一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒的制作方法

一种rpa可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌o157:h7的检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种腹泻性病原菌的提取检测试剂盒，特别是涉及一种出血性大肠埃希氏菌o157:h7的检测试剂盒。


背景技术：

2.出血性大肠埃希氏菌o157:h7(enterohemorrhagic escherichia coli，ehec o157:h7)是肠出血性大肠杆菌常见的血清型，以污染食物和水为主要传播途径。在世界各地都有不同规模的ehec o157:h7爆发和流行，每年有280万人感染，因此在世界范围内都受到关注。感染ehec o157:h7可以引起病人腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征，甚至死亡，死亡率可以达5％-10％。此外，ehec o157:h7的致病量很低，食入不足10个细菌就能致病。而ehec o157:h7的生存能力非常强，即使在人类食物链中遇到各种恶劣条件依然存活，使其可以在食物中长期存在。目前对ehec o157:h7的感染机制尚不完全清楚，且临床上缺乏有效的治疗方法，因此建立快速且灵敏检测ehec o157:h7的方法，对预防和控制ehec o157:h7在环境和食品中的传播具有重要意义。
3.目前对ehec o157:h7的检测方法有很多种，检测ehec o157:h7的常用方法包括传统细菌检测法、免疫学分析法、分子生物学检测、微流控传感器检测法等。虽然这些方法使用较广泛，但传统细菌检测法分析时间通常需要2～3d，耗时耗力；免疫学分析法虽然缩短，但样品预处理时间长，易被污染，也容易出现假阳性结果；相对于传统检测方法，核酸检测方法有诸多优势，比如pcr检测的特异性、敏感性都很好，但是检测速度依然在120min左右，而且需要依赖昂贵的仪器设备。
4.现行的国家标准gb4789.6-2016，其方法是先对样品增菌，然后用平板法进行多次筛选及生化试验鉴别，最后用pcr进行确认试验，操作繁琐且周期很长，而且需要精准昂贵的pcr仪和完善的实验环境，限制了在基层实验室和现场的应用。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明根据ehec o157:h7的rfbe基因保守序列，设计rpa检测引物，运用sybr green i作为核酸显色剂，建立可视化rpa检测方法，并检测其特异性和敏感性，本研究建立的方法能够在现场快速检测ehec o157:h7，不需要复杂的仪器设备且操作简单、灵敏度高，可以在医院、口岸、食品监测现场以及一些基层实验室等进行应用。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种rpa可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌o157:h7的检测试剂盒包括：ehec o157:h7浓度参照管、ehec o157:h7阳性对照标准品、ehec o157:h7阴性对照标准品、样品处理管、检测管、缓冲液i、缓冲液ii、显色剂；所述ehec o157:h7浓度参照管为装有5管不同颜色液体的pcr 8联排管；所述ehec o157:h7阳性对照标准品为ehec o157:h7标准菌株基因组dna的溶液，其浓度为10-2ng/μl-100ng/μ
l，优选1ng/μl；所述ehec o157:h7阴性对照标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述样品处理管为包含100μl-500μl的ehec o157:h7核酸提取试剂的无菌ep管；所述检测管为包含rpa通用反应试剂冻干制剂的twistamp反应管；所述缓冲液i为含有ehec o157:h7检测上游引物f2和ehec o157:h7检测下游引物r2的rpa通用反应缓冲液，所述缓冲液i中含有ehec o157:h7检测上游引物f2浓度为0.28μm-0.85μm；所述ehec o157:h7检测下游引物r2浓度为0.28μm-0.85μm；所述缓冲液ii为含有280mm醋酸镁的溶液；所述显色剂为sybr green i溶液，其浓度为100
×‑
10000
×
之间。
7.优选地，所述ehec o157:h7浓度参照管获取方法为：按照本发明检测待测样品中的ehec o157:h7的步骤检测ehec o157:h7基因组dna浓度为10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl的三个样品以及ehec o157:h7阴性对照标准品、ehec o157:h7阳性对照标准品，检测完成后得到5个带颜色的检测管，参照上述检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入pcr 8联排管的5个孔中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、阴性、阳性，整体作为ehec o157:h7浓度参照管；所述ehec o157:h7浓度参照管中的液体容量为50μl-200μl，优选为200μl；所述5个带颜色的检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；所述本发明检测待测样品中的ehec o157:h7的步骤为：(1)待测样品核酸提取；(2)配制本发明的待测样品的检测体系：33.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀；将2μl的显色剂滴加在检测管的盖子内侧上；(3)盖上检测管盖子，将检测管放置25℃-45℃中反应10min-25min；(4)结果检测：将检测管上下颠倒，充分混匀检测管中液体；检测管在室温放置1min-5min；每次检测反应均同步检测ehec o157:h7阳性对照标准品、ehec o157:h7阴性对照标准品各一份；(5)结果判读：首先检测ehec o157:h7阳性对照标准品的检测管，比对ehec o157:h7浓度参照管，与ehec o157:h7浓度参照管中标注为“阳性”的管的颜色一致为绿色，且检测ehec o157:h7阴性对照标准品的检测管比对ehec o157:h7浓度参照管，与ehec o157:h7浓度参照管中标注为“阴性”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样品的检测管比对ehec o157:h7浓度参照管，颜色为橙红色且与标注为“阴性”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样品的检测管颜色为绿色且与ehec o157:h7浓度参照管中标注为“阳性”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度大于10-3
ng/μl；检测待测样品的检测管颜色为黄绿色，且与ehec o157:h7浓度参照管中标注为“10-4
ng/μl”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度接近10-4
ng/μl；检测待测样品的检测管颜色为浅黄绿色，且与ehec o157:h7浓度参照管中标注为“10-5
ng/μl”的管的颜色相近判断为阳性，同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度接近10-5
ng/μl；所述步骤(1)待测样品核酸提取的具体操作为：1)待测样品为液体时每份样品取100μl-500μl，待测样品为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样品取100mg-500mg，充分剪碎；2)所述待测样品加入样品处理管，充分混匀；3)样品处理管放置90℃-100℃孵育5min-25min；4)将样品处理管12000g离心，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
8.优选地，所述本发明的待测样品核酸提取步骤的1)中，优选的，所述待测样品的取样量与样品处理管内的ehec o157:h7核酸提取试剂的用量相同；更优选的，所述样品处理
管中装有200μl的ehec o157:h7核酸提取试剂；更优选的，所述待测样品为液体时每份样品取200μl，待测样品为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样品取200mg。
9.优选地，所述待测样品核酸提取步骤3)中，更优选的，100℃孵育10min；待测样品核酸提取步骤4)中，更优选的，12000g离心3min。
10.优选地，所述本发明检测待测样品中的ehec o157:h7的步骤(3)中更优选的温度为35℃；其中，优选的反应时间为10min-25min。
11.优选地，所述所述本发明检测待测样品中的ehec o157:h7的步骤(3)反应时间和步骤(4)的检测管在室温放置时间，总计为15min。
12.优选地，所述ehec o157:h7阳性对照标准品获取方法：按照通用细菌基因组dna提取试剂盒操作提取ehec o157:h7标准菌株基因组dna，从细菌样品中获得dna，溶于te溶液或无菌去离子水中，检测核酸浓度后，用te溶液或无菌去离子水稀释ehec o157:h7标准菌株基因组dna浓度为10-2
ng/μl-100ng/μl，更优选的稀释ehec o157:h7标准菌株基因组dna浓度为1ng/μl。
13.优选地，所述样品处理管中ehec o157:h7核酸提取试剂为：0.5mol/lnaoh、2％浓度的chelex-100、0.05mol/l的trishcl，三者以1:1:1的体积比例配制。
14.优选地，所述ehec o157:h7检测上游引物f2序列为:5'-aactattactacaggtgaaggtggaatggt-3'(seq id no3)，所述ehec o157:h7检测下游引物序列r2为:5'-aatcatcagcttgttctaactgggctaatc-3'(seq id no 4)。
15.优选地，所述待测样品的检测体系优选为50μl的体系，体系为：12μl提取待测样品后得到的待测核酸、33.5μl缓冲液i、2.5μl缓冲液ii、2μl的显色剂；共50μl，所述缓冲液i为含有0.7μm的ehec o157:h7检测上游引物f2和0.7μm的ehec o157:h7检测下游引物r2的rpa通用反应缓冲液，显色剂为含有1000
×
的sybr green i溶液。
16.如上所述，本发明的一种rpa可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌o157:h7的检测试剂盒，具有以下有益效果：
17.(1)核酸提取过程和核酸扩增过程对仪器要求低，一个水浴锅或热水壶和一台离心机即可能够满足，食品监督、快速检测现场和基层实验室都可以满足条件；(2)能特异性的检测ehec o157:h7，且与其他腹泻病原体无交叉反应；(3)检测ehec o157:h7灵敏度好，检测下限可以达到10-5
ng/μl，是pcr检测10-100倍；(4)核酸提取效率高，不会受到腹泻时的粪便污染影响ehec o157:h7的核酸提取，且核酸检测敏感性高，检测效率好(5)本发明核酸提取简单、检测步骤少、判读方法简单，对操作员的要求低；(6)本发明检测样品中的ehec o157:h7，从核酸提取到结果判读能在20min-60min内完成，满足敏感性特异性的同时比其他方法快速很大；(7)结果判读简单，肉眼直接判读，且时间放置越长，显色效果越好，结合对比ehec o157:h7浓度参照管，可以判断样品中的ehec o157:h7浓度，不会因为浓度太低而判读不准，判读成假阴性。
附图说明
18.图1显示为本发明方法用不同扩增引物检测ehec o157:h7的电泳结果，其中m为marker，1-5：1-5号引物扩增产物，6：空白对照。
19.图2显示为本发明方法用不同扩增温度检测ehec o157:h7的电泳结果，其中m：
marker，1-5：4℃、15℃、25℃、35℃、45℃。
20.图3显示为本发明方法用不同扩增时间检测ehec o157:h7的电泳结果，其中m：marker，1-5：5min、10min、15min、20min、25min
21.图4显示为本发明方法用rpa扩增检测不同菌株的电泳结果，其中m：marker，1-6：志贺氏菌、ehec o157:h7、沙门氏菌、副溶血弧菌、粪肠球菌、菌株混合液
22.图5显示为本发明方法用rpa扩增检测不同浓度ehec o157:h7核酸的电泳结果，其中m：marker，1-8：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl
23.图6显示为用不同浓度核酸检测pcr扩增敏感性的电泳结果，其中m：marker，1-8：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl
24.图7显示为本发明方法用不同浓度sybr green i检测ehec o157:h7的检测结果，其中n：阴性对照，1-5：1.25μl sybr green i(100
×
)、0.5μl sybr green i(1000
×
)、1μl sybr green i(1000
×
)、2μl sybr green i(1000
×
)、4μl sybr green i(1000
×
)。
25.图8显示为本发明方法检测不同菌株的检测结果，其中n：阴性对照，1-6：志贺氏菌、ehec o157:h7、沙门氏菌、副溶血弧菌、粪肠球菌、菌株混合液
26.图9显示为本发明方法检测不同浓度ehec o157:h7核酸的检测结果，其中n：阴性对照，1-8：10-5
ng/μl、10-4
ng/μl、10-3
ng/μl、10-2
ng/μl、10-1
ng/μl、1ng/μl、10ng/μl、100ng/μl。
27.图10为本发明方法检测ehec o157:h7样品的检测流程示意图
具体实施方式
28.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
30.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种rpa可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌o157:h7的检测试剂盒，包括：ehec o157:h7浓度参照管、ehec o157:h7阳性对照标准品、ehec o157:h7阴性对照标准品、样品处理管、检测管、缓冲液i、缓冲液ii、显色剂；
31.具体的，所述ehec o157:h7浓度参照管为装有不同颜色液体的pcr 8联排管；
32.具体的，所述ehec o157:h7浓度参照管为装有5管不同颜色液体的pcr 8联排管；
33.具体的，所述ehec o157:h7阳性对照标准品为ehec o157:h7标准菌株基因组dna的溶液，其浓度为10-2ng/μl-100ng/μl，优选1ng/μl；
34.具体的，所述ehec o157:h7阴性对照标准品为不含有核酸的无菌去离子水；
35.具体的，所述样品处理管为包含100μl-500μl的ehec o157:h7核酸提取试剂的无菌ep管；
36.具体的，所述检测管为包含rpa通用反应试剂冻干制剂的twistamp反应管；
37.具体的，所述缓冲液i为含有ehec o157:h7检测上游引物f2和ehec o157:h7检测
500mg，充分剪碎；2)所述待测样品加入样品处理管，充分混匀；3)样品处理管放置90℃-100℃孵育5min-25min；4)将样品处理管12000g离心，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
46.具体的，所述本发明的待测样品核酸提取步骤的1)中，优选的，所述待测样品的取样量与样品处理管内的ehec o157:h7核酸提取试剂的用量相同；更优选的，所述样品处理管中装有200μl的ehec o157:h7核酸提取试剂；更优选的，所述待测样品为液体时每份样品取200μl，待测样品为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样品取200mg。
47.具体的，所述所述待测样品核酸提取步骤3)中，更优选的，100℃孵育10min；待测样品核酸提取步骤4)中，更优选的，12000g离心3min。
48.具体的，所述所述本发明检测待测样品中的ehec o157:h7的步骤(3)中更优选的温度为35℃；其中，优选的反应时间为10min-25min。
49.具体的，更优选所述本发明检测待测样品中的ehec o157:h7的步骤(3)反应时间和步骤(4)的检测管在室温放置时间，总计为15min。
50.具体的，所述ehec o157:h7阳性对照标准品获取方法：按照通用细菌基因组dna提取试剂盒操作提取ehec o157:h7标准菌株基因组dna，从细菌样品中获得dna，溶于te溶液或无菌去离子水中，检测核酸浓度后，用te溶液或无菌去离子水稀释ehec o157:h7标准菌株基因组dna浓度为10-2
ng/μl-100ng/μl，更优选的稀释ehec o157:h7标准菌株基因组dna浓度为1ng/μl。
51.具体的，所述样品处理管中ehec o157:h7核酸提取试剂为：0.5mol/l naoh、2％浓度的chelex-100、0.05mol/l的trishcl，三者以1:1:1的体积比例配制。
52.具体的，所述ehec o157:h7检测上游引物f2序列为:5'-aactattactacaggtgaaggtggaatggt-3'(seq id no3)，所述ehec o157:h7检测下游引物序列r2为:5'-aatcatcagcttgttctaactgggctaatc-3'(seq id no 4)。
53.具体的，所述待测样品的检测体系优选为50μl的体系，体系为：12μl提取待测样品后得到的待测核酸、33.5μl缓冲液i、2.5μl缓冲液ii、2μl的显色剂；共50μl，所述缓冲液i为含有0.7μm的ehec o157:h7检测上游引物f2和0.7μm的ehec o157:h7检测下游引物r2的rpa通用反应缓冲液，显色剂为含有1000
×
的sybr green i溶液。
54.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
55.实施例一
56.请参阅图1，本发明筛选对ehec o157:h7特异性高、灵敏性强的扩增引物
57.从ncbi数据库中检索到ehec o157:h7的rfbe基因序列，通过比对数据库中已有序列，选择相对保守区域，利用primer premier 5.0软件，参照twistdx公司说明书上的引物设计原则设计引物，通过在ncbi数据库中blast比对，选出5对可扩增出rfbe基因序列的引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
58.样品处理管：配制0.5mol/lnaoh，配制2％浓度的chelex-100，配制0.05mol/l的trishcl，以1:1:1的体积比例将上述3种溶液进行混合，充分混匀，配制成为ehec o157:h7
核酸提取试剂；在无菌ep管中加入上述ehec o157:h7核酸提取试剂200μl，作为ehec o157:h7的样品处理管。
59.核酸制备：以ehec o157:h7标准菌株的培养菌液为待测样品，取菌液200μl，加入样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的ehec o157:h7基因组dna。将ehec o157:h7基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μl，即为待测核酸。
60.缓冲液ii：为含有280mm醋酸镁的溶液。
61.配制rpa扩增反应体系50μl一共5份：30.5μlrpa通用反应缓冲液加入到检测管，吹打混匀；分别加入10μm上游引物2.5μl，加入10μm下游引物2.5μl，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。
62.rpa扩增反应：37℃下反应扩增40min；
63.结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μl扩增产物进行检测，3v/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
64.同步检测ehec o157:h7阴性对照标准品一份；
65.以ehec o157:h7标准菌株的培养菌液为待测样品，对设计的5对引物进行扩增的电泳结果见图1，所设计引物的扩增条带与目的条带大小一致，且扩增条带单一、清晰、无弥散、无拖尾。结果说明这几对引物扩增效率高，可以被准确检测到。根据twistdx公司的rpa说明书，建议rt-pcr产物长度不超过200bp，为后续设计引物探针实验继续进行，因此选择第2对引物对eq id no 3、seq id no 4作为本发明的特异性引物，扩增产物长度为191bp。
66.表1 ehec o157:h7的rpa扩增引物
[0067][0068]
实施例二
[0069]
请参阅图2-3，本发明方法rpa扩增反应的建立及优化
[0070]
1.优化rpa扩增最佳反应温度
[0071]
以ehec o157:h7标准菌株的培养菌液为待测样品，取菌液200μl加入含有200μl ehec o157:h7核酸提取试剂的样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的ehec o157:h7基因组dna。将ehec o157:h7基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μl，即为待测核酸。
[0072]
配制缓冲液i：首先在ehec o157:h7检测上游引物f2(seq id no 3)粉末中加入适
量rpa通用反应缓冲液，配制成带有0.7μm的上游引物的rpa通用反应缓冲液，再取适量的上述溶液溶解ehec o157:h7检测下游引物r2(seq id no 4)粉末，最终配制成含有0.7μm的ehec o157:h7检测上游引物f2和0.7μm的ehec o157:h7检测下游引物r2的rpa通用反应缓冲液，即为本发明中的缓冲液i，分装后备用。
[0073]
配制rpa检测体系50μl一共5份：35.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。
[0074]
rpa扩增反应：分别在4℃、15℃、25℃、35℃、45℃下各放置一份检测管，反应扩增40min；
[0075]
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μl扩增产物进行检测，3v/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
[0076]
以ehec o157:h7标准菌株的基因组dna为模板，rpa反应管分别在4℃、15℃、25℃、35℃、45℃下扩增的结果见图2，检测结果显示，在扩增温度为15℃时出现微弱的目的扩增条带，随着温度升高目的条带逐渐明亮，在35℃时目的条带最清晰明亮，在45℃下条带变暗，说明温度在15℃时，本发明方法就可以发生反应，在25℃-45℃范围内，本发明方法检测ehec o157:h7标准菌株可以达到比较理想的扩增效果，在35℃时扩增效率最高。
[0077]
2.rpa扩增最短有效反应时间
[0078]
核酸制备：以ehec o157:h7标准菌株的培养菌液为待测样品，取菌液200μl加入含有200μl ehec o157:h7核酸提取试剂的样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的ehec o157:h7基因组dna。将ehec o157:h7基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μl，即为待测核酸。
[0079]
配制rpa检测体系50μl一共5份：35.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。
[0080]
rpa扩增反应：将5份检测管放置在35℃下，分别扩增5min、10min、15min、20min、25min。
[0081]
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μl扩增产物进行检测，3v/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
[0082]
结果：在35℃下分别扩增5min、10min、15min、20min、25min的检测结果见图3，结果显示，在5min时反应不明显，在10min时可以观察到清晰的产物，且随着反应时间的延长，rpa扩增的效果越好，说明至少需要扩增10min以上本发明方法可以达到理想的检测结果。
[0083]
实施例三
[0084]
请参阅图4，检测本发明方法rpa反应的特异性
[0085]
核酸制备：准备志贺氏菌标准菌株溶液、ehec o157:h7标准菌株溶液、沙门氏菌标准菌株溶液、副溶血弧菌标准菌株溶液、粪肠球菌标准菌株溶液、五种标准菌株按照体积1：1：1：1：1比例混合的菌液。以上6种菌液分别为待测样品，各自取菌液200μl加入含有200μl ehec o157:h7核酸提取试剂的样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的基因组dna。将6种基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μl，即为待测核酸。
[0086]
配制rpa检测体系50μl一共6份：35.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；分别加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。
sybr green i(100
×
)、0.5μl sybr green i(1000
×
)、1μl sybr green i(1000
×
)、2μl sybr green i(1000
×
)、4μl sybr green i(1000
×
)滴加在5份检测管的盖子内侧上。
[0103]
阴性对照检测管1份：35.5μl缓冲液i、2.5μl缓冲液ii、12μl ehec o157:h7阴性对照标准品、2μl sybr green i(1000
×
)加入到检测管，吹打混匀。
[0104]
rpa扩增反应：将6份检测管放置在35℃下，扩增10min。
[0105]
结果检测：rpa扩增反应结束后，上下颠倒检测管，充分颠倒混匀液体；室温放置5min，观察颜色变化。
[0106]
结果：在扩增10min后的本发明的检测体系中加入不同浓度的sybr green i，进行可视化检测结果见图7，结果表明阴性对照的检测管为橙红色，其他的5份检测管观察发现50μl的检测体系中加入超过1μl的sybr green i(1000
×
)，检测管的颜色即从橙红色变向绿色，2μl的sybr green i(1000
×
)变色就非常明显。
[0107]
实施例六
[0108]
请参阅图8，检测本发明方法的特异性
[0109]
核酸制备：准备志贺氏菌标准菌株溶液、ehec o157:h7标准菌株溶液、沙门氏菌标准菌株溶液、副溶血弧菌标准菌株溶液、粪肠球菌标准菌株溶液、五种标准菌株按照体积1：1：1：1：1比例混合的菌液。以上6种菌液分别为待测样品，各自取菌液200μl加入含有200μl ehec o157:h7核酸提取试剂的样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的基因组dna。将6种基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为1ng/μl，即为待测核酸。
[0110]
显色剂：含有1000
×
的sybr green i溶液。
[0111]
配制本发明方法的检测体系50μl一共6份：33.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。2μl的显色剂滴加到检测管的盖子内侧上。
[0112]
阴性对照检测管1份：35.5μl缓冲液i、2.5μl缓冲液ii、12μl ehec o157:h7阴性对照标准品、2μl显色剂加入到检测管，吹打混匀。
[0113]
rpa扩增反应：将6份检测管放置在35℃下，扩增10min。
[0114]
结果检测：rpa扩增反应结束后，上下颠倒检测管，充分颠倒混匀液体；室温放置5min，观察颜色变化。
[0115]
结果：分别以志贺氏菌标准菌株、ehec o157:h7标准菌株、沙门氏菌标准菌株、副溶血弧菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、菌株混合液的基因组dna为待测核酸模板，本发明方法的检测结果如图8，除了检测ehec o157:h7和混合菌液的检测管出现黄绿色反应，其他检测管均为橙黄色的阴性结果，说明本发明方法检测的ehec o157:h7特异性好，不会被其他肠道致病菌干扰。
[0116]
实施例七
[0117]
请参阅图9，检测本发明方法的灵敏性
[0118]
核酸制备：以ehec o157:h7标准菌株的培养菌液为待测样品，取菌液200μl加入含有200μl ehec o157:h7核酸提取试剂的样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的核酸。将ehec o157:h7基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μl，再将ehec o157:h7基因组dna进行10倍的倍比稀释，
最终获得基因组dna浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl，即为待测核酸。
[0119]
配制本发明方法的检测体系50μl一共8份：33.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。2μl的显色剂滴加到检测管的盖子内侧上。
[0120]
阴性对照检测管1份：35.5μl缓冲液i、2.5μl缓冲液ii、12μl ehec o157:h7阴性对照标准品、2μl显色剂加入到检测管，吹打混匀。
[0121]
rpa扩增反应：将8份检测管放置在35℃下，扩增10min。
[0122]
结果检测：rpa扩增反应结束后，上下颠倒检测管，充分颠倒混匀液体；室温放置室温放置1min，观察颜色变化。
[0123]
结果：以浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl的ehec o157:h7基因组dna为模板，本发明方法的检测结果见图9，结果表明，当ehec o157:h7的dna浓度为10-5
ng/μl时，反应管与阴性对照相比依然有比较明显的变色反应，检测结果与实施例四的结果一致，本研究建立的可视化rpa检测ehec o157:h7方法，灵敏性达到10-5
ng/μl，至少是标准pcr方法灵敏性的100倍。
[0124]
实施例八
[0125]
请参阅图10，本发明检测样品中检测ehec o157:h7的检测流程，检测本发明方法的重复性
[0126]
核酸制备：以ehec o157:h7标准菌株的培养菌液为待测样品，取菌液200μl加入含有200μl ehec o157:h7核酸提取试剂的样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的核酸。将ehec o157:h7基因组dna进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μl，再将ehec o157:h7基因组dna进行稀释，最终获得基因组dna浓度分别为20ng/μl、2
×
10-1
ng/μl、2
×
10-3
ng/μl，即为3份待测核酸；稀释并获得基因组dna浓度为1ng/μl的液体，即为ehec o157:h7阳性对照标准品。
[0127]
配制本发明的检测体系50μl：33.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。2μl的显色剂滴加到检测管的盖子内侧上。
[0128]
ehec o157:h7浓度参照管：参照待测核酸浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl时本发明方法检测管的颜色，在待测核酸浓度大于10-3
ng/μl时，检测管颜色均呈现绿色，随着浓度升高也没有明显变化，因此根据待测核酸浓度为10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl以及检测ehec o157:h7阴性对照标准品、ehec o157:h7阳性对照标准品时，本发明方法检测完毕后的检测管的颜色，用水溶性染料首先用日落黄染料调配出半透明的橙红色染液，用荧光绿染料调配出半透明的绿色染液，再用橙红色染液和绿色染液配制出5份颜色与待测核酸浓度为10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl以及检测ehec o157:h7阴性对照标准品、ehec o157:h7阳性对照标准品时，本发明方法检测完毕后的检测管的颜色对应、一样且半透明的液体，颜色顺序为依次为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色，取上述5份液体200μl，依次按顺序加入pcr 8联排管的5个孔中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、阴性、阳性；作为ehec o157:h7浓度参照管颜色顺序显示见表2。
[0129]
批间重复性检测：对3份待测核酸，在反应体系相同的条件下，连续3天重复检测，每次检测反应均同步检测ehec o157:h7阳性对照标准品、ehec o157:h7阴性对照标准品各一份；
[0130]
批内重复性检测：对3份待测核酸，在同一反应体系中，同时进行3次重复测定，每次检测反应均同步检测ehec o157:h7阳性对照标准品、ehec o157:h7阴性对照标准品各一份；
[0131]
rpa扩增反应：检测管放置在35℃下，扩增10min。
[0132]
结果检测：rpa扩增反应结束后，上下颠倒检测管，充分颠倒混匀液体；室温放置5min，观察颜色变化。
[0133]
定量判读：检测管，对比ehec o157:h7浓度参照管，颜色相近则ehec o157:h7浓度相近，初步进行判读ehec o157:h7核酸浓度。
[0134]
结果：批间重复性结果显示见表3，结果表明相同浓度待测核酸的连续3天检测结果一致，批内重复性结果见表4，结果表明对相同浓度待测核酸，在同一反应体系中，同时进行3次重复检测结果一致。说明本方法的检测重复性好。
[0135]
表2 ehec o157:h7浓度参照管颜色与浓度对照
[0136][0137]
表3批间重复性检测结果
[0138][0139][0140]
表4批内重复性检测结果
[0141][0142]
实施例八
[0143]
本发明方法检测实验室样品
[0144]
核酸制备：实验室保存10份经参照标准《ws 271-2007感染性腹泻诊断标准》检测为阳性的样品，5份为治疗恢复后再次检测为阴性的样品，一共15份样品用本发明进行检测。取样品200μl加入样品处理管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
[0145]
配制本发明的检测体系50μl：33.5μl缓冲液i加入到检测管，吹打混匀；加入12μl待测核酸，吹打混匀；2.5μl缓冲液ii加入到检测管，吹打混匀。2μl的显色剂滴加到检测管的盖子内侧上。
[0146]
每次检测反应均同步检测ehec o157:h7阳性对照标准品、ehec o157:h7阴性对照标准品各一份；
[0147]
rpa扩增反应：检测管放置在35℃下，扩增10min。
[0148]
结果检测：rpa扩增反应结束后，上下颠倒检测管，充分颠倒混匀液体；室温放置5min，观察颜色变化。
[0149]
定量判读：检测管，对比ehec o157:h7浓度参照管，颜色相近则ehec o157:h7浓度相近，初步进行判读ehec o157:h7核酸浓度。
[0150]
结果：检测实验室样品的结果见表5，结果表明10份阳性样品本发明方法检测也均为阳性，其中5份阴性样品本发明方法检测4份为阴性，1份检测为阳性，核酸浓度10-4
ng/μl-10-5
ng/μl之间。本发明方法比标准pcr方法灵敏性高，且该份样品是通过服药后症状消失，但是不一定粪便中致病菌或致病菌核酸就为阴性，因此判断编号1的样品为阳性。
[0151]
表5 pcr与本发明方法检测结果的比较
[0152][0153][0154]
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0155]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。