一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体及其应用

1.本发明属于基因工程领域，涉及一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体，具体地说是一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体及其应用。


背景技术：

2.裂殖壶菌是一种富含dha(二十二碳六烯酸)的异养海洋原生生物，因其生长速度快、dha含量丰富、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。而epa(二十碳五烯酸)被认为对人体健康和心血管疾病防治有很好的作用，以epa为代表的多不饱和脂肪酸在帮助covid-19患者恢复健康方面也表现出良好的效果。然而，具有极高商业化价值的epa在裂殖壶菌脂肪酸中占比很小。研究发现，裂殖壶菌中脂肪酸积累以中性脂质、磷脂和糖脂为主，而中性脂质占比超过75％，tag(三酰基甘油酯)是中性脂质的主要储存形式。对裂殖壶菌hx-308的tag组成进行分析，发现其tag的sn-1/2/3位脂肪酸及其含量大小为：dha》c16:0》dpa》c14:0，且以上四种脂肪酸的量约占总脂肪酸含量的95％，几乎没有epa的存在，这可能是裂殖壶菌epa积累过少的原因。
3.tag是通过肯尼迪途径合成的，该途径包括以下三个步骤：第一步，3-磷酸甘油(g3p)被限速酶甘油-sn-3-磷酸酰基转移酶(gpat)转化为溶血磷脂(lpa)；第二步，溶血磷脂酸酰基转移酶(lpaat)将一个酰基部分从coa转移到lpa的sn-2位，得到磷脂酸(pa)；第三步，在二酰基甘油酰基转移酶(dgat)的催化下，酰基从coa转移到二酰基甘油酯形成tag。
4.相对于gpat和dgat将脂肪酸转移到甘油的sn-1/3位，lappt则将脂肪酸转移到甘油的sn-2位。研究表明，sn-2位上的脂肪酸在人体中不易被胃中的脂肪酶水解，更易被运输到人体的其他部位发挥功能。因此，通过调控酰基转移酶(尤其是lappt)使裂殖壶菌hx-308的tag sn-1/2/3位定向富集epa，对裂殖壶菌整体epa积累将非常有意义。
5.传统许多研究都试图通过优化发酵过程来提高裂殖壶菌的脂质产量。jakobsen等人报道，当细胞受到氮限制时，裂殖壶菌t66的脂质生成显著增强(jakobsen an,accumulation of docosahexaenoic acid-rich lipid in thraustochytrid aurantiochytrium sp.strain t66:effects of n and p starvation and o2 limitation.appl microbiol biotechnol,2018,80(2):297-306)。此外，当整个发酵过程中溶解氧水平保持在50％时，裂殖壶菌sr21产脂量为5.75g/l/d(huang ty,a fermentation strategy for producing docosahexaenoic acid in aurantiochytrium limacinum sr21 and increasing c22:6proportions in total fatty acid.bioresour technol,2012,123:8-14)。然而，该技术已经达到了一个瓶颈，仅通过发酵优化无法进一步提高脂质生产率。同样的，适用于这些裂殖壶菌的高效基因编辑工具尚未完全建立(du f,biotechnological production of lipid and terpenoid from thraustochytrids.biotechnol adv,2021,48(8):107725)。因此，寻找一种简单有效的代谢流扰动策略成为近年来的研究热点。
6.近年来，许多小分子药物通过靶向特定的酶蛋白或作为信号分子来扰乱生物系
统，从而导致天然生产者的特定表型(garlick jm,norstictic acid is a selective allosteric transcriptional regulator.j am chem soc,2021,143:9297-9302)，而可作为激活剂或抑制剂的小分子药物称为化学调节剂。环己酰亚胺(cycloheximide)，别称放线菌酮，是一种干扰蛋白质生物合成过程的细菌毒素，一些细胞也用它构建蛋白质以执行不同功能，同时，环己酰亚胺是一种潜在的抑制淀粉合成途径关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的抑制剂(decker,d,identification and characterization of inhibitors of udp-glucose and udp-sugar pyrophosphorylases for in vivo studies.plant.j,2017,90,1093
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1107)。淀粉合成途径通常被认为是菌体内碳源的主流途径，和脂肪酸合成途径竞争共同前体乙酰辅酶a，因此用环己酰亚胺抑制菌体内的淀粉合成，可能会使脂肪酸合成增多。
7.artp是常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma)的简称，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、oh自由基等)浓度的等离子体射流。为了从生物技术应用的角度突出这种等离子体源的特点，采用常压室温等离子体即artp来代表这种rf apgd等离子体源。科学研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用artp能够有效造成dna多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株；与分子操作手段相比，artp进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。


技术实现要素：

8.本发明的目的，旨在要提供一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体，以解决裂殖壶菌中epa占比低的问题，同时达到提高tag含量的目的；
9.本发明的另一个目的，是要提供上述一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的应用。
10.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
11.一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体，通过突变技术对裂殖壶菌溶血磷脂酸酰基转移酶进行以下突变得到：第106位氨基酸由亮氨酸突变为精氨酸、第113位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸、第131位氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸、第216位氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸、第261位氨基酸由苏氨酸突变为脯氨酸。
12.作为一种限定，所述溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示：
13.seq id no.1：
14.mlakgfpqqtssatashgfglpttptgasaklgkaaaqevssgksdvkatsrleflafyariaglllisimiilvglsawpmiapfhrgkwrtfidqleclwvnarlwllpastlemhgdfptasstpklvicnhatdvdwiyqlmpmtvvnfgttdlsgsvkiflkqevknipivgwgcalfefvflkrdwavdrlriensltrfckdggpitvvlypegstvntrtldkcrtfarvqgrpefdltllprvrgfahiceplakhsptgdvdvfdqtmafdtysgevpdwemgfkrnvdtgvpnfqtmflgrasrrchidsrrfsyrqlkqeyqdslenwlderwarkesllrefiehqqfdslgaeprlsvpvngsirrslmavtfyiamwvgmaftysrysadfsafnl。
15.本发明还提供了上述一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的编码基因，所述溶血磷
脂酸酰基转移酶突变体的编码基因的序列如seq id no.2所示：
16.seq id no.2：
17.atgctcgccaaggggtttccgcagcaaacctcgtccgccacagcctcacacgggttcggtctgcccacgacgcctacgggcgccagcgcgaagctgggcaaggccgcagcgcaggaggtcagtagtgggaagagcgatgtgaaagcgacgtcgcgactcgaatttctcgctttttatgcgcgaatcgccggtctcctgctcatcagcatcatgatcatcctcgttggcctgtctgcctggccaatgattgcccccttccaccggggcaagtggcgcaccttcatcgaccaactcgagtgtctgtgggtgaatgcgcgtctgtggctgctacccgcctccacgctcgagatgcacggcgactttccaaccgcatcgtcgacgcccaagttggtcatttgcaaccacgctaccgatgtcgactggatctaccagctcatgcccatgaccgtcgtcaactttggtacgaccgatctcagtggctccgtgaagattttcctcaaacaagaagtcaagaacatccccattgtcggctggggctgcgccctctttgagtttgtttttctcaagcgcgactgggccgtagatagactgcgtatcgagaattcgctcacgcgcttttgcaaagacggtggcccgatcacggtggtcctctacccggaaggttccaccgtcaacacgcgcactctcgacaagtgccgcacctttgcccgcgtgcagggccggcccgagtttgacctcaccttgctgccacgtgtgcgcgggttcgcacacatttgcgaacctctcgccaagcactctcccacgggcgacgtcgacgtctttgaccagaccatggcgttcgacacatactcgggcgaggtacctgactgggagatgggctttaagcgcaatgtggacacgggcgtgccgaacttccagaccatgttcctcgggcgcgcgtctcgccgctgccacattgactcgcgccgcttttcgtaccgccagcttaagcaagagtaccaggactcgctcgagaattggctcgacgagcgctgggctcgtaaggagagcctgctccgcgaatttatcgagcaccagcagttcgattcgctcggcgcggaaccgcgattgtcggttccggtaaacggttccatccgtcgctctctcatggccgtcaccttttacattgccatgtgggtcggtatggcgttcacgtattcgcgctactcggccgacttctccgcattcaatctgtaa。
18.本发明还提供了上述一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的编码基因的应用，所述溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的编码基因用于构建工程菌。
19.作为一种限定，所述工程菌的构建包括以下步骤：
20.s1.克隆所述溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的编码基因；
21.s2.将s1中的编码基因插入质粒中，构建所述溶血磷脂酸酰基转移酶突变体基因的载体；
22.s3.将所述载体电转化导入裂殖壶菌，即得所述工程菌。
23.作为另一种限定，所述工程菌的构建包括以下步骤：
24.s1.克隆所述溶血磷脂酸酰基转移酶突变体的编码基因和二酰基甘油酰基转移酶突变体的编码基因；
25.s2.将s1中的编码基因插入质粒中，构建所述溶血磷脂酸酰基转移酶突变体基因和所述二酰基甘油酰基转移酶突变体基因的载体；
26.s3.将所述载体电转化导入裂殖壶菌，即得所述工程菌。
27.作为进一步限定，所述二酰基甘油酰基转移酶突变体的编码基因序列如seq id no.3所示：
28.seq id no.3：
29.atgaccctgaccgggccggaggaagactacgccgcgagtctgagtctgcaagaggacgcgggcgcgcccgaagtcgcggacgcctcggcgagggagcgcaagcagcgcgcgccagatgcgccaagcttgttgcgccagggctcgtcccaggaagacgctgacaatacgctcgtgcagcagacaggagtggcgactgtcctcttgcacgatgcctcggaggtggtgcgacaggcgacctttgggtccggacatcgccacgccgtggccatggagaatgtagaaattaaaacacctgc
gaaaaccctccccgaaggcacaacgcgcaagcccgtcctcattatccctggcttcatgtcgagttcgctccgtgtcgagtcatcgagtgtagtgcctcgatgggagggtaagcgcatttggatgtcgctcgggcgtttgggtttcacgggcaaatttttaggaacgtcgagcgtttttgagaccaaggacgacgatgcggagcagatcagtatgcggaatgattggctcttgcacatgtcacttcaaacggacctcatttctgagcgagaaggtgtgcgggtgcgcgccattccgggcttgcgtggtgttgattttctcgaaccaggtctcttcatgaacgcccagacctacgtattcgggcccgtaattagcgctctcgtcaagcgcggtggttacactccagaaaaggatctcgatgccgcatcgtacgtctggcgcatgccgcctcgcattctcgaggagagagaccaatactttacgcgtacacttgatcgcatcgagcgtatgtgccaagaaaacgacaatcgtcgcgtcgttcttctctgtcactccatgggctgccaaatgggcgaatatcttttgcgttttgcactggatcctcgcggacgcgagtggatcgatcagcacatcgaaacgtatcttcccgtgggcggtccgcatctcggatctccgagcgccttgcagagcctcgtgcatggatctaacatgggtcttcccgcggcctttctctcttcgcatgctgctctcatcatgggccggtccttggggtcgactcctttcctgatgccagtggccacatctggagatatcgaagacgaccataccgcagcgaattgcttgtatcctaacatcgtcaagcagacgggcatggttcgcttcaaaatcaccaaaatcgatcttcgccaaatcgcatccttttatcgcaacttgggccagctccgtctgcgcattcgcttcgggcccacgacccttgcaaccgcatggtatacgacgcaccccattcatccgattcgtcccgtggacggcgacaacaattacgtcatgttcgaaatggaggcccctgtcgagctaggccagggggatgacatcttcattgtcgagatcgtcgagcaggttcttgcactagacgttacagcgcgtcgcctataccttcccaatcgcatcacgcgctgcatgtgcgtcgacaccaagctcggcaaggccagcagtgctgcctttgagaattctctcggcactctcaaagtcattgaccctggaacggttctatgcaagaacaaatttcagctcgcgcacattttgcgcaaccacgattctgaaaatccgcattccgagcctggcacgcctaaactctttacttttcctctcgccaacataaaaacctcccgcacgcgatatgggtgctatgcagaggcaggaatggaaatcacttggttctcgcctgaaacgctctaccaagaagccggcgcggagatgcctcgacacgctgcgcccctatatacaaccaagcgtcgcaaaaatgcatttaacgcggcgagctcaagacctctgctccgcctgtcgaaaacgtatacgccatccatgccgtcaatgttgacactgtga。
30.本发明还提供了上述一种工程菌的应用，所述工程菌用于积累二十碳五烯酸和三酰基甘油酯。
31.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
32.①
本发明提供的溶血磷脂酸酰基转移酶突变体，其基因转录水平上调，能产生更多的epa和tag；
33.②
本发明提供的溶血磷脂酸酰基转移酶突变体，其编码基因可用于构建工程菌，构建的工程菌用于提高裂殖壶菌中油脂含量，且epa占比和tag含量都有所提高；
34.③
本发明提供的溶血磷脂酸酰基转移酶突变体编码基因与二酰基甘油酰基转移酶突变体编码基因，用于构建工程菌，构建的工程菌epa占比和tag含量都有明显提高，为裂殖壶菌工程化定向合成epa和tag提供了基础。
35.本发明提供了一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体及其编码基因，该突变体与基因可用于提高裂殖壶菌中epa和tag的含量，同时该突变体也可与二酰基甘油酰基转移酶突变体共同应用于提高裂殖壶菌中油脂的含量。
附图说明
36.图1为实施例1中环己酰亚胺浓度与菌种存活率的关系；
37.图2为实施例1中artp诱导时间与菌种存活率的关系；
38.图3为实施例1中裂殖壶菌野生型和裂殖壶菌突变体(h1～h10)中tag含量；
39.图4为实施例1中裂殖壶菌野生型和裂殖壶菌突变体(h1～h10)中epa占比；
40.图5为实施例1中裂殖壶菌野生型和裂殖壶菌h-7中两种酶转录水平对比；
41.图6为实施例1中裂殖壶菌野生型和裂殖壶菌h-7的lpaat-3蛋白质序列对比；
42.图7为实施例1中裂殖壶菌野生型和裂殖壶菌h-7的dgat-4蛋白质序列对比；
43.图8为实施例2中lpaat-3基因克隆的凝胶电泳图；
44.图9为实施例2中lpaat-3基因裂殖壶菌表达载体构建示意图；
45.图10为实施例4中lpaat-3和dgat-4基因克隆的凝胶电泳图；
46.图11为实施例4中lpaat-3和dgat-4基因裂殖壶菌表达载体构建示意图。
具体实施方式
47.下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
48.实施例1一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)基因的获得方法
49.本实施例为溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)基因的获得方法，该获得方法包括依次进行的以下步骤：
50.s1.菌种活化：将实验室自保存的产油裂殖壶菌(sch i zochytr i um sp.hx-308)从-80℃的冷冻室中取出，接种于摇瓶培养基，于28℃条件下，180r/mi n摇床培养24h获得一代种子培养液；取1ml一代种子培养液接种于250ml锥形瓶(含种子培养基50ml)中，于28℃条件下，180r/mi n摇床培养24h获得二代种子培养液；取1ml二代种子培养液接种于250ml锥形瓶(含种子培养基50ml)中，于28℃条件下，180r/mi n摇床培养到对数期(od540：0.6-0.8)获得三代种子培养液；
51.s2.筛选合适的环己酰亚胺压力：将环己酰亚胺溶于甲醇，获得1m的环己酰亚胺母液，然后分别制备含有0mm、0.1mm、0.2mm、0.5mm、1mm、2mm、5mm和10mm浓度的环己酰亚胺的固体培养基，分别取100μl三代种子培养液涂布于不同浓度环己酰亚胺平板上，筛选合适的环己酰亚胺压力，结果如图1所示，当环己酰亚胺浓度在5mm时，裂殖壶菌的致死率在90％左右，符合筛选标准，因此，选择5mm浓度的环己酰亚胺作为筛选压力；
52.s3.筛选合适的artp诱导时间：取1ml三代种子培养液，离心除去上清液，用去离子水洗涤两次，再次离心除去上清液后加入生理盐水稀释至1ml，得到菌悬液；
53.在artp诱变专用金属片上滴加10μl的菌悬液，并使其浸润金属片的整个平面，然后将artp诱变专用金属片放入artp诱变育种仪对应的孔中，调整artp诱变育种仪参数，设置诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、30s、60s和90s，打开诱变开关开始诱变，诱变结束后将菌体用1ml生理盐水洗下，得到artp诱变菌悬液；
54.将100μl不同诱变时间的artp诱变菌悬液分别涂布于空白平板上，分析致死率，确定诱变时间，结果如图2所示，当诱变时间为30s时，裂殖壶菌的致死率在90％左右，符合筛选标准，因此，选择诱变时间为30s；
55.s4.获得诱变菌株：将100μl诱变时间为30s的artp诱变菌悬液涂布于5mm浓度的环己酰亚胺平板上，挑选单菌落，按照步骤s1的方法培养至三代种子，得突变体h1～h10，作为发酵菌种；
56.s5.菌株发酵分析：分别取10ml步骤s1中的三代种子培养液(野生型)和10ml步骤s4中的三代种子培养液(突变体h1～h10)接种于500ml锥形瓶(含发酵培养基90ml)中，于28℃条件下，180r/mi n摇床培养120h，每隔24h取样测量脂肪酸组成，发酵培养结束后收集菌体提取脂质，分析tag含量和epa的占比，结果分别如图3和图4所示，选取tag含量和epa占比最高的裂殖壶菌h-7；
57.s6.对裂殖壶菌野生型和裂殖壶菌h-7突变体转录分析：按照步骤s5发酵裂殖壶菌野生型与裂殖壶菌h-7突变体，取72h的发酵菌体，在-80℃冰箱中保存12h，然后使用真空冷冻干燥机除水48h；
58.用称量勺取出干燥后的菌体0.5g，放入碾钵中，倒入液氮后进行碾磨，反复碾磨5次；碾磨完成后，收集菌体提取rna，进行转录组分析，并对溶血磷脂酸酰基转移酶(lpaat)和二酰基甘油酰基转移酶(dgat)的转录水平进行分析，结果如图5所示，lpaat-3和dgat-4基因的转录水平都明显提高；
59.对转录组差异较大的lpaat-3和dgat-4基因进行分析，蛋白质序列对比结果如图6、图7所示(lpaat-3和dgat-4基因均发生了突变)，即得所述lpaat-3，其氨基酸序列seq id no.1为：
60.mlakgfpqqtssatashgfglpttptgasaklgkaaaqevssgksdvkatsrleflafyariaglllisimiilvglsawpmiapfhrgkwrtfidqleclwvnarlwllpastlemhgdfptasstpklvicnhatdvdwiyqlmpmtvvnfgttdlsgsvkiflkqevknipivgwgcalfefvflkrdwavdrlriensltrfckdggpitvvlypegstvntrtldkcrtfarvqgrpefdltllprvrgfahiceplakhsptgdvdvfdqtmafdtysgevpdwemgfkrnvdtgvpnfqtmflgrasrrchidsrrfsyrqlkqeyqdslenwlderwarkesllrefiehqqfdslgaeprlsvpvngsirrslmavtfyiamwvgmaftysrysadfsafnl；
61.lpaat-3的基因序列seq id no.2为：
62.atgctcgccaaggggtttccgcagcaaacctcgtccgccacagcctcacacgggttcggtctgcccacgacgcctacgggcgccagcgcgaagctgggcaaggccgcagcgcaggaggtcagtagtgggaagagcgatgtgaaagcgacgtcgcgactcgaatttctcgctttttatgcgcgaatcgccggtctcctgctcatcagcatcatgatcatcctcgttggcctgtctgcctggccaatgattgcccccttccaccggggcaagtggcgcaccttcatcgaccaactcgagtgtctgtgggtgaatgcgcgtctgtggctgctacccgcctccacgctcgagatgcacggcgactttccaaccgcatcgtcgacgcccaagttggtcatttgcaaccacgctaccgatgtcgactggatctaccagctcatgcccatgaccgtcgtcaactttggtacgaccgatctcagtggctccgtgaagattttcctcaaacaagaagtcaagaacatccccattgtcggctggggctgcgccctctttgagtttgtttttctcaagcgcgactgggccgtagatagactgcgtatcgagaattcgctcacgcgcttttgcaaagacggtggcccgatcacggtggtcctctacccggaaggttccaccgtcaacacgcgcactctcgacaagtgccgcacctttgcccgcgtgcagggccggcccgagtttgacctcaccttgctgccacgtgtgcgcgggttcgcacacatttgcgaacctctcgccaagcactctcccacgggcgacgtcgacgtctttgaccagaccatggcgttcgacacatactcgggcgaggtacctgactgggagatgggctttaagcgcaatgtggacacgggcgtgccgaacttccagaccatgttcctcgggcgcgcgtctcgccgctgccacattgactcgcgccgcttttcgtaccgccagcttaagcaagagtaccaggactcgctcgagaattggctcgacgagcgctgggctcgtaaggagagcctgctccgcgaatttatcgagcaccagcagttcgattcgctcggcgcggaaccgcgattgtcggttccggtaaacggttccatccgtcgctctctcatggccgtcaccttttacattgccatgtgggtcggtatggcgttcacgtattcgcgctactcggccgacttctccgcattcaatctgtaa；
63.dgat-4的基因序列seq id no.3为：
64.atgaccctgaccgggccggaggaagactacgccgcgagtctgagtctgcaagaggacgcgggcgcgcccgaagtcgcggacgcctcggcgagggagcgcaagcagcgcgcgccagatgcgccaagcttgttgcgccagggctcgtcccaggaagacgctgacaatacgctcgtgcagcagacaggagtggcgactgtcctcttgcacgatgcctcggaggtggtgcgacaggcgacctttgggtccggacatcgccacgccgtggccatggagaatgtagaaattaaaacacctgcgaaaaccctccccgaaggcacaacgcgcaagcccgtcctcattatccctggcttcatgtcgagttcgctccgtgtcgagtcatcgagtgtagtgcctcgatgggagggtaagcgcatttggatgtcgctcgggcgtttgggtttcacgggcaaatttttaggaacgtcgagcgtttttgagaccaaggacgacgatgcggagcagatcagtatgcggaatgattggctcttgcacatgtcacttcaaacggacctcatttctgagcgagaaggtgtgcgggtgcgcgccattccgggcttgcgtggtgttgattttctcgaaccaggtctcttcatgaacgcccagacctacgtattcgggcccgtaattagcgctctcgtcaagcgcggtggttacactccagaaaaggatctcgatgccgcatcgtacgtctggcgcatgccgcctcgcattctcgaggagagagaccaatactttacgcgtacacttgatcgcatcgagcgtatgtgccaagaaaacgacaatcgtcgcgtcgttcttctctgtcactccatgggctgccaaatgggcgaatatcttttgcgttttgcactggatcctcgcggacgcgagtggatcgatcagcacatcgaaacgtatcttcccgtgggcggtccgcatctcggatctccgagcgccttgcagagcctcgtgcatggatctaacatgggtcttcccgcggcctttctctcttcgcatgctgctctcatcatgggccggtccttggggtcgactcctttcctgatgccagtggccacatctggagatatcgaagacgaccataccgcagcgaattgcttgtatcctaacatcgtcaagcagacgggcatggttcgcttcaaaatcaccaaaatcgatcttcgccaaatcgcatccttttatcgcaacttgggccagctccgtctgcgcattcgcttcgggcccacgacccttgcaaccgcatggtatacgacgcaccccattcatccgattcgtcccgtggacggcgacaacaattacgtcatgttcgaaatggaggcccctgtcgagctaggccagggggatgacatcttcattgtcgagatcgtcgagcaggttcttgcactagacgttacagcgcgtcgcctataccttcccaatcgcatcacgcgctgcatgtgcgtcgacaccaagctcggcaaggccagcagtgctgcctttgagaattctctcggcactctcaaagtcattgaccctggaacggttctatgcaagaacaaatttcagctcgcgcacattttgcgcaaccacgattctgaaaatccgcattccgagcctggcacgcctaaactctttacttttcctctcgccaacataaaaacctcccgcacgcgatatgggtgctatgcagaggcaggaatggaaatcacttggttctcgcctgaaacgctctaccaagaagccggcgcggagatgcctcgacacgctgcgcccctatatacaaccaagcgtcgcaaaaatgcatttaacgcggcgagctcaagacctctgctccgcctgtcgaaaacgtatacgccatccatgccgtcaatgttgacactgtga；
65.dgat-4氨基酸序列seq id no.4为：
66.mtltgpeedyaaslslqedagapevadasarerkqrapdapsllrqgssqedadntlvqqtgvatvllhdasevvrqatfgsghrhavamenveiktpaktlpegttrkpvliipgfmssslrvesssvvprwegkriwmslgrlgftgkflgtssvfetkdddaeqismrndwllhmslqtdliseregvrvraipglrgvdflepglfmnaqtyvfgpvisalvkrggytpekdldaasyvwrmpprileerdqyftrtldriermcqendnrrvvllchsmgcqmgeyllrfaldprgrewidqhietylpvggphlgspsalqslvhgsnmglpaaflsshaalimgrslgstpflmpvatsgdieddhtaanclypnivkqtgmvrfkitkidlrqiasfyrnlgqlrlrirfgpttlatawytthpihpirpvdgdnnyvmfemeapvelgqgddifiveiveqvlaldvtarrlylpnritrcmcvdtklgkassaafenslgtlkvidpgtvlcknkfqlahilrnhdsenphsepgtpklftfplaniktsrtrygcyaeagmeitwfspetlyqeagaemprhaaplyttkrrknafnaassrpllrlsktytpsmpsmltl。
67.实施例2含有溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)基因的重组载体
68.本实施例包括依次进行的以下步骤：
69.s1.溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)基因的克隆：根据裂殖壶菌溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)基因序列信息，设计如seq id no.5/seq id no.6所示的引物p1/p2；
70.seq id no.5 p1(sense)：atgctcgccaaggggtttccgc
71.seq id no.6 p2(antisense)：ttacagattgaatgcggagaag
72.以裂殖壶菌h-7基因组为模版，用引物p1/p2、primerstar高保真聚合酶，通过pcr对lpaat-3基因片段进行扩增，得到lpaat-3基因片段，pcr程序为：94℃30s、55℃30s、70℃30s，32个循环，并对pcr产物进行纯化，纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图8所示；
73.s2.溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)基因上拼接及添加同源臂：为lpaat-3基因设计同pbs-zeo酶切位点两端的同源臂序列seq id no.9 p5和seq id no.10 p6；
74.seq id no.9 p5(sense)：ctcctgggaggcgtctagaatgctcgccaaggggtttccgc
75.seq id no.10 p6(antisense)atagactgcgtatcgagaattcgttacagattgaatgcggagaag
76.将同源臂通过pcr加到lpaat-3基因的两端，胶回收；
77.s3.连接反应：用gibson组装将酶切后的载体pbs-zeo片段和lpaat-3基因片段连接，得到重组过表达载体pbs-zeo-lpaat,连接体系(25μl)：2μl目的基因片段，1μl载体酶切后片段，2.5μl连接酶buffer，19.5μl ddh2o，50℃连接2h；
78.s4.连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞：无菌状态下取100μl感受态细胞，加入连接产物混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，迅速放置冰上2min；加入900μl lb培养基，37℃，180r/min孵育1h；取200μl涂布于含100μg/ml zeo抗性lb平板上倒置，37℃培养过夜；挑选阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，即得过表达载体pbs-zeo-lpaat，载体示意图如图9所示。
79.实施例3含有溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)重组载体的工程菌
80.本实施例包括依次进行的以下步骤：
81.s1.裂殖壶菌感受态细胞的制备：
82.(1)挑取平板上已活化好的schizochytrium sp.hx-308裂殖壶菌单菌落至50ml种子培养基，28℃，170r/min摇床培养24h；
83.(2)按5％的接种量转接至50ml种子培养基，28℃，170r/min摇床培养24h；
84.(3)重复前一步；
85.(4)取25ml菌液，4000rpm室温下离心2min，弃上清液，得菌体；
86.(5)用25ml的预处理剂(20mm dtt和0.1m cacl2溶于ph6.5 tris-hcl缓冲液)重悬菌体，轻微震荡以松散细胞壁；
87.(6)于4000rpm，4℃条件下对(5)中的菌体离心2min后，用25ml已预冷的无菌水洗涤菌体两次；
88.(7)于4000rpm，4℃条件下对(6)中的菌体离心2min后用1m的无菌预冷山梨醇溶液(含0.1m cacl2)洗涤菌体两次；
89.(8)用200μl的1m的无菌预冷山梨醇溶液(含0.1m cacl2)重悬(7)中的菌体，得裂殖壶菌感受态细胞，分装于1.5ml的无菌离心管，每管100μl，冰上备用；
90.s2.裂殖壶菌电转化：
91.(1)将10μl线性化后的过表达载体pbs-zeo-lpaat加入100μl裂殖壶菌感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min；
92.(2)电击，2kv，一个脉冲；
93.(3)立即往电转杯加入1ml预冷的含1m山梨醇的种子培养基，混匀后转移至含1m山梨醇的种子培养基；
94.(4)28℃，180rpm培养2～3h；
95.(5)取适量菌液涂板，28℃培养2～4天，得电转化后的裂殖壶菌；
96.s3.重组过表达载体pbs-zeo-lpaat基因的裂殖壶菌基因工程菌株的筛选和鉴定：
97.(1)挑取s2中平板上电转化后的裂殖壶菌，接种至含50mg/l博莱霉素的种子培养基中，28℃，180rpm培养24h；
98.(2)传代5次保证过表达载体稳定遗传，每一代都重复前一步中描述实验；
99.(3)稳定遗传的菌株即为过表达pbs-zeo-lpaat的裂殖壶菌te1工程菌株表型，保藏于-80℃冰箱。
100.实施例4含有溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)和二酰基甘油酰基转移酶突变体(dgat-4)的重组载体
101.本实施例包括依次进行的以下步骤：
102.s1.溶血磷脂酸酰基转移酶突变体(lpaat-3)和二酰基甘油酰基转移酶突变体(dgat-4)基因的克隆：根据裂殖壶菌lpaat-3基因和dgat-4的序列信息，设计分别如seq id no.5/seq id no.6和seq id no.7/seq id no.8所示的引物p1/p2和p3/p4；
103.seq id no.5 p1(sense)：atgctcgccaaggggtttccgc
104.seq id no.6 p2(antisense)：ttacagattgaatgcggagaag
105.seq id no.7 p3(sense)：atgaccctgaccgggccggagga
106.seq id no.8 p4(antisense)：tcacagtgtcaacattgacggc
107.以裂殖壶菌h-7基因组为模版，用引物p1/p2或p3/p4、primerstar高保真聚合酶，通过pcr对lpaat-3和dgat-4基因片段进行扩增，得到lpaat-3和dgat-4基因片段，pcr程序为：94℃30s、55℃30s、70℃30s，32个循环，并对pcr产物进行纯化，纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图10所示；
108.s2.lpaat-3和dgat-4基因上拼接及添加同源臂：为lpaat-3和dgat-4基因设计同pbs-zeo酶切位点两端的同源臂序列(seq id no.9 p5和seq id no.10 p6)和(seq id no.11 p7和seq id no.12 p8)；
109.seq id no.9 p5(sense)：ctcctgggaggcgtctagaatgctcgccaaggggtttccgc
110.seq id no.10 p6(antisense)atagactgcgtatcgagaattcgttacagattgaatgcggagaag
111.seq id no.11 p7(sense)：cgaattctcgatacgcagtctatatgaccctgaccgggccggagga
112.seq id no.12 p8(antisense)cgccgagtttgagcggctagctcacagtgtcaacattgacggc
113.将同源臂通过pcr加到lpaat-3和dgat-4基因的两端，胶回收；
114.s3.连接反应：用gibson组装将酶切后的载体pbs-zeo片段、lpaat-3基因片段和dgat-4基因片段连接，得到重组过表达载体pbs-zeo-lpaat-dgat,连接体系(25μl)：2μl目
的基因片段，1μl载体酶切后片段，2.5μl连接酶buffer，19.5μl ddh2o，50℃连接2h；
115.s4.连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞：无菌状态下取100μl感受态细胞，加入连接产物混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，迅速放置冰上2min；加入900μl lb培养基，37℃，180r/min孵育1h；取200μl涂布于含100μg/ml zeo抗性lb平板上倒置，37℃培养过夜；挑选阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得过表达载体pbs-zeo-lpaat-dgat，载体示意图如图11所示。
116.实施例5含有溶血磷脂酸酰基转移酶(lpaat-3)和二酰基甘油酰基转移酶(dgat-4)重组载体的工程菌
117.本实施例包括依次进行的以下步骤：
118.s1.裂殖壶菌感受态细胞的制备：
119.(1)挑取平板上已活化好的schizochytrium sp.hx-308裂殖壶菌单菌落至50ml种子培养基，28℃，170r/min摇床培养24h；
120.(2)按5％的接种量转接至50ml种子培养基，28℃，170r/min摇床培养24h；
121.(3)重复前一步；
122.(4)取25ml菌液，4000rpm室温下离心2min，弃上清液，得菌体；
123.(5)用25ml的预处理剂(20mm dtt和0.1m cacl2溶于ph6.5 tris-hcl缓冲液)重悬菌体，轻微震荡以松散细胞壁；
124.(6)于4000rpm，4℃条件下对(5)中的菌体离心2min后，用25ml已预冷的无菌水洗涤菌体两次；
125.(7)于4000rpm，4℃条件下对(6)中的菌体离心2min后用1m的无菌预冷山梨醇溶液(含0.1m cacl2)洗涤菌体两次；
126.(8)用200μl的1m的无菌预冷山梨醇溶液(含0.1m cacl2)重悬(7)中的菌体，得裂殖壶菌感受态细胞，分装于1.5ml的无菌离心管，每管100μl，冰上备用；
127.s2.裂殖壶菌电转化：
128.(1)将10μl线性化后的过表达载体pbs-zeo-lpaat-dgat-4加入100μl裂殖壶菌感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min；
129.(2)电击，2kv，一个脉冲；
130.(3)立即往电转杯加入1ml预冷的含1m山梨醇的种子培养基，混匀后转移至含1m山梨醇的种子培养基；
131.(4)28℃，180rpm培养2～3h；
132.(5)取适量菌液涂板，28℃培养2～4天，得电转化后的裂殖壶菌；
133.s3.重组过表达载体pbs-zeo-lpaat-dgat-4基因的裂殖壶菌基因工程菌株的筛选和鉴定：
134.(1)挑取s2中平板上电转化后的裂殖壶菌，接种至含50mg/l博菜霉素的种子培养基中，28℃，180rpm培养24h；
135.(2)传代5次保证过表达载体稳定遗传，每一代都重复前一步中描述实验；
136.(3)稳定遗传的菌株即为过表达pbs-zeo-lpaat-dgat-4的裂殖壶菌te2工程菌株表型，保藏于-80℃冰箱。
137.实施例6裂殖壶菌野生型、突变体和工程菌脂肪酸含量检测
138.本实施例为裂殖壶菌野生型、裂殖壶菌h-7、裂殖壶菌te1和裂殖壶菌te2发酵产生脂肪酸含量的检测，结果如表1所示：
139.表1裂殖壶菌脂肪酸含量
[0140] 野生型裂殖壶菌h-7裂殖壶菌tel裂殖壶菌te2c14:0(％)9.2910.298.948.29c16:0(％)18.2717.3716.7916.66epa(％)1.004.907.468.40dpa(％)14.6212.4712.6211.62dha(％)46.4248.2245.8047.74other(％)10.396.748.387.28tag(％)53.6477.3368.4668.53tag(g/l)34.6164.5250.3552.73脂质(g/l)64.5283.4473.5576.95
[0141]
由表1可知，裂殖壶菌突变体h-7、裂殖壶菌工程菌te1和裂殖壶菌工程菌te2的tag含量、epa占比和脂质含量都比裂殖壶菌野生型有显著提高，证明溶血磷脂酸酰基转移酶(lpaat-3)以及溶血磷脂酸酰基转移酶(lpaat-3)和二酰基甘油酰基转移酶(dgat-4)可以提高裂殖壶菌中epa和tag含量，可用于裂殖壶菌积累脂质。