一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法与流程

1.本技术属于生物技术领域，尤其涉及一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法。


背景技术：

2.寡肽在护肤、保健和医疗等领域具有重要的应用价值，但其工业化合成方式仍然是一个很大的难点。传统的短肽合成方法是基于化学反应合成技术，这种方法需要复杂的反应步骤和剧烈的反应条件，会生成大量的副产物，严重影响降低了寡肽的产量和提高了提纯的难度。这种化学合成方式往往会造成较大的环境污染和产生有毒的副产物。因此，更加环境友好和产物单一的生物合成法在寡肽制备上具有很大的优势。生物合成法利用人工构建的遗传编码信息在宿主中高效快速的产生寡肽产物，具有合成成本低、效率高、副产物少等优势。为了能够将寡肽特异性地分离提纯出来，在设计人工构建的遗传编码信息时，需要在寡肽上游加上亲和标签(如his标签或gst标签)，并在标签和寡肽序列之间加上蛋白酶切割位点。整体的流程包括蛋白表达、菌体破碎、介质富集、目标蛋白洗脱、超滤除盐浓缩、蛋白酶切割、分子筛富集纯化等多道生产工艺，这使得寡肽的生物合成法变得极为繁琐，提高了生产的损耗和成本。因此，更加方便的寡肽生物合成及分离纯化技术，在寡肽的工业化生产上，是迫切的需求。


技术实现要素：

3.鉴于此，本技术提供了一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法，有效解决现有寡肽生物合成方法中存在的纯化困难，操作繁琐和损耗大等问题。
4.本技术提供了一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法，包括：
5.步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽和目标寡肽组成；所述内含肽为产生c末端自切割的蛋白分子；
6.步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌表达所述融合蛋白；
7.步骤3、将表达融合蛋白的宿主菌依次进行破碎和第一次过滤处理，收集含有分子量大于等于10kda总蛋白的第一混合物；
8.步骤4、调节所述第一混合物的ph值小于等于7然后进行孵育以激活所述内含肽进行自切割，得到含有内含肽和目标寡肽的第二混合物；
9.步骤5、将所述第二混合物进行第二次过滤处理，收集含有分子量小于3kda的目标寡肽。
10.具体的，所述目标寡肽为现有常规的寡肽或短肽，如乳四肽或四肽-9等。
11.具体的，所述表达载体质粒可以为原核生物表达载体质粒或真核生物表达载体质粒，优选为原核生物表达载体质粒，将现有常规的原核生物表达载体质粒经过常规酶切和连接与融合蛋白结合，构建得到含有融合蛋白的表达载体质粒。
12.进一步的，所述原核生物表达载体质粒可以为大肠杆菌菌株表达载体质粒。
13.另一实施例中，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个。
14.具体的，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个。
15.另一实施例中，所述融合蛋白的数量可以为1个或复数个，所述融合蛋白的数量为2个时，两个相邻所述融合蛋白间以所述表达载体的核糖体结合位点rbs相隔。
16.另一实施例中，所述内含肽选自ssp dnab、ssp dnae、mtu reca、mth rir1、sce vma、mtuδi-cm和gp41-1中的一种或多种。
17.另一实施例中，步骤2中，采用诱导表达剂诱导所述宿主菌表达所述融合蛋白。
18.具体的，步骤2中，通过强诱导表达环境；是指加入高浓度的诱导表达剂如iptg，来快速大量地产生靶融合蛋白。
19.另一实施例中，步骤3中，所述破碎菌体方法为现有常规的破碎菌体方法，镜检染色直至没有明显的菌体。所述破碎的方式为加热破碎法、裂解液超声破碎法或高压破碎法中的一种。
20.具体的，所述加热破碎法中加热条件为：加热温度为50～70℃，加热时间为30～120min。
21.具体的，所述裂解液超声破碎法采用的裂解液包括20mm tris和500mm nacl，裂解液的ph为8.0，所述裂解液超声破碎法中超声条件为现有常规破碎菌体的超声条件。
22.另一实施例中，步骤3中，所述第一次过滤为：将破碎后宿主菌经过10kda的滤膜。
23.具体的，步骤3中，所述破碎还可以包括离心过滤处理，如12000rpm，4℃离心20min，收集上清，将所述上清经过0.45um滤膜过滤处理。将破碎后宿主菌经过离心过滤处理，有利于菌液经过10kda的滤膜。
24.具体的，步骤3中，将破碎后宿主菌经过离心过滤处理，然后将离心过滤处理的溶液经过10kda的滤膜。
25.另一实施例中，所述滤膜选自10kda的超滤管或/和10kda的超滤膜包。
26.另一实施例中，步骤4中，采用酸性缓冲液调节所述第一混合物的ph值，所述酸性缓冲液选自ph 5～7的磷酸缓冲液和ph 5～7的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、ph 5～7哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液中的一种或多种。所述酸性缓冲液优选为ph 5～6的磷酸缓冲液，其目的是在酸性条件下激活的内含肽自切割活性，释放出目标寡肽。
27.具体的，所述磷酸缓冲液的ph值为5，所述磷酸缓冲液加入体积为所述第一混合物体积的三分之一至十分之一，其目的是在酸性条件下激活的内含肽自切割活性，释放出目标寡肽。
28.另一实施例中，步骤4中，所述孵育的条件为37℃孵育2h或4℃孵育6～14h。
29.另一实施例中，步骤5中，所述第二次过滤处理为：将所述第二混合物经过3kda的滤膜。
30.另一实施例中，所述滤膜选自3kda的超滤管或/和3kda的超滤膜包。
31.为解决目前寡肽的生物合成法存在的缺陷，本技术开发了一种基于过滤工艺的寡肽生物合成及纯化的方案，本技术的方法在设计人工构建的遗传编码信息时，在寡肽上游
连接有内含肽序列，通过生物合成产生内含肽-寡肽融合蛋白。在破碎菌体后，先利用第一轮过滤技术去掉10kda以下的蛋白分子，加入ph调节缓冲液，完成内含肽的自切割和寡肽的释放。最后利用第二轮过滤技术获得小于3kda的蛋白分子，即可高效大量地获得目标寡肽。这种寡肽生物合成及纯化方案仅需要经过蛋白表达、菌体破碎、第一轮过滤、酸性环境释放寡肽和第二轮过滤技术共五个步骤，避免了传统生物合成法中复杂的蛋白纯化和蛋白酶切割方法，极大地提高了寡肽的生产效率和生产品质，适用于寡肽类物质的工业化大规模生产。
附图说明
32.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
33.图1为本技术实施例提供的基于过滤法的寡肽合成及纯化方法的原理图，其中，图1左边从上到下为调节总蛋白ph大于等于8，然后将总蛋白过10kda滤膜，获得上层截留液蛋白(即大于10kda蛋白)，接着调节上层截留液蛋白ph小于等于6.5以驱动内含肽切割，获得游离寡肽溶液，然后将游离寡肽溶液过3kda滤膜，收集下层流通液蛋白(即小于3kda蛋白)，最终获得寡肽，寡肽进行hplc分析。图1右边从上到下为总蛋白的分子量为15kda～30kda，过10kda滤膜后获得的上层截留液蛋白的分子量为15kda～30kda，调节上层截留液蛋白ph至酸性后获得寡肽和内含肽，过3kda滤膜后获得的下层流通液蛋白为小于3kda的寡肽；
34.图2为本技术实施例提供的合成纯化后寡肽1的hplc结果图，其中横坐标为时间(min)，纵坐标为电信号(mau)；
35.图3为本技术实施例提供的合成纯化后寡肽2的hplc结果图，其中横坐标为时间(min)，纵坐标为电信号(mau)；
36.图4为本技术实施例提供的合成纯化后寡肽3的hplc结果图，其中横坐标为时间(min)，纵坐标为电信号(mau)；
37.图5为本技术实施例提供的合成纯化后寡肽4的hplc结果图，其中横坐标为时间(min)，纵坐标为电信号(mau)。
具体实施方式
38.本技术提供了一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法，用于解决现有技术中寡肽生物合成方法存在的纯化困难，操作繁琐和损耗大的技术缺陷。
39.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
40.其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
41.以下实施例中所用的寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3和寡肽-4为现有成熟的寡肽，本技术不对寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3和寡肽-4作具体赘述。
42.实施例1
43.本技术实施例提供了一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法，基于过滤法的寡肽
合成及纯化方法原理请参阅图1，具体步骤包括：
44.1)融合蛋白表达：按照表1的融合蛋白中内含肽种类和寡肽种类，采用分子生物学方法构建含有不同融合蛋白的表达载体质粒，其中，寡肽连接在内含肽的c末端，即得到含有融合蛋白1的表达载体质粒、含有融合蛋白2的表达载体质粒、含有融合蛋白3的表达载体质粒和含有融合蛋白4的表达载体质粒，将这四种质粒转入大肠杆菌中。
45.将表达不同的内含肽-寡肽融合蛋白的大肠杆菌菌株在lb培养基中扩大培养中od
600
值为0.8，加入1/20体积1m tris-hcl缓冲液(ph 8.5)和终浓度为0.5mm的iptg，37℃200rpm继续培养5h。10000rpm，4℃离心20min，收集菌体。菌体用pbs清洗2次，使四种大肠杆菌分别表达四种不同的融合蛋白。
46.2)菌体破碎：分别将四种大肠杆菌菌体重悬在裂解液(20mm tris，500mmnacl，ph 8.0)中，使用超声进行菌体破碎，镜检染色直至没有明显的菌体。12000rpm，4℃离心20min，收集上清，0.45μm滤膜过滤。
47.3)第一轮过滤：将裂解液通过10kda滤膜(使用10kda超滤管)，直至截留液体积小于原来体积的二十分之一。加入20倍体积的裂解液，将裂解液通过10kda滤膜(使用10kda超滤管)，直至截留液体积小于原来体积的二十分之一，重复3次。收集截留液(即为含有分子量大于等于10kda总蛋白的第一混合物)。
48.4)内含肽切割：将上述截留液加入三分之一至十分之一体积的ph 5.0的0.5m磷酸缓冲液，混匀后37℃孵育2h以激活内含肽进行自切割，得到含有内含肽和不同寡肽的第二混合物。
49.5)第一轮过滤：将上述第二混合物通过3kda滤膜(使用3kda膜包)，直至截留液体积小于原来体积的二十分之一。收集通过3kda滤膜的流通液。hplc检测流通液中的寡肽含量和纯度。
50.表1：不同寡肽的纯度和产量
51.项目融合蛋白1融合蛋白2融合蛋白3融合蛋白4内含肽种类sspdnabsspdnabmtuδi-cmmtuδi-cm寡肽种类寡肽-1寡肽-2寡肽-3寡肽-4纯度95.6％91.3％89.4％94.7％产量mg/l2.91.71.81.5
52.hplc结果见附图2～4和表1，对于不同种类的寡肽，本技术的方法都具有很好的产量和纯度。这说明本技术提供的寡肽纯化工艺具有操作简单、成本低、产量高和纯度好等明显的优势。
53.可见，传统的寡肽生物合成方法需要利用亲和标签进行亲和纯化，整个纯化步骤繁琐，需要预处理、挂柱、洗杂、洗脱、除盐等多个步骤，适合小量的蛋白生产，在大量蛋白的工业化生产上难以应用，且整个过程导致蛋白损耗较多，生产成本较高。本技术不需要蛋白纯化步骤，仅仅需要两步过滤即可，这个在大规模工业化生产上比较容易实现，因此这种方法的生产工艺在放大应用上更好。
54.其次，传统的寡肽生物合成方法需要利用蛋白酶切割亲和标签，对于寡肽几个氨基酸的底物，蛋白酶切割的效率和亲和性较差，且在切割过程中会引入额外的蛋白酶污染，导致寡肽的纯度不够。此外，蛋白酶切割往往会在寡肽的n端留下1～2个氨基酸残基，这些
残基对于只有几个氨基酸的寡肽而言，可能会很大程度上影响寡肽的性质和功能。因此蛋白酶切割的方式不太适用于寡肽的生产和纯化上。本技术选用了能够进行自切割的内含肽，内含肽的自切割只需要将ph调至酸性即可，无需加入额外的蛋白酶，保证了寡肽的纯度。此外，内含肽的切割不会在寡肽的n端留下氨基酸残基，使得获得的短肽更符合原本的结构和性质。
55.以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。