被修饰以用于生产复合酶的木霉属真菌菌株的制作方法

1.本发明涉及一种木霉属(trichoderma)新菌株，包括能够提高复合酶的产量的基因修饰。


背景技术：

2.纤维素酶或半纤维素酶是构成能够作用于纤维素物质并促进其水解的复合物的酶。此类酶是在糖的释放中作用的高特异性生物催化剂，由于葡萄糖有可能转化为乙醇，所以葡萄糖是引起最大工业兴趣的一种糖。纤维素酶的高效生产对于生物精炼的定义很重要，生物精炼使用可再生木质纤维素物质生产具有高附加值的燃料和化学品。
3.由于其工业重要性，近几十年来，已经公布了关于影响这些酶及其理想培养基的生产的因素的若干研究。这是因为在从木质纤维素物质生产乙醇的背景下，纤维素酶是影响该过程的输入，并且可以代表工厂的重大运营成本。
4.为了提高酶生产的水平，可以使用不同的技术，其中有关纤维素酶的最常见技术是通过经典(随机)突变或通过基因表达来选择真菌。几十年来，该经典突变一直应用于诸如木霉属(trichoderma)的真菌菌株。
5.在这个意义上，里氏木霉(trichoderma reesei)(martinez d.等人(2008)，生物质降解真菌里氏木霉的基因组测序和分析(genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus trichoderma reesei)nat biotechnol.26,553-560)，一种嗜温丝状真菌，红褐肉座菌(hypocrea jecorina)真菌的无性型，已经生成了若干具有特定性质的菌株，其中报道最多的是rut c30菌株(koike h.等人(2013)，里氏木霉菌株的比较基因组学分析(comparative genomics analysis of trichoderma reesei strains.)ind.biotech.9(6):352-367)。由于cre1基因的突变(使得在酶的表达期间，细胞对葡萄糖的分解代谢阻遏作用更小)和内质网数量的增加(促进蛋白质的o糖基化速率提高)，该菌株的纤维素分解潜力提高。
6.已经证明，木霉属可用作宿主细胞以用于重组生产具有生物活性的多肽。一些出版物教导了通过中断或过表达一个或多个特定基因进行基因修饰，以寻求提高其活性(国际出版物wo9823642、wo17177289、wo11075677、wo10022518等)。
7.然而，由此类真菌生产的复合酶的活性表现仍然是一个挑战，因此非常需要结合基因修饰的选择的新菌株来提高复合酶的产量。


技术实现要素：

8.本发明涉及一种木霉属(trichoderma)新菌株，包括能够提高复合酶的产量的基因修饰选择，至少包括：如seq id no.1所定义的转录因子xyr1的过表达；根据seq id no.2的ace1基因的中断；根据seq id no.3的slp1基因的中断；以及根据seq id no.4的来自埃默森罗萨氏菌(rasamsonia emersonii)的cel3a基因的表达。
9.另外，根据本发明的所述木霉属新菌株可以包括：根据seq id no.5的pep1基因的
中断；和/或根据seq id no.6的来自黑曲霉(aspergillus niger)的suca基因的表达。
附图说明
10.图1示出了称为ctbe_r2(对比)和ctbe_r4(根据本发明)的真菌菌株通过在含有糖蜜、酵母提取物和硫酸铵的生物反应器中培养而进行的酶的生产。
11.图2示出了由称为ctbe_r2(对比)和ctbe_r4(根据本发明)的真菌通过在含有糖蜜、酵母提取物和硫酸铵的生物反应器中培养而生产的复合酶的β-葡糖苷酶活性。
具体实施方式
12.木霉属(trichoderma)新菌株可以由基因缺失技术来进行工程改造，以消除或减少基因表达。基因缺失技术允许部分或完全移除基因，从而消除其表达。在此类方法中，基因缺失由同源重组通过使用质粒来执行，该质粒已经被工程改造以连续地包含基因侧翼的5'和3'区域。
13.这些木霉属新突变体也可以通过引入、替换、过表达和/或移除基因中的一个或多个(若干)核苷酸或其转录或翻译所需的控制序列来进行工程改造。例如，核苷酸可以被插入或移除以用于引入终止密码子、移除起始密码子或从开放阅读矩阵中置换。
14.基因中断技术也是可用的。木霉属新菌株也可以通过将破坏性核酸结构插入到基因中而被工程改造，该破坏性核酸结构包括与该基因同源的核酸片段，该核酸片段将产生同源区的复制品并且合并复制区域之间的dna结构。
15.所有这些修饰都可以通过传统诱变技术执行(botstein和shortle，体外诱变的策略与应用(strategies and applications of in vitro mutagenesis)，科学，1985年9月20日；229(4719):1193-201等)。
16.为了提供在复合酶生产中表现出改进性能的菌株，开发了一种木霉属新菌株，该菌株包括以下具体基因修饰：如seq id no.1所定义的转录因子xyr1的过表达；根据seq id no.2的ace1基因的中断；根据seq id no.3的slp1基因的中断；以及根据seq id no.4的来自埃默森罗萨氏菌(rasamsonia emersoni)的cel3a基因的表达。
17.根据本发明所述的木霉属菌株可以是任何木霉属菌株，诸如野生型木霉属菌株或其突变体。
18.根据本发明所述的新菌株可以无任何限制地通过本领域技术人员已知的传统诱变技术生产。
19.在特定实施例中，该菌株是被修饰以包含根据本发明的至少四种具体基因修饰的里氏木霉(trichoderma reesei)。
20.在更特定的实施例中，该菌株是里氏木霉rutc30(koike h.等人2013.里氏木霉菌株的比较基因组学分析(comparative genomics analysis of trichoderma reesei strains.)ind.biotech.9(6):352-367)。由于cre1基因的突变(使得在酶的表达期间，细胞对葡萄糖的分解代谢阻遏作用更小)和内质网数量的增加(促进蛋白质的o糖基化速率提高)，该菌株的纤维素分解潜力提高。
21.里氏木霉xyr1转录因子是木质纤维素酶(纤维素酶和半纤维素酶)——更具体地说是木聚糖酶的表达和分泌所必需的，并且该基因的组成型表达增加了真菌分泌的混合物
的酶活性。在本发明的特定实施例中，xyr1基因在rut-c30菌株中的pdc1基因的表达控制下被放置。
22.该ace1基因已经被标识为阻遏里氏木霉中的(半)纤维素酶的生产的转录因子。缺失该基因提高了酶产量。
23.另一方面，蛋白酶的缺乏是酶制剂稳定性的决定性因素。为此，已经研究了从(半)纤维素酶生产真菌的基因组中移除蛋白酶编码基因。来自里氏木霉的slp1基因是一种蛋白酶编码基因并且在酶的全局生产中表现出增益。在现有技术中尚未报道slp1基因缺失对真菌生产率的单独影响。
24.转而，来自埃默森罗萨氏菌的cel3a基因(β-葡糖苷酶)的表达具有对β-葡糖苷酶的活性的显著影响，这对于木质纤维素物质的有效降解至关重要。在现有技术中已经频繁报道了里氏木霉分泌的复合酶中的低β-葡糖苷酶活性，并且其仍然是要克服的技术挑战。
25.令人惊讶的是，本发明提供了木霉属新菌株，其中具体基因修饰的选择极大地提高了β-葡糖苷酶活性。
26.在另一实施例中，本发明额外地设想了以下基因修饰中的一种或多种：根据seq id no.5的pep1基因的中断；根据seq id no.6的来自黑曲霉(aspergillus niger)的suca基因的表达。
27.该pep1基因的中断编码了天冬氨酸蛋白酶及其失活，与里氏木霉中的木质纤维素酶和异源酶的分泌的增长有关。
28.关于黑曲霉的suca基因的表达，该基因编码了转化酶，该转化酶是一种催化蔗糖水解为果糖加葡萄糖的酶，从而允许将甘蔗糖蜜用作用于生产酶的碳源。
29.在本发明的范围内，术语“修饰”指的是，通过本领域技术人员已知的任何技术，在基因或其转录或翻译所需的控制序列中引入、替换或移除一个或多个(若干)核苷酸，或在选定的木霉属菌株中的基因中断、基因缺失、基因过表达。
30.根据本发明的木霉属菌株可以在营养培养基中培养，以用于使用本领域已知的方法生产感兴趣的多肽。例如，在特定实施例中，在没有任何限制的情况下，培养基可包括酵母(例如未自溶的全酵母(酿酒酵母))、至少一种碳源，诸如甘蔗糖蜜和硫酸铵。
31.以下示例无任何限制地描述了本发明的一些特定实施例，并且旨在展示其优点。
32.实施例1.对酶产量和β-葡糖苷酶活性的影响的对比结果
33.实施例
34.通过本领域技术人员已知的传统诱变技术修饰里氏木霉rut c30菌株，以缺失rut-c30菌株中的ace1基因。该缺失与含有v821f突变的xyr1基因的组成型表达同时进行，从而生成称为ctbe_r2的真菌(对比)。执行两种修饰以增长真菌的酶产量。
35.根据本发明，ctbe_r2菌株中蛋白酶slp1的缺失与来自埃默森罗萨氏菌的β-葡糖苷酶cel3a的插入同时进行，从而生成称为ctbe_r4的真菌(本发明)。
36.两种菌株在含有糖蜜、酵母提取物和硫酸铵的生物反应器中分别培养，呈现出图1和图2中所示的结果。
37.如图1所示，真菌ctbe_r4(本发明)的酶产量与真菌ctbe_r2(对比)的酶产量相似，这表示所进行的修饰并未改变真菌的生产率。
38.然而，如图2所示，真菌ctbe_r4(本发明)生产的复合酶展示出比真菌ctbe_r2(对
比)生产的复合酶高42倍的β-葡糖苷酶活性。
39.本领域技术人员将很容易知道如何通过文本中包含的教导和所呈现的示例来评估本发明的优势，并且在不脱离本发明的范围的情况下提出变型和等效替代实施例，如本文权利要求中所定义的。