蛋白质O-岩藻糖基转移酶OsPOFUT1编码基因及其酶和制备与应用

蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1编码基因及其酶和制备与应用
技术领域
1.本发明涉及一种蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的基因序列及其制备方法。本发明还提供了该蛋白质o-岩藻糖基转移酶的重组质粒和重组基因工程菌株，并且提供了检测蛋白质o-岩藻糖基转移酶活性的方法。


背景技术：

2.蛋白的o-岩藻糖基化是岩藻糖通过-o-糖苷键与蛋白的ser或thr残基相连所形成的一类糖基化修饰形式。动物方面的研究表明，能发生o-岩藻糖基化的蛋白质存在明显的序列特征，主要发生在含表皮生长因子样(egf)重复序列和血小板反应蛋白1型重复序列(tsr)的蛋白上。这两种不同特征蛋白质底物的o-岩藻糖基化分别由蛋白o-岩藻糖基转移酶1(pofut1)和pofut2介导催化完成。o-岩藻糖可以继续被其他糖修饰，延长糖链，最终能够形成两种不同的糖型。而在复杂的生物体内，糖链在一定概率下不会完整地延伸，相对应地，不同糖链长度的o-岩藻糖基化也发挥着不同的功能。如notch蛋白的配体结合域需要构成特定糖基化模式以完成与配体的结合。
3.动物中关于蛋白质o-岩藻糖基转移酶的相关研究比较全面。第一个o-岩藻糖修饰糖蛋白于1990年就已经在哺乳动物中发现(kentzer et al.,1990)，1998进一步成功鉴定了蛋白o-岩藻糖基转移酶(pofut1)(wang and spellman,1998)，2006年又发现了pofut2(luo et al.,2006)。紧接着pofuts催化机制及晶体结构得到了解析，其重要的生物学功能也被逐渐揭示，特别是pofut1。研究发现缺乏pofut1的小鼠胚胎在妊娠中期会发生严重的体节、心血管和神经发育障碍，从而产生胚胎致死表型；pofut1表达异常在人体中可以导致多种疾病的发生，在如乳腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌和胃癌等癌症中pofut1表达升高，且其表达量与患者的预后呈现负相关；pofut1突变会抑制notch信号通路从而导致多种疾病的发生，如dowling-degos病、小儿发育迟缓和心血管缺陷等。
4.相对于动物方面，植物领域pofuts的相关活性及功能研究要远远滞后，到目前为止，只有两篇此方面的报道。2017年，杜克大学taiping sun团队在nat cell biol上揭示了一种植物特有的且与pofuts有明显催化底物差别的o-岩藻糖基转移酶spy。随后，内华达大学ian s.wallace团队在进行拟南芥发育突变株研究时，发现一个基因at3g05320功能缺失会引起花粉管延伸异常并导致部分种子不育，通过生物信息学比对发现该基因具有高度保守的pofuts关键催化位点，将其命名为atpofut1，但并未对其催化活性及糖生物学功能进行考察。综上可知，植物pofuts相关研究才刚刚起步，尚有极大的研究空间。
5.针对上述蛋白质o-岩藻糖基转移酶的研究现状，本发明首次公开了一种来源于水稻(oryza sativa l.)的蛋白质o-岩藻糖基转移酶(oryza sativa l.protein o-fucosyltransferase 1，ospofut1)的基因序列及其制备方法。借此弥补植物中蛋白质o-岩藻糖基转移酶催化活性鉴定方面的空白，暗示了植物中同样存在通过岩藻糖基化调控蛋白活性的途径，为后续进一步的功能研究奠定基础。转录水平大数据分析显示ospofut1在水
ospofut1。
37.将ppiczαa-ospofut1转化到毕赤酵母中使其重组到酵母基因组上，用载体质粒ppiczαa的标签抗生素博来霉素初步筛选重组酵母克隆，随后分别利用ppiczαa通用引物(5
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aox：gactggttccaattgacaagc；3
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aox：gcaaatggcattctgacatcc)和ospofut1克隆特异性引物(y-ospofut1-f：ggggccgaattcatgaacatcatactagaact；y-ospofut1-r：taaagcggccgcgtggcatgagatattgt)进行酵母基因组pcr筛选验证正确的转化子。结果如图2所示，左侧为通用引物，右侧为特异引物。
38.使用bmgy和bmmy培养基以28℃，转速200rpm培养毕赤酵母，bmgy培养基培养24h扩增酵母数量，bmmy培养基培养48h诱导蛋白表达，蛋白将分泌到菌液中，随后使用4℃，8000rpm离心菌液分离酵母菌体和含有酶的上清液；再用膜超滤系统(默克密理博merck millipore)浓缩上清液获取浓缩的粗酶液。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测粗酶液中蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的表达情况结果结果如图3所示，蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。
39.实施例4蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的活力测定
40.对实施例1产物测定ospofut1酶活的体系如下：
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对照组的酶活测定体系将酶液替换为同体积沸水浴灭活的酶，其余组分完全相同。在25℃下，以转速300rpm震荡反应12h，随后沸水浴10min终止反应，12000rpm常温离心去除蛋白，0.22μm滤器过滤即为检测样品。用高效液相色谱检测体系中底物的消耗情况。
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实施例5
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紫外-可见光检测的高效液相色谱方法可以有效检测对实施例4反应底物gdp-岩藻糖的消耗。所用的高效液相色谱系统是uv230 紫外-可见检测液相色谱仪，c-18色谱柱hypersil bds c18，与紫外-可见光检测器。所用的流动相2mm四丁基硫酸氢氨磷酸缓冲液(ph 6.2)。流动相以1ml/min恒定进样及洗脱，检测柱温是25℃，进样体积是20μl。
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液相检测标准品在21min左右出峰，经过不同浓度标品测试可以确定此峰为gdp-岩藻糖(图4)。与对照相比，在加入ospofut1的实验组中底物gdp-岩藻糖的峰明显减小，证明了这个异源表达的ospofut1的确具有蛋白质o-岩藻糖基转移酶活性。
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实施例6
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为了预测ospofut1在植物体内的功能，利用现有水稻转录组数据库plant regulomics(http://bioinfo.sibs.ac.cn/plant-regulomics/)对ospofut1的转录水平进行了分析，结果如图5所示。在寒冷、干旱等逆境处理下，ospofut1的表达水平发生显著变化，提示其可能参与到水稻植株的抗逆途径之中，这为其作为靶标进行水稻抗逆品种的改良提高了可能性。


技术特征：
1.一种蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的编码基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列；2)编码seq id no.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列；3)对序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有蛋白质o-岩藻糖基转移酶活性的核苷酸序列。2.一种权利要求1所述的蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的编码基因编码的蛋白质o-岩藻糖基转移酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：1)序列表中seq id no.2从氨基端开始的氨基酸残基序列；2)对序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有蛋白质o-岩藻糖基转移酶活性的氨基酸序列。3.按照权利要求2所述的蛋白质o-岩藻糖基转移酶，其特征在于：该酶具有将二磷酸鸟苷-岩藻糖(gdp-fucose)以o-糖肽键形式转移到具有表皮生长因子样重复序列(epidermal growth factor repeat)蛋白质上的活性。4.一种权利要求2或3所述的蛋白质o-岩藻糖基转移酶的制备方法，其特征在于：是将蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的蛋白质o-岩藻糖基转移酶；上述蛋白质o-岩藻糖基转移酶ospofut1的编码基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：1)具有序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列，2)编码seq id no.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(dna)序列，3)对序列表中seq id no.1的脱氧核糖核酸(dna)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有蛋白质o-岩藻糖基转移酶活性的核苷酸序列；所述的重组表达蛋白质o-岩藻糖基转移酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。5.按照权利要求4所述方法，其特征在于：用于重组表达蛋白质o-岩藻糖基转移酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞escherichia coli bl21、escherichia coli jm109、escherichia coli dh5α，酵母菌宿主细胞saccharomyces cerevisiae、pichia pastoris、kluyveromyceslactis，枯草杆菌宿主细胞bacillus subtilis r25、bacillus subtilis 9920，乳酸菌宿主细胞lactic acid bacteria cocc101，放线菌宿主细胞streptomycesspp，丝状真菌宿主细胞trichoderma viride、trichoderma reesei、aspergillus niger、aspergillus nidulans，昆虫细胞bombyxmori、antharaea eucalypti，哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞cho、幼小仓鼠肾脏细胞bhk、中国仓鼠肺细胞chl中的一种或二种以上。6.一种权利要求1所述的蛋白质o-岩藻糖基转移酶的应用，其特征在于：将o-岩藻糖基转移酶ospofut1编码基因为靶标进行植物品种改良，将ospofut1在水稻或其他植物中敲除、过表达、一个或多个碱基的基因突变用于品种改良，或通过外源添加抑制剂或激活剂调控蛋白o-岩藻糖基转移酶用于植物品种改良。

技术总结
本发明公开一种来源于水稻(Oryza sativa L.)的蛋白质O-岩藻糖基转移酶(Oryza sativa L.Protein O-Fucosyltransferase 1，OsPOFUT1)的基因序列及其制备方法。本发明提供了一种制备该蛋白质O-岩藻糖基转移酶的方法，即将该酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备出OsPOFUT1。用该菌株异源表达制备出OsPOFUT1。


技术研发人员：尹恒 贾晓晨 梁蓉
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2020.12.02
技术公布日：2022/6/4