一种与鸡屠体性状相关的SNP分子标记及应用的制作方法

一种与鸡屠体性状相关的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种与鸡屠体性状相关的snp分子标记及应用。


背景技术：

2.鸡作为最重要的农业畜禽动物之一，其产肉性能直接影响着市场经济效益。相比于白羽肉鸡，黄羽肉鸡的肉质更好、风味更佳，但也存在较大的弱势。黄羽肉鸡，尤其是地方鸡品种普遍存在饲料转化率低、产肉量低以及繁殖性能差等问题，对养殖成本以及饲料消耗具有较大的要求。从育种角度上，培育出高产肉量的黄羽肉鸡能够极大地带动黄羽肉鸡产业的经济效益，有利于资源的有效利用，对推动黄羽肉鸡养殖产业发展具有重大意义。
3.屠体性状是动物生产中重要的经济性状，直接反应动物的产肉性能，如屠体重、半净膛重、全净膛重、腿肌重、胸肌重及翅重等，因此一直是动物育种生产中的研究热点。在肉质品质的基础上，进一步提高肉鸡的屠体重是肉鸡选育的目标。
4.分子标记辅助选择(mas)是一种常用的分子育种技术，具有存在范围广、遗传稳定、直观准确等优点。其中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)作为一种dna分子标记，具有可稳定遗传的特性，对提高育种效率具有明显效果，可广泛用于肉鸡的大群体规模化育种筛选。snp作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。进一步挖掘分子水平上与鸡重要经济性状相关的候选基因，通过对其多态性的研究并建立相关分子遗传标记，可以有效推动肉鸡的育种工作。
5.myod家族抑制剂结构域基因(myod family inhibitor domain containing，mdfic)位于鸡的1号染色体(参考基因组grcg6a，chrome 1)。mdfic基因的产物被认为是一种包含myod抑制剂结构域的蛋白，其特征是具有特定的富含半胱氨酸的c端结构域，参与病毒基因组表达的转录调控，同时能够通过抑制myod的功能进而影响机体发育过程。据报道mdfic基因可以调控淋巴瘤细胞的增殖与迁移,进而影响鸡马立克氏病的发展。我们之前的研究显示，mdfic基因也可以控制鸡细胞的增殖、分化与凋亡。该基因在鸟类中的具体作用少有报道，尤其是在鸡上的研究更少。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种与鸡屠体性状相关的snp分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过对mdfic基因外显子区分析和实验，得出该基因与屠体性状相关联的snp位点，该位点作为屠体性状分子标记能够准确、快速的对鸡产肉性状进行选择。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种与鸡屠体性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记对应于鸡mdfic基因中的nc_006088.5：25921381位点出现点突变，snp突变位点25921381：c》t。
9.优选的是，snp突变位点的基因型包括cc、ct和tt。
10.本发明还提供根据所述的与鸡屠体性状相关的snp分子标记在鸡遗传育种中的应
用。
11.本发明还提供根据所述的与鸡屠体性状相关的snp分子标记早期筛选鸡产肉性状的方法，包括利用所述snp分子标记早期筛选屠体重、半净膛重、全净膛重、胫长和体斜长的过程。
12.优选的是，包括以下步骤：
13.(1)提取待测鸡血液dna；
14.(2)以步骤(1)所得的dna为模板，扩增获取mdfic基因chrome1：25920881-25921780基因序列；
15.(3)对步骤(2)所得基因序列上的突变位点25921381进行基因分型；
16.(4)基于步骤(3)的基因分型对鸡产肉性状进行早期选择，其中，cc基因型个体表现出最高的屠体重、半净膛重、全净膛重及最短胫长、体斜长；ct基因型个体表现出最低的屠体重、半净膛重、全净膛重及最短的胫长、体斜长。
17.优选的是，扩增引物为：
18.mdfic-f3：tccttcttcccatcgcttgc；
19.mdfic-r3：ctcttgtggagcctgccatt。
20.优选的是，扩增体系包括：2
×
taq master mix 20μl、ddh2o 16.5μl、mdfic-f3 1μl、mdfic-r3 1μl和dna模板1.5μl。
21.优选的是，扩增程序包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s，36个循环；72℃后延伸，5min；4℃保存。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.本发明通过分析鸡mdfic基因外显子区，发现一个与屠体性状相关联的snp位点，即mdfic基因中的nc_006088.5：25921381位点出现点突变，snp突变位点25921381：c》t，该snp突变位点可作为新的snp分子标记应用到早期筛选与屠体性状相关的产肉性能上，以辅助加快鸡遗传育种的进程。通过试验验证了，该突变位点的cc基因型个体表现出最高的屠体重、半净膛重、全净膛重及最短胫长、体斜长；ct基因型个体表现出最低的屠体重、半净膛重、全净膛重及最短的胫长、体斜长。可见，通过该分子标记对筛选特定屠体性状的鸡品种具有重要意义。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为snp突变位点分型的示意图。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.以下实施例所用到的主要试剂包括：nrbc blood dna kit(品牌：omega；货号：d0715；广州飞扬生物工程有限公司)、2xtaq mastermix(dye)(康为世纪，cw0682)、dnamarker(品牌：诺维赞；货号：md101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：tsj001；北京擎科生物科技有限公司)。
32.实施例1
33.1、动物材料
34.同批次的731只麻黄鸡(广东江丰公司福和种鸡场)，在相同饲养条件下饲养。每只鸡都有唯一的身份标识(脚号)。100日龄时，使用真空抗凝管采集其翅下静脉血液1.2ml，保存于-80℃低温冰箱，用于后续的dna提取。100日龄进行屠宰、分割以及采样，测定鸡屠体重、半净膛重、全净膛重、胫长、体斜长等性状。
35.2、试验方法
36.2.1血液采集以及屠宰性状测定
37.使用真空抗凝管采集翅下静脉血液1.2ml，冰上暂存，运回实验室，将所有个体的血液转移到1.5ml离心管中，保存于-80℃冰箱，用于后续的dna提取。100日龄麻黄鸡100日龄活禽用颈部放血法处死，使用60℃水烫毛，时长3分钟内。脱毛机脱毛，沥干水分后进行体尺测量(包括体斜长、屠体重、胫长等性状)。屠体重指活禽放血、去羽毛、脚角质层、趾壳和喙壳后的重量(单位：g，精确到0.1g)；胫长指从胫部上关节到第3、4趾之间的距离(单位：mm，精确到0.01mm)；体斜长指沿禽体表测量肩关节至髋骨结节间的距离(单位：cm，精确到0.1cm)。之后进行屠体分割，测定半净膛重、全净膛重等屠体性状。半净膛重指禽屠体去除气管、食管、嗉囊、肠、脾脏、胰脏、胆、生殖器官以及角质膜后的重量(单位：g，精确到0.1g)；全净膛重指半净膛重去除心脏、肝脏、腺胃、肌胃、腹脂、头、脚之后的重量(单位：g，精确到0.1g)。
38.2.2dna提取
39.所有个体的dna提取操作均按照nrbc blood dna kit说明书进行，提取血液样品的基因组dna后，检测dna样本浓度和od值，将dna浓度大于25ng/μl、od
260
/od
280
之比值在
1.7-1.8之间的样品，储存于-20℃冰箱中备用，用于后续的pcr扩增。
40.2.3引物设计
41.根据ncbi(national center for biotechnology information)官网所提供的鸡(gallus gallus)mdfic基因参考基因组序列，使用ncbi的primer-blast工具进行引物设计。pcr产物长度为900bp，引物信息如表1，该引物交由北京擎科生物科技有限公司广州分公司合成。
42.表1 mdfic基因pcr扩增引物信息
[0043][0044]
2.4鸡mdfic基因的pcr扩增
[0045]
以血样dna为模板，使用2
×
taq mastermix(dye)(康为世纪，cw0682)试剂进行mdfic基因(chrome 1：25,920,881-25,921,780)的pcr扩增，pcr体系如表2。pcr程序按2
×
taq mastermix(dye)说明书进行操作，具体程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s(变性-退火-延伸，36个循环)，72℃后延伸，5min。产物4℃保存备用。将pcr产物送往北京擎科生物科技有限公司广州分公司进行桑格测序。其中，pcr产物核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0046]
pcr产物序列(seq id no：1)：
[0047]
》chromosome 1:25,920,881-25,921,780
[0048]
tccttcttcccatcgcttgccttgttctctctgtccaattgacagagaaccacaagccagtacagtgctgaacagggattctaggcctcatctagacgtgagtgagacactttataaatgtttaattgtaattatttttaatctttcttgttttgtctggggatgttaatttttgcccagtctagcctaaagtatttggtgttcaatttacagttttaattaacaccttctttctctttcattttaagcacaacctcaacgtttgcctcagccgaatacttcagcactggaagggggtgaggaagaaattggcaaagtgcagaatggccacgcaggcttgagtaatggaagtggaatgcacaatggagtcaagcatgcatcagcaaacaacagaaaactttcatctcctgtttcagaaaaaatgcacaggaaaattcagtccaccttgtctgtcaacagcaatggcagcaagaagagtaaaataagctctgcgtt(c/t)tctcaaaagccttcacctgaaggtaagcataaattcttattaaaaaaacaaacggaatgaagactagccaaaccctgttctcactaataattacacaatcaactgaaaataattgaagagcgtgactcatgctccagaagcaaatagaaatcattatgataaaaagcaagttacttccccaaaggaaactattaagtatttgaaggaaattgaagcaatgggagatttgttgctttcaaatattttgccaacatagtctggtgatgttttcttctttgtagttagtatcatgaacggacagaaactcctgtcaacatcatcacaagtatatcaggaaaaaagttaaagcagtagttgaaaacacagtaaatacttaattgcattaatggcaggctccacaagag
[0049]
测序结果正确，表明已经成功扩增mdfic基因序列。测序结果检测成功鉴定到位于鸡mdfic基因中的nc_006088.5：25921381位点出现点突变，snp突变位点25921381：c》t。
[0050]
表2 pcr扩增体系
[0051][0052]
2.5 snp位点的基因分型、基因频率计算以及基因型频率计算
[0053]
使用dnastar 11软件的seqman工具比对每个样本的测序数据，对结果中snp位点25921381：c》t的峰图(图1)进行分析以及snp位点25921381：c》t的基因分型。对分型结果进行基因频率计算以及哈代温伯格(hardy-weinberg)平衡系数检测，计算公式如下：
[0054][0055]fi
表示snp位点等位基因的频率，a
ii
和a
ij
表示snp位点纯合(ii)与杂合(ij)的个体数，n为群体总数。哈代温伯格平衡检验使用excel软件进行卡方检验。计算结果如表3。
[0056]
该结果显示hw系数p》0.05，表明群体该群体数量足够大，没有发生突变、人工选择和群体迁移等，符合基因遗传平衡。
[0057]
表3 snp位点25921381：c》t的基因频率结果
[0058][0059]
2.6 snp位点25921381：c》t与屠体性状的关联分析
[0060]
使用sas 9.0软件进行snp位点与屠体性状及体尺性状的关联分析，采用的模型为proc-glmr函数模型，模型公式为：
[0061]
y＝u f m s g e
[0062]
其中，y为表型值，u为群体均值，f为父系效应，m为母系效应，s为性别效应，g为基因型效应，e为随机残差。
[0063]
关联分析结果显示：snp位点25921381：c》t与屠体重性状的关联性达极显著水平(p＝0.0002)，与半净膛重性状显著相关(p＝0.0012)，与全净膛重性状极显著相关(p＝0.0009)，与胫长极显著相关(p＝0.0001)，与体斜长显著相关(p＝0.0031)。其中，cc基因型个体表现出最高的屠体重、半净膛重、全净膛重及胫长、体斜长，ct基因型个体表现出最低的屠体重、半净膛重、全净膛重及最短的胫长、体斜长，具体信息如表4。
[0064]
表4 snp位点25921381：c》t与屠体性状的关联分析结果
[0065][0066]
注：不同字母表示组间差异显著。
[0067]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。