一种基于微流控芯片的新型冠状病毒肠道感染模型构建方法

1.本发明涉及将微流控芯片技术应用到肠道生理/病理研究的技术领域，具体 涉及一种基于微流控芯片技术的新型冠状病毒肠道感染模型构建方法。


背景技术：

2.sars-cov-2是一种严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，该病毒主要通过密 切接触和咳嗽或打喷嚏产生的飞沫在人与人之间传播，主要通过与受体血管紧 张素转换酶2(ace2)结合进入人体细胞。sars-cov-2主要通过呼吸道传播，引起 流感样症状。然而，患者常表现出腹泻、呕吐和腹痛等胃肠道症状。此外，肠 道上皮细胞中有丰富的sars-cov-2受体表达，可能是病毒攻击的靶器官之一。 研究人员已经在肛门拭子中检测到了病毒颗粒的存在，并且证实了sars-cov-2 可以很容易地在肠道内皮细胞和肠道类器官中实现病毒的复制等过程，从而在 可以肠道中产生大量的感染性病毒颗粒。
3.新冠病毒感染目前主要采用动物模型和体外二维细胞模型进行研究。在目 前冠状病毒新病毒暴发急需特效药的背景下，动物实验周期长、耗资大，对其 广泛应用存在诸多限制。而静态二维细胞培养与体内细胞生长环境完全不同， 很难反映体内的动态细胞生物力学环境，且药物试验结果预测人体反应的准确 性较低。总体上看，现有的药物评价研究在方法学和技术手段等方面都存在着 一些不足，在很大程度上制约了新型冠状病毒的感染研究以及药物的研究开发。 为克服简单细胞模型的诸多局限性，开发新的药物评价技术，加快新的冠状病 毒药物的开发进程是当务之急。器官芯片是一项新兴的前沿科技，也是一项多 学科交叉融合的技术，它将仿生生物学和微加工技术结合起来，利用微流控技 术控制流体流动，结合细胞与细胞之间的相互作用、基质和生物化学及生物力 学特性，构建出数平方厘米大小的器官生理微系统。芯片通常包含多种通道结 构，包括活细胞、3d培养、组织界面、生物流体和机械力等器官微环境关键元 素，可以反映人体各器官的主要结构功能单位和各器官之间的复杂联系，是预 测人体对药物和外界各种刺激反应的很好的替代品。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于微流控芯片技术的新型冠状病毒肠道感染模 型构建方法，特别针对模拟构建肠上皮与内皮的组织屏障界面以及肠组织免疫 微环境的主要细胞组成，该方法可同时研究新型冠状病毒感染对肠细胞功能， 组织屏障，炎症因子释放等多方面影响。
5.一种基于微流控芯片的新型冠状病毒肠道感染模型构建方法，新型冠状病 毒肠道感染模型构建方法采用微流控芯片技术，模拟构建肠组织屏障界面和肠 组织免疫微环境的细胞组成，感染新型冠状病毒后出现的肠组织病理生理变化。
6.细胞包括肠道上皮细胞，肠道黏液分泌细胞，内皮细胞及循环免疫细胞。
7.所述微流控芯片芯片包含肠侧通道和血管侧通道，两层通道间由聚二甲基 硅氧
烷楔形多孔膜隔开。
8.肠侧通道细胞表面暴露于新型冠状病毒颗粒(sars-cov-2)。
9.所述微流控芯片由上层芯片和下层芯片粘合封接而成，上层芯片由s形上 层芯片通道与肠上皮细胞入口池1和肠上皮细胞出口池4组成，下层芯片由s 形上层芯片通道与血管内皮细胞入口池2和血管内皮细胞出口池3组成，上层 芯片通道通过聚二甲基硅氧烷楔形多孔膜与下层芯片通道隔开。
10.本发明提供一种基于微流控芯片技术的新型冠状病毒肠道感染模型构建方 法，包含两种肠上皮细胞，内皮细胞和循环免疫细胞，由新型冠状病毒颗粒暴 露引起肠组织屏障的一系列病理变化及组织损伤。
11.本发明提供的一种微流控芯片，该微流控芯片由上层芯片、聚二甲基硅氧 烷楔形多孔膜、下层芯片组成；上层芯片由s形上层芯片通道与肠上皮细胞入 口池1和肠上皮细胞出口池4组成，下层芯片由s形上层芯片通道与血管内皮 细胞入口池2和血管内皮细胞出口池3组成。上层芯片通道通过聚二甲基硅氧 烷楔形多孔膜与下层芯片通道隔开；
12.本发明还提供了一种基于微流控芯片技术的新型冠状病毒肠道感染模型 构建方法，方法过程如下：
13.(1)芯片预处理
14.设计制作芯片，紫外照射除菌，20～200μg/ml i型胶原修饰芯片通道 10h-48h，pbs冲洗1-3次；
15.(2)细胞的接种与培养
16.内皮细胞调整至1～5
×
106cells/ml的细胞悬液，接种于芯片下层通道，芯 片倒置放入培养箱2h后正置；肠上皮细胞调整至1～5
×
106cells/ml的细胞悬液， 肠道黏液分泌细胞密度调整至肠上皮细胞的十分之一，两种细胞混合后加入上 层芯片主通道，细胞贴附于聚二甲基硅氧烷楔形多孔膜界面生长，将芯片平移 放入37℃培养箱中继续培养；12h后应用微流体驱动方法进行持续灌流；
17.(3)外周血单个核提取：取抗凝外周血，与pbs按照1:1稀释，加至淋巴细胞 分离液ficoll表面，水平离心400g
×
30分钟，取单个核细胞层，pbs清洗2次， 加入1640 10％fbs培养基培养。使用时按照1x106/ml加至下层通道；
18.(4)病毒感染：芯片上层通道加入新型冠状病毒，1h后冲洗，之后上下层通 道每日换液。
19.本发明提供的基于微流控芯片技术的新型冠状病毒肠道感染模型构建方 法，可采用生物学上常用的细胞检测手段对分别排列于多孔膜两侧的细胞进行 检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、基因表达检测、蛋白质检 测。可以观察细胞在新型冠状病毒作用下的形态变化，基因，蛋白表达差异， 以及多种细胞的共同培养对于刺激的不同反应等。本发明利用微流控技术，以 具有良好生物相容性，透光性的pdms为芯片材料，设计的装置可用于模拟肠 组织新型冠状病毒感染的典型病理生理特征，探索肠组织多种细胞类型对病毒 的不同响应及在病毒感染导致肠损伤中的不同作用。功能完备，操作简单，并 且在芯片上可以独立完成各项信号检测，如细胞蛋白表达，细胞因子分泌，细 胞增殖，凋亡检测等。
附图说明
20.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本 发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限 定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
21.图1本发明微流控芯片整体结构示意图；
22.其中，1肠上皮细胞入口池，2血管内皮细胞入口池，3血管内皮细胞出口 池，4肠上皮细胞出口池，两层芯片通道由pdms多孔膜隔开。
23.图2肠芯片模型的截面；
24.其中，5肠侧通道，6肠上皮细胞，7细胞外基质，8多孔膜，9内皮细胞， 10免疫细胞，11血管侧通道。
25.图3芯片中肠上皮细胞层的表征图示；
26.其中，12细胞间黏附连接标记物e-cadherin的表达，13细胞间紧密连接标 记物zo-1的表达。
27.图4芯片中内皮细胞层的表征图示；
28.其中，14细胞间黏附连接标记物ve-cadherin的表达，15细胞间紧密连接 标记物zo-1的表达。
具体实施方式
29.下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
30.实施例1
31.利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型见图1。该微流控芯片芯 片由上下两层pdms粘合封接而成，下层芯片包括血管内皮细胞入口池1，血管 内皮细胞出口池2，肠泡上皮细胞入口池3，肠泡上皮细胞出口池4，出口和入 口均外接灌流管；
32.本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片两层pdms通道由pdms多孔膜 隔开，血管内皮细胞培养室和肠泡上皮细胞培养室高度为200-1000μm。
33.实施例2
34.一种基于微流控芯片技术的新型冠状病毒肠感染模型构建方法，采用上述 微流控芯片，按照以下步骤进行：
35.配制20～200μg/ml i型胶原溶液，用移液器将其加入肠上皮和内皮细胞入口池， 每孔30-100μl；加1ml pbs缓冲液于培养皿中，培养箱中放置10h-48h，pbs 冲洗1-3次；将内皮细胞制成悬液，取30μl悬液加入血管内皮细胞入口池，并 迅速从出口池吸走10μl细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地 进入细胞培养室。细胞培养室中的细胞分布均匀时，立即将芯片倒立，移入37℃ 培养箱中放置；竖立放置2h后，取出观察，细胞紧贴在pdms多孔膜上形成薄 层细胞层。在肠上皮细胞入口池中接种肠上皮细胞，将芯片放平移入37℃培养 箱中培养、每隔24h换液一次；培养3天后，取抗凝外周血，与pbs按照1:1 稀释，加至淋巴细胞分离液ficoll表面，水平离心400g
×
30分钟，取单个核细 胞层，pbs清洗2次，加入1640 10％fbs培养基培养。使用时按照1x106/ml加 至下层通道；芯片中细胞组成如图2所示。三天后，采用肠上皮细胞钙粘蛋白 e-cadherin和血管内皮细胞ve-cadherin抗体检测芯片肠上皮及内皮屏障的完整 性，采用病毒spike蛋白抗体检测病毒颗粒，其结果如图
3,4所示。细胞间连接 蛋白分布于细胞间，形成完整的细胞间连接。利用该模型，可以通过控制加入/ 不加入外周血单个核细胞，研究有/无外周血单个核细胞对新型冠状病毒肠感染 的影响。