一种同时提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法及其应用

1.本发明属于工业生物技术领域，特别涉及一种同时提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法及其应用。


背景技术：

2.硅藻含有丰富的生物活性物质和高价值产物，如岩藻黄素(fucoxanthin，简称fx)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，简称epa)和金藻昆布多糖(chrysolaminarin，简称chrl)，生产实践中常作为水产动物幼体的开口饵料，能够促进幼体的生长发育、提高抗病性。在人类健康领域，岩藻黄素是一种丙二烯类胡萝卜素，可用于预防癌症、糖尿病、肥胖症和脂肪肝等慢性疾病。二十碳五烯酸作为特长链多不饱和脂肪酸(long-chain polysaturated fatty acids，lcpufas)的一种，可有效改善心血管功能，缓解抑郁，降低血压，减少运动后肌肉酸痛。金藻昆布多糖是一类由葡萄糖通过β-1,3糖苷键主链和少量的β-1,6糖苷键支链连接而成的水溶性β-1,3葡聚糖，具有抗氧化、抗肿瘤、降低血糖血脂以及提升机体免疫能力等β-葡聚糖特有的生物活性。这三种高价值天然产物在保健食品、功能性食品和动物饲料领域具有广泛的应用潜力。
3.岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖的主要微藻来源为硅藻、金藻和黄藻，其作为微藻光合作用产物主要储存于藻细胞胞内。海洋硅藻三角褐指藻(p.tricornutum)能够进行兼养培养，有效积累上述三种高值天然产物，被认为是生产微藻来源的上述高值天然产物的最佳物种。由于岩藻黄素和二十碳五烯酸属于油溶性成分，通常在硅藻中协同积累；而金藻昆布多糖是水溶性成分，其合成过程会与岩藻黄素和二十碳五烯酸竞争碳前体，即岩藻黄素和脂肪酸的合成途径与金藻3-磷酸甘油醛(g-3-p)多糖合成途径之间会竞争碳前体3-磷酸甘油醛(g-3-p)，从而使得三种高价值天然产物难以同时积累。因此关于硅藻中高值天然产物的积累的研究，绝大多数以单一产物的积累为目标。目前已有报道的生产方法所能达到的较低，更没有同时积累三种产物的研究和诱导方法的报道，难以达到商业化生产的要含量和/或产率求。此外，在特定培养环境中，不同硅藻藻种以单一产物为目标时，岩藻黄素含量范围为干重的0.8～6％，二十碳五烯酸含量范围为干重的1.9～11％，金藻昆布多糖含量范围为干重12～33％。
4.木质素虽然广泛存在于自然界中，但其利用率相对较低，工业中常以木质素磺酸盐的形式将木质素去除，造成较大的环境压力。然而，木质素磺酸钙对硅藻生长和高价值天然产物的积累效果和作用机制，以及在硅藻中的应用尚无相关报道。针对目前规模化培养硅藻生产岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖，仍存在的藻细胞密度低、生物量干重低、培养周期长且易受到生物污染的技术瓶颈，尚无能够同时实现获得三种高价值天然产物的高含量和高产率的调控技术及其应用的报道。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的不足(现有技术中，岩藻黄素、二十碳五烯酸以及金藻昆布多糖这三种高价值天然产物难以同时积累，而生产单一高价值天然产物时硅藻细胞密度低、生物量干重浓度低和其他种高价值天然产物含量低，从而导致高价值天然产物产率低、原料综合利用率低，成本高)，提供了一种同时提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法。
6.本发明的另一目的在于提供所述同时提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种同时提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法，包括如下步骤：
9.s1、种子液培养：将硅藻接种至种子液培养基中，光照培养至对数生长期，得到硅藻种子液；
10.s2、兼养培养：将步骤s1得到的硅藻种子液接种至含有木质素磺酸钙(calcium lignosulphonate)的发酵培养基进行兼养培养，以提高硅藻中高价值天然产物的含量和/或产率；其中，所述的高价值天然产物为岩藻黄素(fx)、二十碳五烯酸(epa)和金藻昆布多糖(chrl)中的至少一种。
11.步骤s1中所述的硅藻优选为三角褐指藻(p.tricornutum)。
12.步骤s1中所述的种子液培养基和步骤s2中所述的发酵培养基均为改良f/2培养基；优选为含有有机碳源和氮源的改良f/2培养基；进一步优选为含有0.025～0.20mol/l甘油和含氮量0.005～0.02mol/l的改良f/2培养基；更进一步优选为含有0.10mol/l甘油和含氮量0.02mol/l的改良f/2培养基。
13.所述的有机氮源为胰蛋白胨和尿素中的至少一种；优选为由胰蛋白胨和尿素混合得到的有机氮源；进一步优选为由胰蛋白胨和尿素混合得到的有机氮源，其中，胰蛋白胨含氮量与尿素含氮量为1～2:1～2(摩尔比)；更进一步优选为由胰蛋白胨和尿素混合得到的有机氮源，其中，胰蛋白胨含氮量与尿素含氮量为1:1(摩尔比)。
14.所述的改良f/2培养基含有如下组分：海盐2
×
104mg/l；含氮量为0.01mol/l的尿素(即尿素0.3mg/l)；含氮量为0.01mol/l的胰蛋白胨(即胰蛋白胨1.167mg/l)；nah2po4·
2h2o10.0mg/l；na2sio3·
5h2o 30mg/l；na2edta
·
2h2o 4.36mg/l；cuso4·
5h2o 9.8
×
10-3
mg/l；na2moo4·
2h2o 6.3
×
10-3
mg/l；znso4·
7h2o 22.0
×
10-3
mg/l；fecl3·
6h2o 3.15
×
10-3
mg/l；cocl2·
6h2o 10.0
×
10-3
mg/l；mncl2·
4h2o 180.0
×
10-3
mg/l；ph为8.0。
15.步骤s1中所述的培养的光照强度为10～30μmol/m2/s；优选为20μmol/m2/s。
16.步骤s1中所述的培养的时间为4～12天；优选为8～12天；进一步优选为10～12天。
17.步骤s1和s2中所述的培养的温度优选为20
±
1℃。
18.步骤s1和s2中所述的培养为在光照恒温摇床上进行的培养，其转速为100～160rpm(转速优选为160rpm)。
19.步骤s1和s2中所述的培养所用的光源为led自然白光(其光谱组成为红：绿：蓝(r:g:b)＝18.9:76.1:5.1，所述的led自然白光由led自然白灯条提供)。
20.步骤s2中所述的硅藻种子液的接种密度为按其在兼养体系的终密度为1
×
106～2
×
107cells/ml添加计算；优选为按其在所述兼养体系的终密度为5
×
106～1
×
107cells/ml
添加计算；更优选为按其在所述兼养体系的终浓度为1
×
107cells/ml添加计算。
21.步骤s2中所述的兼养培养优选为在摇瓶体系中进行兼养培养。
22.步骤s2中所述的含有木质素磺酸钙的发酵培养基中木质素磺酸钙的浓度为0～5000mg/l(不包括0)；优选为0～50mg/l(不包括0)；进一步优选为0～10mg/l(不包括0)；再进一步优选为10mg/l。
23.步骤s2中所述的兼养培养的光照强度为10～30μmol/m2/s；优选为20
±
2μmol/m2/s。
24.步骤s2中所述的兼养培养的初始ph值为7.95～8.05(期间不进行ph调控)；优选为8.0。
25.步骤s2中所述的兼养培养的时间为10～14天；优选为10～12天；进一步优选为12天。
26.步骤s2中所述的高价值天然产物优选为岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖中的至少两种；更优选为岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖，本发明可以同时提高硅藻中三种高价值天然产物含量和/或产率。
27.所述的同时提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法在培养硅藻中的应用。
28.所述的硅藻优选为三角褐指藻(p.tricornutum)。
29.所述的提高硅藻中高价值天然产物含量和/或产率的方法在生产高值产物中的应用。
30.所述的高价值天然产物为岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖中的至少一种；优选为岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖中的至少两种；更优选为岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖。
31.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
32.(1)本发明提供了一种既能促进硅藻生长又能同时提高硅藻中三种高价值天然产物含量和/或产率的方法，将培养至对数生长期的硅藻种子液，接种在含有木质素磺酸钙、有机碳源和混合氮源的发酵培养基进行兼养培养，通过添加合适的木质素磺酸钙浓度获得富含高价值天然产物(岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖)的藻体生物质，采用本发明的方法可以促进硅藻细胞生长以及提高价值天然产物的含量和/或产率，可以运用于硅藻培养及规模化生产高价值天然产物的技术领域。
33.(2)本发明通过在摇瓶培养体系中添加不同浓度(0～5000mg/l)木质素磺酸钙来提高细胞密度、比生长速率和生物量干重：在木质素磺酸钙浓度为10mg/l时细胞密度和比生长速率达到最高，比对照组(0mg/l)显著提高了11.37％和6.15％，但生物量干重无显著影响。
34.(3)本发明通过在摇瓶培养体系中添加不同浓度(0～5000mg/l)木质素磺酸钙来提高三角褐指藻岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖的含量和产率：在木质素磺酸钙浓度为10mg/l条件下，三角褐指藻中岩藻黄素含量和产率比对照组极显著提高了12.71％和9.98％；二十碳五烯酸的含量和产率比对照组提高了4.82％和1.92％；金藻昆布多糖的含量和产率比对照组提高了9.80％和7.27％，其中含量存在显著性提高；在木质素磺酸钙浓度为5000mg/l条件下，岩藻黄素含量和产率、二十碳五烯酸含量达到最高，比对照组极显
著提高了46.53％和16.21％以及13.17％，但岩藻黄素的产率与10mg/l条件下的产率并无显著性差异；在木质素磺酸钙浓度为500mg/l条件下，二十碳五烯酸产率、金藻昆布多糖含量和和产率达到最高，比对照组显著提高了11.92％、34.84％和37.87％，其中金藻昆布多糖含量和产率存在极显著提升。
35.(4)本发明通过在摇瓶培养体系中添加不同浓度(0～50mg/l)木质素磺酸钙来提高细胞密度、比生长速率以及生物量干重，在木质素磺酸钙浓度为20mg/l时细胞密度和比生长速率达到最高，比对照组极显著提高了12.28％和4.74％，但比生长速率与10mg/l条件下并无显著差异；生物量干重在0～50mg/l并无显著差异。
36.(5)本发明通过在摇瓶培养体系中添加不同浓度(0～50mg/l)木质素磺酸钙来提高三角褐指藻岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖的含量和产率。在木质素磺酸钙浓度为10mg/l条件下，三角褐指藻中岩藻黄素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖含量和产率均存在提高，分别比对照组提高了11.51％和14.76％、0.96％和3.97％、14.09％和16.31％，其中岩藻黄素和二十碳五烯酸含量和产率在0～50mg/l范围内达到最大值，岩藻黄素和金藻昆布多糖含量和产率的提升存在显著性。在木质素磺酸钙浓度为2.5mg/l条件下，金藻昆布多糖含量和产率达到最高，比对照组极显著提高了22.72％和25.14％。
附图说明
37.图1为实施例1的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～5000mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻时细胞密度的变化图。
38.图2为实施例1的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～5000mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻时生物量干重的变化图。
39.图3为实施例1的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～5000mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻时平均比生长速率的变化图。
40.图4为实施例1的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～5000mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻高价值天然产物含量的变化图。
41.图5为实施例1的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～5000mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻高价值天然产物产率的变化图。
42.图6为实施例2的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～50mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻时细胞密度的变化图。
43.图7为实施例2的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～50mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻时生物量干重的变化图。
44.图8为实施例2的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～50mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻时平均比生长速率的变化图。
45.图9为实施例2的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～50mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻高价值天然产物含量的变化图。
46.图10为实施例2的摇瓶体系中添加不同浓度木质素磺酸钙(0～50mg/l)条件下兼养培养三角褐指藻高价值天然产物产率的变化图。
具体实施方式
47.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂、仪器及设备未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
48.本发明实施例中采取的检测方法可参照如下说明：
49.(一)三角褐指藻细胞密度测定和比生长速率的计算
50.采用流式细胞仪进行细胞密度测定。吸取2ml三角褐指藻细胞培养液离心，去除上清液，用超纯水洗涤、重悬至上机浓度(约1～5
×
106cells/ml)，经300目尼龙筛绢过滤后上机进行细胞密度绝对计数(3次重复)。
51.比生长速率μ计算公式为：
52.μ＝(in n
2-in n1)/(t
2-t1)
53.其中n2和n1分别是时间点t2和t1测定的细胞密度(cells/ml)。
54.(二)三角褐指藻生物量浓度的测定
55.采用烘干差重法测定生物量浓度。测量已烘至恒重的离心管重量，记为空管重量w1。吸取2ml三角褐指藻的藻液于该离心管中，8000r/min下离心3min，弃上清，蒸馏水洗涤离心两次后将藻泥置于烘箱中80℃烘干至恒重，测定并记录总重量w2。每个样品设置3个平行，取平均值并计算标准差，按如下公式计算生物量浓度：
[0056][0057]
式中：w1为空管重，单位为g；w2为烘干后离心管和微藻生物质的总重量，单位为g；v为样品体积，单位为l。
[0058]
(三)三角褐指藻胞内高值产物含量和/或产率的测定
[0059]
1、采用高效液相色谱法(hplc)测试三角褐指藻胞内岩藻黄素含量，具体步骤如下：
[0060]
(1)称量冻干藻粉10mg置入装有适量陶瓷珠的冻存管中，加入1ml预冷的溶剂(甲醇：丙酮＝1:1，v/v)，细胞破碎仪震荡30s后，液氮迅速冷冻，离心收集上清液至15ml离心管。反复多次提取直至藻粉变白。合并上清液，氮气吹干溶剂后，加入定容剂(甲醇：叔丁基甲醚＝1:1，v/v，含0.1％(w/v)二丁基羟基甲苯)定容至1ml，经0.22μm有机微滤孔膜过滤至棕色样品瓶中，作为待测样品用于后续岩藻黄素检测，全程在无光或弱光下进行。
[0061]
(2)hplc系统采用安捷伦1260型四元泵、dad和rid双检测器，ymc carotenoid column c30柱(4.6
×
150mm，3m)。流动相由甲醇a和叔丁基甲醚b组成，梯度洗脱：0～6min，95％
→
80％a、5％
→
20％b；6～12min，80％
→
60％a、20％
→
40％b；12～15min，60％
→
55％a、40％
→
45％b；15～16min，55％
→
95％a、45％
→
5％b；16～19min，95％a、5％b。流速0.80ml/min，进样量20μl，440nm下测定岩藻黄素峰面积。每个样品设3个平行，取平均值并计算标准差。
[0062]
(3)岩藻黄素的标准曲线：准确称取1.0mg岩藻黄素标准样品，用上述定容剂定容至1ml，配成浓度为1000μg/ml的标准液。然后用定容剂稀释，配成浓度分别为60、120、150、180、240μg/ml的梯度值。采用hplc测定，并绘制标准曲线。
[0063]
(4)岩藻黄素含量的测定：将步骤(1)中获得的待测样品采用hplc测定，并根据步骤(1)中获得的标准曲线计算得到岩藻黄素含量的含量。
[0064]
2、采用气相色谱质谱联用仪(gc-ms)测试三角褐指藻胞内脂肪酸含量，具体步骤如下：
[0065]
脂肪酸分析在agilent 6890n gc-ms上进行，配备5975内置型质量探测器和高效毛细管柱(db-23，30mm
×
0.25mm，0.25μm)。载气为高纯氦气，流速为1ml/min，样品进样量为0.2μl，分流比为5:1。程序升温条件为：初始柱温130℃保持3min，以5℃/min升高到200℃保持0min，质谱的质量扫描范围为33～400amu。各峰型的鉴定采用nist05a谱库自动检索。根据各脂肪酸相对于c19:0内标的峰面积，计算各脂肪酸组分的绝对含量。各脂肪酸占藻粉质量的百分比计算公式如下：
[0066]
脂肪酸(％干重)＝[脂肪酸(％总脂肪酸)/c19:0(％总脂肪酸)
×
100(μg)
×
10-3
]/藻粉重量(mg)
×
100％。
[0067]
3、采用苯胺蓝荧光检测法测定三角褐指藻胞内金藻昆布多糖的含量，具体步骤如下：
[0068]
(1)将新鲜藻液于4℃8000r/min离心5min收集藻细胞，冷冻干燥获得冻干藻粉。称取冻干藻粉15mg，用12ml te缓冲液(先配制5mmol/l的乙二胺四乙酸(edta)溶液，再用10mmol/l tris-hcl调节ph至8.0)溶解，50℃温水浴30min，再用细胞破碎仪70hz破碎细胞10min，于8000r/min离心5min除去细胞碎片，得到上清液s。收集上述浸提的上清s，加入100％三氯乙酸(tca)溶液，使其终浓度为10％(w/v)，50℃水浴60min，以10000r/min离心20min，得到上清液f。将上清液f与5倍无水乙醇混合，置于-20℃冰箱过夜，次日取出，再以10000r/min离心20min，收集沉淀，得到tca处理的粗多糖样品t，将湿沉淀t稀释定容至10ml作为待测液。
[0069]
(2)标准曲线绘制：称取酵母β-1,3-葡聚糖(cas：9012-72-0，购自北京百灵威科技有限公司)20.00mg，用1mol/l氢氧化钠溶液溶解并定容至100ml，为200μg/ml的葡聚糖储备液，用前稀释为质量浓度为1、2、5、10、15、20、30、40、60μg/ml的系列工作液。测定工作液的荧光强度(激发波长为398nm、发射波长为502nm)，再以葡聚糖工作液的浓度-荧光强度进行线性回归，绘制标准曲线。
[0070]
(3)样品含量测定：取微藻多糖的待测液1.00ml于10ml离心管中，加入0.10ml的6mol/l naoh，于80℃水浴保温30min。取出，迅速将离心管插入冰浴中10min。加入2.10ml苯胺蓝工作液(33体积0.1％苯胺蓝水溶液 18体积1mol/l盐酸 49体积ph 9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液混合)，50℃水浴中保温30min，将反应液ph调至9.6。取出，室温下放置30min，去除未反应的试剂。取200μl反应液于酶标仪96孔板中，激发波长为398nm、发射波长为502nm，测定反应液荧光强度。将测定的荧光强度值代入β-1,3-葡聚糖的质量浓度-荧光强度之间的线性回归方程中，即可计算得出样品中金藻昆布多糖的含量。
[0071]
4、高值产物产率的计算
[0072]
高值产物产率(mg/l/d)＝(高值产物含量(mg/g
×
生物量干重(g/l))/培养天数(d)。
[0073]
实施例1在摇瓶体系中不同浓度(0～5000mg/l)木质素磺酸钙比对三角褐指藻生长和高值产物含量和/或产率的影响
[0074]
1.1藻种活化及种子液制备
[0075]
将三角褐指藻(p.tricornutum)转接至改良的f/2培养基(表1)的斜面上进行培养，培养温度20℃，ph值8.0，光照强度20μmol/m2/s，并观察三角褐指藻的生长情况。从斜面上挑取三角褐指藻藻苔于改良的f/2培养基中，装液量为100ml，盐度为20
‰
，ph值8.0，置于光照强度为20μmol/m2/s的恒温光照摇床中进行培养(光源为全光谱led灯，光谱组成为红：绿：蓝(r:g:b)＝18.9:76.1:5.1，由led自然白灯条提供)，摇床转速为160rpm，培养10～12天用作种子液。其中改良的f/2培养基如表1所示。
[0076]
表1改良的f/2人工海水培养基配方(ph 8.0)
[0077]
组分含量(mg/l)组分含量(mg/l)组分含量(mg/l)海盐2
×
104尿素0.3胰蛋白胨1.167na2sio3·
5h2o30na2edta
·
2h2o4.36cuso4·
5h2o9.8
×
10-3
na2moo4·
2h2o6.3
×
10-3
znso4·
7h2o22.0
×
10-3
fecl3·
6h2o3.15
×
10-3
cocl2·
6h2o10.0
×
10-3
mncl2·
4h2o180.0
×
10-3
nah2po4·
2h2o10
[0078]
注：edta为乙二胺四乙酸。
[0079]
1.2摇瓶体系中不同浓度(0～5000mg/l)木质素条件下三角褐指藻的兼养培养
[0080]
1.2.1兼养培养：实验前期先对三角褐指藻连续培养，结果表明，在兼养条件下以尿素和胰蛋白胨为混合氮源连续培养(三代)三角褐指藻，藻细胞生长状况良好，获得的生物量浓度高，而以硝酸钠为氮源连续混养培养三角褐指藻，其藻细胞生长状况不佳，有部分藻细胞死亡。因此后续实验以尿素和胰蛋白胨为混合氮源进行摇瓶体系的兼养培养。通过在改良的f/2培养基(表1，即含氮量为0.01mol/l的尿素 含氮量为0.01mol/l的胰蛋白胨的培养基)中添加不同浓度(10、100、500、1000、5000mg/l(终浓度))木质素磺酸钙作为实验组，不添加木质素磺酸钙(即0mg/l)作为对照组。控制初始细胞密度为1.0
×
107cells/ml(接种后菌和培养基的总体积为100ml，摇瓶体积为250ml)。每个梯度三个平行，将摇瓶放置在温度为20
±
1℃、光照强度为20
±
2μmol/m2/s、转速为160r/min的恒温光照摇床中培养12天，光源为全光谱led灯(光谱组成为红：绿：蓝(r:g:b)＝18.9:76.1:5.1，由led自然白灯条提供)。
[0081]
1.2.2分析测试：培养过程中每2天取样一次，取样体积为2ml，测定样品的细胞密度，同时将剩余藻液离心取藻泥，并用蒸馏水洗涤两次后将藻泥置于60℃烘箱中烘干以监测三角褐指藻细胞生物量浓度的变化。所有实验结束后收集剩余藻液，洗涤收集藻泥，并将藻泥真空冷冻干燥以获得藻粉，藻粉置于-20℃冰箱中储存作后续分析检测高值产物含量并计算产率。
[0082]
采用prism9和spss软件对数据进行处理和统计学分析采用单因素方差分析法和成对数据t-检验进行显著性检验分析，不同字母表示组间显著性差异(无显著p》0.05；显著p《0.05；极显著p《0.01)。
[0083]
1.3产能分析结果
[0084]
不同浓度木质素磺酸钙对三角褐指藻细胞密度、生物量干重和比生长速率的影响如图1、图2和图3所示。结果表明，在木质素磺酸钙浓度为0～5000mg/l条件下，三角褐指藻细胞密度在5.640～11.862
×
107cells/ml之间，生物量干重在3.500～4.472g/l之间，比生长速率在0.129～0.207之间。在木质素磺酸钙浓度为10mg/l时细胞密度和比生长速率达到
最高，为11.862
×
107cells/ml和0.207d-1
，比对照组(0mg/l，10.651
×
107cells/ml和0.195d-1
)显著提高了11.37％和6.15％，但生物量干重并无显著差异；在木质素磺酸钙浓度为500mg/l时生物量干重达到最高，为4.472g/l，与10mg/l(4.288g/l)条件下并不存在显著差异。浓度为500、1000、5000mg/l时，细胞密度和比生长速率显著低于对照组，其中1000mg/l和5000mg/l的细胞密度存在极显著降低。木质素磺酸钙浓度为100、5000mg/l时，生物量干重也显著低于对照组；因此，在0～5000mg/l木质素磺酸钙浓度中，10mg/l为细胞生长的最佳浓度，不影响生物量积累的同时能够显著提高细胞密度和比生长速率。
[0085]
岩藻黄素(fx)含量在10.94～16.03mg/g之间，产率在4.01～4.66mg/l/d之间；二十碳五烯酸(epa)含量在28.40～32.14mg/g之间，产率在9.35～11.64mg/l/d之间；金藻昆布多糖(chrl)的含量在112.41～196.31mg/g之间，产率在32.49～73.57mg/l/d之间(图4、图5)。岩藻黄素含量在添加木质素磺酸钙后均存在显著提升，而产率只在10mg/l和5000mg/l条件下存在显著提升。含量和产率在5000mg/l浓度下达到最高，分别为16.03mg/l和4.66mg/l/d，分别比对照组极显著提高了46.53％和16.21％，但产率与10mg/l浓度下并无显著差异；二十碳五烯酸含量在100～5000mg/l条件下相比于对照组存在显著提升，而产率只在500mg/l和1000mg/l条件下存在显著提升，在5000mg/l条件下存在显著降低。二十碳五烯酸含量和产率分别在5000和500mg/l浓度下达到最高，分别为32.14mg/g和11.64mg/l/d，分别比对照组显著提高了13.17％和11.92％，其中含量存在极显著提升；金藻昆布多糖含量100～1000mg/l浓度下均有显著提升，而产率只在100～1000mg/l浓度下存在显著提升，其中500mg/l和1000mg/l存在极显著提升。金藻昆布多糖含量和产率在5000mg/l和500mg/l浓度下达到最高，分别为196.31mg/g和73.57mg/l/d，分别比对照组极显著提高了34.84％和37.87％。因此，因此，在0～5000mg/l木质素磺酸钙浓度中，10mg/l能够促进三种高价值天然产物的同时积累，同时提高三种高价值产物的含量和产率，其中岩藻黄素和金藻昆布多含量和产率存在显著提升。
[0086]
实施例2在摇瓶体系中不同浓度(0～50mg/l)木质素磺酸钙比对三角褐指藻生长和高值产物含量和/或产率的影响
[0087]
2.1藻种活化及种子液制备
[0088]
三角褐指藻(p.tricornutum)按1.1所述方法传代培养，培养10～12天用作种子液。
[0089]
2.2摇瓶体系中不同浓度(0～50mg/l)木质素条件下三角褐指藻的兼养培养
[0090]
在改良的f/2培养基(表1)中添加不同浓度木质素磺酸钙(0、2.5、5、10、20、50mg/l(终浓度))作为实验组，控制初始细胞密度为1.0
×
107cells/ml，其余培养条件同1.2.1。
[0091]
检测及分析方法同1.2.2。
[0092]
2.3产能分析结果：
[0093]
不同浓度木质素磺酸钙对三角褐指藻细胞密度、生物量干重和比生长速率的影响如图6、图7和图8所示。结果表明，在木质素磺酸钙浓度为0～50mg/l条件下，三角褐指藻细胞密度在9.295～10.436
×
107cells/ml之间，生物量干重在3.869～4.187g/l之间，比生长速率在0.190～0.199之间。在木质素磺酸钙浓度为5～20mg/l时细胞密度和比生长速率均存在极显著提升，并在20mg/l浓度下达到最高，分别为10.436
×
107cells/ml和0.199d-1
，比对照组(0mg/l，9.295
×
107cells/ml和0.190d-1
)显著提高了12.28％和4.74％，但生物量干
重并无显著差异；在木质素磺酸钙浓度为5mg/l时生物量干重达到最高，为4.187g/l，比对照组(3.869g/l)提高了8.22％。因此，在0～50mg/l木质素磺酸钙浓度中，10mg/l和20mg/l均不影响生物量干重浓度积累的同时显著提高细胞密度和比生长速率。因此10mg/l为细胞生长的最佳浓度。
[0094]
在木质素磺酸钙浓度为0～50mg/l条件下，岩藻黄素含量在11.12～12.40mg/g之间，产率在3.59～4.12mg/l/d之间；二十碳五烯酸含量在26.05～28.36mg/g之间，产率在8.95～9.42mg/l/d之间；金藻昆布多糖的含量在139.88～182.09mg/g之间，产率在44.50～59.48mg/l/d之间(图9、图10)。岩藻黄素含量在10～50mg/l浓度下均存在显著提升，而产率在5～50mg/l条件下均存在显著提升，其中10mg/l和20mg/l条件在在含量和产率方面均存在极显著提升。岩藻黄素含量和产率在10mg/l浓度下达到最高，分别为12.40mg/l和4.12mg/l/d，分别比对照组极显著提高了11.51％和14.76％，含量与20mg/l浓度下并无显著差异但产率存在显著提升；二十碳五烯酸含量和产率在0～50mg/l浓度下相比于对照组均无显著差异。二十碳五烯酸含量和产率10mg/l浓度下达到最高，分别为28.36mg/g和9.42mg/l/d；金藻昆布多糖含量在2.5、10和50mg/l条件下均有显著提升，其中2.5mg/l和10mg/l存在极显著提升。金藻昆布多糖含量和产率在2.5mg/l浓度下达到最高，分别为182.09mg/g和59.48mg/l/d，分别比对照组极显著提高了22.72％和25.14％。因此，在0～50mg/l木质素磺酸钙浓度中，10mg/l能够同时提高三种高价值产物的含量和产率，其中岩藻黄素和二十碳五烯酸的含量和产率存在显著提高。
[0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。