一种从桑黄药材中制备原儿茶酸的方法

1.本方法涉及分离纯化技术领域，具体是一种从桑黄药材中制备原儿茶酸的方法。更进一步的，本发明是利用二维液相色谱技术从桑黄药材中制备高纯度原儿茶酸的方法，纯度可以达到95％以上。


背景技术：

2.桑黄是一种珍贵的多年生大型药用真菌，素有“森林黄金”之美称之美称，在《本草纲目》中有记载。属于担子菌门层菌纲非褶菌目多孔菌科针层孔菌属，在我国分布有四十个种。主要寄生在桑、柳、桦杨栎等树干上，其中以野生的桑树桑黄最为珍贵。
3.桑黄作为我国传统真菌类中药，是目前国际公认的生物治癌领域中有效率排在第一位的药用菌。其包含多种结构类型的化学成分，包括多糖、黄酮、三萜类、芳香酸、氨基酸等；现代药理学实验也表明，桑黄具抗癌、免疫调节、抗肥胖、抗氧化和抗炎等多种药理学活性。
4.近年来，在天然化合物中寻找具有神经营养样作用且可增强神经营养因子作用的双靶标药物成为研究的热点。据研究表明原儿茶酸具有抗癌、抗氧化、抗炎症、降血糖等多种功效，是一种健康安全的有益小分子物质。
5.原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)，性状为白色粉末，结构式如下：
[0006][0007]
原儿茶酸分子式中具有多个-oh，与硅胶表面的硅醇基有一定的结合作用，这是导致该物质制备过程中拖尾严重、分离困难的主要原因，为了解决该问题，该专利所使用的一维和二维分离填料，分别采用多点温和键合、封尾技术和极性共聚等技术对填料表面进行处理，大大改善制备过程中的拖尾问题；
[0008]
原儿茶酸具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、镇痛等多方面药理活性，是一种重要的天然活性物质。近年来的研究发现了其具有抗氧化、抗癌及介导肿瘤细胞凋亡等许多新的药理作用；对缺血缺氧神经元具有一定的神经细胞保护作用；能显著的缓解白细胞介素1β对软骨细胞的炎症反应；能维持受损的软骨细胞的表型和促增殖作用；维持软骨细胞表型和促进细胞增殖等等。
[0009]
原儿茶酸具有较强的抗氧化能力，对金黄色葡萄球菌、链球菌等具有明显抑制作用，并有收敛和促进伤面愈合的作用，可用于治疗炎症、发热和癌症等。
[0010]
从桑黄药材中提取制备原儿茶酸罕有报道，谱效关系不明确，因此制备该化合物对桑黄物质基础研究和药理活性研究具有重要意义；
[0011]
鉴于以上技术背景及发展前景，提出本发明。


技术实现要素：

[0012]
本发明提供一种以桑黄药材为原料，采用二维液相色谱制备原儿茶酸的方法，操作步骤如下：
[0013]
1.作为优选，利用桑黄药材采用纯水提取，料液比1:15～30，浸泡10～24小时，加热煮沸水提1～2小时，提取2～3次，合并得到水提液；
[0014]
2.作为优选，采用膜过滤技术对水提液进行中空纤维膜过滤，中空纤维膜滤芯精度10000～800000分子量，得到中空纤维膜透过液；
[0015]
3.作为优选，利用耐纯水c8ye硅胶填料，对原儿茶酸具有很好的富集作用，可以将中空纤维膜水相透过液进行大体积直接上样富集，填料为粒径30～60μm，孔径为富集获得原儿茶酸粗品。
[0016]
4.为了实现一维制备富集原儿茶酸粗品的目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0017]
一维液相色谱制备采用的洗脱条件为丙酮、乙腈、异丙醇(有机相)与酸水(水相)混合，水相为乙酸或磷酸中的一种或二种，比例为0.1～0.5％(v/v)，按照有机相5～25％等度，5～25％线性梯度或台阶梯度，流速为0.1～0.2倍填料体积/min，温度25～45℃，载样量0.5～3.0％(样品溶液固体质量与填料质量之比)，检测器为dad紫外检测器，洗脱时间为20～60min，按照检测器色谱峰曲线收集馏分，对所有馏分进行液相分析，确认原儿茶酸馏分，合并后浓缩至20～80mg/ml为一维制备原儿茶酸粗品；
[0018]
5.作为优选，二维制备采用极性共聚c18hc键合硅胶填料，填料粒径为10～40μm，孔径为制备获得纯度》95％原儿茶酸；
[0019]
6.为了实现二维制备原儿茶酸的目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0020]
二维液相色谱制备采用洗脱条件为丙酮、乙腈、异丙醇(有机相)与甲酸水(水相)混合，按照有机相5～25％等度，5～25％梯度或台阶等度，水相为甲酸比例为0.1～1.2％(v/v)，流速为0.2～0.3倍填料体积/min，温度25～45℃，载样量0.2～2.0％(样品质量与填料质量之比)，检测器为dad紫外检测器，洗脱时间为30～80min，按照检测器色谱峰曲线对原儿茶酸的组分进行收集，所得馏分真空干燥，即可得到纯度》95％的原儿茶酸。
[0021]
本发明具有如下优点：
[0022]
本发明与现有技术相比具有以下特点：
[0023]
1.桑黄化合物的一维分离填料采用耐纯水的合成工艺，可以对纯水相样品进行大体积上样，可以避免普通c18键合填料的键合相卷曲，失去保留的问题，二维分离填料采用极性共聚c18hc键合硅胶填料，对一维桑黄化合物原儿茶酸进行正交性分离，与一维分离填料具有互补性；
[0024]
2.原儿茶酸纯度高：由于本发明所用的技术方法，直接针对药材中所含的原儿茶酸进行制备，无需经过加热、酸碱的变化，原儿茶酸以在药材中本身存在的状态被制备出来，没有水解产物掺杂，因此得到的原儿茶酸纯度高，达到95％以上。
[0025]
3.本发明所涉及的制备原儿茶酸的方法，仪器自动化程度高，操作简便，收率高，
可以满足大规模生产的需求。
附图说明
[0026]
图1是实施例1的原儿茶酸一维制备谱图；
[0027]
图2是实施例1的原儿茶酸二维制备谱图；
[0028]
图3是实施例1的原儿茶酸液相分析谱图。
具体实施方式
[0029]
现结合实例，对本发明做进一步说明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。实例仅限于说明本发明，本发明不仅限于此。
[0030]
实施例1
[0031]
称取桑黄药材100g，加入3l水溶液，浸泡24小时后加热煮沸水提8小时，收集水提液，固体物料再次按加入3l水溶液重复加水煮沸提收集水提液，重复提取1次，合并得到水提液，得到桑黄药材水提溶液，浓度为1.8mg/ml，中空纤维膜过滤(膜芯精度100000分子量)。
[0032]
一维制备条件，色谱条件采用c8ye填料(制备柱规格：100
×
250mm，粒径30μm，孔径质量1200g，华谱新创科技有限公司)，流动相采用(a)乙腈(有机相)-(b)0.1％乙酸水(水相，v/v)，梯度洗脱方式：纯水洗脱10min，乙腈(流动相a)体积浓度由10％经60min提高到20％乙腈(其余为流动相b)梯度洗脱60min，采用dad紫外检测器选择254nm吸收波长，制备温度25℃，上样体积为3.3l/针，载样量0.5％(样品溶液固体质量与填料质量之比)，流动相流速为300ml/min，按照检测器色谱峰曲线收集馏分，对所有馏分进行液相分析，确认原儿茶酸馏分，合并后浓缩至30mg/ml，得到一维制备原儿茶酸粗品，纯度36.51％，收率86.9％。
[0033]
二维制备条件，色谱条件采用反相c18hc键合硅胶填料(制备柱规格：50
×
150mm，粒径10μm，孔径质量300g，华谱新创科技有限公司)，流动相选择(a)丙酮(有机相)-(b)含0.1％甲酸水(水相，质量浓度)，采用体积浓度10％丙酮(流动相(a)等度洗脱(其余为流动相b)，采用dad紫外检测器选择320nm吸收波长，制备温度为25℃，进样量为20ml/针，流动相流速为60ml/min，按照检测器色谱峰曲线对原儿茶酸的馏分进行收集(按色谱峰收集)，旋转蒸发至干，得到原儿茶酸化合物(产物经核磁和高分辨质谱结构解析，确定其为化合物原儿茶酸)，经液相色谱分析，纯度为95.55％，收率93.2％。
[0034]
实施例2
[0035]
称取桑黄药材100g，溶于2l水溶液，浸泡30小时后加热煮沸水提6小时，收集水提液，固体物料再次按加入2l水溶液重复加水煮沸提收集水提液，重复提取2次，合并得到水提液，得到桑黄药材水提溶液，浓度为1.2mg/ml，中空纤维膜膜过滤，中空纤维膜膜芯精度500000分子量，透过液浓缩至40mg/ml。
[0036]
一维制备条件，色谱条件采用c8ye填料(制备柱规格：100
×
250mm，粒径60μm，孔径质量1200g，华谱新创科技有限公司)，流动相采用(a)乙腈(有机相)-(b)0.1％磷酸水(水相，v/v)，台阶等度洗脱方式：纯水洗脱20min，乙腈(流动相a)体积浓度20％等度洗脱
(其余为流动相b)60min，采用dad紫外检测器选择254nm吸收波长，制备温度25℃，进样量为300ml/针，载样量0.75％(样品溶液固体质量与填料质量之比)，流动相流速为300ml/min，按照检测器色谱峰曲线收集馏分，对所有馏分进行液相分析，确认原儿茶酸馏分，合并后浓缩至40mg/ml，得到一维制备原儿茶酸粗品，纯度46.82％，收率90.1％。
[0037]
二维制备条件，色谱条件采用反相c18hc键合硅胶填料(制备柱规格：50
×
150mm，粒径10μm，孔径质量300g，华谱新创科技有限公司)，流动相选择(a)丙酮(有机相)-(b)0.5％磷酸水(水相，质量浓度)，采用5％丙酮(流动相a)60min提高至25％丙酮(其余为流动相b)梯度洗脱，采用dad紫外检测器选择320nm吸收波长，制备温度为18℃，进样量为25ml/针，流动相流速为60ml/min，按照检测器色谱峰曲线对原儿茶酸的馏分进行收集(按色谱峰收集)，旋转蒸发至干，得到原儿茶酸化合物(产物经核磁和高分辨质谱结构解析，确定其为化合物原儿茶酸)，经液相色谱分析，纯度为96.68％，收率93.8％。
[0038]
对比例1
[0039]
与实施例1不同之处在于，以非基团修饰的硅胶(100～200目)为分离材料，其它条件同实施例1，无法富集得到原儿茶酸粗品，因此无法进行二维制备分离纯化，无法得到高纯原儿茶酸。
[0040]
对比例2
[0041]
与实施例1不同之处在于，一维分离填料采用普通的十八烷基硅烷键合硅胶，其余制备条件相同，一维制备原儿茶酸粗品，液相分析纯度42.58％，收率44.9％。
[0042]
二维分离填料采用普通的十八烷基硅烷键合硅胶，其余制备条件相同，经液相色谱分析，原儿茶酸纯度为79.48％，收率73.8％。