一种筛查Di(b-)稀有血型的分子标记及检测方法与流程

一种筛查di(b-)稀有血型的分子标记及检测方法
技术领域
1.本发明属于稀有血型检测技术领域，具体涉及一种筛查di(b-)稀有血型的分子标记及检测方法。


背景技术：

2.diego(di)血型系统是目前43个血型系统中的一员，在国际输血协会(international society of blood transfusion,isbt)中位于第10位。diego血型系统含有23个抗原，其中对偶抗原dia和dib抗原免疫原性较强，是最具有临床意义的一对。
3.dib抗原在不同人种均属于高频抗原，缺失dib抗原的di(b-)表型十分罕见，属于稀有血型，目前亚洲人群中检出率约为0.2％，比“熊猫血”rhd阴性的概率还低一半。这种稀有的di(b-)血型个体一旦输血或妊娠，极易产生抗-dib抗体。抗-dib抗体既可以引起新生儿溶血病，又可以引发溶血性输血不良反应，因此及时发现di(b-)稀有血型并做到抗原匹配性输注是解决临床安全输血问题的关键。
4.由于di(b-)血型的罕见性，抗-dib血清来源困难，目前无商品化的抗-dib抗体，同时不规则抗体筛选和鉴定的谱细胞中也不包含di(b-)表型，导致常规的血清学检测方法无法鉴定个体的diego血型，因此研发一种快速筛选di(b-)血型的分子生物学方法迫在眉睫。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种筛查di(b-)稀有血型的分子标记及检测方法，以实现对稀有血型di(b-)进行特异、灵敏、快速、方便的筛选，确保临床安全用血。
6.本发明首先提供一种检测diego血型的引物对和探针组，其中引物对和探针序列信息如下：
7.正向引物slc4a1 forward：
[0008]5′‑
cttattcacgggcatccaga-3
′
(seq id no:1)
[0009]
反向引物slc4a1 reverse：
[0010]5′‑
cacagtgaggatgaggacgaa-3
′
(seq id no:2)
[0011]
探针slc4a1-p-dia-t：
[0012]5′‑
ccacgctggcct-3
′
(seq id no:3)
[0013]5′
端使用fam基团标记，3
′
端用mgb基团进行标记；
[0014]
探针slc4a1-p-dib-c：
[0015]5′‑
cacgccggcctc-3
′
(seq id no:4)
[0016]
其中探针slc4a1-p-dib-c的5
′
端用vic基团进行标记，3
′
端用mgb基团进行标记。
[0017]
其中探针有两条，根据slc4a1基因2561bp处的不同分别在5
′
端标记不同的荧光基团(t型为蓝色的fam荧光，c型为绿色的vic荧光)，3
′
端均为非荧光猝灭mgb基团。
[0018]
本发明所提供的引物对和探针组可用于制备用于快速筛查di(b-)血型的试剂盒；
[0019]
所述的试剂盒，优选为qrt-pcr taqman mgb探针检测试剂盒。
[0020]
本发明再一个方面提供快速筛查di(b-)血型的qrt-pcr检测方法，包括如下的步骤：
[0021]
1)配制qrt-pcr反应体系
[0022][0023]
2)qrt-pcr反应条件
[0024]
pcr反应条件：94℃ 3min；94℃ 5sec，60℃ 30sec，40cycles。
[0025]
结果描述及判定:仅出现蓝色荧光，即在2561bp处为tt纯合，样品判断为dia纯合基因型，di(a b-)表型；仅出现绿色荧光，即在2561bp处为cc纯合，样品判断为dib纯合基因型，di(a-b )表型；出现绿色和蓝色荧光，即在2561bp处为tc杂合，样本判断为dia/dib杂合基因型，di(a b )表型；无荧光出现，则提示pcr反应失败。筛选di(b-)血型为仅出现蓝色荧光的dia纯合基因型样本。
[0026]
本发明提供一种基于分子生物学的快速筛查di(b-)血型的方法，以实现对罕见的稀有di(b-)血型进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于献血员的快速检测，与pcr法相比，qrt-pcr法敏感度更高，特异性更强，操作简单，不需要进行凝胶电泳，大大缩短了反应时间。同时，由于不存在di(a-b-)血型个体，所以筛选稀有di(b-)血型只需要挑选仅出现蓝色荧光的样本，结果判断简单快速高效。
附图说明
[0027]
图1：快速筛查di(b-)血型的qrt-pcr引物和taqman-mgb探针设计示意图。下划线部分序列是pcr扩增引物，方框标记的核苷酸c是dia与dib的区别，在此核苷酸附近设计探针，分别用蓝色的fam标记t型dia探针和绿色的vic标记c型dib探针。
[0028]
图2：本发明引物和探针的检测结果图。横坐标：fam信号强度值；纵坐标：vic信号强度值；蓝色点：dia纯合子；绿色点：dib纯合子。
具体实施方式
[0029]
申请人研究发现diego血型抗原由位于17号染色体的slc4a1基因编码，共有20个外显子(exon)，而dia抗原和dib抗原的分子区别是单核苷酸突变，在exon 19的2561bp处
dia是碱基t而dib是碱基c。理论上，根据个体dna上此位置的碱基是tc杂合、tt纯合、cc纯合或是基因缺失，会形成di(a b )、di(a b-)、di(a-b )和di(a-b-)四种表型，但由于slc4a1基因参与编码细胞膜带3蛋白(band 3蛋白)，负责维系人体红细胞膜结构和功能的完整性，若基因缺失则个体无法存活，因此目前为止无di(a-b-)血型的健康个体报道，这就导致所筛选di(b-)血型只有di(a b-)一种表型，即exon 19的2561bp处是tt纯合。同时，dia抗原在我国表现频率报道为3％-5％不等，阳性率较低，因此大多数个体的diego血型仅表现为di(a b-)和di(a-b )两种表型，即dna在slc4a1基因exon 19的2561bp处是tt纯合(dia)或cc纯合(dib)。因此，本发明确定采用qrt-pcr的分子方法进行di(b-)血型的快速筛选十分理想。
[0030]
实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qrt-pcr)借助荧光信号检测pcr进程中dna的扩增，可对模板进行定性和定量分析。检测方法可分为sybr green法和taqman探针法，其中taqman探针法特异性更强、灵敏度更高、可重复性更好。而taqman mgb探针的猝灭基团为非荧光猝灭基团(non-fluorescent quencher)，大大降低了pcr反应的荧光本底信号强度，进一步增强了方法的特异性；同时探针上还连接有mgb(minor groove binder)修饰集团，可以提高探针的tm值，因此mgb探针更短，这样不仅设计出灵敏度、特异性更好探针的成功率更高，还降低了合成成本，同时在错配碱基的识别与信噪比方面也有优势。
[0031]
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0032]
实施例1：di(b-)血型检测引物及探针筛选
[0033]
1.提取外周血基因组dna：
[0034]
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取di(a b-)和di(a-b )血型个体(前期已通过dna验证)外周静脉血2-5ml，放入edta-na2抗凝管内，-80℃冻存备用；dna提取使用life公司的dna提取试剂盒，具体操作流程如下：
[0035]
冻存的edta抗凝血在室温融化后，取500μl放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(ph 8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500μl涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。
[0036]
沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50μl，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135μl。涡旋充分混匀，至于4℃30分钟。
[0037]
室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200μl)至一新离心管中。加入冰乙醇500μl，反复震荡离心管，直至白色dna沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向dna沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μl te(ph8.0)，4℃过夜溶解dna。
[0038]
对提取的dna行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测dna纯度及浓度。
[0039]
2.引物和探针设计和筛选
[0040]
通过ncbi查找到人的slc4a1基因(参考序列genbank登录号：ng_007498)，定位于染色体17q12－q21，涵盖了一段18kb的dna片段，包含20个外显子和19个内含子。dia和dib抗原的分子基础是第19外显子2561位上碱基存在t＞c的置换，使得854位的氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸。同时，由于slc4a1基因还参与带3蛋白的组成，是人体所必须的基因，因此不
存在基因缺失，也就是不存在di(a-b-)血型，所以寻找的di(b-)血型个只存在di(a b-)这种情况，这就为qrt-pcr筛选确定了分子基础。
[0041]
使用primer premier 6.0软件进行引物和探针设计，选取得分最高的一组引物和探针，上游引物位于第19外显子2502-2521bp，下游引物位于第19外显子2581-2602bp，扩增产物长度100bp。荧光探针围绕第19外显子2561bp的t/c位置设计，可检测dia基因的t型探针5
′
端标记fam发光基团，可检测dib基因的c型探针5
′
端标记vic发光基团，3
′
端均标记非荧光的mgb基团。引物探针示意图见图1，具体序列如下：
[0042]
正向引物slc4a1 forward
[0043]5′‑
cttattcacgggcatccaga-3
′
(20bp)
[0044]
反向引物slc4a1 reverse：
[0045]5′‑
cacagtgaggatgaggacgaa-3
′
(21bp)
[0046]
探针slc4a1-p-dia-t：
[0047]5′
fam-ccacgctggcct-mgb 3
′
(12bp)
[0048]
探针slc4a1-p-dib-c：
[0049]5′
vic-cacgccggcctc-mgb 3
′
(12bp)
[0050]
引物对和探针的筛选包括如下步骤：
[0051]
(1)配制qrt-pcr反应体系
[0052][0053]
(2)qrt-pcr反应条件
[0054]
pcr反应条件：94℃ 3min；94℃ 5sec，60℃ 30sec，40cycles。
[0055]
3.结果描述及判定:
[0056]
(1)由于不存在slc4a1基因缺失型，因此无扩增曲线情况不存在，如出现无扩增曲线，则提示实验失败。
[0057]
(2)理论上，仅出现蓝色荧光，即在2561bp处为tt纯合，样品判断为dia纯合基因型，di(a b-)表型；出现绿色荧光，即在2561bp处为cc纯合，样品判断为dib纯合基因型，di(a-b )表型；出现绿色和蓝色荧光，即在2561bp处为tc纯合，样本判断为dia/dib杂合基因型，di(a b )表型。
[0058]
(3)由于实验目的是筛选di(b-)血型，因此只需观察出现单一蓝色荧光的情况。
[0059]
质控标准:以测序验证的di(a b-)和di(a-b )样品分别为对照，di(a b-)样本出现单一蓝色荧光，di(a-b )样品出现单一绿色荧光，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。
[0060]
实验结果表明，蓝绿色荧光信号强，分界清楚，引物扩增效率优，满足实验要求(图2)。
[0061]
实施例2：对实际样品的检测应用
[0062]
1.样品收集及核酸提取：
[0063]
随机收集4位献血员(签署知情同意书)外周静脉血2-5ml，放入edta-na2抗凝管内，-80℃冻存备用；实验室之前保存的血清学结果疑似di(a b-)血型个体dna样本4例，-80℃冻存备用。dna提取和检测方法同前。
[0064]
2.鉴定
[0065]
(1)对比方法：采用常规sanger测序法同时将8例样本进行dna直接测序，测序结果与qrt-pcr结果进行对比。
[0066]
(2)检测结果
[0067]
图2的结果显示，采用本发明的qrt-pcr方法检测，4位献血员仅出现vic绿色荧光信号，判定为di(b )血型，与sanger测序结果为dib纯合基因型一致(2561bp处为cc纯合)；4例疑似样本仅出现fam蓝色荧光信号，判定为di(b-)血型，与sanger测序结果为dia纯合基因型一致(2561bp处为tt纯合)，结果准确可信。
[0068]
综上所述，这8份临床样品中，4份可疑样本样品可以快速判定为di(b-)血型，其余4份样品为di(b )血型。
[0069]
本发明中的方法可以快速、准确、高效的鉴定人群中罕见的di(b-)血型，可在献血人群或罕见血型患者家属中进行快速筛查，确保罕见血型个体的用血安全，一定程度上解决了当前我国稀有血型库覆盖率低、征用困难的弊端，满足了临床快速、安全用血，确保了个体的医疗权益。