一种新型肿瘤衔接器治疗药物的开发和应用的制作方法

1.本公开涉及一种双特异性抗体及其应用，特别是一种新型肿瘤衔接器治疗药物的开发和应用。


背景技术：

2.磷脂酰肌醇聚糖3(glypican-3，gpc3，又称dgsx，gtr2-2，mxr7，oci-5，sdys，sgb，sgbs或sgbs1)是一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，hspgs)家族，通过糖磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，gpi)锚定于细胞膜外表面。gpc3蛋白核心由580氨基酸组成，分子量约65kda，蛋白酶furin在358arg-359ser之间(355r-356q-357y-358r-359s)切割后形成2个亚基，两条硫酸肝素多糖链连接在近膜的c端亚基，是细胞外基质的重要组成部分，可能参与wnt、hh(hedgehog)和成纤维细胞生长因子fibroblast growth factor(fgf)等多个信号通路对细胞的活化(li n等，2018)。gpc3在多种胎儿组织(肝、肺、肾和胎盘)中表达，出生后由于dna甲基化修饰gpc3基因不再表达，但在多种肿瘤组织，如：66-90％的肝细胞癌、54-65％的肺鳞癌、16-64％的小细胞肺癌，20-30％的消化道肿瘤(食道癌、胃癌、贲门癌)以及部分其他类型癌细胞中，gpc3基因恢复表达(kawaida m 2019，yu x 2015，ishiguro t 2017，baumhoer 2008)。病理切片上，gpc3的弥漫性表达与hcc细胞的低分化程度以及疾病预后相关。最近有报道显示，gpc3是一种肿瘤干细胞标志，通过gpc3特异的细胞毒t细胞(cytotoxic t lymphocytes,ctl)，可以有效杀伤肿瘤干细胞，并抑制小鼠体内肿瘤生长(okada m等，2019)。
3.t细胞双特异抗体(或称t细胞衔接器)，是一种人为构建的特殊抗体分子，可通过其一端识别靶细胞表面抗原(抗原臂)，通过另一端结合t细胞cd3受体(cd3臂)。利用靶向cd3ε链的抗体，以一种类似于tcr/肽/hla的方式，使t细胞上的cd3发生聚集，从而活化t细胞并杀伤肿瘤。bcma
×
cd3双特异性分子是靶向骨髓瘤细胞上表达的bcma和t细胞上存在的cd3ε链(cd3e)的t细胞双特异性(tcb)抗体。bcma
×
cd3双特异性分子的作用机制包含同时结合bcma 骨髓瘤细胞和cd3 t细胞，引起t细胞活化和t细胞介导的细胞杀伤作用。
4.codrituzumab是首个靶向gpc3的治疗性单抗，在小鼠肿瘤模型中显示具有显著抑瘤活性，但ii期临床试验(nct01507168)中，codrituzumab和对照组相比无疾病进展期和总生存期无显著差别(abou-alfa gk 2017)，研究显示codrituzumab可能会对肿瘤的gpc3高表达或具有cd16高亲和力突变的患者带来临床受益(chen g 2018)。ery974是一种抗-gpc3/cd3双特异性抗体，通过t细胞介导的杀伤效应可有效杀伤多种gpc3阳性肿瘤细胞，活性优于单克隆抗体，但由于副作用较强，2018年临床研究暂停；2019年，i期临床试验重新启动后，联用il-6抗体tocilizumab以避免细胞因子释放综合征。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本公开提供了一种新的与gpc3蛋白具有高亲和力的gpc3抗体。并且，本公开还提供了所述gpc3抗体与cd3抗体形成的新型gpc3-cd3κλ双特
异抗体。所述gpc3抗体可介导对靶细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒(adcc)作用，且所述gpc3抗体可抑制gpc3引起的细胞内吞作用。所述gpc3-cd3κλ双特异抗体采用全长igg构型，通过引入电荷及亲和力优化，使κλ双特异抗体优先定位到gpc3 肿瘤组织，低浓度下即可募集活化t细胞，对靶细胞产生有效杀伤，无靶细胞存在时不激活t细胞；同时，κλ双特异抗体不与fcγri、fcγriia和fcγriiia等受体结合，减低了产生细胞因子风暴的风险。药效试验证实，这种新型gpc3-cd3κλ双特异抗体在极低剂量，即可抑制肿瘤生长，有效抑制免疫重建小鼠移植瘤的生长；在食蟹猴体内进行的毒理研究也显示，动物对新型gpc3-cd3κλ双特异抗体耐受良好，新型gpc3-cd3κλ双特异抗体的疗效和安全性均优于同类抗体。
6.在一方面，本公开提供了一种结合gpc3的抗体或其抗原结合部分。
7.在一方面，本公开提供了一种双特异性抗体或其抗原结合部分。
8.在一方面，本公开提供了编码如前述方面的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸。
9.在一方面，本公开提供了包含前述方面的核酸的载体。
10.在一方面，本公开提供了包含前述方面的核酸或载体的细胞。
11.根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的。
12.在一方面，本公开提供了包含如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分或其编码核酸和药学上可接受的载体的药物组合物或试剂盒。
13.在一方面，本公开提供了包含共价附着至治疗部分的前述任一方面所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性或多特异性分子的抗体-药物偶联物。
14.在一方面，本公开提供了治疗与gpc3相关病症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。
15.在一方面，本公开提供了前述任一方面的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞和/或药物组合物在制备用于治疗哺乳动物中与gpc3相关病症的药物或试剂盒中的用途。
16.本公开的抗体可以用于多种应用，包括检测gpc3蛋白，诊断、治疗或预防与gpc3相关的疾病。
附图说明
17.图1示出了gpc3重组蛋白的非还原sds-page结果。
18.图2示出了gpc3稳转细胞的流式细胞检测结果。
19.图3示出了cd3εγ-fc重组蛋白的sds-page结果。
20.图4示出了gpc3抗体和人gpc3稳转细胞的流式细胞结果。
21.图5示出了抗体49g8与不同种属gpc3抗原的结合。
22.图6示出了抗体49g8介导的adcc作用。
23.图7示出了人源化抗体与gpc3抗原的结合。
24.图8示出了人源化抗体与gpc3稳转细胞的结合。
25.图9示出了人源化抗体的octet亲和力测定。
26.图10示出了人源化抗体的spr亲和力测定。
27.图11示出了人源化抗体的细胞内吞结果。
28.图12示出了cd3人源化抗体与人cd3εγ抗原的结合。
29.图13示出了cd3人源化抗体与jurkat细胞的结合。
30.图14示出了cd3人源化抗体与人和猴cd3εγ抗原亲和力的比较。
31.图15示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与gpc3稳转细胞的结合。
32.图16示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与hepg2细胞的结合。
33.图17示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与jurkat细胞的结合。
34.图18示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与外周血t细胞的结合。
35.图19示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体介导的tdcc作用，图19a显示对hepg2细胞的杀伤，图19b显示对t细胞的活化。
36.图20示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体对t细胞nfat信号通路的作用。
37.图21示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体对pbmc的活化作用。
38.图22示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与fcγr活化性受体的结合。
39.图23示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体在免疫重建小鼠hepg2移植瘤模型中的抑制作用。
40.图24示出了gpc3
×
cd3κλ双特异抗体在cd3人源化鼠hepa1-6/hgpc3移植瘤模型中的抑制作用。
具体实施方式
41.i.定义
42.在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
43.如本文中使用的，术语“gpc3”可以指共同指代存在于动物中并且优选地存在于人体中的gpc3本身及其任何变体、同种型和旁系同源物的概念。
44.术语“人gpc3”是指人来源的gpc3。
45.术语“抗gpc3抗体”和“结合gpc3的抗体”指能够以足够亲和力结合gpc3，使得该抗体作为诊断剂和/或治疗剂在靶向gpc3中是有用的抗体。在一个实施方案中，抗gpc3抗体对无关非gpc3蛋白的结合程度小于该抗体对gpc3的结合的约10％，如通过例如放射免疫测定法(ria)测量的。在某些实施方案中，结合gpc3的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8
m或更低，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗gpc3抗体结合在来自不同物种的gpc3间保守的gpc3表位。
[0046]“cd3”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然cd3，除非另外指明。该术语涵盖“全长”未加工的cd3以及源自细胞中加工的任何形式的cd3。该术语还涵盖cd3的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，cd3是人cd3，特别是人cd3的厄普
西隆亚基(cd3ε)。人cd3ε的氨基酸序列显示于uniprot(www.uniprot.org)登录号p07766(版本144)，或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseq np_000724.1。食蟹猴[macaca fascicularis]cd3ε的氨基酸序列显示于ncbi genbank no.bab71849.1。
[0047]
术语“细胞表面”的使用是根据其在本领域的正常含义，因此包括可通过与蛋白和其它分子结合而接近的细胞外部。
[0048]
如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
[0049]
就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为表现出与参照多肽序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为表现出与参照核酸序列至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0050]
序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性(参见，例如：computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university pres,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987；and sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(carrillo,h.&lipman,d.,siam j applied math 48:1073(1988))。
[0051]“取代型”变体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的变体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变体包括取代和插入二者。“插入型”变体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变体。通常情况下，缺失型变体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基酸被缺失。
[0052]
就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于针对其特异靶的特定抗体的特异识别和结合。但是，可变性在抗体的整个可变结构域内不是均匀分布的。可变性集中在被称为互补决定区域(cdrs；即cdr1、cdr2和cdr3)或超变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保守程度更高的部分被称为构架(fr)区或构架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括四个fr区，其主要采用β-折叠构型，它们籍三个cdrs连接起来，cdrs形成环，所述环连接β-折叠结构并在某些情形下形成部分的β-折叠结构。每条链的cdrs通常被fr区在邻近连
接起来，并且借助于来自其它链的cdr，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成(参看kabat等人sequences of proteins of immunological interest,nationalinstitute of health,bethesda,md(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个cdr可具有特异结合关联表位的能力。
[0053]
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个cdr和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，methods in molecular biology，vol 207:recombinant antibodies for cancer therapy methods and protocols(2003)；chapter 1；p 3-25,kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10
7-108m-1的ka)抗原的抗体。“功能片段”或“抗gpc3抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段
″
含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等等。“fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(v
h-v
l
二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个cdrs相互作用，以确定v
h-v
l
二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个cdrs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的cdrs的fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
[0054]
如本文中所用，术语“双特异性”(bispecific antibody，bsab)指抗体和/或抗原结合分子能够特异性结合两种不同的抗原性决定簇，通常，双特异性抗体和/或抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗体和/或抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
[0055]
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(smith et al.(2004)j.clin.pathol.57,912-917；和nelson et al.,j clin pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化b细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如ebv的病毒感染b细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
[0056]
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产
抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，harlow&lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
[0057]
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如vh-ch1-ch2-ch3或vh-ch1-ch2-ch3-ch4)和两条全长轻链(vl-cl)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌b细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
[0058]
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
[0059]“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(cdr)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的cdr残基置换。
[0060]
此外，在人源化中，还可能对vh和/或vl的cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如pcr介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，cdr内的突变通常不超过一个或两个。因此，本公开所述人源化抗体还涵盖cdr内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
[0061]
如本文所用，术语“cdr”指互补决定区(complementarity-determining region)，已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个cdr。cdr也称作高变区，且存在于抗体的每个重链和轻链的可变区中，在cdr的一级结构中具有非常高的变异性位点。本说明书中，重链的cdr由来自重链的氨基端序列的氨基端的cdr1、cdr2、cdr3表示，轻链的cdr由来自轻链的氨基端序列的氨基端的cdr1、cdr2、cdr3表示。这些位点在三级结构中彼此临近，并决定抗体所结合的抗原的特异性。
[0062]
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
[0063]
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1
×
107m-1
或1
×
108m-1
或更大的亲和常数ka(或者1
×
10-7
m或1
×
10-8
m或更低的解离常数(kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(spr)(rich and myszka(2000)curr.opin.biotechnol 11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，paul,ed.,fundamental immunology,2nd ed.,raven press,new york,pages 332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性spr和itc方法的
美国专利第7，229，619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，biacore 2000,biacore ab,upsala,sweden and ge healthcare life sciences；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)。
[0064]
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括dna分子及rna分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cdna。
[0065]
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cdna分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
[0066]
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
[0067]
亦提供本文所述序列表中所述序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及pcr介导的诱变)将修饰引入本文所述的序列表中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域中已有定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗gpc3抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见brummell et al.,biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi et al.,protein eng.12(10):879-884(1999)；burks et al.,proc.natl.acad.sci.usa 94:412-417(1997))。
[0068]
作为另一选择，在另一实施方案中，可通过例如饱和诱变沿抗gpc3抗体编码序列的全部或一部分随机引入突变，且可针对改良的结合活性筛选所得经修饰抗gpc3抗体。
[0069]
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过elisa定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，lowry蛋白测定以及bradford蛋白测定。
[0070]
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于cho细胞、各种cos
细胞、hela细胞、hek细胞例如hek 293细胞。
[0071]
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
[0072]
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
[0073]
如本文所用，“表达载体”包括能够表达dna的载体，所述dna与诸如启动子区的能够影响这类dna片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒dna，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组dna或rna构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆dna的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
[0074]
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
[0075]
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
[0076]
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
[0077]
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
[0078]
如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
[0079]
ii.具体实施方案详述
[0080]
在一方面，本公开提供了一种双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含：
[0081]
(a)结合到靶细胞表面上的gpc3抗原的第一抗原结合部分或其抗原结合片段，所述第一抗原结合部分包含第一重链和第一轻链，所述第一抗原结合部分包含与第一抗原结合的第一结合结构域，其中，所述第一结合结构域包含选自氨基酸序列seq id no:11、12、13、21、32、33、64、65、66、72、73、79、80、81、101、106或其任何变体的重链cdr，和/或选自氨
基酸序列seq id no:16、17、18、26、29、38、39、46、47、48、51、54、57、60、61、69、92、95、98或任何变体的轻链cdr；和
[0082]
(b)结合到t细胞表面上的cd3抗原的第二抗原结合部分或其抗原结合片段，所述第二抗原结合部分包含第二重链和第二轻链，所述第二抗原结合部分包含与第二抗原结合的第二结合结构域。
[0083]
根据前一方面的抗体或其抗原结合部分，所述第一结合结构域包含选自氨基酸序列seq id no:11、32、64、79或其任何变体的重链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:12、21、33、65、72、80、101、106或其任何变体的重链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:13、66、73、81或其任何变体的重链cdr3；和/或所述第一结合结构域包含选自氨基酸序列seq id no:16、38、46、60或其任何变体的轻链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:17、47或其任何变体的轻链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:18、26、29、39、48、51、54、57、61、69、76或其任何变体的轻链cdr3。
[0084]
根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，所述第一结合结构域的重链cdr1、cdr2及cdr3序列选自：氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:11、21、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:32、33、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:64、65、66的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:11、72、73的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:79、80、81的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:11、101、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:11、106、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列；和所述第一结合结构域的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列选自：氨基酸序列seq id no:16、17、18的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、26的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、29的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:38、17、39的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:46、47、48的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、51的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、54的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、57的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:60、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、69的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:16、17、76的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:92、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:95、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:98、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0085]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、18的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0086]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、21、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、18的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0087]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、26的第一轻链cdr1、
cdr2及cdr3序列。
[0088]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、29的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0089]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:32、33、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、18的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0090]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、21、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:38、17、39的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0091]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、21、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、18的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0092]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:46、47、48的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0093]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、51的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0094]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、54的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0095]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、57的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0096]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、12、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:60、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0097]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:64、65、66的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、69的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0098]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、72、73的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、76的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0099]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:79、80、81的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:16、17、69的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0100]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、106、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:60、17、61的第一轻链
cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0101]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、106、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:92、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0102]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、106、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:95、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0103]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:11、106、13的第一重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:98、17、61的第一轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0104]
根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，所述第一结合结构域包含选自氨基酸序列seq id no:9、19、30、40、62、70、77、99、102、104、107、109、111或其任何变体的第一重链可变区，和/或包含选自氨基酸序列seq id no:14、22、24、27、34、36、42、44、49、52、55、58、67、74、82、84、86、88、90、93、96或其任何变体的第一轻链可变区。
[0105]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:14或其任何变体的第一轻链可变区。
[0106]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:19或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:22或其任何变体的第一轻链可变区。
[0107]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:24或其任何变体的第一轻链可变区。
[0108]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:27或其任何变体的第一轻链可变区。
[0109]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:30或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:34或其任何变体的第一轻链可变区。
[0110]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:19或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:36或其任何变体的第一轻链可变区。
[0111]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:40或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:42或其任何变体的第一轻链可变区。
[0112]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:44或其任何变体的第一轻链可变区。
[0113]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:49或其任何变体的第一轻链可变区。
[0114]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:52或其任何变体的第一轻链可变区。
[0115]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:55或其任何变体的第一轻链可变区。
[0116]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:58或其任何变体的第一轻链可变区。
[0117]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:62或其任何
变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:67或其任何变体的第一轻链可变区。
[0118]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:70或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:74或其任何变体的第一轻链可变区。
[0119]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:77或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:82或其任何变体的第一轻链可变区。
[0120]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:111或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:86或其任何变体的第一轻链可变区。
[0121]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:111或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:88或其任何变体的第一轻链可变区。
[0122]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:111或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:90或其任何变体的第一轻链可变区。
[0123]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:111或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:93或其任何变体的第一轻链可变区。
[0124]
在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:111或其任何变体的第一重链可变区，和氨基酸序列seq id no:96或其任何变体的第一轻链可变区。
[0125]
根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，所述第二结合结构域选自氨基酸序列seq id no:134、135、136、139、142、145、148、151、154、155或其任何变体的重链cdr；和/或包含选自氨基酸序列seq id no:115、116、117、122、123、128、131或其任何变体的轻链cdr。
[0126]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含选自氨基酸序列seq id no:134、139、154或其任何变体的第二重链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:135、155或其任何变体的第二重链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:136、142、145、148、151或其任何变体的第二重链cdr3；和/或选自氨基酸序列seq id no:115、122或其任何变体的第二轻链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:116、123、131或其任何变体的第二轻链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:117、128或其任何变体的第二轻链cdr3。
[0127]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域的重链cdr1、cdr2及cdr3序列选自：氨基酸序列seq id no:134、135、136的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:139、135、136的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:139、135、142的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:139、135、145的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:139、135、148的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:139、135、151的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:154、155、136的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列；和所述第二结合结构域的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列选自：氨基酸序列seq id no:115、116、117的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:122、123、117的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:115、116、128的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列，氨基酸序列seq id no:115、131、128的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0128]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:134、135、136的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:115、116、128的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0129]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:134、135、136的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:115、116、117的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0130]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:134、135、136的第二重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和包含氨基酸序列seq id no:122、123、117的第二轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0131]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含选自氨基酸序列seq id no:132、137、140、143、146、149、152、156、158、160或其任何变体的第二重链可变区，和/或包含选自氨基酸序列seq id no:113、118、120、124、126、129或其任何变体的第二轻链可变区。
[0132]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:132或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:126或其任何变体的第二轻链可变区。
[0133]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:156或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:113或其任何变体的第二轻链可变区。
[0134]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:156或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:126或其任何变体的第二轻链可变区。
[0135]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:158或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:113或其任何变体的第二轻链可变区。
[0136]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:158或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:118或其任何变体的第二轻链可变区。
[0137]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:158或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:120或其任何变体的第二轻链可变区。
[0138]
在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:158或其任何变体的第二重链可变区，和氨基酸序列seq id no:126或其任何变体的第二轻链可变区。
[0139]
根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，所述第一抗原结合部分的所述第一轻链为κ型轻链，所述第二抗原结合部分的所述第二轻链为λ型轻链，
[0140]
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一轻链可变区具有gln
43
lys突变(vκ
gpc3
:gln
43
lys)。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区具有gln
39
glu(vh
gpc3
:gln
39
glu)突变。
[0141]
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二轻链可变区具有gln
40
glu突变(vλ
cd3
:gln
40
glu)。在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区具有gln
39
lys突变(vh
cd3
:gln
39
lys)。
[0142]
在一些实施方案中，所述双特异抗体的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的fc部分采用knob-into-hole结构。在一些优选的实施方案中，采用人igg4 knob-into-hole结构。
[0143]
在一些实施方案中，所述第一重链包含选自seq id no:164、172或其任何变体的重链，所述第一轻链包含选自seq id no:162、170或其任何变体的轻链。
[0144]
在一些优选的实施方案中，所述第一重链包含选自seq id no:164或其任何变体的重链，所述第一轻链包含选自seq id no:162或其任何变体的轻链。
[0145]
在一些优选的实施方案中，所述第一重链包含选自seq id no:172或其任何变体
的重链，所述第一轻链包含选自seq id no:170或其任何变体的轻链。
[0146]
在一些优选的实施方案中，所述第二重链包含氨基酸序列seq id no:168或其任何变体的重链，所述第二轻链包含氨基酸序列seq id no:166或其任何变体的轻链。
[0147]
在一个具体实施方案中，所述双特异性抗体的所述第一重链包含氨基酸序列seq id no:164或其任何变体的重链，所述双特异性抗体的第一轻链包含氨基酸序列seq id no:162或其任何变体的轻链；所述第二重链包含氨基酸序列seq id no:168或其任何变体的重链，所述第二轻链包含氨基酸序列seq id no:166或其任何变体的轻链。
[0148]
在一个具体实施方案中，所述第一重链包含氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的重链，所述双特异性抗体的第一轻链包含氨基酸序列seq id no:170或其任何变体的轻链；所述第二重链包含氨基酸序列seq id no:168或其任何变体的重链，所述第二轻链包含氨基酸序列seq id no:166或其任何变体的轻链。
[0149]
在一方面，本公开提供了一种结合gpc3的抗体或其抗原结合部分，所述抗体包含前述第一抗原结合部分。
[0150]
在一些实施方案中，结合gpc3的抗体或其抗原结合部分与前述任一方面的抗体或其抗原结合部分具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
[0151]
在一方面，本公开提供了编码如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分的核酸，或与其具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸分子。
[0152]
在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:10、20、31、41、63、71、78、100、103、105、108、110、112或其任何变体；和/或所述第一抗原结合部分的第一轻链可变区的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:15、23、25、28、35、37、43、45、50、53、56、59、68、75、83、85、87、89、91、94、97或其任何变体。
[0153]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:15。
[0154]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:20；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:23。
[0155]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:25。
[0156]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:28。
[0157]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:31；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:35。
[0158]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸
为核苷酸序列seq id no:20；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:37。
[0159]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:41；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:43。
[0160]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:45。
[0161]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:50。
[0162]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:53。
[0163]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:56。
[0164]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:10；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:59。
[0165]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:63；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:68。
[0166]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:71；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:75。
[0167]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:78；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:83。
[0168]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:112；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:87。
[0169]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:112；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:89。
[0170]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:112；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:91。
[0171]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸
为核苷酸序列seq id no:112；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:94。
[0172]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:112；和所述第一轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:97。
[0173]
优选地，所述第一抗原结合部分的第一重链的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:165、173或其任何变体；和/或所述第一抗原结合部分的第一轻链的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:163、171或其任何变体。
[0174]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:165，和所述第一抗原结合部分的第一轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:163。
[0175]
在一些优选的实施方案中，所述第一抗原结合部分的第一重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:173，和所述第一抗原结合部分的第一轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:171。
[0176]
在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:133、138、141、144、147、150、153、157、159、161或其任何变体；和/或所述第二抗原结合部分的第二轻链可变区的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:114、119、121、125、127、130或其任何变体。
[0177]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:133；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:127。
[0178]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:157；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:114。
[0179]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:157；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:127。
[0180]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:159；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:114。
[0181]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:159；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:119。
[0182]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:159；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:121。
[0183]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:159；和所述第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:127。
[0184]
优选地，所述第二抗原结合部分的第二重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:169或其任何变体；和/或所述第二抗原结合部分的第二轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:167或其任何变体。
[0185]
在一些优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分的第二重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:169，和所述第二抗原结合部分的第二轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:167。
[0186]
在一个具体实施方案中，所述双特异性抗体的所述第一抗原结合部分的第一重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:165，和所述第一抗原结合部分的第一轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:163，所述第二抗原结合部分的第二重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:169，和所述第二抗原结合部分的第二轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:167。
[0187]
在一个具体实施方案中，所述双特异性抗体的所述第一抗原结合部分的第一重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:173，和所述第一抗原结合部分的第一轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:171，所述第二抗原结合部分的第二重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:169，和所述第二抗原结合部分的第二轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:167。
[0188]
在一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。
[0189]
在一方面，本公开提供了包含前述核酸或载体的细胞。
[0190]
在一方面，本公开提供了包含前述双特异性抗体或其抗原结合部分、核酸、载体和/或细胞的组合物。
[0191]
在一方面，本公开提供了包含共价附着至治疗部分的前述双特异性抗体或其抗原结合部分的抗体-药物偶联物。
[0192]
优选地，所述治疗部分选自细胞毒性部分、化疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。
[0193]
本公开的抗体在各种gpc3被不利地表达或发现的疾病中可用作治疗或诊断工具。
[0194]
在一个与gpc3相关的疾病实施方案中，gpc3在患病组织或器官的细胞中的表达与在健康组织或器官中的状态相比有所增加。增加是指增加至少10％、特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，表达仅在患病组织中发现，而在相应健康组织中的表达受阻抑。根据本公开，与gpc3相关的疾病包括肿瘤。
[0195]
在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是gpc3阳性癌症，例如，可以为gpc3阳性肝癌、gpc3阳性肝细胞癌、gpc阳性胰腺癌、gpc阳性肺癌、gpc阳性结肠癌、gpc阳性乳腺癌、gpc阳性前列腺癌、gpc阳性白血病或gpc阳性淋巴瘤。
[0196]
在一些实施方案中，该治疗剂包含特异性结合活化性t细胞抗原的抗体。
[0197]
在一个实施方案中，该治疗剂包含特异性结合cd3，特别是cd3ε的抗体。
[0198]
用本公开的双特异性抗体治疗的疾病和症状方法包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物。
[0199]
在一些实施方案中，本公开提供治疗或预防癌症疾病的方法，其包括向患者施用
能够结合gpc3的抗体，其中施用所述抗体以提供至少40μg/ml的血清水平。在不同实施方案中，施用所述抗体以提供至少50μg/ml、至少150μg/ml、至少300μg/ml、至少400μg/ml或至少500μg/ml的血清水平。在不同实施方案中，施用所述抗体以提供不超过800μg/ml、700μg/ml、600μg/ml、550μg/ml或500μg/ml的血清水平。在一个实施方案中，所提供的血清水平为40μg/ml至700μg/ml，优选为40μg/ml至600μg/ml，优选为50μg/ml至500μg/ml，如150μg/ml至500μg/ml或者300μg/ml至500μg/ml。如本说明书中使用的术语“血清水平”，其意指所讨论的物质在血清中的浓度。在一个实施方案中，提供所述血清水平至少7天或至少14天。在一个实施方案中，所述方法包括施用至少300mg/m2的抗体剂量，如至少600mg/m2，且优选至多1500mg/m2，至多1200mg/m2或至多1000mg/m2。
[0200]
在一些实施方案中，本公开提供治疗或预防癌症疾病的方法，其包括向患者施用能够结合gpc3的抗体，其中以至少300mg/m2，如至少600mg/m2，且优选至多1500mg/m2，至多1200mg/m2或至多1000mg/m2的剂量施用所述抗体。
[0201]
在一些实施方案中，本公开提供治疗或预防癌症疾病的方法，其包括向患者施用能够结合gpc3的抗体，其中所述患者的至少50％，优选为60％、70％、80％或90％的癌细胞为gpc3阳性和/或所述患者的至少40％，优选为50％或60％的癌细胞为gpc3的表面表达阳性。在该方面，本公开还提供治疗或预防癌症疾病的方法，所述方法包括：a.鉴定显示至少50％，优选为60％、70％、80％或90％的gpc3阳性癌细胞和/或至少40％，优选为50％或60％的癌细胞的患者，所述癌细胞为gpc3的表面表达阳性；以及b.向所述患者施用能够结合gpc3的抗体。在一个实施方案中，所述患者的至少95％或至少98％的癌细胞为gpc3阳性的。在一个实施方案中，所述患者的至少70％、至少80％或至少90％的癌细胞为gpc3的表面表达阳性。
[0202]
在本文所述的任何方面的方法的一个实施方案中，癌症疾病的治疗结果是实现病情稳定。在一个实施方案中，病情稳定实现至少2个月、至少3个月或至少6个月。
[0203]
在一些实施方案中，本公开提供实现癌症患者的病情稳定的方法，其包括向所述患者施用能够结合gpc3的抗体。在一个实施方案中，病情稳定实现至少2个月、至少3个月或至少6个月。
[0204]
在本文所述的任何方面的方法的一个实施方案中，以单剂量或多剂量施用抗体。
[0205]
在一些实施方案中，本公开提供治疗或预防癌症疾病的方法，其包括向患者施用能够结合gpc3的抗体，其中以多剂量施用所述抗体。
[0206]
如果根据本公开以多次剂量施用所述抗体，则优选以至少3次剂量、至少4次剂量、至少5次剂量、至少6次剂量、至少7次剂量、至少8次剂量、至少9次剂量或至少10次剂量且优选至多30次剂量、25次剂量、20次剂量、15次剂量或10次剂量施用所述抗体。优选以至少7天、至少10天、至少14天或至少20天的时间间隔施用所述抗体的剂量。优选以7至30天、10至20天且优选为约14天的时间间隔施用所述抗体的剂量。
[0207]
在一个实施方案中，施用所述抗体以便提供至少40μg/ml的血清水平。在不同实施方案中，施用所述抗体以便提供至少50μg/ml、至少150μg/ml、至少300μg/ml、至少400μg/ml或至少500μg/ml的血清水平。在不同实施方案中，施用所述抗体以便提供不超过800μg/ml、700μg/ml、600μg/ml、550μg/ml或500μg/ml的血清水平。在一个实施方案中，所提供的血清水平为40μg/ml至700μg/ml，优选为40μg/ml至600μg/ml，优选为50μg/ml至500μg/ml，如150
μg/ml至500μg/ml或300μg/ml至500μg/ml。在一个实施方案中，提供所述血清水平至少7天或至少14天。在一个实施方案中，所述方法包括施用至少300mg/m2，如至少600mg/m2且优选至多1500mg/m2、至多1200mg/m2或至多1000mg/m2的抗体的剂量。
[0208]
前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物在制备用于治疗哺乳动物中gpc3相关病症的药物中的用途。
[0209]
根据前述任一方面，任选地，所述抗体偶联其他药物，例如带标记或具有细胞毒性的缀合物。
[0210]
在一方面，本公开还包括试剂盒，例如所述试剂盒包括本公开的抗体、其片段、同源物、其衍生物等，例如带标记或具有细胞毒性的缀合物，以及抗体使用说明书、杀死特定类型细胞的缀合物等等。该说明书可包括在体外、体内或离体使用抗体、缀合物等的指导。抗体可以是液体形式或固体，通常是冻干的。该试剂盒可包含其它适宜的试剂，如缓冲液、重构溶液以及为了预定用途的其它必要成分。考虑了以预定量包装好的试剂组合与用于其用途的说明书，所述用途例如用于治疗用途或用于进行诊断测定。当抗体是带标记的时，例如用酶标记的，那么该试剂盒可包括底物和酶所需的辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。此外，其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等也可包括在内。多种试剂的相对量可以改变而提供试剂溶液的浓缩物，这就提供了用户灵活性、节省空间、节省试剂等。这些试剂也可以干粉形式提供，通常是冻干形式，包括赋形剂，它在溶解时可提供具有适当浓度的试剂溶液。
[0211]
前述任一方面的抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物或试剂盒在制备用于抑制gpc3结合的试剂中的用途。
[0212]
此外，本公开的抗体还可用于免疫测定、纯化方法以及其它用到免疫球蛋白或其片段的方法。此类用途在本领域为人所熟知。
[0213]
相应地，本公开还提供包含本公开的抗gpc3的抗体或其片段的组合物，所述抗体方便地和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合，这是本领域的常规做法。
[0214]
本公开所使用的术语“药物组合物”系指多种制备物的制剂。含有治疗有效量的多价抗体的制剂为无菌液体溶液、液体悬浮剂或冻干形式，任选地包含稳定剂或赋形剂。
[0215]
本公开的抗体可以作为单独施用的组合物使用，或可与其它活性剂联合使用。
[0216]
在一些实施方案中，本公开的人源化抗体与治疗部分(即药物)偶联。治疗部分可以是例如细胞毒素、化疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。此类偶联物在本文中称为“抗体-药物偶联物”或“adc”。
[0217]
在一些实施方案中，抗体与细胞毒性部分偶联。细胞毒性部分可以例如选自以下：紫杉醇；细胞松弛素b；短杆菌肽d；溴化乙锭；吐根碱；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；柔红霉素；二羟基蒽二酮；微管蛋白抑制剂如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂如单甲基奥瑞他汀e或f或其类似物或衍生物；海兔毒素10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光辉霉素；放线菌素d；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢药，如甲氨喋呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、癸二嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷化剂，如二氯甲基二乙胺、硫代嘌呤、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)、洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐
菌素、达卡巴嗪(dtic)、丙卡巴嗪、丝裂霉素c；铂类衍生物，如顺铂或卡铂；多卡霉素a、多卡霉素sa、雷切霉素(cc-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，如放线菌素、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、光霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普力霉素、安定霉素(amc)；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(pdb)；白喉毒素及相关分子如白喉a链及其活性片段和杂合分子、蓖麻毒素如蓖麻毒素a或去糖基化蓖麻毒素a链毒素、霍乱毒素、志贺样毒素如slt i、slt ii、slt iiv、lt毒素、c3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆bowman-birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、阿罗林、皂草素、蒴莲根毒素、胶凝蛋白、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-sarcin、油桐(aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白如papi、papii和pap-s、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素；核糖核酸酶(rnase)；dnase i、葡萄球菌内毒素a；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素和假单胞菌内毒素。
[0218]
在一些实施方案中，抗体与奥瑞他汀或其肽类似物、衍生物或前药偶联。已经表明，奥瑞他汀干扰微管动力学、gtp水解以及核和细胞分裂并具有抗癌和抗真菌活性。例如，奥瑞他汀e可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，分别产生aeb和aevb。其他典型的奥瑞他汀衍生物包括afp、mmaf(单甲基奥瑞他汀f)和mmae(单甲基奥瑞他汀e)。合适的奥瑞他汀和奥瑞他汀的类似物、衍生物和前药，以及用于将奥瑞他汀与ab偶联的合适接头描述于例如美国专利号5,635,483、5,780,588和6,214,345以及国际专利申请公开wo02088172、wo2004010957、wo2005081711、wo2005084390、wo2006132670、wo03026577、wo200700860、wo207011968和wo205082023。
[0219]
在一些实施方案中，抗体与吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(pdb)或其肽类似物、衍生物或前药偶联。合适的pdb以及pdb衍生物和相关技术描述于例如hartley j.a.等,cancer res 2010；70(17):6849-6858；antonow d.等,cancer j 2008；14(3):154-169；howard p.w.等,bioorg med chem lett 2009；19:6463-6466和sagnou等,bioorg medchem lett2000；10(18):2083-2086。
[0220]
在一些实施方案中，抗体与选自以下的细胞毒性部分偶联：蒽环类抗生素、美登素、卡奇霉素、多卡霉素、雷切霉素(cc-1065)、海兔毒素10、海兔毒素15、伊立替康、单甲基奥瑞他汀e、单甲基奥瑞他汀f、pdb，或它们任何的类似物、衍生物或前药。
[0221]
在一些实施方案中，抗体与蒽环类抗生素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与美登素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与卡奇霉素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与多卡霉素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与雷切霉素(cc-1065)或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与海兔霉素10或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与海兔霉素15或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与单甲基奥瑞他汀e或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与单甲基奥瑞他汀f或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与伊立替康或其类似物、衍生物或前药偶联。
[0222]
在一些实施方案中，抗体与细胞因子(例如il-2、il-4、il-6、il-7、il-10、il-12、
il-13、il-15、il-18、il-23、il-24、il-27、il-28a、il-28b、il-29、kgf、ifna、ifn3、ifny、gm-csf、cd40l、flt3配体、干细胞因子、安西司亭和tnfa)偶联。
[0223]
在一些实施方案中，抗体与放射性同位素或含放射性同位素的螯合物偶联。例如，抗体可以与允许抗体与放射性同位素络合的螯合剂接头(例如dota、dtpa或噻西坦)偶联。抗体还可以或可选地包含一个或多个放射性标记的氨基酸或其他放射性标记的分子或与之偶联。放射性同位素的非限制性实例包括3h、
14
c、
15
n、
35
s、
90
y、
99
tc、
125
i、
131
i、
186
re、
213
bi、
225
ac和
227
th。为了治疗目的，可以使用发射β或α颗粒辐射的放射性同位素，例如
131
i、
90
y、
211
at、
212
bi、
67
cu、
186
re、
188
re和
212
pb。
[0224]
将分子与抗体偶联的技术是本领域熟知的。通常，核酸分子分别通过n-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺官能团与抗体上的赖氨酸或半胱氨酸共价连接。据报道，使用工程化半胱氨酸或整合非天然氨基酸的偶联方法可改进偶联物的同质性。特别地，本领域技术人员还可以预期用含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如含有gin肽的标签或q-标签)或通过多肽工程(例如通过多肽上的氨基酸缺失、插入、取代或突变)产生反应性的内源性谷氨酰胺工程化的含fc多肽。然后，转谷氨酰胺酶可与胺供体剂(例如，包含或连接于反应性胺的小分子)共价交联，以形成稳定且均质的工程化含fc多肽偶联物群，其中胺供体剂通过含酰基供体谷氨酰胺标签或可接近/暴露/反应性的内源性谷氨酰胺位点特异性地与含fc多肽偶联(wo2012059882)。
[0225]
应当理解，根据所述实施方案的治疗剂将与合适的药学上可接受的载体、赋形剂、以及其它被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一同施用。大量适当的制剂可见于所有药物化学工作者已知的药典中：remington's pharmaceutical sciences(第15版，mack publishing company，easton，pa.(1975))，特别是其中blaug、seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)载体(例如lipofectin
tm
)、dna缀合物、无水吸浆、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶以及含有聚乙二醇的半固态混合物。任何前述混合物均可适用于根据本公开的治疗或疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理学上是相容的并耐受给药途径。
[0226]
在一个实施方案中，可将所述抗体用作治疗剂。此类试剂将通常用于治疗、缓解和/或预防受试者的与异常gpc3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病理。可使用标准方法通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与异常gpc3表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍，例如gpc3相关病症的人患者来实施治疗方案。将抗体制剂，优选对其靶抗原有高特异性和高亲和性的抗体制剂施用给受试者并且将通常因其与靶标结合而产生效应。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如gpc3)的表达、活性和/或信号传导功能。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如gpc3)与其所天然结合的内源性的配体结合。例如，抗体与靶标结合并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和/或以其它方式妨碍gpc3表达、活性和/或信号传导。在一些实施方案中，为治疗与异常gpc3表达相关的疾病或障碍，可将具有重链和轻链cdr的抗体施用给受试者。
[0227]
在另一个实施方案中，针对gpc3的抗体可用于本领域中已知的与gpc3定位和/或定量相关的方法(例如，用于测定适当生理样品中的gpc3和/或gpc3的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等等)。在一个给定实施方案中，对gpc3或其衍生物、片段、类似物或同系物具
有特异性的、包含源于抗体的抗原结合结构域的抗体，被用作药物学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
[0228]
在另一个实施方案中，可通过标准技术例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，使用对gpc3具有特异性的抗体来分离gpc3多肽。针对gpc3蛋白质的抗体(或其片段)可用于检测生物样品中的蛋白质。在一些实施方案中，在生物样品中可检测gpc3作为临床测试过程的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联(即物理连接)到可检测物质可有利于检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的一个示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白，并且合适放射性材料的示例包括
125
i、
131
i、
35
s或3h。
[0229]
在另一个实施方案中，根据本公开的抗体可用作检测样品中gpc3或其蛋白质片段存在的试剂。在一些实施方案中，抗体包含可检测标记。抗体为多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。使用完整的抗体或其片段(例如fab、scfv或f(ab')2)。关于抗体的术语“标记”旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到该抗体来直接标记该抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记该抗体。间接标记的示例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素进行末端标记抗体，以便能够用荧光标记的链霉亲和素进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物学流体，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。因此，使用的术语“生物样品”包括血液和血液中的级分或组分，包括血清、血浆、或淋巴液。换言之，所述实施方案的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的分析物mrna、蛋白质或基因组dna。例如，分析物mrna体外检测技术包括norhtern杂交和原位杂交。分析物蛋白质体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(elisa)、western印迹、免疫沉淀、以及免疫荧光。分析物基因组dna体外检测技术包括southern杂交。用于进行免疫测定的过程描述于例如“elisa:theory and practice:methods in molecular biology”，第42卷，j.r.crowther(编辑)human press，totowa，n.j.，1995；“immunoassay”，e.diamandis和t.christopoulus，academic press，inc.，san diego，calif.，1996；以及“practice and theory of enzyme immunoassays”，p.tijssen，elsevier science publishers，amsterdam，1985。此外，分析物蛋白质的体内检测技术包括向受试者体内导入标记的抗分析物蛋白抗体。例如，可以用放射性标记标记抗体，然后可以通过标准成像技术检测受试者体内该放射性标记物的存在和位置。
[0230]
可将本文所述抗体和其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的，例如参见remington's pharmaceutical sciences:the science and practice of pharmacy第19版(alfonso r.gennaro等人编辑)mack pub.co.，easton，pa.:1995；drug absorption enhancement:concepts，possibilities，limitations，and trends，harwood academic publishers，langhorne，pa.，1994；以及peptide and protein drug delivery(advances in parenteral sciences，第4卷)，1991，m.dekker，new york。
[0231]
此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。当使用抗体片段时，与靶蛋白
结合结构域特异性结合的最小抑制片段可为优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组dna技术产生(参见例如marasco等人，proc.natl.acad.sci.usa，90:7889-7893(1993))。
[0232]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适的药学上可接受的载体描述于最新版的remington's pharmaceutical sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组合物中的用途。
[0233]
将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。ph可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。
[0234]
适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的药学上可接受的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，parsippany，n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
[0235]
根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将抗体掺入含有碱性分散介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含活性成分和任何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。
[0236]
对于吸入给药，从包含合适推进剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气溶胶喷雾形式递送化合物。
[0237]
还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜
给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。
[0238]
还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。
[0239]
在一个实施方案中，所述抗体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0240]
尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体。所述实施方案的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：抗体的独特特征和待实现的具体治疗效果，和用于治疗个体的此类抗体的调配领域中固有的局限性。
[0241]
所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。
[0242]
本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述抗体，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地联合存在。例如，可以在试剂盒中联合存在，也可以在使用中联合存在。
[0243]
在一个实施方案中，一种或多种所述抗体可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗剂(其可用于治疗病理学病症或障碍，例如各种形式的癌症、自身免疫性障碍和炎性疾病)联合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地，同时地或顺次地给予。如果顺次给予，则在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种仍优选在治疗位点处以有效浓度被检测到。在一种情况下，“联合”也可以是在试剂盒中同时包含本公开的抗体和其他治疗剂。
[0244]
例如，联合治疗可包含本文所述一种或多种抗体与一种或多种附加治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂，如下更详述的)共同配制和/或共同施用。此类联合治疗可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
[0245]
在一个实施方案中，与相应的不施用抗gpc3抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该t细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放。
[0246]
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
[0247]
实施例
[0248]
实施例1：抗原表达和稳转细胞的构建
[0249]
以人gpc3(sino biological，hg10088)为模板，扩增人gpc3胞外区(25-563)，转染hek293e细胞，表达得到人gpc3重组蛋白(seq id no.1)，或将近膜端序列(aa 524-563)通
过gibson assembly方法插入pgex3x载体ecori位点，质粒转染大肠杆菌bl21(de3)，iptg诱导表达纯化得到gst-人gpc3 stem重组蛋白(seq id no.2)。同样方法表达得到gst-食蟹猴gpc3 stem重组蛋白(seq id no.3)和gst-小鼠gpc3 stem重组蛋白(seq id no.4)。图1示出了gpc3重组蛋白的非还原sds-page结果。
[0250]
将含有人和恒河猴gpc3全长序列的lenti载体和包装质粒(genecoepia)，共转染hek293t细胞，转染48小时后收集含有假病毒的培养上清，取10μl感染1x10
6 cho细胞，加入嘌呤霉素(puromycin)进行抗性筛选，最终分离得到高表达人或猴gpc3的稳转细胞cho-hgpc3(克隆2b10)和cho-cynogpc3(克隆4d6)。图2示出了gpc3稳转细胞的流式细胞检测结果。
[0251]
构建人或猴cd3εγ异源二聚体：合成人cd3γ(uniprot p09693，gln23-asn116)和cd3ε(uniprot p07766，gln23-asp126)胞外区核苷酸序列，c端分别与人igg fc hole或fc knob融合，表达形成人cd3εγ-fc异源二聚体(人cd3γigg fc(hole)的氨基酸序列如seq id no.5所示，人cd3εigg fc(knob)的氨基酸序列如seq id no.6所示)；同样合成食蟹猴cd3γ(uniprot q95li7，gln23-asn110)和cd3ε(uniprot q95li5，gln22-asp117)，c端与食蟹猴igg fc hole或fc knob融合，表达形成食蟹猴cd3εγ-fc异源二聚体(食蟹猴cd3γigg fc(hole)的氨基酸序列如seq id no.7所示，食蟹猴cd3γigg fc(knob)的氨基酸序列如seq id no.8。将表达cd3γ-fc和cd3ε-fc的重组质粒与3mg/ml pei(polysciences，#24765-2)混合，共转染hek293e细胞(培养基opm-293 cd03 dpm)，37℃120rpm 5％co2培养7天后，收集培养基上清液，经protein a亲和层析纯化，得到人或食蟹猴cd3εγ-fc重组蛋白，sds-page纯度高于95％(图3)。
[0252]
实施例2、动物免疫和gpc3抗体的制备
[0253]
1、gpc3抗体筛选
[0254]
选择4-6周龄雌性balb/c小鼠，使用人gpc3胞外区全长或近膜端序列(aa 524-563)构建瞬时表达质粒，以基因枪对小鼠进行dna免疫，每次免疫20μg质粒/小鼠，每周一次，免疫8次后检测血清滴度，以cho-hgpc3稳转细胞(5
×
106细胞/只)进行冲击免疫。3天后，断颈处死小鼠，收集小鼠脾脏与外周淋巴结，研磨离心收集后提取总rna，逆转录后分别利用轻重链特异性引物进行pcr扩增，得到抗体的轻链和重链可变区cdna文库。利用噬菌体抗体库展示技术，构建基于丝状噬菌体m13的gpc3免疫文库，用于后续噬菌体淘选。
[0255]
采用经典的淘选方式，在免疫管(immuno tube)上包被人gpc3重组蛋白，加入1ml gpc3噬菌体免疫文库进行孵育和淘洗，洗脱展示高亲和力fab的噬菌体并感染tg1细菌，再次制备噬菌体用于下一轮淘洗。经过2轮淘洗筛选，接种单克隆至96孔u形板中进行iptg诱导表达，取培养上清进行elisa检测，共得到323个识别人gpc3胞外区近膜端的阳性克隆。
[0256]
通过测序选择部分克隆，将轻、重链基因分别克隆到含有抗体轻链恒定区或人igg1重链恒定区ch1-ch3的真核表达载体，共转染hek293e细胞，37℃ 120rpm 5％co2培养5-6天后，收集培养基上清液，通过protein a层析柱纯化得到igg抗gpc3嵌合抗体。对照抗体gc33参照文献nakano k等(2009)合成，表达为人igg1嵌合抗体(简称gc33)。
[0257]
gpc3抗体可变区序列如下所示：
[0258]
表1、gpc3鼠源抗体的可变区序列
[0259][0260][0261]
5d6
[0262]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0263]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0264]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0265]
核酸序列
[0266]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0267]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.14所示，其编码核酸如seq id no.15所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、18所示。
[0268]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0269]
isrveaedlgvyfcsqsthvpltfgagtklelk
[0270]
核酸序列
[0271]
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
[0272]
29a10
[0273]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.19所示，其编码核酸如seq id no.20所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、21、13所示。
[0274]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
evqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfkgkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0275]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0276]
核酸序列
[0277]
gaggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0278]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.22所示，其编码核酸如seq id no.23所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、18所示。
[0279]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0280]
isrveaedlgvyfcsqsthvpltfgagtkleik
[0281]
核酸序列
[0282]
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaa
[0283]
34h1
[0284]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0285]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0286]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0287]
核酸序列
[0288]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0289]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.24所示，其编码核酸如seq id no.25所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、26所示。
[0290]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0291]
isrveaedlgvyfcsqsihvpltfgagtklelk
[0292]
核酸序列
[0293]
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtatacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
[0294]
19f1
[0295]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0296]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0297]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0298]
核酸序列
[0299]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0300]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.27所示，其编码核酸如seq id no.28所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、29所示。
[0301]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0302]
isrveaedlgvyfcsqsthiptfgggtklelk
[0303]
核酸序列
[0304]
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatattcccacgttcggtggaggcaccaagctggagctgaaa
[0305]
30b7
[0306]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.30所示，其编码核酸如seq id no.31所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.32、33、13所示。
[0307]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvrlsckalgytftdyemhwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqkfkgkatltadksssta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0308]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0309]
核酸序列
[0310]
caggttcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaggctgtcctgcaaggctttgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0311]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.34所示，其编码核酸如seq id no.35所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、18所示。
[0312]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0313]
isrveaedlgvyfcsqsthvpltfgagtkleik
[0314]
核酸序列
[0315]
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaatcaaa
[0316]
28g4
[0317]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.19所示，其编码核酸如seq id no.20所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、21、13所示。
[0318]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
evqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfkgkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0319]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0320]
核酸序列
[0321]
gaggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0322]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.36所示，其编码核酸如seq id no.37所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.38、17、39所示。
[0323]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrssqsivhsngntylqwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0324]
isrveaedlgvyycfqgshvpytfgggtkleik
[0325]
核酸序列
[0326]
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctatttacaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
[0327]
30a4
[0328]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.40所示，其编码核酸如seq id no.41所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、21、13所示。
[0329]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgyafadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfkgkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0330]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0331]
核酸序列
[0332]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacgcatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0333]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.42所示，其编码核酸如seq id no.43所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、18所示。
[0334]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0335]
isrveaedlgvyfcsqsthvpltfgagtklelk
[0336]
核酸序列
[0337]
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
[0338]
38d2
[0339]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0340]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0341]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0342]
核酸序列
[0343]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaag
gctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0344]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.44所示，其编码核酸如seq id no.45所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.46、47、48所示。
[0345]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslensngntylnwylqkpgqspqlliyrvsnrfsgvldrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0346]
isrveaedlgvyfclqvthvpytfgggtkleik
[0347]
核酸序列
[0348]
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcaggtctagtcagagccttgaaaacagtaatggaaacacctatttgaactggtacctccagaaaccaggccagtctccacagctcctgatctacagggtttccaaccgattttctggggtcctagacaggttcagtggtagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttatttctgcctccaagttacacatgtcccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
[0349]
39g4
[0350]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0351]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0352]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0353]
核酸序列
[0354]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0355]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.49所示，其编码核酸如seq id no.50所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、51所示。
[0356]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvvtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0357]
isrveaedlgvyfcsqsthvptfgggtkleik
[0358]
核酸序列
[0359]
gatgttgtggtgactcaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaggcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacag
atttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
[0360]
41f1
[0361]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0362]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0363]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0364]
核酸序列
[0365]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0366]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.52所示，其编码核酸如seq id no.53所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、54所示。
[0367]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0368]
isrveaedlgvyfcsqnthvpltfgagtklelk
[0369]
核酸序列
[0370]
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaaatacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
[0371]
41h1
[0372]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0373]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0374]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0375]
核酸序列
[0376]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactat
tcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0377]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.55所示，其编码核酸如seq id no.56所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、57所示。
[0378]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlr
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0379]
isrveaedlgvyfcsqstrvpltfgagtklelk
[0380]
核酸序列
[0381]
gatgttgtgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaggatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacgtgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
[0382]
49g8
[0383]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.9所示，其编码核酸如seq id no.10所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、12、13所示。
[0384]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaynqtfegkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0385]
ymelssltsedsavyyctryysfaywgqgtlvtvsa
[0386]
核酸序列
[0387]
caggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggagtggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacaatcagacgttcgagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatactattcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0388]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.58所示，其编码核酸如seq id no.59所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.60、17、61所示。
[0389]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqsivhsngntylewylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》isrveaedlgvyfclqvthvpltfgagtklelk
[0390]
核酸序列
[0391]
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgcctccaagttacacatgtcccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
[0392]
46c3
[0393]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.62所示，其编码核酸如seq id no.63所示，其
hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.64、65、66所示。
[0394]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgpelvkpgasvkisckasgytftdyyinwvkqkpgqglewigwiypgsgntkynekfkgkatltvdtsssta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑
fr4
‑‑
》
[0395]
ymqlssltsedtavyfcargrwgqgtlvtvsa
[0396]
核酸序列
[0397]
caggtccagttgcaacagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggctacaccttcactgactactatataaactgggtgaagcagaagcctggacagggacttgagtggattggatggatttatcctggaagcggtaatactaagtacaatgagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatccgaggacactgctgtctatttctgtgcaagggggcgctggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0398]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.67所示，其编码核酸如seq id no.68所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、69所示。
[0399]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvmtqtplslpvslrdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0400]
isrveaedlgvyfcsqsthvprtfgggtklelk
[0401]
核酸序列
[0402]
gatgttgtgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttcgagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttcctcggacgttcggtggaggcaccaagctggagctgaaa
[0403]
42a1
[0404]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.70所示，其编码核酸如seq id no.71所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、72、73所示。
[0405]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelvrpgasvklsckalgytfadyeihwvkqtpvhglewigaihpgsggtaysqtfkgkatltadksstta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑‑
》
[0406]
ymelssltsedsavyyctryfsfaywgqgtlvtvsa
[0407]
核酸序列
[0408]
caggttcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctttgggctacacatttgctgactatgaaatacactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattcatccaggaagtggtggtactgcctacagtcagacgttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatggagctcagcagcctgacatctgaggactctgctgtctattactgtacaagatacttttcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0409]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.74所示，其编码核酸如seq id no.75所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、76所示。
[0410]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
dvvv
tqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0411]
isrveaedlgvyfcsqsthapytfgggtrleik
[0412]
核酸序列
[0413]
gatgttgtggtgactcaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgctccgtacacgttcggaggggggaccagactggaaataaaa
[0414]
47b6
[0415]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.77所示，其编码核酸如seq id no.78所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.79、80、81所示。
[0416]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
qvqlqqsgaelmkpgasvkisckatgytfssywiewvkqrpghglewigeilpgsgstnynekfkgkatftadtssnta
‑‑‑‑‑‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑
fr4
‑‑
》
[0417]
ymqlssltsedsavyycargywgqgtlvtvsa
[0418]
核酸序列
[0419]
caggttcagctgcaacagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagctactggatagagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtactaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcgaggggttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0420]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.82所示，其编码核酸如seq id no.83所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.16、17、69所示。
[0421]
《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
fr1
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr1《
‑‑‑‑‑
fr2
‑‑‑‑‑
》cdr2《
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
divmtqaplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlk
‑‑
fr3
‑‑‑‑‑‑‑‑
》cdr3《
‑‑‑
fr4
‑‑
》
[0422]
isrveaedlgvyfcsqsthvprtfgggtkleik
[0423]
核酸序列
[0424]
gatattgtgatgacgcaggctccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttcctcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
[0425]
用facs检测上述抗体与人gpc3稳转细胞的结合。取对数生长期的实施例1制备的cho-人gpc3稳转细胞，用4％小牛血清(hyclone，sh30626.06)调整细胞至5
×
105细胞/ml，加入100μl/孔细胞悬液至96孔u型板，300g离心5分钟，弃上清，每孔加入100μl梯度稀释的抗体(起始浓度200nm，3倍稀释，12个梯度)，4℃孵育45分钟。二抗加入50μl/孔alexa fluro647标记的山羊抗人igg fc(1:300稀释)，冰上孵育45分钟，用流式细胞仪进行检测。
图4显示嵌合抗体和人gpc3-cho稳转细胞的流式细胞检测结果。
[0426]
利用bli生物膜干涉技术(octet)，将待测抗体捕获在protein a探针上，检测与人gpc3蛋白(10μg/ml为起始浓度，2倍梯度，共5个浓度点)的结合能力，根据结合及解离速率得到亲和力常数kd。
[0427]
综合facs和octet检测结果，共得到15个高亲和力识别细胞膜上gpc3受体，同时结合gpc3重组蛋白的阳性单克隆抗体。表2显示单克隆抗体与人gpc3的亲和力常数。
[0428]
表2、单克隆抗体与人gpc3的结合活性
[0429][0430]
2、gpc3候选抗体的人源化
[0431]
2.1候选抗体的种属交叉反应
[0432]
选择高亲和力阳性克隆49g8检测与人、食蟹猴、小鼠gpc3全长重组蛋白和人gpc3胞外区近膜端重组蛋白的结合活性。将1μg/ml上述蛋白4℃包被过夜，封闭后，加入49g8嵌合抗体(以200nm为起始浓度，3倍梯度稀释，共12个浓度)，室温反应1小时；二抗加入hpr标记的山羊抗人igg fc，tmb溶液显色后，以浓硫酸终止反应并在450nm处读出吸光度。elisa结果如图5所示，49g8抗体可结合人和食蟹猴gpc3全长蛋白及人gpc3胞外区近膜端，亲和力略高于对照抗体，与小鼠gpc3蛋白亲和力弱(表3)。
[0433]
表3、49g8与不同种属gpc3全长蛋白及人gpc3近膜端蛋白elisa测定结果
[0434][0435]
2.2抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(adcc)
[0436]
以表达gpc3的人肝癌细胞hepg2作为靶细胞，调整靶细胞密度5
×
104细胞/孔，调
整效应细胞nk92mi-cd16a1
×
105细胞/孔，加入梯度稀释的抗体(66.7nm为起始浓度，10倍梯度，共6个稀释度)，37℃、5％co2培养箱中培养4小时，取上清检测乳酸脱氢酶(ldh)释放。结果如图6所示，49g8嵌合抗体可介导对靶细胞hepg2的adcc作用。
[0437]
2.3 49g8抗体的人源化
[0438]
通过cdr移植和点突变，对鼠源抗体49g8可变区序列进行了人源化改造。mab49g8鼠源抗体轻链为小鼠imgt_mvk1-110，选择与其框架区同源性最高的人imgt_hvk2-28进行cdr移植，fm4选用同源性最高的人igkj4*01；鼠源抗体重链为ighv1-15，选择人胚系基因imgt_hvh1-69进行cdr移植，fm4选用同源性最高的人ighj4*01。设计回复突变，共合成6个重链可变区和6个轻链可变区人源化变体，组合配对后，在hek293e细胞中瞬时表达，37℃120rpm 5％co2培养5-6天后，收集培养基上清液，通过protein a层析柱纯化得到抗gpc3人源化抗体。
[0439]
利用elisa方法，测定49g8人源化抗体与人和食蟹猴gpc3全长蛋白的结合活性；利用流式细胞仪，检测49g8人源化抗体与人gpc3-cho稳转细胞的结合。elisa结果如图7所示，49g8人源化抗体均可高亲和力结合人和食蟹猴gcp3重组蛋白。facs结果如图8所示，49g8人源化抗体对人gpc3-cho稳转细胞的亲和力与人源化前鼠抗的结合能力相当，略高于对照抗体。人源化抗体重链/轻链可变区序列如下：
[0440]
表4、人源化gpc3抗体的轻链可变区序列
[0441][0442]
h49g8vkv1
[0443]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.84所示，其编码核酸如seq id no.85所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.60、17、61所示。
[0444]
dvvmtqsplslpvtlgqpasiscrssqsivhsnyntylewyqqrpgqsprlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleik
[0445]
核酸序列
[0446]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacactgggacagcctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaactacaacacatacctggaatggtatcagcagaggcctggccagtctcctagactgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0447]
h49g8vkv2
[0448]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.86所示，其编码核酸如seq id no.87所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.60、17、61所示。
[0449]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsnyntylewylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsg
sgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleik
[0450]
核酸序列
[0451]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaactacaacacatacctggagtggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0452]
h49g8vkv3
[0453]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.88所示，其编码核酸如seq id no.89所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.60、17、61所示。
[0454]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsngntylewylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleik
[0455]
核酸序列
[0456]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaacggcaacacatacctggagtggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0457]
h49g8vkv4
[0458]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.90所示，其编码核酸如seq id no.91所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.92、17、61所示。
[0459]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsnsntylewylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleik
[0460]
核酸序列
[0461]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaacagcaacacatacctggagtggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0462]
h49g8vkv5
[0463]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.93所示，其编码核酸如seq id no.94所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.95、17、61所示。
[0464]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsntntylewylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleik
[0465]
核酸序列
[0466]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaacacaaacacatacctggagtggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgccc
ctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0467]
h49g8vkv6
[0468]
轻链vk的氨基酸序列如seq id no.96所示，其编码核酸如seq id no.97所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.98、17、61所示。
[0469]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsnantylewylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleik
[0470]
核酸序列
[0471]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaacgccaacacatacctggagtggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0472]
表5、人源化gpc3抗体的重链可变区序列
[0473][0474]
h49g8vhv1
[0475]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.99所示，其编码核酸如seq id no.100所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、101、13所示。
[0476]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvrqapgqglewmgaihpgsggtaynqkfqgrvtltadkssttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvss
[0477]
核酸序列
[0478]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgacaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacaaccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacaagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctct
[0479]
h49g8vhv2
[0480]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.102所示，其编码核酸如seq id no.103所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、101、13所示。
[0481]
qvqlvqsgaelkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvrqapgqglewmgaihpgsggtaynqkfqgrvtltadkssttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvss
[0482]
核酸序列
[0483]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaactgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgacaggctccaggacagggacttgaatggatg
ggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacaaccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacaagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctct
[0484]
h49g8vhv3
[0485]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.104所示，其编码核酸如seq id no.105所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、106、13所示。
[0486]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvrqapgqglewmgaihpgsggtayaqkfqgrvtltadkssttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvss
[0487]
核酸序列
[0488]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgacaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacgcccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacaagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctct
[0489]
h49g8vhv4
[0490]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.107所示，其编码核酸如seq id no.108所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、101、13所示。
[0491]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvrqapgqglewmgaihpgsggtaynqkfqgrvtltadessttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvss
[0492]
核酸序列
[0493]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgacaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacaaccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacgagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctct
[0494]
h49g8vhv5
[0495]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.109所示，其编码核酸如seq id no.110所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、101、13所示。
[0496]
qvqlvqsgaelkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvrqapgqglewmgaihpgsggtaynqkfqgrvtltadessttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvss
[0497]
核酸序列
[0498]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaactgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgacaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacaaccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacgagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctct
[0499]
h49g8vhv6
[0500]
重链vh的氨基酸序列如seq id no.111所示，其编码核酸如seq id no.112所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.11、106、13所示。
[0501]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvrqapgqglewmgaihpgsggtayaqkfqgrvtltadessttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvss
[0502]
核酸序列
[0503]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgacaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacgcccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacgagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctct
[0504]
2.3人源化抗体的亲和力
[0505]
1)生物膜干涉技术(biolayer interferometry，bli)
[0506]
利用bli生物膜干涉技术(octet)，将待测抗体捕获在protein a探针上，检测与人gpc3蛋白(10μg/ml为起始浓度，2倍梯度，共5个浓度点)的结合能力，根据结合及解离速率得到亲和力常数kd。结果如图9所示，49g8人源化抗体高亲和力结合gpc3重组蛋白，亲和力数据见表6。
[0507]
表6、bli分析49g8人源化抗体与人gpc3全长蛋白的亲和力结果
[0508][0509]
2)表面等离子共振(surface plasmon resonance,spr)
[0510]
选择亲和力较高的人源化抗体，比较与人和食蟹猴gpc3的结合能力。通过protein a芯片(ge healthcare)捕获人源化抗体h49g8vhv6vkv3，将梯度稀释的人和食蟹猴gpc3重组蛋白(5μg/ml为起始浓度，2倍梯度，共5个浓度点)，以30μl/min的流速流过芯片，结合时间150秒，解离时间600秒。通过biacore t200 evaluation软件以langmuir 1:1kinetics模型，拟合得到动力学常数。结果如图10所示，人源化抗体h49g8vhv6vkv3高亲和力结合人和食蟹猴gpc3，与人gpc3的亲和力为1.39nm，与食蟹猴gpc3亲和力为2.10nm，亲和力相当。亲和力数据见表7。
[0511]
表7、spr分析候选抗体与人和食蟹猴gpc3全长蛋白的亲和力结果
[0512][0513]
2.4人源化抗体的内吞
[0514]
取对数生长期的hepg2细胞，用预热培养基洗细胞一次，1000rpm离心3分钟，弃上清，加入无血清的培养基将细胞重悬到1
×
106细胞/ml；吸取细胞至ep管中200μl/管，加入预冷的500μl 0.5％bsa/pbs，1000rpm离心3分钟，弃上清，加入10μg/ml gpc3待测抗体，4℃或37℃分别孵育60分钟、120分钟、240分钟、120分钟、180分钟、240分钟，每个时间点一抗孵育结束后，加入预冷的500μl 0.5％bsa/pbs洗2遍后，直接加入1:300稀释的二抗af647标记的山羊抗人igg fc孵育45分钟。二抗孵育结束后，500μl 0.5％bsa/pbs洗2遍，将细胞重悬至200μl进行facs检测。流式细胞检测结果如图11所示，gpc3人源化抗体在37℃实验条件和4℃实验条件下，均未见明显的内吞作用。
[0515]
实施例3：gpc3
×
cd3双特异抗体的构建
[0516]
1、cd3人源化抗体的构建
[0517]
鼠源杂交瘤cd3抗体(embo j.1985.4(2):337-344；j.immunol.1986,137(4):1097-100；j.exp.med.1991,174:319-326；j.immunol.1991,147(9):3047-52)识别人和猴cd3受体，其序列如下：
[0518]
抗cd3鼠单抗轻链氨基酸序列：
[0519]
qavvtqesalttspgetvtltcrsstgavttsnyanwvqqkpdhlftgliggtnkrapgvparfsgsligdkaaltitgaqtedeaiyfcalwysnlwvfgggtkltvl
[0520]
抗cd3鼠单抗重链氨基酸序列：
[0521]
evqlvesggglvqpkgslklscaasgftfntyamnwvrqapgkglewvarirskynnyatyyadsvkdrftisrddsqsilylqmnnlktedtamyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0522]
将抗cd3鼠单抗人源化，选择同源性最高的人胚系基因imgt_hvl7-43进行轻链cdr移植，fm4选用人iglj3*02；选择人imgt_hvh3-73进行重链cdr移植，fm4选用人ighj4*01。设计共得到不同的重链变体和轻链变体(表8、9)。
[0523]
表8、cd3人源化抗体的轻链可变区序列
[0524][0525]
hvl1的氨基酸序列如seq id no.113所示，其编码核酸如seq id no.114所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.115、116、117所示。
[0526]
qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqqkpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltlsgaqpedeaeyycalwysnlwvfgggtkltvl
[0527]
核酸序列
[0528]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtaga
tcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcagcagaagcccggccaggctcctagaggactgatcggcggaacaaacaagagagccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacactttctggtgctcagcctgaggacgaggccgagtactattgtgccctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctg
[0529]
hvl2的氨基酸序列如seq id no.118所示，其编码核酸如seq id no.119所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.115、116、117所示。
[0530]
qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltlsgaqpedeaeyycalwysnlwvfgggtkltvl
[0531]
核酸序列
[0532]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcaggagaagcccggccaggctcctagaggactgatcggcggaacaaacaagagagccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacactttctggtgctcagcctgaggacgaggccgagtactattgtgccctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctg
[0533]
hvl3的氨基酸序列如seq id no.120所示，其编码核酸如seq id no.121所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.122、123、117所示。
[0534]
eavvtqepsltvspggtvtltcessdgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkeapwtparfsgsllggkaaltlsgaqpedeaeyycalwysnlwvfgggtkltvl
[0535]
核酸序列
[0536]
gaggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtgagtcttctgacggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcaggagaagcccggccaggctcctagaggactgatcggcggaacaaacaaggaggccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacactttctggtgctcagcctgaggacgaggccgagtactattgtgccctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctg
[0537]
hvl4的氨基酸序列如seq id no.124所示，其编码核酸如seq id no.125所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.122、123、117所示。
[0538]
qavvtqepsltvspggtvtltcessdgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkeapwtparfsgsllggkaaltlsgaqpedeaeyycalwysnlwvfgggtkltvl
[0539]
核酸序列
[0540]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtgagtcttctgacggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcaggagaagcccggccaggctcctagaggactgatcggcggaacaaacaaggaggccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacactttctggtgctcagcctgaggacgaggccgagtactattgtgccctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctg
[0541]
hvl5的氨基酸序列如seq id no.126所示，其编码核酸如seq id no.127所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.115、116、128所示。
[0542]
qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltitgaqaedeaeyycvlwysnlwvfgggtkltvl
[0543]
核酸序列
[0544]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcaggagaagcccggccaggctcctagaggactgatcggcggaacaaacaagagagccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacaatcactggtgctcaggctgaggacgaggccgagtactattgtgtgctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctg
[0545]
hvl6的氨基酸序列如seq id no.129所示，其编码核酸如seq id no.130所示，其lcdr1、lcdr2和lcdr3分别如seq id no.115、131、128所示。
[0546]
qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwfqekpgqaprgliygtnkrapwtparfsgsllggkaaltlsgaqaedeaeyycvlwysnlwvfgggtkltvl
[0547]
核酸序列
[0548]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattggttccaggagaagcccggccaggctcctagaggactgatctacggaacaaacaagagagccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacactttctggtgctcaggctgaggacgaggccgagtactattgtgtcctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctg
[0549]
表9、cd3人源化抗体的重链可变区序列
[0550][0551]
hvh1的氨基酸序列如seq id no.132所示，其编码核酸如seq id no.133所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.134、135、136所示。
[0552]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrqapgkglewvsrirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0553]
核酸序列
[0554]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgctatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0555]
hvh2的氨基酸序列如seq id no.137所示，其编码核酸如seq id no.138所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.139、135、136所示。
[0556]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstyamnwvrkapgkglewvsrirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0557]
核酸序列
[0558]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttctccacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0559]
hvh3的氨基酸序列如seq id no.140所示，其编码核酸如seq id no.141所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.139、135、142所示。
[0560]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstyamnwvrkapgkglewvsrirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgesyvswfaywgqgtlvtvss
[0561]
核酸序列
[0562]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttctccacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcgagagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0563]
hvh4的氨基酸序列如seq id no.143所示，其编码核酸如seq id no.144所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.139、135、145所示。
[0564]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstyamnwvrkapgkglewvsrirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgqsyvswfaywgqgtlvtvss
[0565]
核酸序列
[0566]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttctccacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggccagagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0567]
hvh5的氨基酸序列如seq id no.146所示，其编码核酸如seq id no.147所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.139、135、148所示。
[0568]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstyamnwvrkapgkglewvsrirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgdsyvswfaywgqgtlvtvss
[0569]
核酸序列
[0570]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttctccacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcaga
cacggcaacttcggcgacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0571]
hvh6的氨基酸序列如seq id no.149所示，其编码核酸如seq id no.150所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.139、135、151所示。
[0572]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstyamnwvrkapgkglewvsrirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgtsyvswfaywgqgtlvtvss
[0573]
核酸序列
[0574]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttctccacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaccagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0575]
hvh7的氨基酸序列如seq id no.152所示，其编码核酸如seq id no.153所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.154、155、136所示。
[0576]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdyamnwvrkapgkglewvsrirskynnyatyyadsvedrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0577]
核酸序列
[0578]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttctccgactacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgtccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtggaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0579]
hvh8的氨基酸序列如seq id no.156所示，其编码核酸如seq id no.157所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.134、135、136所示。
[0580]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrkapgkglewvgrirskynnyatyyadsvkdrftisrddsknslylqmnslktedtavyycarhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0581]
核酸序列
[0582]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgggaagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgtgccagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0583]
hvh9的氨基酸序列如seq id no.158所示，其编码核酸如seq id no.159所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.134、135、136所示。
[0584]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrkapgkglewvgrirskynnyatyyadsvkdrftisrddsknslylqmnslktedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0585]
核酸序列
[0586]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgggaagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcaggg
acgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0587]
hvh10的氨基酸序列如seq id no.160所示，其编码核酸如seq id no.161所示，其hcdr1、hcdr2和hcdr3分别如seq id no.134、135、136所示。
[0588]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrkapgkglewvarirskynnyatyyadsvkdrftisrddsknslylqmnslktedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss
[0589]
核酸序列
[0590]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctct
[0591]
将轻、重链人源化变体分别进行全序列合成后，克隆到含有抗体lambda轻链恒定区或人igg4重链恒定区ch1-ch3的真核表达载体，共转染hek293e细胞，37℃120rpm 5％co2培养5-6天后，收集培养基上清液，通过protein a层析柱进行纯化。
[0592]
2、cd3人源化抗体的亲和力
[0593]
包被人cd3εγ蛋白，4℃过夜。2％脱脂牛奶封闭后，每孔加入不同稀释倍数的cd3抗体，孵育1小时；二抗加入hpr标记的山羊抗人igg fc，tmb溶液显色后，以浓硫酸终止反应并在450nm处读出吸光度(结果如图12、表8所示)。图12显示与人cd3εγ蛋白结合的抗cd3人源化抗体组合(包括acd3-hvh8/vl1、acd3-hvh9/vl1、acd3-hvh9/vl2、acd3-hvh9/vl3、acd3-hvh1/vl5、acd3-hvh8/vl5、acd3-hvh9/vl5)，cd3人源化抗体高亲和力结合cd3εγ重组蛋白。
[0594]
3、cd3人源化抗体识别jurkat t细胞
[0595]
取对数生长期的jurkat细胞，3％bsa封闭30分钟，以每孔5
×
104细胞加入96孔u型板，离心弃上清，每孔加入50μl梯度稀释的抗体(抗体浓度从30μg/ml起，3倍稀释5个梯度)，4℃孵育1小时。洗去一抗后，二抗加入1:300稀释的alexa fluro647标记的山羊抗人igg fc(jackson immunoresearch，109-606-170)，4℃孵育45分钟，洗涤后每孔重悬于50μl pbs进行facs(ique，intellicyt)检测(结果如图13、表10所示)。
[0596]
表10、cd3人源化抗体的亲和力
[0597] elisa(cd3εγ)facs jurkatacd3-hvh1/vl50.60nm10nmacd3-hvh8/vl10.65nm15nmacd3-hvh8/vl50.74nm较弱acd3-hvh9/vl10.49nm7nmacd3-hvh9/vl20.44nm25nmacd3-hvh9/vl30.70nm弱acd3-hvh9/vl50.42nm20nmokt3-higg1nd0.27nmklh-higg4
‑‑
[0598]
nd：未检测
[0599]-：不结合
[0600]
图13显示与jurkat细胞结合的抗cd3人源化抗体组合，其中cd3人源化抗体hvh9/vl5(acd3-hvh9/vl5)和hvh9/vl2(acd3-hvh9/vl2)均显著弱于对照抗体okt3，以中度亲和力结合jurkat细胞。
[0601]
4、cd3人源化抗体与人、猴cd3εγ抗原的交叉识别
[0602]
分别包被人cd3εγ蛋白和猴cd3εγ蛋白，4℃过夜。2％脱脂牛奶封闭后，每孔加入不同稀释倍数的cd3抗体，孵育1小时；二抗加入hpr标记的山羊抗人igg fc，tmb溶液显色后，以浓硫酸终止反应并在450nm处读出吸光度。图14显示cd3人源化抗体hvh9/vl5(acd3-hvh9/vl5)和hvh9/vl2(acd3-hvh9/vl2)均可同时结合人cd3εγ和猴cd3εγ蛋白。
[0603]
5、构建gpc3
×
cd3κλ人源化双特异抗体
[0604]
将人源化抗体49g8vhv6vkv3与含λ轻链的人源化cd3抗体hvh9/vl5(acd3-hvh9/vl5)，构建具有天然igg构型的新型gpc3-cd3κλ人源化双特异抗体，同时在gpc3抗原臂和cd3臂引入电荷变异体(vκ
gpc3
:gln
43
lys；vh
gpc3
:gln
39
glu；vλ
cd3
:gln
40
glu；vh
cd3
:gln
39
lys)(表11)。双特异抗体的fc部分采用人igg4 knob-into-hole结构，以实现异源二聚体配对(atwell等，1997)，并且通过突变ser228pro、leu235glu和pro329ala，保持铰链区稳定，同时完全去除与fcγ受体和c1q的相互作用。
[0605]
将编码相应抗体片段的质粒，按κ轻链：λ轻链：重链1：重链2＝2:2:1:1的比率混合，与3mg/ml pei混合后，共同转染cho-s细胞，在500ml cd cho agt培养基(gibco#12490-001)37℃5％co
2 150rpm培养，分别在瞬转第2、4和6天，加入4％cho feed c 补料(gibco#a25031-05)。当细胞活率降至85％左右，收获发酵液，过滤后经protein a亲和层析初步纯化，sec-hplc单体含量显示高于92％；经butyl hp疏水层析和capto q阴离子层析，单体含量进一步提高至99.5％以上(表12)。
[0606]
表11、gpc3-cd3κλ人源化双特异抗体
[0607] gpc3臂轻链gpc3臂重链cd3臂轻链cd3臂重链gpc3
×
cd3κλ002seq id no.162seq id no.164seq id no.166seq id no.168gpc3
×
cd3κλ003seq id no.170seq id no.172seq id no.166seq id no.168
[0608]
gpc3
×
cd3κλ002：
[0609]
gpc3臂轻链seq id no.162
[0610]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsngntylewylkkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0611]
核苷酸序列seq id no.163
[0612]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaacggcaacacatacctggagtggtatctgaagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtac
agtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0613]
gpc3臂重链seq id no.164
[0614]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvreapgqglewmgaihpgsggtayaqkfqgrvtltadessttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglassiektiskakgqprepqvctlppsqeemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0615]
核苷酸序列seq id no.165
[0616]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgagaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacgcccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacgagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctctgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccttgcagcagaagcaccagcgagagcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaacagcggcgctctgaccagcggcgtgcataccttccccgccgtgctccagagcagcggactgtactccctgagcagcgtggtgaccgtgccttccagcagcctgggcaccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcgagggcggacctagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccagtttaattggtacgtggacggcgtggaagtgcataacgccaagaccaagcccagagaggagcagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgcaaggtctccaacaagggcctggccagcagcatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtctgcaccctgccacctagccaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctatcccagcgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctggtttccaagctgaccgtggacaagtccagatggcaggagggcaacgtcttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagcctgggcaag
[0617]
cd3臂轻链seq id no.166
[0618]
qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltitgaqaedeaeyycvlwysnlwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0619]
核苷酸序列seq id no.167
[0620]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcaggagaagcccggccaggctcctagaggactgatcggcggaacaaacaagagagccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacaatcactggtgctcaggctgaggacgaggccgagtactattgtgtgctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctgggtcagcccaaggcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctga
ggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctatccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca
[0621]
cd3臂重链seq id no.168
[0622]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrkapgkglewvgrirskynnyatyyadsvkdrftisrddsknslylqmnslktedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglassiektiskakgqprepqvytlppcqeemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0623]
核苷酸序列seq id no.169
[0624]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgggaagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctctgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccttgcagcagaagcaccagcgagagcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaacagcggcgctctgaccagcggcgtgcataccttccccgccgtgctccagagcagcggactgtactccctgagcagcgtggtgaccgtgccttccagcagcctgggcaccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcgagggcggacctagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccagtttaattggtacgtggacggcgtggaagtgcataacgccaagaccaagcccagagaggagcagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgcaaggtctccaacaagggcctggccagcagcatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtctacaccctgccaccttgtcaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctggtgaaaggcttctatcccagcgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtccagatggcaggagggcaacgtcttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagcctgggcaag
[0625]
gpc3
×
cd3κλ003：
[0626]
gpc3臂轻链seq id no.170
[0627]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivhsngntylewylkkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyfclqvthvpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdkklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0628]
核苷酸序列seq id no.171
[0629]
gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgcacagcaacggcaacacatacctggagtggtatctgaagaagcccggccagtctcctcagctgctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctctggctctggatctggcaccg
acttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtacttctgtctccaggtcacacacgtgcccctgacatttggccagggcaccaagctggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgataagaaattgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0630]
gpc3臂重链seq id no.172
[0631]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfadyeihwvreapgqglewmgaihpgsggtayaqkfqgrvtltadessttaymelsslrsedtavyyctryysfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvderveskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglassiektiskakgqprepqvctlppsqeemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0632]
核苷酸序列seq id no.173
[0633]
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacaccttcgccgactacgagatccactgggtccgagaggctccaggacagggacttgaatggatgggcgctatccatcctggctctggcggcacagcttacgcccagaaattccagggcagagtgaccctgaccgccgacgagtctagcaccaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcacccggtactacagcttcgcctactggggacagggaaccctggtcacagtcagctctgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccttgcagcagaagcaccagcgagagcacagccgccctgggctgcctggtggaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaacagcggcgctctgaccagcggcgtgcataccttccccgccgtgctccagagcagcggactgtactccctgagcagcgtggtgaccgtgccttccagcagcctgggcaccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacgagagagtggagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcgaaggcggacctagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccagtttaattggtacgtggacggcgtggaagtgcataacgccaagaccaagcccagagaggagcagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgcaaggtctccaacaagggcctggccagcagcatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtctgcaccctgccacctagccaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctatcccagcgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctggtttccaagctgaccgtggacaagtccagatggcaggagggcaacgtcttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagcctgggcaag
[0634]
cd3臂轻链seq id no.166
[0635]
qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqekpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltitgaqaedeaeyycvlwysnlwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0636]
核苷酸序列seq id no.167
[0637]
caggctgtggtcacacaagagcctagcctgacagtgtctcctggcggcacagtgaccctgacctgtagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgctaattgggtgcaggagaagcccggccaggctcctagaggact
gatcggcggaacaaacaagagagccccttggacacccgccagattctctggatctctgctcggcggaaaggccgctctgacaatcactggtgctcaggctgaggacgaggccgagtactattgtgtgctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaaactgacagttctgggtcagcccaaggcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctatccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca
[0638]
cd3臂重链seq id no.168
[0639]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrkapgkglewvgrirskynnyatyyadsvkdrftisrddsknslylqmnslktedtavyycvrhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglassiektiskakgqprepqvytlppcqeemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0640]
核苷酸序列seq id no.169
[0641]
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgctatgaactgggtccgaaaggcccctggcaaaggactggaatgggtgggaagaatcaggtccaagtacaacaactacgccacctactacgccgacagcgtgaaggacagattcaccatcagcagggacgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgtgtcagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcacactggtcacagttagctctgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccttgcagcagaagcaccagcgagagcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaacagcggcgctctgaccagcggcgtgcataccttccccgccgtgctccagagcagcggactgtactccctgagcagcgtggtgaccgtgccttccagcagcctgggcaccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcgagggcggacctagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccagtttaattggtacgtggacggcgtggaagtgcataacgccaagaccaagcccagagaggagcagttcaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgcaaggtctccaacaagggcctggccagcagcatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtctacaccctgccaccttgtcaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctggtgaaaggcttctatcccagcgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtccagatggcaggagggcaacgtcttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagcctgggcaag
[0642]
表12、gpc3-cd3人源化双特异抗体的纯化
[0643][0644]
实施例4、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体的结合活性
[0645]
分别通过检测与gpc3重组蛋白、过表达稳转细胞或gpc3 肿瘤细胞的结合，确定双特异抗体gpc3抗原臂的亲和力，通过检测与jurkat细胞的结合，确定双特异抗体cd3臂的亲和力。
[0646]
1、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与gpc3的亲和力测定
[0647]
将浓度为1μg/ml的抗体捕获在proteina芯片(ge healthcare)，不同浓度的人或食蟹猴gpc3重组蛋白(5μg/ml为起始浓度，2倍梯度，共6个浓度点)作为分析物以30μl/min的流速流过芯片，结合时间120秒，解离时间400秒通过记录蛋白结合、解离过程中的spr信号变化，用biacore t200 evaluation软件以1:1结合模型，拟合得到动力学常数。
[0648]
将10μg/ml人或猴cd3εγ重组抗原通过氨基偶联结合到cm5芯片(ge healthcare)，控制抗原结合量约200ru。基线平稳后，将梯度稀释的抗体(从10μg/ml起，2倍稀释7个梯度)，以30μl/min的流速流过芯片，结合时间350秒，解离时间600秒。用biacore t200 evaluation软件以1:1结合模型，拟合得到动力学常数。亲和力测定结果见表13。
[0649]
表13、gpc3
×
cd3κλ双特异性抗体与gpc3和cd3重组抗原的亲和力
[0650]
kd(nm)人gpc3猴gpc3人cd3εγ猴cd3εγgpc3
×
cd3κλ0021.351.6015.923.9gpc3
×
cd3κλ0032.111.9112.117.8
[0651]
2、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与gpc3稳转细胞的结合
[0652]
取对数生长期的cho-人gpc3和cho-食蟹猴gpc3稳转细胞，用4％小牛血清(hyclone，sh30626.06)调整细胞至5
×
105细胞/ml，加入100μl/孔细胞悬液至96孔u型板，300g离心5分钟，弃上清，每孔加入100μl梯度稀释的抗体(起始浓度1800nm，3倍稀释，10个梯度)，4℃孵育60分钟。二抗加入50μl/孔alexa fluro647标记的山羊抗人igg fc(1:300稀释)，冰上孵育20分钟，洗1次后加入50μl/孔碘化丙啶溶液(1:300)，孵育5分钟，用流式细胞仪进行检测。图15和表14显示，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体高亲和力结合细胞gpc3受体，在猴gpc3稳转细胞上的亲和力与人gpc3稳转细胞上的亲和力相当。
[0653]
表14、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与稳转细胞的结合
[0654]
ec50(nm)人gpc3-cho猴gpc3-chogpc3
×
cd3κλ0022.83.0gpc3
×
cd3κλ0032.93.0klh
×
cd3
‑‑
[0655]
3、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与gpc3 肿瘤细胞的结合
[0656]
取对数生长期的hepg2细胞，加入200μg/ml鼠igg(jackson immunoresearch，115-005-03)冰浴封闭30分钟，用4％小牛血清调整细胞至5
×
105细胞/ml，每孔100μl加入96孔u
型板，300g离心5分钟，弃上清，每孔加入100μl梯度稀释的抗体(起始浓度1800nm，3倍稀释，10个梯度)，4℃孵育60分钟。洗去一抗，加入50μl/孔alexa fluro647标记的山羊抗人igg fc(1:300稀释)，冰上孵育20分钟，洗1次后加入50μl/孔pi，孵育5分钟，用流式细胞仪进行检测。检测结果见图16和表15，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体高亲和力结合gpc3 肿瘤细胞hepg2。
[0657]
表15、gpc3
×
cd3κλ双特异性抗体和gpc3 肿瘤细胞的结合
[0658]
ec50(nm)hepg2gpc3
×
cd3κλ0022.1gpc3
×
cd3κλ0032.5klh
×
cd3-[0659]
4、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与jurkat细胞的结合
[0660]
取对数生长期的jurkat细胞，加入200μg/ml鼠igg(jackson immunoresearch，115-005-03)，冰浴30分钟。用4％小牛血清调整细胞至5
×
105细胞/ml，每孔100μl加入96孔u型板，300g离心去上清，每孔加入100μl梯度稀释的抗体(起始浓度1800nm，3倍稀释，10个梯度)，4℃孵育60分钟。二抗加入50μl/孔alexa fluro647标记的山羊抗人igg fc(1:300稀释)，冰上孵育20分钟，洗1次后加入50μl/孔pi，孵育5分钟，用流式细胞仪(bd c6)进行检测。检测结果如图17和表16，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体以中等亲和力结合人白血病t细胞系jurkat细胞，ec50约20-40nm。
[0661]
表16、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与jurkat细胞的结合
[0662]
ec50(nm)jurkatgpc3
×
cd3κλ00236gpc3
×
cd3κλ00326klh
×
cd327
[0663]
5、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与外周血t细胞的结合
[0664]
取新鲜人外周血，通过ficoll.paque plus(ge，17-1440-03)分离得到pbmc。将pbmc用4％小牛血清(hyclone，sh30626.06)调整细胞至5
×
105细胞/ml，100μl/孔加入96孔u型板，离心弃上清，每孔加入100μl梯度稀释的抗体(起始浓度1800nm，3倍稀释，11个梯度)，4℃孵育60分钟。二抗加入50μl/孔alexa fluro647标记的山羊抗人igg fc(1:300稀释)，冰浴20分钟，洗1次后加入50μl/孔pi，孵育5分钟，用流式细胞仪(bd celesta)进行检测。检测结果见图18所示，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体以低亲和力结合人外周血t细胞。
[0665]
表17、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与外周血t细胞的结合
[0666]
ec50(nm)cd4 t cellcd8 t cellgpc3
×
cd3κλ0026565gpc3
×
cd3κλ0035669klh
×
cd37784
[0667]
实施例5、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体介导的tdcc作用
[0668]
取新鲜分离得到的pbmc分别与处于对数生长期的靶细胞hepg2细胞混合，效应/靶细胞＝10:1，每孔加入50μl梯度稀释的抗体(抗体浓度从66.7nm起，10倍稀释，7个梯度)，
5％co
2 37℃培养24小时。培养结束后，将50μl上清转移至新的黑色酶标板，加入50μl/孔ldh检测底物，10分钟后终止反应并检测ldh释放；孔内剩余细胞用4％小牛血清洗2次后，加入100μg/ml人igg孵育10分钟，再加入t细胞活化检测抗体(cd25-bv421，cd4-fitc，cd69-bv605和cd8-apc)，冰上孵育20分钟。洗涤弃上清，加入60μl/孔pi，置于冰上孵育5分钟，用流式细胞仪进行检测。图19显示gpc3
×
cd3κλ双特异抗体在体外活性研究中，对hepg2细胞的最大杀伤率略高或相当于对照抗体(图19a)，、但tdcc过程中t细胞cd69(早期活化)和cd25(晚期活化)的变化，均提示gpc3
×
cd3κλ双特异抗体对t细胞的活化较对照抗体更为温和。
[0669]
实施例6：gpc3
×
cd3κλ双特异抗体对t细胞活化通路的激活
[0670]
取对数生长期的靶细胞cho-人gpc3，离心弃上清，重悬至2
×
105细胞/ml。50μl/孔接种靶细胞至96孔板，5％co2，37℃培养过夜。取对数生长期的jurkat-nfat-luc报告细胞300g离心5分钟弃上清，重悬至4
×
106细胞/ml，取出96孔板，弃上清，25μl/孔接种jurkat-nfat-luc报告细胞至96孔板，每孔加入25μl梯度稀释的gpc3
×
cd3κλ双特异抗体或对照抗体klh
×
cd3(起始浓度20μg/ml，3倍稀释，10个梯度)，5％co2，37℃培养6小时。培养结束后，按照one-glo luciferase assay system说明书，每孔加入100μl检测试剂，于酶标仪(md spectramax i3x)检测。检测结果见图20，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体以cho-hgpc3为靶细胞时，可激活t细胞的nfat信号通路，活化程度略低于对照抗体。
[0671]
实施例7、gpc3
×
cd3κλ双特异抗体对pbmc的非特异激活
[0672]
取新鲜分离得到的pbmc，加入100μl抗体(10μg/ml)，5％co
2 37℃培养24小时。孔内细胞用4％小牛血清洗2次后，加入100μg/ml人igg孵育10分钟，再加入t细胞活化检测抗体(cd25-bv421，cd4-fitc，cd69-bv605和cd8-apc)，冰上孵育20分钟。洗涤弃上清，加入60μl/孔pi，置于冰上孵育5分钟，用流式细胞仪进行检测。检测结果见图21，在缺乏靶细胞的条件下，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体对外周血t细胞无激活作用，与阴性对照klh
×
cd3相当。
[0673]
实施例8：gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与fc受体的结合
[0674]
将50μg/ml his-tag抗体通过氨基偶联到cm5芯片，分别捕获带有his标签的fcγri、fcγriiah131和fcγriiiav158重组蛋白(sino biological，#10256-h08h/10374-h08h1/10389-h08h1)，捕获时间40秒，流速10μl/min，基线平稳后，将梯度稀释的抗体(起始浓度37.5μg/ml，2倍稀释)以30μl/min的流速流过芯片，结合时间120秒，解离时间200秒，用biacore evaluation软件拟合得到亲和力常数。由图22可见，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体与fcγri、fcγriiah131和fcγriiiav158均无结合；野生型igg4对照抗体以较强亲和力结合fcγri，与fcγriiah131有微弱结合。
[0675]
实施例9、免疫重建小鼠皮下hepg2移植瘤模型
[0676]
选择6～8周雌性b-ngd小鼠(百奥赛图生物科技有限公司)，皮下接种hepg2细胞(7
×
106/只)，待肿瘤长至60-100mm3时，随机分组，分别设定为给药组3.0mg/kg、给药组1.0mg/kg、给药组0.3mg/kg和阴性对照组klh
×
cd33mg/kg。每只小鼠尾静脉注射1
×
107个pbmc细胞，3天后开始第一次小鼠给药，给药间隔为5天一次，共给药2次。监测小鼠肿瘤体积及小鼠体重，实验结束后断颈处死小鼠，取瘤称重并记录。结果见图23，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体的体内药效呈现剂量相关性，抑瘤率(低剂量到高剂量)分别为：76.7％、81.3％和95.9％。荷瘤小鼠对以上剂量耐受良好，无体重减轻等不良反应。
[0677]
实施例10、cd3人源化鼠hepa1-6/hgpc3移植瘤模型
[0678]
选择6周雌性c57/bl6-hcd3小鼠(百奥赛图生物科技有限公司)，将hepa1-6/hgpc3(6
×
106/只)接种于小鼠皮下，待肿瘤成瘤体积到达60-100mm3时，随机分组。分别设定为给药组10mg/kg、给药组3mg/kg、给药组1mg/kg和阴性对照组klh
×
cd3 10mg/kg。给药间隔为3天一次，共给药3次。监测小鼠肿瘤体积及小鼠体重，实验结束后断颈处死小鼠，取瘤称重并记录。结果见图24，在cd3人源化鼠模型中，gpc3
×
cd3κλ双特异抗体可显著抑制hepa1-6/hgpc3肿瘤生长，减小荷瘤体积。