一种编辑CYP4F8基因的系统及其用途的制作方法

一种编辑cyp4f8基因的系统及其用途
技术领域
1.本发明属于基因工程和基因遗传修饰技术领域，涉及基于crispr/cas9技术的cyp4f8基因的编辑及其用途。


背景技术：

2.cyp4f8是一种细胞色素p450单加氧酶，其可以将cox产物氧化并羟基化为19-羟基-pge2。pge2可以刺激各种前列腺受体亚型，而19-羟基-pge2则对ep2受体亚型表现出选择性。在前列腺癌中，ep2受体与pge2的结合可以诱导血管内皮生长因子(vegf)的分泌、细胞运动、生长和血管生成。有研究表明，即使部分敲低cyp4f8的表达也会显著降低前列腺癌细胞的细胞活力。因此，cyp4f8的前列腺特异性的表达谱以及19-羟基-pge2对ep2受体的激活表明，抑制cyp4f8可能是一种有吸引力的治疗前列腺癌的方法。


技术实现要素：

3.目前，crispr技术作为一种新的基因组工程化工具，由于其操作简单，靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。最常用的包括ii型、v型、vi型等crispr系统。以ii型crispr系统为例，在外源dna入侵时，来自crispr重复阵列的转录物被cas9和rnase iii核酸酶加工为成熟的crrna，随后与tracrrna和cas9组成复合体。通过识别pam，crrna将该复合体引导至靶标dna，并通过crrna包含的间隔区序列与靶dna的结合，解开dna双链，再由cas9中的hnh结构域剪切crrna的互补dna链，ruvc结构域剪切非互补链，最终在靶标dna处引入双链断裂。人们还发现，引导cas9结合并切割特定的dna序列不需要rna复合物。通过使用设计的嵌合单向导rna(sgrna)可以简单地实现该过程。
4.术语“单向导rna”或“sgrna”是指通过将crrna和tracrrna分子融合成“单个向导rna”的人工工程化rna，当与cas9蛋白结合时，其能够识别并切割向导rna特异性的dna靶标。sgrna一般包含间隔子序列(spacer)和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。间隔子序列的作用是指导cas9蛋白切割与间隔子序列互补的dna位点，也即靶序列。一般而言，间隔子序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导crispr复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。间隔子序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般间隔子序列的长度为约20个核苷酸。骨架序列为sgrna中必须的，除间隔子序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配对序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。由于骨架序列不影响sgrna对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列的结构可参见如文献nowak et al.nucleic acidsresearch 2016.44:9555-9564。
5.在本文中可采用的骨架序列如下表1所示。
6.表1.示例性的sgrna骨架序列
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sgrna，尤其是其中间隔子序列的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含snp、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计sgrna。然而，由于cas酶可以切割任何邻近pam位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量sgrna的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大，例如，pam位点是5'-ngg-3'的编辑效率通常就比5'-nga-3'或5'-nag-3'的高。因此，筛选特异性高的sgrna对于crispr系统编辑效率的提高至关重要。
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因此，在第一个方面，本发明提供一种靶向cyp4f8的sgrna，其包含的间隔子序列如seq id no：14所示。
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在一个优选的实施方案中，所述sgrna还包含选自seq id no：1-12的骨架序列。
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在第二个方面，本发明还提供表达本发明所述的sgrna的dna分子以及包含所述dna分子的载体。
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在第三个方面，本发明还提供一种基因编辑系统，其包含cas9酶和本发明所述的sgrna序列。
[0013]
在第四个方面，本发明提供了一种在体外敲除细胞中的cyp4f8基因的方法，包括将该细胞与cas9酶和sgrna接触，其中所述sgrna包含如seq id no：14所示的间隔子序列。
[0014]
在一个实施方案中，所述cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgrna是rna分子、其编码核酸或载体的形式。例如，可以将细胞与cas9蛋白和sgrna直接接触，或者将细胞与cas9蛋白的编码核酸和sgrna接触，或者将细胞与cas9蛋白和sgrna的编码核酸直接接触。
[0015]
在一个实施方案中，所述细胞是免疫细胞，例如293t细胞、t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞等。优选地，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞或nkt细胞，所述t细胞优选cd4 cd8 t细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞。
[0016]
下面将结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式
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实施例1.sgrna载体构建
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使用crispr在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)，根据评分系统，分别针对cyp4f8的1号外显子、2号外显子、4号外显子、6号外显子设计sgrna间隔子序列，并根据sgrna间隔子序列设计相应的寡核苷酸链，其序列分别如下表2和表3所示。
[0019]
表2.sgrna的间隔子序列
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表3.sgrna间隔子序列的寡核苷酸序列
[0023]
名称寡核苷酸序列sgrna-1oligo15
’-
caccgaagaaccagttctgtttccg-3’(seq id no：17)sgrna-1oligo25
’-
aaaccggaaacagaactggttcttc-3’(seq id no：18)sgrna-2oligo15
’-
caccgatgacagatcggacgatgtc-3’(seq id no：19)sgrna-2oligo25
’-
aaacgacatcgtccgatctgtcatc-3’(seq id no：20)sgrna-3oligo15
’-
caccgaggcaggcgtcagcaagcga-3’(seq id no：21)sgrna-3oligo25
’-
aaactcgcttgctgacgcctgcctc-3’(seq id no：22)sgrna-4oligo15
’-
caccgcatggccaggcgttgccact-3’(seq id no：23)sgrna-4oligo25
’-
aaacagtggcaacgcctggccatgc-3’(seq id no：24)
[0024]
将1μg lenticrispr v2质粒(addgene，52961，其包含cas9编码序列和sgrna骨架序列的编码序列)用bsmbi酶于37℃酶切30分钟，并用天根胶回收试剂盒(天根，dp209-02)纯化酶切质粒产物。将一对sgrna oligo退火形成双链，并与酶切的lenticrispr v2质粒进
行连接，16℃孵育2h。然后，将连接质粒转化至感受态细胞dh5α，均匀涂至amp抗性lb固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，然后挑取单个菌落扩大培养并提取质粒，通过测序确定sgrna序列被正确克隆入lenticrispr v2质粒。
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实施例2.细胞转染并检测敲除效率
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使用脂质体转染法将携带sgrna序列的lenticrispr v2质粒转染入293t细胞。具体地，提前用完全培养基(10％胎牛血清的高糖dmem培养基)接种293t细胞，并于5％co2，37℃恒温培养箱中培养1天，待细胞达到70-90％汇合度时进行转染。将转染试剂(125μl opti-mem、3.75μl lipo3000r)与dna预混液(125μl opti-mem、5μg lenticrispr v2质粒、10μl p3000
tm
)以1：1的比例混合，25℃孵育5分钟后，将其加入293t细胞。将细胞置于37℃培养培养箱继续培养48-72小时后，用含1ng/ml嘌呤霉素的完全培养基进行抗性筛选，并将阳性细胞用完全培养基恢复培养2-3天。收集细胞，并用facs法鉴定基因敲除效率，结果如下表4所示。
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表4.不同sgrna的敲除效率
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名称敲除效率sgrna-160.0％sgrna-283.3％sgrna-330.0％sgrna-424.0％
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从上表可以看出，sgrna-1敲除效率约为60％，sgrna-2的敲除效率最高，达到约85％，远远高于其他3个sgrna的敲除效率。
[0030]
实施例3.基因表达验证
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提取经嘌呤霉素筛选的阳性293t细胞的rna，并将其逆转录为cdna，然后用以下引物检测细胞中的cyp4f8基因的表达情况，结果如表5所示。
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p-f：tcttcgcaatccatcacaac(seq id no：25)
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p-r：accaccttcatctctgcca(seq id no：26)
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表5.cy4f8表达水平
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可见，sgrna-2敲除的293t细胞中的cyp4f8的表达量最低，敲除效果最好。
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需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。