转移酶或其酶活性片段或变体形成己糖二糖。己糖-α-1,3-己糖基转移酶将被理解为指能够将己糖转移至另一种己糖以形成α-1,3键的酶。在本发明的上下文中，键可以另外用于指连接。在一些实施方式中，使用己糖-α-1,3-半乳糖基转移酶形成己糖二糖。己糖-α-1,3-半乳糖基转移酶可以包含以下或由以下组成：glcnac-α-1,3-半乳糖基转移酶、任选地酶wbbp、或其酶活性片段或变体组成。酶wbbp可以使用uniprotkb-q53982(q53982_shidy)进行鉴定。在一些实施方式中，wbbp可以包含氨基酸序列seqidno：42或由氨基酸序列seqidno：42组成。因此，在一些实施方式中，二糖由其还原端的glcnac和其非还原端的半乳糖组成，这两种己糖通过α-1,3键连接。[0140]在一些实施方式中，该方法包括使用酶wbbp或其酶活性片段或变体形成己糖二糖，然后使用酶wbbr或其酶活性片段或变体将鼠李糖部分转移至己糖二糖。[0141]可以使用己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体形成己糖二糖。例如，可以使用半乳糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶(例如wsad或其酶活性片段或变体)来形成己糖二糖。在这样的实施方式中应当理解，己糖二糖由还原端的半乳糖和非还原端的鼠李糖部分形成。当使用半乳糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶形成己糖二糖时，酶wsap也可任选地用于二糖的形成，例如将脂质连接到半乳糖上。wsap酶来源自嗜热脂肪地芽孢杆菌。wsap可以使用uniprotkb-q7bg44(q7bg44_geose)来识别。在一些实施方式中，wsap酶包含seqidno：43或由seqidno：43组成。[0142]wsap的酶活性片段或变体可源自其他芽孢杆菌菌株，例如短芽孢杆菌属物种和类芽孢杆菌属物种。wsap的酶活性片段或变体可与wsap具有至少20％、30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸同一性。[0143]己糖二糖可使用己糖-α-1,2-己糖基转移酶或其酶活性片段或变体延伸以形成三糖或四糖，然后使用异源细菌酶gacc和/或gacg或其酶促活性同源物、变体或片段从三糖或四糖的非还原端的鼠李糖部分进一步延伸。示例性己糖-α-1,2-己糖基转移酶可以包括但不限于wsac和wsae。wsac可以由uniprotkb-q7bg54(q7bg54_geose)识别。任选地，wsac包含seqidno:44或由seqidno:44组成。wsae可以由uniprotkb-q7bg51(q7bg51_geose)识别。任选地，wsae可以包含seqidno:45或由seqidno:45组成。[0144]当该方法进一步包括形成己糖三糖时，两个单糖可以如对于二糖所述的那样连接在一起，然后使用另外的己糖基转移酶将另外的己糖转移到二糖的非还原端。额外的己糖基转移酶可以包含己糖-鼠李糖基转移酶，从而将鼠李糖部分转移至非还原端。合适的己糖-鼠李糖基转移酶可以包括本文所述的任何己糖-鼠李糖基转移酶。合适的己糖-鼠李糖基转移酶可以包括鼠李糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶(例如酶wbbq或wsac)、或其酶活性变体或片段。wbbq可以使用uniprotkb-a0a090nic3(a0a090nic3_shidy)来识别。在一些实施方式中，wbbq包含seqidno：46或由seqidno：46组成。[0145]在一些实施方式中，使用不是gacc的鼠李糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶形成己糖三糖。[0146]实施例中提供了关于用于本发明的示例性己糖基转移酶的进一步信息。[0147]鼠李糖部分被转移到的己糖单糖、二糖或三糖可以与脂质连接。因此，步骤i)可包括将鼠李糖部分转移至脂连己糖单糖、二糖或三糖。己糖单糖、二糖或三糖之间的连接可以包括十一异戊烯二磷酸。[0148]该方法可以进一步包括使用能够识别鼠李糖多糖还原端的己糖单糖的o-寡糖基转移酶将鼠李糖多糖与受体分子缀合以形成鼠李糖糖缀合物的步骤(步骤(iii))。[0149]o-寡糖基转移酶是用于在称为蛋白质糖基化的过程中催化碳水化合物部分转移至靶蛋白的酶。蛋白质糖基化是将碳水化合物部分(即多糖)共价连接到蛋白质底物的过程。o-寡糖基转移酶通过在多糖的还原端切割磷酸-单糖键起作用。为了能够与底物相互作用，o-寡糖基转移酶必须能够识别磷酸键后的前两个单糖。底物可以另外称为受体。因此，受体分子可以包含肽或蛋白质。这导致形成包含本发明的鼠李糖多糖的糖缀合物。这种糖缀合物作为抗原特别有用，可用于免疫原性组合物或疫苗。此外，当该方法在细菌中进行时，糖基化过程导致在细菌表面上呈现糖缀合物。这使得糖缀合物能够从细菌中分离出来以供进一步使用，或者使整个细菌能够用作抗原，可用于免疫原性组合物或疫苗。[0150]在一些实施方式中，o-寡糖基转移酶能够识别葡萄糖或葡萄糖衍生物。在这样的实施方式中，在鼠李糖多糖还原端的己糖单糖将是葡萄糖或葡萄糖衍生物，例如n-乙酰葡糖胺(glcnac)。[0151]o-寡糖基转移酶可包含pgib、pgil、pgis或wsab或其酶活性同源物、片段或变体。[0152]pgib酶可以来源自弯曲杆菌属(campylobacter)物种，例如空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)或红嘴鸥弯曲杆菌(campylobacterlari)。不希望受理论束缚，据信pgib酶能够识别除葡萄糖之外的任何己糖。[0153]pgil酶可以来源自脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)。据信pgil酶能够识别除葡萄糖之外的任何己糖。[0154]pgis酶可以来源自不动杆菌属(acinetobacter)物种。据信pgis酶能够识别葡萄糖。[0155]wsab酶来源自嗜热脂肪地芽孢杆菌。wsab酶的酶活性变体可以来源自其他地芽孢杆菌属(geobacillus)物种。[0156]在一些实施方式中，o-寡糖基转移酶来源自与进行该方法的细菌异源的细菌物种。[0157]该方法可以进一步包括纯化鼠李糖糖缀合物的额外步骤。纯化可包括高效液相色谱(hplc)(例如再循环hplc)、亲和色谱或尺寸排阻色谱。其他合适的纯化方法将为技术人员所知。[0158]应当理解，该方法可以以工业规模进行。如技术人员将意识到的，可以执行该方法的细菌在液体培养基中生长。这种包含细菌的液体培养基可用于填充工业规模的生物反应器，例如体积至少50升、100升或1000升的的生物反应器。这有利地导致合成大量本发明的多糖产物。常用的液体培养基是luriabroth，也可以称为lysogenybroth。其他液体培养基将为技术人员所知。[0159]当该方法在细菌中进行时，该方法可以是分批补料法。“补料”是本领域技术人员熟悉的术语。然而，为了清楚起见，“补料批次”将被理解为指一种合成方法，其中在培养期间通过液体培养基向细菌提供营养物。[0160]合适的营养物将为技术人员所知。一些示例性但非限制性的营养物可以包括鼠李糖部分、除了鼠李糖部分之外的己糖和/或包括但不限于镁和/或锰的二价阳离子。[0161]在一些实施方式中，鼠李糖部分包含鼠李糖。鼠李糖可以以d或l同种型，优选以l同种型提供给液体培养基。[0162]将除鼠李糖部分以外的哪种己糖提供给液体培养基取决于通过该方法生产的鼠李糖多糖的组成。如果鼠李糖部分被转移到的己糖单糖、二糖或三糖包括葡萄糖，则技术人员将理解要供应到液体培养基的合适营养物是葡萄糖。如果己糖单糖、二糖或三糖包含半乳糖，则技术人员将理解要供应至液体培养基的合适营养物将是半乳糖。因此，供应至液体biology(2019)中找到，其通过引用并入本文。[0175]质粒还可包含适当的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、增强子序列、标记基因和/或其他序列。更多细节参见例如sambrook&russell,molecularcloning:alaboratorymanual:3rdedition。[0176]可以进一步工程化质粒以包含充当增强子和启动子区域并导致构建体上携带的融合蛋白序列有效转录的调节序列。调节单元的许多部分位于异源基因编码序列的上游并与异源基因编码序列可操作地连接。调节序列可以指导异源编码序列的组成型或诱导型表达。如果希望以特定时间的方式发生表达，则此类调节序列尤其适用。可以通过向液体培养基提供诱导剂来诱导表达。诱导剂可包括阿拉伯糖、iptg或鼠李糖或由阿拉伯糖、iptg或鼠李糖组成。当暴露于阿拉伯糖、iptg或鼠李糖时可以指导诱导型表达的调控序列将为技术人员所知的。[0177]阿拉伯糖可以以在液体培养基中1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l的最终浓度供应至液体培养基中。任选地，阿拉伯糖以约2g/l的浓度供应至液体培养基。[0178]iptg可以以在液体培养基中0.1mm至5mm的最终浓度供应至液体培养基。在一些实施方式中，iptg以在液体培养基中0.1至2mm的最终浓度，优选约1mm的浓度供应至液体培养基。[0179]l-鼠李糖可以作为诱导剂以0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/ml的最终浓度供应至液体培养基。[0180]还提供了使用根据第一方面的方法可获得的产品。可通过根据第一方面的方法获得的产品由于其合成生产方法而尤其纯且均质。因此，本发明的产品非常适合商业用途，例如用于大规模生产以用作抗原或用于研究应用。[0181]根据第三方面，提供一种合成链球菌多糖，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的非还原端和包含己糖单糖、二糖或三糖的还原端，己糖单糖、二糖或三糖如关于方法方面所述。多糖包含在己糖单糖、二糖或三糖与鼠李糖部分直链之间的α-1,3键或α-1,2键、或多糖包含己糖单糖、二糖或三糖与鼠李糖部分直链之间的β-1,4键，并且己糖单糖、二糖或三糖不包括n-乙酰葡糖胺。[0182]如发明人所发现的，来自酿脓链球菌的天然存在的gac包含通过β-1,4糖苷键连接至鼠李糖单糖线性链的glcnac(n-乙酰葡糖胺)单糖。通过改变还原末端糖的这种天然组成，发明人已经生成了一种合成多糖，其保留了gac的α-1,2-α-1,3鼠李糖二糖重复单元的化学组成和抗原能力，同时能够以工业规模和高纯度和严格控制的尺寸分布生产多糖，以提高产品长度的均匀性。[0183]因此，通常，多糖包括选自由a群、b群、c群和g群碳水化合物组成的组中的多糖或其片段或变体。[0184]在一些实施方式中，多糖包含在己糖单糖、二糖或三糖与鼠李糖部分直链之间的α-1,3键。己糖单糖二糖或三糖可以包括n-乙酰葡糖胺、n,n'-二乙酰杆菌胺、葡萄糖或半乳糖。[0185]在一些实施方式中，多糖包含在己糖单糖、二糖或三糖与鼠李糖部分直链之间的α-1,2键。己糖可以包括半乳糖。[0186]在一些实施方式中，多糖包含在己糖单糖、二糖或三糖与鼠李糖部分直链之间的β-1,4键，并且己糖包括葡萄糖。[0187]根据第四方面，提供链球菌鼠李糖糖缀合物，其包含缀合至受体的根据第三方面的链球菌多糖。糖缀合物具有很强的抗原潜力，因此本发明的鼠李糖糖缀合物在提高免疫反应方面具有特别的用途，例如作为免疫原性组合物或疫苗，或作为免疫原性组合物或疫苗的一部分。[0188]在实施方式中，多糖在多糖的还原端与受体缀合。受体可以包括肽或蛋白质。[0189]在一些实施方式中，链球菌鼠李糖糖缀合物在细菌宿主细胞(任选地革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌)的表面上表达。因此，本发明还包括细菌宿主细胞，该细菌宿主细胞在其细胞表面上包含第四方面的链球菌鼠李糖糖缀合物。方便地，在细菌宿主细胞的细胞表面上的表达使糖缀合物的分离变得容易。甚至更方便地，这意味着在其细胞表面上包含链球菌鼠李糖糖缀合物的细菌宿主细胞可以用作免疫原性组合物或疫苗的组分，而不需要从细菌宿主细胞中分离糖缀合物。这减少了生产用于下游用作免疫原性组合物或疫苗的糖缀合物所需的时间和成本。[0190]因此，根据第五方面，提供了细菌宿主细胞，其包含己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶或己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶、或其酶活性片段或变体、以及如本文所述的异源细菌酶gacc和/或gacg、或其酶活性同源物、变体或片段。[0191]细菌宿主细胞可以与己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶或己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或酶活性片段或其变体所来源的物种异源。任选地，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。细菌宿主细胞可以包含本文所述的酶和/或编码这些酶的核酸序列。[0192]根据第六方面，提供了免疫原性组合物或疫苗，该免疫原性组合物或疫苗包含第二方面或第三方面的鼠李糖多糖或根据第四方面的链球菌糖缀合物。免疫原性组合物或疫苗还可包含药学上可接受的和/或无菌赋形剂、载体和/或稀释剂。[0193]在一些实施方式中，免疫原性组合物或疫苗还包含抗原、多肽和/或佐剂。[0194]该组合物还可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所指的“药学上可接受的载体”是本领域普通技术人员已知的可用于配制药物组合物的任何生理媒介。如本文所指的“稀释剂”是本领域普通技术人员已知的可用于稀释药剂以用于药物组合物的任何物质。药剂可以与载体、稀释剂或赋形剂混合，或溶解、悬浮或分散在载体、稀释剂或赋形剂中。[0195]该组合物可以是胶囊、片剂、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束、透皮贴剂、脂质体的形式，或可被施用至患有由链球菌病因引起的疾病、病症或感染或具有发展成由链球菌病因引起的疾病、病症或感染的风险的动物的任何其他合适形式。[0196]本发明的组合物和/或疫苗可以配制用于口服、局部(包括皮肤和舌下)、乳房内、肠胃外(包括皮下、皮内、肌内和静脉内)、透皮和/或粘膜施用。在实施方式中，本发明的组合物和疫苗可以配制用于肠胃外施用，任选地皮下、皮内、肌内和/或静脉内施用。[0197]还提供了用于在动物中引起免疫反应或用于治疗或预防由链球菌病因引起的疾病、病症或感染的第二方面或第三方面的鼠李糖多糖、第四方面的链球菌糖缀合物、或第六方面的免疫原性组合物或疫苗。[0198]动物可以是任何哺乳动物对象，例如狗、猫、大鼠、小鼠、人、绵羊、山羊、驴、马、牛、猪和/或鸡。[0199]在实施方式中，动物是绵羊类动物、山羊类动物、马类动物、猪类动物、牛类动物或人。在实施方式中，动物是绵羊类动物。对于“绵羊类动物”，这将被理解为包括绵羊。[0200]技术人员将理解术语“山羊类”包括山羊，而“牛类”包括牛。马类是可以理解为包括马的术语。如本文所用，术语“猪类”包括猪。[0201]有助于动物解决感染/侵染的能力和/或帮助减轻与感染/侵染相关症状的免疫反应可称为“保护性反应”。在本发明的上下文中，通过利用本文所述的鼠李糖多糖引起的免疫反应可称为“保护性”免疫反应。术语“保护性”免疫反应可以包括任何免疫反应：(i)促进或影响宿主病原体负担的减少；(ii)减轻感染/侵扰的一种或多种影响或症状；和/或(iii)预防、减少或限制进一步(后续/继发性)感染的发生。[0202]因此，保护性免疫反应可以防止动物被特定病原体感染/侵染和/或发展成特定疾病或病症。[0203]“免疫反应”可被视为引发抗体(例如iga、igm和/或igg或任何其他相关同种型)反应和/或细胞因子或细胞介导的免疫反应的任何反应。免疫反应可以靶向本发明的鼠李糖多糖。例如，免疫反应可以包括对鼠李糖多糖的表位或整个鼠李糖多糖具有亲和力的抗体。[0204]还提供了治疗患有由链球菌病因引起的疾病、病症或感染的动物的方法，该方法包括向动物施用治疗有效量的第二或第三方面的鼠李糖多糖、第四方面的链球菌糖缀合物，或根据第六方面的免疫原性组合物或疫苗。[0205]治疗有效量应理解为指足以消除、减少或预防由链球菌病因引起的疾病、病症或感染的量。[0206]鼠李糖多糖、糖缀合物或免疫原性组合物或疫苗可以单剂量或多剂量施用。可以在一天内施用多剂(例如以例如3、6或8小时的间隔施用2、3或4剂)。可以酌情在几天、几周或几个月的时间段内定期(例如每天、每隔一天或每周)施用药剂。[0207]应当理解，待施用的最佳剂量可以由本领域技术人员确定，并且将根据所使用的特定药剂、制剂的强度、施用方式以及由链球菌病因引起的疾病、病症或感染的进展或严重程度而变化。取决于正在治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。已知的程序，例如制药工业常用的程序(例如体内实验、临床试验等)，可用于建立根据本发明使用的特定配方和精确的治疗剂量方案。[0208]还提供了试剂盒，该试剂盒包括：[0209](i)编码己糖-β1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶或己糖-α1,3-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体的核酸序列；和[0210](ii)编码异源细菌酶gacc和/或gacg或其酶活性同源物、变体或片段的核酸序列。用于试剂盒的合适的核酸序列如本文关于本发明的方法所描述。[0211]在一些实施方式中，该试剂盒还包含一种或多种编码如本文所述的o-寡糖基转移酶的核酸序列。[0212]该试剂盒可包含的其他核酸序列可包括编码以下12种酶gaca、gacd、gace、gacf、gach、gaci、gacj、gack和gacl中的一种或多种或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段的一种或多种核酸序列。[0213]在一些实施方式中，该试剂盒还包含编码gaca或其酶活性同源物、变体或片段的核酸序列。在一些实施方式中，该试剂盒包含编码gacg或其酶活性同源物、变体或片段的核酸序列。[0214]在一些实施方式中，该试剂盒包含编码gacg和gacc或其一种或多种酶活性同源物、变体或片段的核酸序列。[0215]在一些实施方式中，试剂盒进一步包含编码酶gaca、gacd、gace和gacf或其一种或多种酶活性同源物、片段或变体的核酸序列。[0216]该试剂盒还可包含一种或多种编码报道基因的核酸序列。报道序列可编码其表达可通过某些方式检测的基因或肽/蛋白质。合适的报道序列可以编码其表达可以通过例如光学、免疫学或分子手段检测的基因和/或蛋白质。示例性报道序列可以编码例如荧光和/或发光蛋白。示例可以包括编码萤火虫荧光素酶(luc：包括密码子优化形式)、绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(dsred)的序列。试剂盒的(i)和(ii)中描述的核酸序列之一或两者可以包含报道序列。[0217]该试剂盒可以任选地进一步包含细菌，例如革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。细菌可以与己糖-β-1,4-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶、己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶或其酶活性片段或变体所来源的细菌物种异源。[0218]应当理解，可以在一个或多个质粒中提供多个核酸序列。[0219]除非另有说明，本文所述的所有特征(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)可以以任何组合与任何上述方面结合。[0220]详细说明[0221]现在将参考以下附图以示例的方式描述本发明，这些附图显示：[0222]图1a)显示了产生鼠李糖链所需的化脓链球菌和变形链球菌基因的基因补充策略和图谱。变形链球菌簇：scca(smu0824)、sccb(smu0825)、sccc(smu0826)、sccd(smu0827)、scce(smu0828)、sccf(smu0829)、sccg(smu0830)。酿脓链球菌簇：gaca(m5005_spy_0602),gacb(m5005_spy_0603),gacc(m5005_spy_0604),gacd(m5005_spy_0605),gace(m5005_spy_0606),gacf(m5005_spy_0607),gacg(m5005_spy_0607)。b)细菌补充测定。用抗a群抗体探测的全细胞样品的蛋白质印迹。图上的图例；[0223]图2显示了针对抗gac抗体探测的全细胞样品的蛋白质印迹，显示了为δsccb或δgacb补充sccb_ttg、sccb_atg和gacb；[0224]图3显示了从表达空载体、变形链球菌sccab-defg、化脓链球菌gacb或变形链球菌sccb的大肠杆菌细胞中提取的放射性标记的脂连寡糖的薄层色谱分析；[0225]图4显示了检测到maldi-ms的gacb活性的体外评估。光谱从dtdp-rha和以下酶促反应产物获得：a.受体1(c13-pp-glcnac)b.受体1 gacb-gfpc.受体1 gacb裂解(无gfp)d.受体2(苯酚-o-c11-pp-glcnac)。e.受体2 gacb-gfp；f.受体2 gacb切割(无gfp)；g.受体2 gacb-d160n-fgfp；h.受体2 gacb-y182n-f-gfp；[0226]图5显示了使用maldi-ms对gacb对不同活化核苷酸糖供体的特异性的体外评估。光谱从gacb-gfp、受体2与以下之间的酶反应产物获得：dtdp-rha(a)、udp-glc(b)、udp-glcnac(c)或udp-rha(d)。只有当dtdp-rha用作核苷酸糖供体时，才能观察到转化为产物(818m/z和840m/z)；[0227]图6显示了通过maldims对gacb的金属离子依赖性的体外评估。光谱从dtdp-rha、受体2(a)与以下之间的酶促反应产物获得：gacb-gfp(b)、1mmmgcl2(c)、1mmmncl2(d)或edta(e)。在存在gacb-gfp的所有条件下，无论是否添加金属离子或金属螯合剂，都观察到转化为产物(818m/z和840m/z)；[0228]图7显示了a)(a)受体底物1、(b)产物1、(c)受体底物2、(d)产物2的800mhz1hnmr光谱；b)产物1的部分2droesy光谱显示β-l-rha的h1与鼠李糖(r)和glcnac(g)的质子之间的相关性。通过rha的h1的f2横截面以红色显示。c)带有质子编号的化学结构。[0229]图8显示了与肺炎链球菌中的荚膜多糖相比，不同链球菌中rhaps起始的示意图。rhaps生物合成由gaco(绿色背景)在und-p上起始，然后是gacb(蓝绿色)的作用，生成保守的核心结构und-pp-glcnac-rha。与gaco或gacb相比，氨基酸序列同一性、阳性氨基酸和序列内的空位的百分比在每个同源物下方给出：变形链球菌血清型csccb、无乳链球菌(gbs)rfab、停乳链球菌类马亚种167(gcs)rgpac、停乳链球菌类马亚种atcc12394(ggs)rs03945。右侧描绘了扩展每组脂连核心结构的特定碳水化合物组成。碳水化合物的重复单元(ru)突出显示(浅粉色背景)，糖残基的符号表示显示在图例中；[0230]图9显示(上)大肠杆菌总细胞裂解物的抗脂质a和抗gac蛋白质印迹。dgacb基因簇的wchf补充补充了21548细胞中的rhaps生物合成(缺乏und-pp-glcnac，失活weca基因)，而没有其他gacb和同源酶不能起始rhaps生物合成。(下)所有基因组合导致cs2775细胞中的功能性rhaps生物合成(包含und-pp-glcnac，功能性weca基因)；[0231]图10a)显示了48种部分或完全测序的链球菌病原体之间的系统发育关系。该树是基于gacb同源物的多序列比对使用clustalomega的默认邻接聚类方法构建的。该树是使用itol在线工具绘制的。树枝上的黑色方块表示具有全测序基因组的物种。(b)与每个节点相关联的条形图表示与gacb(蓝色)或gaco(洋红色)的各个同源物的百分比氨基酸同一性；[0232]图11左)显示了总细胞裂解物抗gac蛋白质印迹，表达dgacb基因簇和gacb、gacb突变体或gacb-wchf嵌合体的大肠杆菌21548细胞的的蛋白质印迹。gacb-wchf嵌合体补充了dgacbrhapscluster，表明n端wchf结构域足以将gacb的受体底物特异性从und-pp-glcnac更改为und-pp-glc；右)上样对照-蛋白质印迹后的考马斯染色膜；[0233]图12是显示天然存在的gac的组成的示意图；和[0234]图13是示出本发明的一实施方式的示意图；[0235]图14是示出本发明另一实施方式的示意图；[0236]图15是示出本发明又一实施方式的示意图；[0237]图16是示出本发明另一实施方式的示意图；[0238]图17是示出本发明实施方式的示意图；[0239]图18是进一步示出本发明的另一示意图；[0240]图19是抗gac蛋白质印迹，显示在根据本发明的方法中可以使用wbbl代替gacb或sccb。该图显示了来自表达基因簇rmld-sccc-sccd-scce-sccf-sccg(deltasccb)和gaca-gacc-gacd-gace-gacf-gacg(deltagacb)的细胞的总大肠杆菌裂解物的抗gac蛋白质印迹。辅以空质粒对照或wbbl。阿拉伯糖诱导浓度以％表述；[0241]图20和21是体内制备的放射性标记的脂联寡糖的图像；[0242]图22显示了大肠杆菌补充研究的结果；[0243]图23显示来自链球菌属的gaco、gacb和gacc酶的系统发育研究结果；[0244]图24显示了gacc的功能表征以及gacc如何将多聚鼠李糖安装到接头/茎上；[0245]图25显示了从2dtocsy和noesy光谱获得的质子和碳糖信号的分配以及它如何转化为鼠李糖多糖分子；[0246]图26显示了用wbbpqr接头/茎生成鼠李糖多糖而获得的蛋白质印迹图像；[0247]图27显示了从shigellaspp.接头/茎和gac重复单元生成的鼠李糖多糖的示意图；和[0248]图28显示根据本发明制备的鼠李糖多糖能够充当大肠杆菌糖缀合系统的底物。[0249]实施例1-gacb是α-d-glcnacβ-1,4-l-鼠李糖基转移酶[0250]引入[0251]酿脓链球菌依赖于不同的机制来抵御宿主的防御(1-5)。这些机制由多种毒力因子的合成支持，其中包括a群碳水化合物(gac)，其是占细菌细胞壁的40％至60％的表面多糖(6-9)。gac由[→3)α-rha(1→2)α-rha(1→]鼠李糖多糖(rhaps)主链组成，该主链在每个α-1,2-连接的鼠李糖上都具有β-d-glcnac(1→3)侧链修饰(9-11)。最近对gac的结构检查和成分分析也表明存在磷酸甘油(grop)(12)，这一观察结果在50多年来一直未被注意到(13,14)。进一步地，edgaretal.证明了约25％的gac侧链glcnacs修饰有grop，使这种聚合物带有负电荷，这对酿脓链球菌生物学和防御机制具有影响(12,13,15)。先前在其他表面聚糖(16,17)中发现的这一特征为gac的结构组成、生物合成和功能提供了新的见解。[0252]提出gac由12种蛋白质gacabcdefghijkl合成，这些蛋白质编码在一个基因簇中(即：mgas5005_spy0602-0613)，该基因簇已在迄今为止鉴定的所有酿脓链球菌物种中发现(1,18)。通过对转座子突变文库进行测序，lebretonetal.发现其中8个基因gacabcdefg和gacl对于酿脓链球菌的存活至关重要(4,19)。该信息支持vansorgeetal.的观察结果，他们通过插入诱变确定簇(gacabc)的前三个基因是必不可少的(1)。[0253]目前假设gac由五个连续步骤形成：(i)脂连受体起始，(ii)[→3)α-rha(1→2)α-rha(1→]rhaps主链合成，(iii)膜易位，(iv)细胞外环境中的易位后链修饰和(v)与肽聚糖的连接(9)。dtdp-鼠李糖的细胞质池由在两个独立基因簇rmlabc和gaca/rmld中编码的酶提供(16)。[0254]尽管最近有这些发现，但有关gac的生物合成的一些紧迫问题仍未得到解答。例如，构成gac簇(gacbcdefg)的12个基因中的6个的产物尚未被表征，因此gac起始、rhaps主链生物合成和易位步骤未知。[0255]作为获得有关gac起始步骤的更多信息的一种手段，我们对gac基因簇中编码的第二种酶进行了深入检查。在这里，我们证明与其初步的遗传注释和目前提出的作用(8)不一致的gacb是催化l-鼠李糖从dtdp-β-l-鼠李糖转移的第一种保留鼠李糖基转移酶。gacb通过不依赖金属的机制与脂连glcnac-二磷酸形成β-1,4糖苷键。更重要的是，我们对来自其他重要人类致病性链球菌的系统发育相关同源物的研究，特别是来自b、c和g兰氏分群链球菌的研究揭示了，gacb的作用在链球菌属中得到了很好的保留，这表明从所有兰氏分群生产rhaps的共同第一步。[0256]实验步骤[0257]生物信息学分析[0258]使用ncbiblastglobal比对(https://goo.gl/vb9zmd)和clustalomega(https://goo.gl/8fbvyp)(49)进行蛋白质序列的比对。使用expasy服务器(http://www.expasy.org/)上的protparam工具获得分子量预测。使用spoctopus(http://octopus.cbr.su.se/)和tmhmm算法(www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)生成拓扑预测。[0259]使用phyre2(https://goo.gl/zrgkj7)或raptorx(raptorx.uchicago.edu)同源识别引擎生成二级结构预测，并使用pymolmoleculargraphicssystem(教育版1.8llc)查看和分析这些结构。检查碳水化合物活性酶数据库(cazy)(http://www.cazy.org/)(50)以获得有关碳水化合物活性酶的分类和表征的信息。系统发育关系是使用clustalomega、clustalx和交互式生命树itol(22)建立的。[0260]细菌菌株和生长条件[0261]大肠杆菌菌株dh5α和mc1061无差别地用作重组质粒增殖和质粒整合的宿主菌株。大肠杆菌cs2775是在脂多糖上缺乏rha修饰的菌株，被用作宿主菌株来评估rhaps的产生。大肠杆菌21548是und-pp-glcnac缺陷型菌株，含有weca缺失，被用作生产rhaps的阴性对照。大肠杆菌菌株c43(de3)用于生产重组蛋白。所有大肠杆菌菌株均在lb培养基中生长。除非另有说明，否则所有细菌培养物均在37℃下以200rpm的转速在振荡培养箱中培养。必要时，培养基中添加了一种或多种抗生素，最终浓度如下：100μg/μl的羧苄青霉素(amp)、300μg/μl的红霉素(erm)或50μg/ml的卡那霉素(kan)。[0262]分子遗传学技术[0263]表1显示了用于扩增、缺失或诱变目的基因的正向和反向寡核苷酸引物对的dna序列。所有引物均获自integrateddnatechnologies(idt)。所有pcr反应均使用thermofisherscientific的simpliamp热循环仪按照标准程序进行。使用标准分子生物学程序克隆构建体，包括限制酶消化和连接。所有构建体都经过dna测序验证。[0264][0265][0266][0267]表1[0268]rhaps产量的确定[0269]将50μlod600标准化的过夜培养物在37℃下与50μl6xsds上样缓冲液混合，并在20％tricine-sds凝胶中分离(29)。按照传统的免疫印迹技术，通过在pvdf膜上进行免疫印迹来评估rhaps产量。一抗：兔抗酿脓链球菌a群碳水化合物多克隆抗体(abcam，ab21034)。二抗：山羊抗兔igghrp缀合物(biorad,170-6515)。在暴露于claritywesternecl(biorad)后，使用genesystm10suv-vis分光光度计(thermoscientific)捕获免疫反应信号。[0270]脂联寡糖的提取和放射性标记[0271]使用1:1chcl3/ch3oh和水饱和丁-1-醇(1:1v/v)溶液提取带有所选质粒的诱导的大肠杆菌cs2775细胞的放射性标记的脂联糖(lls)，确定补充葡萄糖d[6s3h](n)(perkinelmer)(1mci/ml)后体内糖残基的添加量。在beckmanls6000se闪烁计数器中测量掺入的放射性。将含有lls的有机相标准化为0.05μci/μl。使用c:m:ac:a:w流动相(180ml氯仿 140ml甲醇 9ml1m乙酸铵 9ml13m氨溶液，23ml蒸馏水)，然后干燥并喷洒en3hance液体(perkinelmer)。使用xarfilm和msintensifyingscreens，在5到10天后获得放射自显影图像。[0272]重组表达的膜相关蛋白的纯化[0273]按照具有如下修改的waldoetal.建立的方案(3)进行纯化。将表达c末端gfp融合蛋白的大肠杆菌c43(de3)细胞的过夜培养物按1:100稀释，孵育3小时直至od600＝0.6，用0.5mmiptg诱导并转移至室温过夜，均以200rpm振荡。使用fujifla-5000激光扫描仪通过凝胶内荧光来检测gpf表达。gacb-wt、gacb-d160n-gfp和gacb-y182-gfp的克隆、表达和纯化：如表1所述将含有gfp-his8标记的重组蛋白的质粒构建到载体pwaldo-e中(30)。出于蛋白质生产和纯化目的，将载体转化到大肠杆菌c43(de3)细胞中并如上所述表达。使用avestinc3高压均质器(biopharma，uk)对细胞进行分级分离，并以4000xg离心。将上清液以200000xg进一步离心2小时，得到2-3g含有gacb-gfp蛋白的膜。将膜溶解在缓冲液1(500mmnacl、10mmna2hpo4、1.8mmkh2po42.7mmkcl、ph7.4、20mm咪唑、0.44mmtcep)中，添加1％ddm(anatrace)，在4℃下保持2小时，并与1mlni-sepharose6fastflow(gehealthcare)柱结合，用缓冲液1加0.03％ddm预洗。使用补充有250mm咪唑和0.03％ddm的缓冲液1进行洗脱。使用用缓冲液(pbs、0.03％ddm、0.4mmtcep)平衡的hiprep26/10脱盐柱(gehealthcare)去除咪唑。在4℃下用prescissionprotease以1:100的比例过夜切割，去除gfp-his标签。在阴性imac后收集切割后的gacb蛋白。蛋白质特性和纯度分别通过胰蛋白酶肽质量指纹、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi-tof)确定(敦提大学‘指纹’蛋白质组学设施)。[0274]受体1和2的合成[0275]受体2(p1-(11-苯氧基十一烷基)-p2-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖基)二磷酸)由苯氧基十一烷基磷酸二氢盐和2-乙酰氨基-2-脱氧-3,4,6-三-o-乙酰基-α-d-吡喃葡萄糖基磷酸二氢盐根据t.n.druzhininaetal.2010(94)的程序合成为钠盐。受体1(p1-十三烷基-p2-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖基)二磷酸)由十三烷基磷酸二氢盐(与苯氧基十一烷基磷酸二氢盐类似地获得)通过与对受体2所描述的相同的程序合成。[0276]gacb体外酶促反应[0277]将纯化的gacb-wt-gfp、gacb-d160n-gfp、gacb-y182f-gfp和gacb(无标签)蛋白(0.15mg/ml终浓度)在100μltbs缓冲液中混合，并添加1mmtdp-rha作为糖供体和1mm受体1(c13-pp-glcnac)或1mm受体2(苯酚-o-c11h22-pp-glcnac)作为受体底物。将反应在30℃下孵育3小时至24小时。通过将核苷酸糖供体交换为udp-rha或udp-glcnac并添加1mmmgcl2、1mmmncl2或1mmedta来调整测定混合物，以确定金属依赖性的重要性。[0278]质谱分析[0279]基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)用于分析gacb体外测定的受体和产物。100μl反应样品在100μlsep-pakc18小柱(waters，uk)上纯化，用5％etoh预平衡。用800μlh2o和800μl15％etoh洗涤结合的样品，用a)800μl30％和b)800μl60％etoh分两次洗脱。将两个洗脱部分在高速真空中干燥并在20μl50％meoh中重悬。将1μl样品与1μl2,5-二羟基苯甲酸(dhb)酸基质(15mg/ml溶于30:70乙腈:0.1％tfa)混合，然后将1μl添加到maldi网格中。通过maldi在设置为反射正离子模式(bruker,germany)的autoflex速度质谱仪中分析样品。[0280]nmr分析[0281]将纯化的gacb体外测定产物(0.5-2mg)溶解在d2o(550μl)中并在300k下测量。光谱是在配备有具有自动匹配和调整功能的5mmtcicryoprobetm的4通道avanceiii800mhzbrukernmr光谱仪上获得的。1d光谱分别使用5和1.8s的弛豫和采集时间获得。使用11ppm的光谱宽度进行了32到512次扫描。j连通性是在一系列1d和2dtocsy实验中建立的，混合时间在20到120ms之间。使用40ms高斯脉冲和dipsi-2序列(33)(γb1/2π＝10khz)获得选择性1dtocsy光谱(32)，用于20和120ms之间的自旋锁定。以下参数用于获取2dtocsy和roesy实验：t2和t1中分别有2048和768个复点，f2和f1中的光谱宽度分别为11和8ppm，t2和t1采集时间分别为116和60ms.分别使用1.5s的弛豫时间对每个t1增量进行16次扫描。每个实验的总采集时间为6-7小时。在f1中应用了对4096个点的前向线性预测。在f2中应用了到4096的零填充。在傅里叶变换之前，在两个维度上使用余弦平方窗函数进行切趾(apodization)。roesy混合时间以γb1/2π＝4167hz的250ms矩形脉冲的形式应用。dipsi-2序列(γb1/2π＝10khz)应用于20、80和120ms自旋锁定。2d幅度模式hmbc实验：t2和t1中分别有2048个和128个复点，f2和f1中的光谱宽度分别为6和500ppm，t2和t1采集时间分别为0.35s和0.6ms。分别使用1.2s的弛豫时间对128个t1增量中的每个进行2次扫描。总采集时间为8分钟。在f1中应用了对512个点的前向线性预测；在f2中应用了到4096的零填充。在傅里叶变换之前，在两个维度上使用正弦平方窗函数进行切趾(apodization)。[0282]gacc/同源酶蛋白纯化[0283]对于重组蛋白的生产，使用idt的gblock基因片段合成服务合成目标基因(gacc、gbcc、cps2f、sccc)。pcr扩增gacc及其同源物的野生型序列，突出端被设计为用于克隆到popinf1中，popinf1中包含用于亲和纯化的n端6x组氨酸标签。使用in-fusiontm克隆技术(clontech)克隆到popinf。然后将得到的质粒转化到dh5α感受态细胞中进行增殖和提取(miniprep试剂盒；qiagen)。使用凝胶电泳通过与未转化对照popinf质粒的大小比较来鉴定阳性转化的质粒，随后通过dna测序确认。为了插入点突变体，使用野生型质粒作为模板，对含有所需点突变体的2个重叠片段进行pcr扩增。片段被设计成包含最少15bp的重叠，并被克隆到popinf中，并按照野生型质粒验证序列。可在表a中找到用于野生型和突变体克隆的引物的完整列表。[0284]然后将经过序列验证的质粒转化到c43细胞中进行蛋白质表达。对于活性测定，1l大肠杆菌培养物通常产生足够的蛋白质用于》50次测定(1mgl-1)。培养物在37℃下生长并以200rpm振荡直到od为0.6-1，此时将它们转移到18℃1小时，然后用0.5mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导。使培养物在18℃下振荡过夜。在以3000xg离心培养物后，根据制造商的说明，使用avestinc3细胞破坏器在补充有蛋白酶抑制剂的缓冲液a0(50mmhepesph7.5、300mmnacl、10％甘油、2mmtcep)中提取蛋白质。然后将裂解的培养物以200,000xg超速离心并收集上清液。然后根据制造商的说明，使用洗涤缓冲液a(50mmhepesph7.5、300mmnacl、10％甘油、2mmtcep、20mm咪唑)和洗脱缓冲液b(50mmhepesph7.5、300mmnacl、10％甘油、2mmtcep、400mm咪唑)在镍亲和(thermofisher)柱上纯化含有感兴趣的可溶性蛋白质的上清液。然后将含有目标蛋白的洗脱部分通过脱盐柱，用缓冲液a0预平衡，以去除咪唑。将蛋白质样品浓缩至0.5-1mg/ml并在液氮中速冻直至使用。[0285]表a[0286][0287][0288]1.berrowns,aldertond,sainsburys,nettleshipj,assenbergr,rahmann,stuartdi,owensrj.aversatileligation-independentcloningmethodsuitableforhigh-throughputexpressionscreeningapplications.nucleicacidsresearch.2007mar1；35(6):e45.[0289]hplc测定[0290]对于体外酶分析，50μl反应被设置为包含2.5mm合成脂质受体ph-o-c11h22-pp-α-nag、12.5mmtdp-l-鼠李糖、0.5至1.5μmgacb-gfp和1.25至2.5μmgacc或感兴趣的同源物/突变体，用补充有2mmmncl2的tbs缓冲液加满至50μl。反应在30℃下孵育，当达到所需的时间点时，用50μl乙腈淬灭并在冰上放置15分钟。将反应物在台式离心机中以14,000rpm的转速旋转过滤去除沉淀的蛋白质，然后将其注入xbridgebehamideobsprep色谱柱(5μm,10x250mm)上，该色谱柱连接到配备有设置为270nm的uv检测器(ultimate3000，thermo)的hplc系统。使用运行缓冲液a(95％乙腈，10mm乙酸铵，ph8)和运行缓冲液b(50％乙腈，10mm乙酸铵，ph8)，以4ml/min的速度在b浓度增加的梯度上将样品上样到柱上。越来越多的带有额外糖残基的极性产品随后洗脱到梯度中，三重鼠李糖基化gacc产品通常在36分钟的运行时间中洗脱约14分钟。从hplc纯化的产物在快速真空中干燥以去除过量的乙腈，然后冷冻干燥以去除残留的水和乙酸铵。样品可以储存在-20℃用于结构分析。[0291]nmr分析gacc产物[0292]在敦提大学进行nmr分析时，将hplc纯化产物(0.5至2mg)重悬在600μld2o中，并在293k下记录nmr光谱。光谱是在配备5-mmqcpi冷冻探头的brukeravanceiiihd500mhznmr光谱仪上获得的。如对gacb反应产物所述地记录nmr光谱。使用brukertopsin(4.0.7)分析光谱。[0293]结果[0294]gacb是gacrhaps链的生物合成所必需的[0295]为了研究gacb功能并识别潜在的催化残基，我们使用大肠杆菌作为异源表达系统来研究gacrhaps主链生物合成。我们构建了两个载体，它们携带来自酿脓链球菌的同源基因，gacacdefg(gaca-g；δgacb)和gacb(图1a)。[0296]推测rhaps链在大肠杆菌中易位至外膜，外膜天然含有附着在脂多糖上的鼠李糖。因此，为避免抗gac抗体的非特异性结合，所有转化均使用rfas缺陷菌株进行(20)。rfas基因的中断阻碍了鼠李糖向细菌外膜上lps的附着，从而导致菌株在其表面上缺乏内源性鼠李糖(20)。使用图1中描述的传统补充策略研究了gacb的作用。[0297]我们使用总细胞裂解物的免疫印迹从我们的补充方法中研究了由gaca-g产生的rhaps(图1b)。如果gacbcdefg的表达足以产生rhaps链，那么我们应该能够使用特定的抗gac抗体检测合成的rhaps。结果表明，缺乏gaca-g基因簇(空载体)的大肠杆菌细胞不产生rhaps(图1，泳道2)。同样，带有δgacb或δsccb质粒的转化体失去了与gac抗体的反应性(图1，泳道3和5)。相反，sccb δsccb或gacb δgacb的共转化恢复了rhaps的产生，强调了sccb和gacb对于gac主链生物合成的重要性(图1，泳道4和6)。[0298]为了研究gacb和sccb是否催化相同的反应，我们通过共转化δsccb gacb和δgacb sccb测试了gacb功能上置换sccb的能力，反之亦然。在所有情况下，sccb和gacb都是可互换的(图2)。gacb的预测起始密码子与变形链球菌sccb不同，后者使用ttg而不是atg(图2)。我们决定测试两个版本的sccb；一种以ttg作为起始密码子，另一种以atg为起始密码子。两个版本都提供了可以补充δsccb和δgacb的活性酶(图2)。除非另有说明，否则所有进一步的工作都是使用具有天然ttg起始密码子的sccb构建体进行的。[0299]gacb扩展脂连前体[0300]我们调查了gacb是否是使用glcnac-pp-und作为受体的gt。我们进行了体内实验，生成了放射性标记的脂联寡糖(llo)，这些脂联寡糖从细菌膜中分离出来，并通过薄层色谱(tlc)分离。基于作为鼠李糖基转移酶的注释，放射性标记的dtdp-β-l-鼠李糖将是gacb的首选糖供体。然而，这种化合物在市场上无法买到，因此选择了氚化葡萄糖作为替代品。在细菌细胞内，葡萄糖被用作合成包括dtdp-l-鼠李糖在内的多种有机成分的底物(25)。[0301]我们假设gacb将活化的糖从(放射性标记的)核苷酸糖供体转移到膜结合受体单糖-pp-und，例如glcnac-pp-und。因此，与在tlc板中运行样品后的单糖脂连受体的信号相比，我们预计膜结合受体的大小会发生变化。作为阴性对照，我们使用了用空载体转化的大肠杆菌cs2775(δrfas)。该转化体显示出与单糖-pp-und的生成一致的信号(图3泳道1)。在gacb或sccb基因表达后，我们观察到在tlc板上迁移更慢的放射性信号的积累，表明这些化合物的分子量更高(图3，泳道3和4)。对于sccab-defg(δsccc)构建体(图3，泳道2)观察到相同的变化，表明sccb和gacb可以糖基化脂连前体。根据文献，我们假设上面的放射性标记条带对应于glcnac-pp-und，而较低的放射性标记条带对应于rha-glcnac-pp-und(8,9)。[0302]gacb是可将鼠李糖从tdp-β-l-rha转移到glcnac-pp-脂质受体上的鼠李糖基转移酶[0303]观察到的带移表明gacb将单糖添加到脂连前体中，很可能是glcnac-pp-und。我们使用重组产生和纯化的gacbwt和氨基酸突变体(突变体d160n和y182f)研究了这一假设。我们使用预测的核苷酸糖供体、tdp-β-l-鼠李糖和合成受体底物建立了体外测定。我们测试了其中两种旨在模拟天然脂连受体的合成底物：c13h27-pp-glcnac(受体1)或苯基-o-c11h22-pp-glcnac(受体2)(图7c)。使用基质辅助激光解吸电离质谱(maldi-ms)在正离子模式下纯化和表征反应。[0304]酶促反应的maldi-ms光谱(图4)证实，当与tdp-β-l-rha一起孵育时，gacb催化将一种鼠李糖添加到两种受体底物中(图4b和e)。受体1的分子量为563da，在m/z＝608[m-1h 2na] 和m/z＝630[m-2h 3na] 处检测到(图4a)。缺少gpf标签的gacb-gfp和gacb修饰了受体，导致m/z＝776[m-2h 3na] 处有一个主要峰(图4b，c)。在该光谱中，我们还可以在m/z＝754[m-1h 2na] 处观察到另外的强度较低的峰，对应于与2个na 离子而不是3个na 离子偶联的修饰受体1。在这两种情况下，与未修饰的受体相比，产物偏移m/z＝146，这与通过糖苷连接添加一种鼠李糖一致。对于第二个受体，观察到相同的质量转移；在m/z＝672[m-1h 2na] 和m/z＝694[m-2h 3na] 处检测到未修饰受体2(图4d)的峰，而产物峰出现在m/z＝818[m-1h 2na] 和m/z＝840[m-2h 3na] 处(图4e和4f)。我们还测试了gacb催化glcnac-α-1-p鼠李糖基化的能力，但该反应没有产生可检测的产物(数据未显示)，这表明该酶不仅与glcnac-p相互作用，而且可能需要第二种磷酸盐和脂质成分识别受体底物。[0305]我们进一步研究了gacb对糖核苷酸供体的特异性。特别是，我们测试了gacb是否对基于胸苷的核苷酸具有选择性并耐受基于尿苷的核苷酸，例如udp-glc、udp-glcnac和udp-rha。如前所示，在存在tdp-β-l-rha的情况下，在光谱中观察到两种产物与鼠李糖以及两种或三种钠阳离子的掺入一致(图5a)。相反，以udp-α-d-glc或udp-α-d-glcnac作为底物(图5b和c)未观察到产物峰，而检测到udp-β-l-rha的残留活性(图5d)。该数据表明gacb不耐受α-d构型的核苷酸糖。此外，gacb对脱氧核糖(tdp-鼠李糖)具有特异性和/或需要结合胸腺嘧啶甲基。[0306]最后，我们在体外评估了金属离子依赖性。与对照反应相比(图6b)，我们注意到当gacb添加mgcl2、mncl2或edta作为金属螯合剂时，酶的鼠李糖基化活性没有显著差异(图6c、d、e)，表明gacb的活性不需要二价金属离子。[0307]总之，这些数据证实了我们之前从lls放射性标记测定中得出的结论(图3)。这是首个体外证据表明gacb是不依赖金属的鼠李糖基转移酶，其通过使用tdp-β-l-rha作为唯一的活化核苷酸糖供体将单个鼠李糖转移到glcnac-pp-und来催化gacrhaps主链生物合成中的起始步骤。[0308]研究gacb的催化残基[0309]我们无法从洗涤剂提取的蛋白质中获得最终会揭示对催化区域的详细了解的衍射质量的晶体。我们基于属于gt-4gt家族的两种酶构建了gacb结构模型：炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)的babsha(pdb条目3mbo)(72)和谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)的msha(pdbid：3c4v)(24)。babsha在424个氨基酸中共享64个氨基酸，具有15％的同一性。msha是“同源”gt，在446个氨基酸中共享一段71个氨基酸的序列，具有16％的同一性。基于结构模型提供的稀缺信息和下文详细描述的多序列比对，我们使在40多种致病性链球菌中高度保守的几个残基突变。[0310]我们的体外大肠杆菌系统是第一个能够研究gacb突变蛋白的系统，可以识别那些消除或减少rhaps主链产生的突变体。在酿脓链球菌中进行此操作是不可能的，因为gacb基因的缺失会使细胞无法存活(1,20)。我们使用上述gt模型中可用的信息和多个链球菌的序列比对来选择可能参与底物结合的残基，这些残基在gt中往往是保守的。通过原位诱变，我们构建了九个重组版本的gacb，其中包含以下氨基酸置换：d126a、d126n、e222a、e222q、d160a、d160n、y182a、y182f和k131r。末者的突变被包括作为阴性对照，因为它是保守的预测表面残基，可能不参与催化活性或可能使酶失活。[0311]我们发现用天冬酰胺置换d160会导致rhaps链的产生急剧减少，而丙氨酸残基不会造成如此显著的影响。这表明d160羧基可能是催化所必需的，它可能在丙氨酸突变体中被水分子取代。y182突变观察到更严重的影响。y182(y182a)的丙氨酸置换显著阻碍了rhaps主链的生物合成，而y182f使gacb完全失活，表明y182羟基在gacb的酶活性中起重要作用。[0312]我们使用重组表达和纯化的gacb-gfp-融合体在体外测定中进一步研究了突变体d160n和y182f。对来自gacb-d160n-gfp和gacb-y182f-gfp的反应产物的maldi-ms分析显示，这两种突变体在体外都缺乏酶活性(图4g和h)。这些结果支持残基d160和y182在底物结合或催化中起作用的假设。[0313]最后，我们在创建了三个n端截短版本的gacb，试图确定在没有预测与膜相关的残基的情况下酶是否保持活性。我们的结果表明，当通过补充测定评估时，前22个(gacb23-385)、75个(gacb76-385)和118个残基(gacb119-385)的截短导致酶失活。它们无法补充δgacb表明n端结构域是活性所必需的，并支持gacb是膜相关鼠李糖基转移酶的假设。[0314]gacb是保留β-1,4-鼠李糖基转移酶[0315]目前的基因注释表明gacb是反向α-1,2鼠李糖基转移酶(1,8)。该注释与受体糖glcnac不兼容，因为它在c2位的碳已经被n-乙酰基修饰。因此，gacb只能将鼠李糖转移到c3、c4或c6上的可用羟基上。此外，gac主链由通过α-1,3-1,2键连接的鼠李糖重复单元组成(9,12)，表明gacb将是该途径中唯一使用保留作用机制的鼠李糖基转移酶。根据cazy数据库，gacb序列被归类为gt-4家族成员，gt-4家族被归类为保留gt(27)。如果该分类对gacb是正确的，则糖供体tdp-β-l-鼠李糖的异头中心(anomericcentre)处的立体化学构型应保留在最终产物中。[0316]为了阐明gacb是反向还是保留鼠李糖基转移酶，我们对纯化的反应产物1和2进行了核磁共振(nmr)光谱分析。在800mhz下收集1hnmr光谱，以建立受体1和2的结构完整性(图7a)，并确定酶促反应后其产物的化学结构(产品1和2)。核磁共振参数通过一维和二维(1d和2d)和2d总相关光谱(tocsy)实验确定(图7b)；它们的化学位移总结在表2中。对于这两种受体，α-d-glcnac的异头质子表现为双联体，3j(h1,h2)＝3.4hz，3j(h1,p)＝7.2hz。α-d-glcnac的质子h2也被3j(h2,p)＝2.4hz与p的耦合裂分。2d1h,31phmqc光谱(数据未显示)揭示了，这两个h-1'质子与在-13.5ppm处的p的相关性。在-10.6ppm处的31p和烷基链的相邻ch2基团的质子之间出现了另一种相关性，证实了受体底物的完整性。对于受体2，观察到积分强度为2:2:1的单置换苯的典型信号模式。[0317]向两种受体底物添加鼠李糖伴随着在水信号旁边的光谱异头区域(4.88ppm，h1)中出现特征信号。这种单糖的异头构型以多种方式建立。测得的1.0hz的3j(h1,h2)耦合常数表明β-l和α-l-rha的β-l构型(分别报告为1.1和1.8hz)。旋转框架核overhauser效应(roesy)光谱(图4b)显示鼠李糖的h1与其他四个质子在空间上接近。其中有鼠李糖的h2、h3和h5质子，后两者证实了h1、h3和h5之间的1,3双轴排列，这表明是β-1rha构型。最后，对鼠李糖的1h化学位移与α-l和β-l-吡喃鼠李糖的化学位移进行比较(图7c)，显示与β-l-鼠李糖的化学位移非常一致(75)，从而证实了该环的构型。鼠李糖h1的第四个roesy交叉峰伴随glcnac的h4，表明两个单糖之间存在(1→4)连接。受体底物和产物的glcnac1h化学位移的比较进一步支持了这一观察结果。在这里，观察到糖基化后h4的化学位移增加( 0.21ppm)，而glcnac的其他相应质子的化学位移之间差异的绝对值的平均值为0.03ppm。正如预期的那样，烷基和芳基侧链的信号在各自的受体-产物对中实际上没有改变。[0318]总之，1hnmr谱揭示了β-l-rha(1→4)d-glcnac部分的形成和产物的完整性。[0319]a、b、c和g群链球菌共享共同的rhaps起始步骤[0320]除了变形链球菌sccb之外，具有高度序列同一性的gacb同源物还存在于其他具有临床重要性的链球菌物种中，例如来自b群(gbs)、c组(gcs)和g组(ggs)的链球菌物种。所有同源酶都位于编码兰氏抗原(即b、c和g群碳水化合物)的生物合成的相应基因簇中(15)。同源基因产物分别与gacb共享67％、89％和89％的氨基酸同一性(表2，图8)。通过根据物种不同而程度不同的证据，存在对这些链球菌的rhaps的化学结构的大致了解(9)。目前公认的gac、gbc、gcc、ggc和scc结构如图8所示。值得注意的是，通向理解表面碳水化合物结构的研究都没有包括描述参与每个rhaps生物合成的引发步骤的酶的作用机制的数据。[0321]基于与gacb的高序列同一性，我们假设a群、b群、c群和g群链球菌的碳水化合物生物合成具有保守的起始步骤，该步骤中第一个鼠李糖残基转移到脂连受体上形成rha-β-1,4-glcnac-pp-und。我们测试了来自gbs、gcs和ggs的同源物(分别为gbsb、gcsb和ggsb)在rhaps链生产中功能上置换gacb的能力(图9)。我们的结果表明，当它们的基因与δgacb表达质粒共表达时，所有同源蛋白都能够恢复rhaps主链，这表明这些酶可以进行相同的酶促反应。[0322]我们发现gacb需要glcnac-pp-und作为受体，但来自gbs、gcs和ggs的酶可能使用不同的脂连受体底物，例如glc-pp-und。因此，为了确定gacb同源物是否需要glcnac-pp-und作为脂质受体，我们使用缺乏glcnac-pp-und的大肠杆菌δweca细胞进行了补充测定(23)。作为阳性对照，我们鉴定了肺炎链球菌wchf，其是仅使用glc-pp-und作为底物的glc-1,4-β-鼠李糖基转移酶(28)。正如预期的那样，在没有glcnac-pp-und的情况下，当与δgacb载体共转化时，gacb无法恢复rhaps链(图9a，泳道2)。来自gbs、gcs和ggs的gacb同源物也未能产生rhaps主链(图9a，泳道4-6)，但可以取代δrfas菌株中的gacb功能(图9b)。只有使用glc-pp-und受体转移鼠李糖残基的wchf在没有glcnac-pp-und的情况下恢复了rhaps生物合成(图9a，泳道3)。结合我们体外酶促反应的数据，这些结果表明来自gbs、gcs和ggs的gacb同系物也是需要glcnac-pp-und作为膜结合受体的glcnac-1,4-β-鼠李糖基转移酶，。[0323]预计大多数链球菌病原体具有glcnac-1,4-β-鼠李糖基转移酶[0324]肺炎链球菌wchf编码需要glc-pp-und作为受体的glc-β-1,4-鼠李糖基转移酶(28)。它与gacb具有51％的氨基酸同一性，相比而言与来自gbs、gcs、ggs和变形链球菌的同源酶的氨基酸同一性为67-89％。为了更好地了解gacb在链球菌属中的保守性，我们扩展了我们的生物信息学分析以寻找含有gacb同源基因的其他菌株。我们发现48种人类/兽医致病性链球菌物种具有单个gacb同源物，它们具有50％至94％的序列同一性(表2，图10)。在我们鉴定的48个物种中，有5个的同一性百分比等于或低于51％(缓症链球菌、肺炎链球菌、口腔链球菌虎亚种(s.oralissubsp.tigurinus)、栖口腔链球菌和假肺炎链球菌)，而所有其他编码的蛋白质与gacb的同源性超过65％。为简单起见，我们将具有低氨基酸同一性的五种链球菌菌株称为“低同一性”亚组，其余物种称为“高同一性”亚组。[0325]与补充分析配对的序列分析使我们假设“高同一性”亚组中包含的所有gacb同源物都具有glcnac-β-1,4-鼠李糖基转移酶活性。相比之下，“低同一性”亚组包含肺炎链球菌wchf，即已知的glc-1,4-β-鼠李糖基转移酶(28)。与wchf相比，“低同一性亚组”的所有五个成员都表现出非常高的序列同一性(》90％)。[0326]来自酿脓链球菌的gaco(weca同源物)被证明负责glcnac-pp-und(gacb的底物)的生物合成(8,9)。因此，我们假设“低”和“高同一性”亚组利用不同的底物，因此研究了在比较gaco同源物的序列同一性时是否应观察到等效差异。在48个致病性链球菌基因组中(表2，图10)，我们发现来自“高同一性”亚组的所有菌株共享具有63-92％序列同一性的gaco同源物。重要的是，来自“低同一性”亚组的任何基因组都包含与gaco序列同一性等于或小于30％的基因产物。该亚组呈现与将glc-1-p转移到p-und以生成glc-pp-und的肺炎链球菌cps2e具有高度同源性的基因产物(28)。缓症链球菌、口腔链球菌虎亚种、假肺炎链球菌和栖口腔链球菌同源物与cps2e具有98％的序列同一性。[0327]链球菌属中gacb的系统发育保守程度突出了该基因对于链球菌病原体的存活和发病机制的重要性。总体而言，这些结果使我们提出，那些具有高度同一性(》65％)的gacb同源物的链球菌物种是glcnac-β-1,4-鼠李糖基转移酶，该glcnac-β-1,4-鼠李糖基转移酶通过将鼠李糖从tdp-β-l-鼠李糖转移到膜结合的glcnac-pp-und来催化其表面rhaps的生物合成的第一关键步骤。相反，我们假设，根据肺炎链球菌血清型2wchf的功能，“低同一性”亚组中的物种含有作用于脂连glc-pp-und的鼠李糖基转移酶。[0328][0329]表2来自48种链球菌属的gacb和gaco同源酶的序列保守性百分比。[0330]gacb的n端结构域编码对glcnac受体的特异性[0331]我们对来自所有48种链球菌病原体的gacb同源物进行了多序列比对，以确定蛋白质序列中最可变和最保守的区域。我们观察到其n端结构域在“高同一性”和“低同一性”亚组之间存在较大差异(表2)。更准确地说，在gacb氨基酸残基40和80之间可识别出低序列保守区，这表明该结构域的这一部分参与glcnac受体糖识别，或者参与必需的蛋白质-蛋白质相互作用。[0332]我们从之前的实验中知道，gacb无法在weca缺失的背景下起始rhaps生物合成(图9a，泳道2)。基于此信息并为了识别参与糖受体识别的残基，我们在gacb氨基酸序列中引入了突变。目标是挽救gacb突变体识别除glcnac-pp-und之外的脂质连接糖受体的weca缺陷型大肠杆菌菌株中的rhaps起始步骤。[0333]因此，我们研究了基于来自炭疽芽孢杆菌的gacb同源物babsha(pdb条目3mbo)的结构模型，这表明残基l128、r131、gnt100可能参与糖受体识别。我们对这些残基进行了突变，以模仿wchf中发现的那些残基。使用gacbl128h_r131l的补充测定未能在δweca背景下补充δgacb(图11，泳道2)。按照顺序方法，我们通过引入与wchf中发现的氨基酸置换相对应的额外氨基酸取来修饰gacb一级序列：l128h_r131l_gnt100arc和l128h_r131l_gnt100arc_a105p。这些突变体都没有识别出葡萄糖来起始鼠李糖链，因此没有恢复gacb的活性。最后，我们用相应的wchf氨基酸(1-186)取代了gacb的前178个残基。当weca缺失的背景下表达时，该wchf-gacb嵌合体能够在排他的受体底物glc-pp-und上合成rhaps主链(图11，泳道5)。[0334]讨论[0335]这项工作揭示了gac生物合成的第一关键步骤，并提供了对gacb功能的洞察，gacb是首个报告的金属非依赖性、保留和非进行性α-d-glcnacβ-1,4-l-鼠李糖基转移酶。图12示意性地描述了这一见解，该图显示了gac的阐明结构以及参与每个部分的合成的内源性变形链球菌酶。来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的其他参与多糖生物合成的酶使用脂连glcnac作为受体以及使用dtdp-l-或gdp-d-鼠李糖核苷酸，然而，它们的反应导致α-1,3或α-1,4糖苷键(29-31)。此外，gac主链由通过α-1,3-1,2键连接的鼠李糖重复单元组成这一事实(9,13)表明gacb是该途径中唯一使用保留作用机制的鼠李糖基转移酶。[0336]我们还表明，使用酶wchf，链球菌rhaps可以在重组表达系统(即大肠杆菌)中被合成到不同的受体und-pp-glu上。这在图13中进行了示意性描述。具体而言，图13示了酶wchf如何可用于将鼠李糖部分转移至葡萄糖单糖以形成二糖，该二糖具有在还原端的葡萄糖和在非还原端的鼠李糖部分。wchf酶促进两种单糖之间形成β-1,4糖苷键。然后使用细菌酶gacc或其酶促活性同源物gbcc从二糖非还原端的鼠李糖部分延伸生成鼠李糖多糖。wchf来源于肺炎链球菌，这与gacc或gbcc所来源的细菌(变形链球菌和无乳链球菌)是异源的。在这个特定的实施方式中，该方法在大肠杆菌中进行，大肠杆菌也是与wchf、gacc和gbcc所来源的细菌不同的物种。[0337]这导致合成链球菌多糖的形成，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的非还原端和包含葡萄糖单糖的还原端，该多糖包含葡萄糖和鼠李糖部分直链之间的β-1,4键。如本领域技术人员将理解的，这不同于天然存在的gac(其显示在图12中)，因为在还原端的单糖是葡萄糖而不是glcnac。[0338]实施例2[0339]为了进一步说明本发明，本实施例涉及进一步的示例性合成方法和本发明的鼠李糖多糖。[0340]图14是本发明的另一个示例性实施方式。图14显示了来源自大肠杆菌的酶wbbl可如何用于将鼠李糖部分转移到glcnac单糖上。这形成了一种二糖，该二糖具有在还原端的glcnac和在非还原端的鼠李糖部分以及在鼠李糖部分和glcnac之间的α-1,3糖苷键。然后使用细菌酶gacc或其酶促活性同系物gbcc从二糖还原端的鼠李糖部分延伸生成鼠李糖多糖。由于wbbl来源自大肠杆菌，它来源自与gacc和gbcc所来源的细菌物种异源的细菌物种。[0341]在这个特定的实施例中，该方法在大肠杆菌中进行，尽管为此目的可以设想其他细菌。因此，在这个特定的实施方式中，wbbl可以是大肠杆菌内源的，或者它可以在大肠杆菌中过表达。[0342]如图14所示，该方法导致合成链球菌多糖的生成，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的非还原端和包含glcnac单糖的还原端，该多糖包含glcnac和鼠李糖部分直链之间的α-1,3键。这不同于内源性gac(如图12所示)，因为gac含有glcnac和鼠李糖直链之间的β-1,4键。任何其他的己糖-α-1,3-鼠李糖基转移酶都可以用来代替wbbl，如图15所示。图15与图14的不同之处在于单糖是葡萄糖而不是glcnac。因此，图14的产物是合成链球菌多糖，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的非还原端和包含葡萄糖单糖的还原端，该多糖包含葡萄糖和鼠李糖部分直链之间的α-1,3键。这与内源性gac(如图12所示)的不同之处在于包含葡萄糖和α-1,3键。[0343]其他合成方法也在本发明的范围内。图16显示了这种示例性方法。在该方法中，使用dinacbac-α-1,3-鼠李糖基转移酶将鼠李糖部分转移至dinacbac单糖。因此，形成了一种二糖，该二糖具有在其还原端的dinacbac和在其非还原端的鼠李糖部分。这两种单糖通过α-1,3糖苷键连接。然后使用细菌酶gacc或其酶促活性同源物gbcc从二糖非还原端的鼠李糖部分延伸生成鼠李糖多糖。dinacbac-α-1,3-鼠李糖基转移酶来源自与gacc或其酶活性同源物gbcc所来源的细菌物种不同的细菌物种。[0344]图16的方法导致合成链球菌多糖的生成，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的非还原端和包含dinacbac单糖的还原端，该多糖包含dinacbac和鼠李糖部分直链之间的α-1,3键。这不同于内源性gac(如图12所示)，因为gac含有glcnac和鼠李糖直链之间的β-1,4键。[0345]图17展示了另一个示例性方法和产物。在该方法中，可以在从鼠李糖部分延伸之前形成二糖、三糖或四糖。对于二糖，半乳糖-α-1,2-鼠李糖基转移酶wbbr用于将鼠李糖部分转移到半乳糖单糖上。这形成了一种二糖，该二糖具有在其还原端的半乳糖和具有在其非还原端的鼠李糖部分。然后通过从该鼠李糖部分延伸形成鼠李糖部分直链来生成鼠李糖多糖。在本实施例中，延伸使用酶gacc、gacg或gbcc(参见图17的倒数第二个示意图和顶部示意图)。wbbr来源自志贺氏菌，其是不同于gacc、gacg或gbcc各自所来源的链球菌的细菌物种。该方法导致合成链球菌多糖的产生，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的非还原端和包含半乳糖单糖的还原端，该多糖包含dinacbac和鼠李糖部分直链之间的α-1,2键。[0346]另一个实施方式，也如图17的顶部示意图和倒数第二个示意图所示，是在从鼠李糖部分延伸之前形成三糖。对于三糖，使用酶wbbp将半乳糖单糖转移到glcnac，从而在两个单糖之间形成α-1,3糖苷键。然后如上文对二糖所述使用酶wbbr，从而将鼠李糖部分转移至半乳糖。此后，延伸可以发生，如上面对二糖的详述。[0347]图17左侧是斑点印迹(阳性抗体印迹)。每个印迹代表一个实验的样本；每行代表相同条件的一式三份。对于每个实验，添加来自反应的样品作为斑点，并使用抗gac抗体来确定反应是否成功形成鼠李糖多糖。中间行显示了从反应中获得的一式三份样品，其中酶wbbp用于将半乳糖单糖转移到glcnac，然后是酶wbbr，然后是gacg。左侧的点图证实该反应能够产生本发明的鼠李糖多糖。[0348]wbbp可替代地用于形成二糖(即，在其非还原端的半乳糖单糖通过α-1,3糖苷键连接到在其还原端的glcnac，随后通过从二糖的非还原端的鼠李糖部分延伸而生成鼠李糖多糖(参见图17的底部示意图)。该示意图左侧的点图行证实该反应也能够产生本发明的鼠李糖多糖。[0349]任选地，在如上详述的延伸步骤之前，可以将一个或两个额外的鼠李糖部分转移到与半乳糖连接的鼠李糖部分以形成四糖或五糖。可以使用酶wbbq转移一个或两个额外的鼠李糖部分，然后使用gacc使用gbcc进行进一步延伸，如图17的第三个示意图所示。该图左侧的点图行证实了包含wbbp、wbbr、wbbq和gacc的反应成功地生成了根据本发明的鼠李糖多糖。[0350]对于三糖、四糖或五糖方法，这些方法导致合成链球菌多糖的生成，该多糖具有包含鼠李糖部分直链的还原端和包含glcnac和半乳糖的非还原端，该多糖包含鼠李糖部分直链和半乳糖之间的α-1,2键以及半乳糖和glcnac之间的α-1,3键。[0351]在将鼠李糖部分转移至二糖或三糖的实施方式中，设想任何己糖组合可用于使用本文所述的α或β键形成二糖或三糖。这在图18中进行了描述。同样，对于从鼠李糖部分延伸鼠李糖多糖，设想可以使用任何具有酶活性的gacc、gacg同源物或其片段或变体，前提是在每对鼠李糖部分之间形成α-1,2和/或α-1,3糖苷键。[0352]图19证实在本发明的方法中可以使用wbbl代替gacb或sccb来生产鼠李糖多糖。该图显示了来自表达基因簇rmld-sccc-sccd-scce-sccf-sccg(deltasccb)和gaca-gacc-gacd-gace-gacf-gacg(deltagacb)的细胞的总大肠杆菌裂解物的抗gac蛋白质印迹。辅以空质粒对照或wbbl。第一列是梯状条带。第二列证实gac不在具有rgpa缺失的大肠杆菌细胞中产生，而第三列证实在rgpa缺陷细胞中单独表达wbbl不会恢复gac合成。第三列显示来自具有rgpa缺失但也表达基因簇gaca-gacc-gacd-gace-gacf-gacg(deltagacb)的大肠杆菌细胞的裂解物。在这些细胞中没有发现gac。然而，第四列显示当wbbl在第三列的细胞中表达时，会产生gac。当rgpa缺陷细胞与wbbl一起表达基因簇rmld-sccc-sccd-scce-sccf-sccg(deltasccb)时观察到相同的结果(参见最后两列的副本)。该数据证实wbbl可以与来自其他物种的异源酶一起使用以产生根据本发明的鼠李糖多糖。[0353]图20证实gacc将多达五种鼠李糖引入由gacb生成的产物中。图20显示了体内脂连寡糖(llos)的放射性标记(大肠杆菌)。tlc板的胶片曝光，tlc板具有来自带有gacb(泳道1)或gacbc(泳道2)的大肠杆菌cs2775的放射性标记llos。[0354]gacc的同源物可以以类似的方式发挥作用。图21显示了与图20中所示结果相似的结果，但使用的是来自b、c和g群链球菌的同源酶的gbcc、gccc和ggcc。图21显示了tlc板的胶片曝光，具有来自带有gacb和gacc(泳道1)、单独gacb(泳道2)、gacb和gbcc(泳道3)、gacb和gccc(泳道4)以及gacb和ggcc(泳道5)的大肠杆菌cs2775的放射性标记llos。gacc、gbcc、gccc、ggcc是来自a、b、c和g群链球菌的同源酶，该图显示所有3-5个鼠李糖被转移到gacb的产物上。[0355]类似地，本发明人已经证明gacc酶功能在链球菌中是保守的并且能够补充大肠杆菌的sccc酶。图22显示：[0356]a)基因补充策略。sccc基因被同源基因gacc、gbcc、gccc、ggcc取代。[0357]b)用于用抗a群抗体探测的细菌补充测定的全细胞裂解物的免疫印迹。[0358]补充研究证实gacc酶功能在来自b、c、g群和变形链球菌的链球菌中是保守的。[0359]gaco、gacb和gacc酶的系统发育分析显示高度相似性，因此链球菌中的功能是保守的-预计致病菌株都会产生具有相同接头/茎rhaps，因此，所有这些都适合根据本发明使用。[0360]图23显示a)基于从48种致病性链球菌中鉴定的gacb直向同源蛋白序列的系统发育树。物种名称后的星号表示未从整个测序基因组中检索到直向同源序列。为了研究gacb功能并识别潜在的催化残基，我们使用大肠杆菌作为异源表达系统来研究gacrhaps主链生物合成。b)条形图以百分比表示与酿脓链球菌gaco(红色)、gacb(蓝色)或gacc(绿色)的同源性程度。gaco、gacb和gacc标签旁边的数字代表了酿脓链球菌催化的步骤。该图中心缩进中的数字基于我们目前对肺炎链球菌cps2e、cps2t(wchf)和cps2f(james2013)的作用的了解。[0361]图24显示体外gacc鼠李糖基化合成llo底物(gacb产物)。[0362]a)hplc分析显示gacc延伸使用具有3个额外鼠李糖残基的gacb生成的化学酶促脂质连接的二糖。随后通过nmr分析化学连接。b)gacb/c与体外受体底物反应的化学绘图[0363]发明人使用nmr和质谱技术进行的进一步研究(并非显示所有数据)证实了，gacc可以添加多达4种鼠李糖，并且gacc是反向α-1,3鼠李糖基转移酶。图25显示了质子和碳糖信号的完整分配。1h分配基于对几个f1波段选择性2dtocsy光谱的分析。使用2d1h,13chsqc分配13c信号。使用2dnoesy实验分配连接。每个糖残基的化学位移与吡喃糖的1h和13c信号的已发表数据非常吻合。[0364]本发明人进一步表明，根据本发明的鼠李糖多糖可以使用不同的酶组合生成。图26显示根据本发明的鼠李糖多糖可以使用来自痢疾志贺氏菌的酶与大肠杆菌和痢疾志贺氏杆菌与变形链球菌的组合来产生成。图26显示了使用抗a群碳水化合物抗体的全细胞蛋白质印迹。通过sds-page分离总大肠杆菌细胞裂解物。newrhaps由痢疾志贺氏菌基因产物与变形链球菌/a群链球菌基因产物结合构建而成。rmld_gacd_e_f_g加上wbbp_q_r足以构建newrhaps。newrhaps也可以使用rmld_sccc_d_e_f_g加上wbbp_q_r构建。[0365]基于上述证据，预计志贺氏菌属可以进一步用于提供接头/茎和gac重复单元，如图27所示。在原生系统中，gacb和gacc酶在gacg安装免疫原性重复单元之前安装接头/茎区(红色框)。该图以gacc安装的3种α-1,3-鼠李糖为例。[0366]替换gacb/c酶(替换glcnac-β1,4-鼠李糖-α1,3-鼠李糖接头/茎)以生成newrhaps，提供了维持免疫原性重复单元的替代方法(建议由gacg酶活性引入)。用o-otase兼容性多糖/寡糖取代接头区域(绿色框)足以构建免疫原性多糖(α1,2-α1,3鼠李糖)。[0367]如本文所述，本发明的鼠李糖多糖可以与合适的蛋白质缀合并呈现在细菌表面上。图28显示根据本发明制备的鼠李糖多糖是用于大肠杆菌糖缀合系统的合适底物。根据reglinskietal.,npjvaccines(2108)3:53描述的程序建立了周质表达测试系统。图28acetylglucosamineside-chainattachmenttothelancefieldgroupacarbohydrateinstreptococcuspyogenes.j.biol.chem.292,19441–19457[0381]9.mistou,m.-y.,sutcliffe,i.c.,andsorge,n.m.van(2016)bacterialglycobiology:rhamnose-containingcellwallpolysaccharidesingram-positivebacteria.femsmicrobiol.rev.40,464–479[0382]10.coligan,j.e.,kindt,t.j.,andkrause,r.m.(1978)structureofthestreptococcalgroupsa,a-variantandccarbohydrates.immunochemistry.15,755–760[0383]11.krause,r.m.,andmccarty,m.(1961)studiesonthechemicalstructureofthestreptococcalcellwall.j.exp.med.114,127–140[0384]12.edgar,r.j.,hensbergen,v.p.van,ruda,a.,turner,a.g.,deng,p.,breton,y.l.,el-sayed,n.m.,belew,a.t.,mciver,k.s.,mcewan,a.g.,morris,a.j.,lambeau,g.,walker,m.j.,rush,j.s.,korotkov,k.v.,widmalm,g.,sorge,n.m.van,andkorotkova,n.(2019)discoveryofglycerolphosphatemodificationonstreptococcalrhamnosepolysaccharides.nat.chem.biol.15,463[0385]13.h.heymann,zeleznick,l.d.,boltralik,j.j.,barkulis,s.s.,andsmith,c.(1963)biosynthesisofstreptococcalcellwalls:arhamnosepolysaccharide.science.140,400–401[0386]14.heymann,h.,manniello,j.m.,andbarkulis,s.s.(1967)structureofstreptococcalcellwalls.v.p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