一种同时检测百合五种病毒的引物对、探针、试剂盒以及方法与流程

1.本发明涉及分子检测技术领域，特别是涉及一种同时检测百合五种病毒的引物对、探针、试剂盒以及方法。


背景技术：

2.百合(lilium spp.)是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物。在生产中，百合采用无性繁殖方式进行繁殖，易感染多种病毒，导致其种球减产、花蕾畸形和凋落，严重影响了百合的产量和品质，给百合产业带来极大的经济损失。百合斑驳病毒(lily mottle virus，lmov)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)、葱黄条病毒(shallotyellowstripe virus，sysv)和车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus，plamv)是五种感染百合的重要病毒，在生产中，这些病毒常常复合侵染百合，严重影响百合的产量和品质。建立一种可以高通量快速同时检测以上五种病毒的方法对于有效防止百合病毒病的传播，减少经济损失至关重要。
3.目前，病毒的检测方法包括酶联免疫吸附试验、直接组织印迹、逆转录环介导的等温扩增、常规rt
‑
pcr和实时荧光定量pcr(rt
‑
qpcr)等，其中，基因rt
‑
qpcr发展起来的多重实时荧光定量pcr技术凭借其可以实现在同一个反应体系里同时检测多种病毒，被广泛应用于动植物的高通量病害检测中。林笑东等建立了对呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光定量pcr方法；李丹丹等建立了猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量pcr检测方法；陈瑜等建立了一种检测肠道病毒的五重实时荧光定量pcr技术。
4.目前，公开号为“cn 109913588a”，名称为“一种同时检测车前草花叶病毒和百合x病毒的试剂盒”的专利申请文献中具体公开了“所述引物对序列，如下所示：1)plamv正向引物：5
’‑
ccttgccctggtcaacgcat
‑3’
；2)plamv反向引物：5
’‑
tctcgtttgctgtgacctcg
‑3’
；3)lvx正向引物：5
’‑
ccaatttcttcgatgtggcgttc
‑3’
；4)lvx反向引物：5
’‑
gctcggccatgggtaatctca
‑3’”
，对比后发现，上述对比文献中仅仅只公开了同时检测两种百合植株病毒的引物对和试剂盒，并没有公开可以同时检测百合植株五种病毒的引物对、探针、试剂盒以及方法。
5.再如，公开号为“cn 112458214a”，名称为“检测百合病毒的多重pcr引物及其在免rna提取的百合病毒快速检测方法中的应用”的专利申请文献中具体公开了“所述百合病毒分别为黄瓜花叶病毒cmv、百合无症状病毒lsv和百合斑驳病毒lmov，所述用于检测黄瓜花叶病毒cmv的引物对为：cmv
‑
f如seq id no.1所示，cmv
‑
r如seq id no.2所示；用于检测百合无症状状病毒lsv的引物对为：lsv
‑
f如seq id no.3所示，lsv
‑
r如seq id no.4所示；用于检测百合斑驳病毒lmov的引物对为：lmov
‑
f如seq id no.5所示，lmovr如seq id no.6所示”，从上述对比文献说明书公开的内容可以，在该文献中也仅仅只公开了三种百合植株的病毒检测引物对和检测方法，并没有公开可以同时检测百合植株五种病毒的引物对、探针、试剂盒以及方法。
6.综上，到目前为止，尚无报道有同时检测百合中lsv、lmov、cmv、sysv、plamv五种病
毒的技术，而且常规pcr和单重实时荧光定量pcr检测五种病毒耗时耗力，建立一种同时检测百合五种病毒的实时荧光定量pcr检测方法至关重要。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时检测百合五种病毒的引物对、探针、试剂盒以及方法，该方法能够实现快速鉴定百合中五种病毒侵染情况的目的，还解决了现有不能同时对五种病毒进行鉴定的缺陷，省时省力，检测的准确度高，本发明可为lsv、lmov、cmv、sysv、plamv的准确高效监测防控提供技术支持。
8.为了实现上述目的，本发明具体的技术方案如下：
9.本发明主要适用于百合科(liliaceae)百合属(lilium)植株的鉴定，本发明通过选取lsv、lmov、cmv、sysv、plamv的外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性检测引物和探针，通过优化反应条件，建立了五种病毒的高效五重实时荧光定量pcr检测技术体系。该五重实时荧光定量pcr检测方法的lsv、lmov、cmv、sysv、plamv的检出下限分别为1.33
×
102copies
·
μl
‑1、1.27
×
101copies
·
μl
‑1、1.28
×
101copies
·
μl
‑1、2.33
×
102copies
·
μl
‑1、2.01
×
102copies
·
μl
‑1，且特异性强，重复性高(组内和组间变异系数均小于2.0％)，并可实现对感病植株内plamv五种病毒的定量分析。
10.较为具体地，本发明第一方面提供了一种针对百合植株五种病毒的pcr引物对和探针，其特征在于，所述pcr引物对由针对百合无症病毒lsv的引物对和探针、针对百合斑驳病毒lmov的引物对和探针、针对黄瓜花叶病毒cmv的引物对和探针、针对葱黄条病毒sysv的引物对和探针、针对车前草花叶病毒plamv的引物对和探针组成；其中，
11.所述针对百合无症病毒lsv的引物对和探针为：
12.lsv
‑
f：5
’‑
gcgtcgtatctaacaaca
‑3’
；
13.lsv
‑
r：5
’‑
gctccattctcaaactca
‑3’
；
14.lsv
‑
probe：cy5
‑
caaggaacgccgaactgctc
‑
bhq3；
15.所述针对百合斑驳病毒lmov的引物对和探针为：
16.lmov
‑
f：5
’‑
cagtgaaagacgagtatg
‑3’
；
17.lmov
‑
r：5
’‑
gaggtgccattctctatg
‑3’
；
18.lmov
‑
probe：fam
‑
cagaccattcattgcgagagcc
‑
bhq1；
19.所述针对黄瓜花叶病毒cmv的引物对和探针为：
20.cmv
‑
f：5
’‑
gacagtccgtaaagttcc
‑3’
；
21.cmv
‑
r：5
’‑
gatgcagcgtactgataa
‑3’
；
22.cmv
‑
probe：texas red
‑
tatccgttgccgccatctct
‑
bhq2；
23.所述针对葱黄条病毒sysv的引物对和探针为：
24.sysv
‑
f：5
’‑
gcttggatggtaacataag
‑3’
；
25.sysv
‑
r：5
’‑
cgtgtgatgatccttattc
‑3’
；
26.sysv
‑
probe：cy5.5
‑
agaacgacatacagcagccga
‑
bhq2；
27.所述针对车前草花叶病毒plamv的引物对和探针为：
28.plamv
‑
f：5
’‑
ccaacatcaagttcgaac
‑3’
；
29.plamv
‑
r：5
’‑
cgaagaggtttagggatc
‑3’
；
30.plamv
‑
probe：hex
‑
cgtctcattggcagttacttcgtc
‑
bhq1。
31.较为具体地，本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1中所述的pcr引物对和探针。
32.较为具体地，本发明第二方面提供了一种快速鉴定侵染百合植株五种病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
33.s1：取百合待测样品的叶片，提取总rna；
34.s2：以提取的百合叶片总rna为模板，进行逆转录反应，获得cdna；
35.s3：将步骤s2中获得的cdna作为待测模板，并使用如权利要求1中所述的pcr引物对和探针对所述待测模板进行实时荧光定量pcr扩增反应，并制作质粒标准品的标准曲线；
36.s4：根据上述步骤s3的检测结果判断百合植株的带病情况并计算待测植株内病毒浓度。
37.优选的，所述步骤s2中逆转录的反应体系为：
38.在rnase free microtube管中加入7.0μl模板rna、浓度为0.5μg
·
μl
‑1的anchored oligo(dt)
20
primer1.0μl、1.0μlii rt/ri enzyme mix、1.0μl gdnaremover、10.0μl 2
×
ts ii reaction mix配置混合液。
39.优选的，所述步骤s2中逆转录的反应程序为：
40.混合液50℃孵育15min，85℃加热5s得到的cdna用于实时荧光定量pcr；
41.混合液50℃孵育30min；85℃加热5s得到的cdna用于常规pcr。
42.本发明中，所述步骤(3)的实时荧光定量pcr检测，最佳反应体系为(20μl)：
43.所述步骤s2中所得的cdna 2.0μl，lsv
‑
f/r/probe、lmov
‑
f/r/probe、cmv
‑
f/r/probe、sysv
‑
f/r/probe、plamv
‑
f/r/probe引物(20μl)和探针(20μl)各0.4μl，2
×
perfectstart
tm ii probe qpcr supermix 10.0μl，rnase free ddh2o 2.0μl。
44.本发明中，所述pcr扩增反应的热循环为：
45.94℃预变性30s；40个循环(94℃变性5s；55.9℃退火延伸30s)。
46.作为优先的，上述荧光定量pcr扩增时，最适退火温度为55.9℃。
47.本发明中，所述五种病毒质粒标准品的标准曲线为：
48.lsv：y＝
‑
3.274x 39.879，r2＝0.981；
49.lmov：y＝
‑
3.143x 38.942，r2＝0.989；
50.cmv：y＝
‑
3.424x 41.702，r2＝0.994；
51.sysv：y＝
‑
3.228x 36.131，r2＝0.997；
52.plamv：y＝
‑
3.970x 42.915，r2＝0.993，y为cq值，x为病毒浓度的对数值。
53.本发明中，所述步骤s4中待测百合植株带病情况的判断方法如下：
54.通过扩增曲线及cq值来判定待测植株是否为病毒侵染阳性植株，当扩增曲线良好并且cq<35时，则为阳性，即判断待测植株带毒；反之，cq≥35时，则为阴性，即判断待测植株不带毒。参考五种病毒质粒标准品的标准曲线标准曲线，确定病毒浓度。
55.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
56.相对于传统的elisa和rt
‑
pcr检测手段，本发明对百合中五种病毒侵染植株的鉴定具有灵敏度高、高通量及可重复性强的特点，以及对植株内的lsv、lmov、cmv、sysv、plamv病毒可进行定量分析。在百合进口鉴定、大规模种植及病害流行调查时，采用本发明对可能
存在这五种病毒侵染植株进行快速检测，不仅精准高效而且将有效降低生产风险，并可有效防控这五种病毒的传播流行，维护百合产业安全。
附图说明
57.图1中a
‑
e是本发明五种病毒保守序列靶基因扩增胶图。
58.图2中a
‑
e是不同退火温度下五重实时荧光定量pcr扩增结果。
59.图3中a
‑
e是不同引物和探针浓度下五重实时荧光定量pcr扩增结果。
60.图4是本发明五重实时荧光定量pcr特异性扩增曲线。
61.图5中a
‑
e是本发明五重实时荧光定量pcr的标准曲线。
62.图6中a
‑
e是本发明五重实时荧光定量pcr灵敏度扩增曲线。
63.图7中是本发明百合不同组织图。
64.图8中a
‑
e是本发明五种病毒在百合不同组织中的分布。
具体实施方式
65.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
66.主要材料、试剂与仪器
67.1.材料：使用中国农业科学院蔬菜花卉研究所百合课题组保存的感染lsv、lmov、cmv、plamv、sysv百合植株建立检测体系；田间检测的样品为课题组资源圃的百合资源。
68.2.试剂：rna提取试剂盒：rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(dp441)和质粒提取试剂盒：高纯度质粒小提试剂盒(dp104)均购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒ii one
‑
step gdna removal and cdna synthesis supermix(目录号：ah311)、胶回收试剂盒：pcr purification kit(目录号：ep101)、克隆载体：zero background ptopo
‑
blunt simple cloning kit(ly
‑
0017)购自北京兰易科技有限公司；高保真酶：kapahifi hotstart readymix pcr kit(目录号：kk2601)购自北京巨华泰克公司；常规pcr mix：2
×
hieff
tm
pcrmastermix(with dye)(目录号：10102es08)购自翌圣生物科技(上海)有限公司。
69.3.仪器：设备：超微量紫外分光光度计(quawell q3000)、pcr仪(bio
‑
rad)、cfx96 real
‑
time荧光定量pcr仪(bio
‑
rad)。
70.实施例1：引物对和探针的设计
71.1.百合总rna的提取及反转录
72.取百合植株的叶片50
‑
100mg，采用多糖多酚植物组织裂解法对百合叶片样品进行总rna提取，之后采用反转录试剂盒ii one
‑
step gdna removal and cdna synthesis supermix获得cdna。
73.2.引物和探针的设计合成
74.选择lsv(genbank:ef158109.1)、lmov(genbank:eu348827.1)、cmv(genbank:
aj890465.2)、sysv(genbank:mk127536.1)、plamv(genbank:kx245539.1)为模板序列，利用在线ncbi blast分析比对ncbi数据库的五种病毒的cp基因保守序列，由beacon designer 8.0软件设计合成5对特异性taqman rt
‑
qpcr检测引物和探针。引物和探针及添加两端荧光基团和淬灭基团由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
75.表1五重实时荧光定量pcr所用引物和探针
[0076][0077]
实施例2：五种病毒质粒标准品制备
[0078]
1)以cdna为模板，用上述所设计引物进行pcr扩增，反应体系总体积50.0μl：cdna2.0μl，上下游引物各1.5μl，2
×
kapahifi hotstart ready mix25.0μl，ddh2o 20.0μl。反应条件：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，35个循环；72℃2min。利用2％的琼脂糖凝胶进行pcr产物切胶回收(图1)。
[0079]
2)pcr纯化产物的连接反应参照北京兰易科技有限公司的zero background ptopo
‑
blunt simple cloning kit说明书进行。反应体系10.0μl；
‑
blunt cloningvector 2.0μl，pcr纯化产物8.0μl。混合液混匀后25℃放置15min，进行连接反应。
[0080]
3)参照唯地生物dh5αchemically competent cell产品说明书，将连接后的质粒迅速转化到dh5α感受态细胞，并均匀涂抹于lb(50mg
·
l
‑1氨苄青霉素)平板上，12小时后，挑取单菌落。将单菌落置于1ml lb液体培养基(50mg
·
l
‑1氨苄青霉素)中，37℃摇床上(200r
·
min
‑1)培养8小时后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0081]
4)选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用天根质粒提取试剂盒完成plamv质粒的提取。运用公式：c＝a
·
b
‑1×
6.02
×
10
14
(其中a代表质粒浓度ng
·
μl
‑1，b代表质粒dna分子量，c代表copies
·
μl
‑1)计算出质粒浓度拷贝数，获得母液浓度：blunt
‑
lsv(1.33
×
10
10
copies
·
μl
‑1)、blunt
‑
lmov(1.27
×
10
10
copies
·
μl
‑1)、blunt
‑
cmv(1.28
×
10
10
copies
·
μl
‑1)、blunt
‑
sysv(2.33
×
10
10
copies
·
μl
‑1)、blunt
‑
plamv(2.01
×
10
10
copies
·
μl
‑1)，将其作为试验质粒标准品使用。
[0082]
实施例3：多重实时荧光定量pcr检测体系的建立及优化
[0083]
1)体系建立：cdna2.0μl，lsv
‑
f/r/probe、lmov
‑
f/r/probe、cmv
‑
f/r/probe、sysv
‑
f/r/probe、plamv
‑
f/r/probe引物和探针各0.4μl，2
×
perfectstarttm ii probe qpcr supermix 10.0μl，rnase free ddh2o 2.0μl。反应条件：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火延伸30s，39个循环，同时收集荧光信号。
[0084]
2)体系优化：将5种病毒混合质粒标准品作为模板，应用5对特异性引物和taqman探针，在同一体系中进行实时荧光定量pcr扩增，采用矩阵法分别对退火温度(52℃、52.7℃、54℃、55.9℃、58.4℃、60.3℃、61.4℃、62℃)、引物浓度(终浓度分别为10、15、20、25、30μmol
·
l
‑1)及探针浓度(终浓度分别为10、15、20、25、30μmol
·
l
‑1)进行优化，如图2中a
‑
e和图3中a
‑
e。
[0085]
3)优化结果：最适温度为55.9℃，最适引物和探针浓度为20μmol
·
l
‑1。最终建立的多重taqman实时荧光定量pcr最佳反应体系(20μl)：2
×
perfectstarttm ii probe qpcr supermix 10.0μl，五种病毒特异性上、下游引物(20μmol
·
l
‑1)各0.4μl，探针(20μmol
·
l
‑1)各0.4μl，模板2μl，灭菌ddh2o 2.0μl。扩增程序为94℃预变性30s；94℃变性5s，55.9℃退火延伸30s，40个循环，同时收集荧光信号。
[0086]
实施例4：本发明的特异性检测
[0087]
用已检测含有百合无症病毒，黄瓜花叶病毒，百合斑驳病毒，车前草花叶病毒，葱黄条病毒，草莓潜环斑病毒(strawberry latentringspotvirus，slrsv)，南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus，armv)的cdna样品进行五种病毒的rt
‑
qpcr特异性检测。
[0088]
结果表明(图4)，仅有5种病毒lsv、lmov、cmv、sysv、plamv的cdna出现扩增曲线，且cq值小于35个循环，表明这五种病毒检测结果为阳性；而其他病毒检测结果则为阴性。因此，该荧光定量体系具有较强的特异性。
[0089]
实施例5：多重探针法标准曲线的建立
[0090]
用dnase/rnase
‑
free去离子水稀释五种病毒混合质粒标准品，按10倍梯度将其稀释为8个梯度。分别以稀释过的五种病毒混合质粒标准品为模板，在上述优化后的反应条件下进行taqman rt
‑
qpcr检测，每组试验重复3次，制定标准曲线。
[0091]
检测结果显示(图5中a
‑
e)，5种病毒均扩增出相对应的曲线，分别是
[0092]
lsv：y＝
‑
3.274x 39.879，r2＝0.981；
[0093]
lmov：y＝
‑
3.143x 38.942，r2＝0.989；
[0094]
cmv：y＝
‑
3.424x 41.702，r2＝0.994；
[0095]
sysv：y＝
‑
3.228x 36.131，r2＝0.997；
[0096]
plamv：y＝
‑
3.970x 42.915，r2＝0.993，
[0097]
且标准曲线的相关系数(r2)均大于0.98。因此，得出5种病毒质粒标准品的初始浓度与cq值之间呈现良好的线性关系。
[0098]
实施例5：检测结果报告
[0099]
1)通过扩增曲线及cq值来判定待测植株是否为病毒侵染阳性植株，当扩增曲线良好并且cq<35时，则为阳性，即判断待测植株带毒；反之，cq≥35时，则为阴性，即判断待测植株不带毒。
[0100]
2)当检测出待测百合植株带毒时，根据待测样品cq值以及建立的标准曲线，图7所示，计算待测植株内病毒浓度。标准品浓度(c代表copies
·
μl
‑1)计算公式为log10c＝x。
[0101]
实施例6：下面对本发明的应用可靠性作进一步检验
[0102]
1.本发明灵敏度检测
[0103]
以109～100梯度稀释的五种病毒混合质粒标准品为模板，进行taqman rt
‑
qpcr扩增(图6中a
‑
e)，计算该技术体系检测五种病毒的灵敏度。
[0104]
计算检测结果得出，该五重实时荧光定量pcr检测方法的lsv、lmov、cmv、sysv、plamv的检出下限分别为1.33
×
102copies
·
μl
‑1、1.27
×
101copies
·
μl
‑1、1.28
×
101copies
·
μl
‑1、2.33
×
102copies
·
μl
‑1、2.01
×
102copies
·
μl
‑1，结果表明，该方法灵敏度较高。
[0105]
2.本发明检测五种病毒的重复性试验
[0106]
取五种病毒质粒标准品107copies
·
μl
‑1、105copies
·
μl
‑1、103copies
·
μl
‑1混合物作为模板，应用所建立的taqman实时荧光定量pcr进行扩增，验证该方法的重复性。组内重复性试验时，重复3次反应；组间重复性试验时，重复3次反应，间隔1周进行。
[0107]
结果表明(表2)，cq值的变异系数在组内与组间重复性试验中均小于2％，说明该体系重复性良好。
[0108]
表2五重实时荧光定量pcr检测体系的重复性试验
[0109][0110]
实施例7：本发明对田间百合样品检测
[0111]
1)对田间采集的92份百合样品进行总rna提取，进一步反转录，应用本研究建立的多重taqman实时荧光定量rt
‑
pcr方法进行检测。
[0112]
2)结果如(表3)所示，lsv和cmv在92份样品中感染率达到100％，其次是sysy在92份样品中有76份被感染，感染率82.6％，plamv和lmov感染率分别达到78％和66％，全部感染五种病毒的阳性样品占比35.8％，因此，这五种病毒均表现出较高的侵染率。
[0113]
表3多重taqman荧光定量rt
‑
pcr田间检测
[0114][0115]
实施例8：本发明检测五种病毒侵染百合植株的不同组织部位病毒量
[0116]
1)选择十株被五种病毒感染的百合植株，提取根、鳞茎、茎、叶片和花瓣部位(图7)的总rna，进一步反转录，应用本研究建立的多重taqman实时荧光定量rt
‑
pcr方法进行检测。
[0117]
2)不同组织病毒量检测显示plamv和cmv的浓度明显高于lsv、lmov和sysv，sysv在百合中病毒量较低，分布不均(图8中a
‑
e)。
[0118]
综上所述，本发明建立的五重探针法rt
‑
qpcr检测方法，具有灵敏度高、高通量、适用范围广等优越性，可对百合样品中的lsv、lmov、cmv、sysv、plamv进行准确高效检测，以用于这五种病毒的长期监测预警和流行趋势研究。
[0119]
本发明提供了一种快速鉴定感染五种病毒百合植株的引物对、探针、试剂盒以及方法，根据lsv、lmov、cmv、sysv、plamv的外壳蛋白基因(coat protein，cp)的保守序列设计特异性检测引物，通过对引物浓度、探针浓度和反应退火温度进行优化，建立了以lsv
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f/r/probe、lmov
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f/r/probe、cmv
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f/r/probe、sysv
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f/r/probe、plamv
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f/r/probe为特异引物和探针，引物和探针最适浓度为20μmol
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‑1，最适退火温度为55.9℃的高效五重实时荧光定量pcr检测技术。本发明建立的五重实时荧光定量pcr检测方法具有灵敏度高、无污染、适用范围广等优越性，可对侵染百合的五种病毒进行准确高效检测，并用于长期监测预警和流行趋势研究，具有广阔的应用前景。
[0120]
利用本发明所述技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。